Practica de micologia
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IESCH Universidad Salazar LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO. MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICOLOGÍA DRA. JULIA MANUELA LÁZARO ZERMEÑO TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS, AGOSTO DEL 2014 0
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IESCH Universidad Salazar
LICENCIATURA EN
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO.
MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICOLOGÍA
DRA. JULIA MANUELA LÁZARO ZERMEÑO
TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS, AGOSTO DEL 2014
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CONTENIDO
Misión y Visión Institucional............................................................................2
Misión y Visión de la Carrera...........................................................................3
Perfil del Egresado............................................................................................4
Introducción a la Micología Medica.................................................................5
Reglamento del Laboratorio.............................................................................6
Reglas de Seguridad.........................................................................................9
Criterios de Calificación.................................................................................14
Formato de reporte de prácticas.......................................……………………14
Practica No. 1. Toma de muestras clínicas para el diagnostico de micosis cutáneas ó superficiales (dermatofitosis)…………………………………………15
Practica No. 2. Primoaislamiento de hongos patógenos de humano a partir de muestras biológicas infectadas………………………………………………………………………………..19
Practica No.3. Morfología macroscópica y microscópica colonial de hