Instituto Tecnolgico de Celaya Departamento de Ingeniera Bioqumica

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PRACTICA 8: TINCION DE CAPSULA.

OBJETIVO.

Observar la cpsula bacteriana, componente extracelular de algunas bacterias, mediante tcnicas especiales.

INTRODUCCION

Generalmente, la capsula se pone de manifiesto mediante una coloracin negativa o una modificacin de ella debido a que no absorbe los colorantes normales de pared en bacterias.

TINCION NEGATIVA.

Mediante este procedimiento, las clulas sin teir resaltan sobre un fondo teido utilizando un colorante acido; la nigrosina, un colorante negro, es el ms comnmente utilizado. El mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que difcilmente se tien con las tcnicas directas.

Figura 1. Tincin negativa para observacin de Cpsula por tinta china. a) Diplococcus pneumoniae. b) Tincin de un quiste c) Tincin de bacilos capsulados. d) Tincin negativa de

Staphylococcus aureus. e) Levadura encapsulada llevando a cabo gemacin.

CPSULAS Y GLUCOCALIX (pelcula viscosa)

Algunas bacterias se encuentran rodeadas de una capa de apariencia mucoide, en el exterior de la envoltura celular. Estas estructuras usualmente consisten de polisacridos; sin embargo, en ciertos bacilos, estn compuestas de polipptidos (por ejemplo, el cido poliglutmico) segregados por la bacteria. Cundo se ven ms definidas y rgidas, se describen como la cpsula. Cuando se observan menos definidas, se describen como glucocalix (pelcula

viscosa).

Las cpsulas tienen diferentes funciones, dependiendo de la especie bacteriana y el ambiente en que se encuentre.

1. Puede servirles como proteccin ante la desecacin y radiacin.

2. La protege del ataque de virus bacterianos y del efecto de metales pesados que le sean txicos.

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3. Adems promueve la adhesin a superficies donde encuentra condiciones adecuadas para su crecimiento.

4. Est relacionada con la capacidad infectiva hacia otras especies (animales o vegetales) su virulencia y su capacidad de resistencia a ser fagocitada, evitando la ingestin por los neutrfilos y los macrfagos.

5. Es una reserva de nutrientes que puede ser reabsorbida.

6. Permite el reconocimiento clula-clula

Estas estructuras no son esenciales a la viabilidad celular y en algunas especies habr cepas que producirn cpsula, mientras que otras no (Klebsiella pneumoniae virulenta y avirulenta). Adems las condiciones de cultivo y fisiolgicas pueden activar o reprimir la sntesis de este material. Las cpsulas varan en grosor y pueden fcilmente representar varias veces el volumen del organismo.

Son factores de virulencia asociados con la invasividad de los tejidos del husped, Durante el cultivo in vitro la sntesis de la cpsula a menudo se pierde.

Las cpsulas no tien bien con las tinciones habituales (Gram), Pero pueden observarse con las tinciones negativas. Los colorantes empleados en este tipo de tinciones no son capaces de penetrar la clula ni fijarse en ella. Como consecuencia, las clulas se ven claras, sin teir y el fondo se observa coloreado.

Figura 2. Tincin negativa para observacin de Cpsula por Muir. a) Klebsiella spp. Colonias rosas, mucoides, bordes irregulares, convexas. Medio de cultivo Mac Conkey. b) Klebsiella pneumoniae

Tincin de cpsula por Tincin Muir. c) Klebsiella pneumoniae, Bacteria que se presenta libre, por pares o cadenas cortas, gram-positiva. Tincin de Cpsula, LM X1000.

Para determinar la presencia de material capsular en los microorganismos, se hace una tincin por el mtodo de la tinta china. Para ello se prepara una suspensin del microorganismo problema (en una gota de glucosa al 6 %) sobre un portaobjetos, se aade una gota de tinta china y se mezcla con la suspensin bacteriana. Una vez seca la extensin al aire, sin calentar, se cubre con metanol y se fija a la llama. A continuacin se tie con azul de metileno durante 1-2 min, se lava con agua y se seca. La preparacin se observa con el objetivo de inmersin de manera que si

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el microorganismo tiene cpsula, las clulas bacterianas se ven azules y rodeadas de un halo azul plido. El fondo de la preparacin queda negro, Figura 1.

Tambin puede aplicarse el mtodo de Muir, el fondo se tie de azul grisceo con el mordiente de Muir y las clulas se tien en rojo con una solucin de fucsina. La cpsula no est teida y aparece como un halo alrededor de la clula, tal como describe Cowan & Steels (1993), Figura 2.

Para estudiar la formacin de cpsula, los microorganismos deben cultivarse en medios enriquecidos y en condiciones que favorezcan la produccin de esta estructura. Para la realizacin del ensayo se recomienda utilizar cultivos en medio slido como Agar Mac Conkey o Agar Soya Tripticasena (TSA) durante 1-3 das a 35 C.

MATERIALES.

METODO DE LA TINTA CHINA. METODO DE MUIR.

Tinta china o nigrosina

Metanol

azul de metileno

Fucsina fenicada.

Etanol

Mordente de Muir

M.O. en proceso de identificacin.

Portaobjetos (4).

Microscopio.

METODOLOGIA (Mtodo de la tinta china).

1. Colocar una gota pequea de tinta china cerca del cultivo cerca de un extremo, de un portaobjetos limpio.

2. Colocar una asada de cultivo sobre la gota de tinta y mezclar, sin extender. 3. Colocar otro portaobjetos limpio en ngulo de 60 sobre la preparacin y extender la

mezcla a lo largo del portaobjetos, utilizando la tcnica del frotis sanguneo. 4. Dejar que el frotis se seque o cubrir con cubreobjetos, procurando que no queden burbujas

de aire. Observar directamente al microscopio. 5. Desechar la preparacin en un vaso con cloro 1:5.

1. Aplicacin de gota de tinta 2. Asada de cultivo

3. Portaobjetos junto a la gota 4. Contacto con gota y exten- 5. Extensin tinta-muestra.

-sin sobre borde del porta.

Figura 3. Preparacin de frotis. Mtodo de la tinta china.

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Una opcin alterna es:

1. Dejar secar la preparacin con nigrosina. 2. Una vez seca la extensin al aire, sin calentar, se cubre con metanol y se fija a la llama. 3. A continuacin se tie con azul de metileno durante 1-2 min, se lava con agua y se seca. 4. Observar directamente al microscopio

METODOLOGIA (Mtodo de Muir).

1. Cubrir la laminilla con fucsina fenicada fuerte y calentar ligeramente durante 1 min. 2. Lavar rpidamente con etanol, despus lavar perfectamente con agua. 3. Cubrir con el mordente de Muir durante 30 segundos. 4. Lavar con agua y con etanol durante 30 segundos o hasta que el frotis tome un color rojo

plido. 5. Lavar perfectamente con agua. 6. Contrastar con azul de metileno durante 30 segundos. 7. Lavar y dejar escurrir o secar en papel secante.

Las bacterias se tien de rojo, las capsulas de azul.

RESULTADOS

MEDIO COLONIA TINCIN GRAM CPSULA (Presencia/ausencia)

Figuras

CUESTIONARIO.

1. Qu efecto tiene la composicin de medio en la produccin de este tipo de estructura? 2. Qu hiptesis propone para explicar porqu Lactobacillus mesenteroides puede sintetizar

cpsula en presencia de sacarosa, pero no en medios con glucosa. 3. Proponga un experimento para evaluar su hiptesis. 4. Qu aspecto tendran las colonias de L. mesenteroides en los medios propuestos de las

prguntas 2 y 3? 5. Qu funcin desempean las capsulas en la infectividad de un organismo? 6. se puede correlacionar siempre la presencia de una capsula en una especie patgena? 7. Explique el experimento de transformacin con neumococo y la relacin de presencia de

cpsula con la justificacin de patogenicidad de cepas.

REFERENCIAS Gamazo, C., Lpez-Goi, I., y Daz, R. (2005) Manual prctico de microbiologa, Ed. Masson, Barcelona, Espaa. Pp. 21-24. Vera-Garca (Introduccin a la microbiologa (2a ed.). Editorial Universidad Estatal a Distancia (EUNED)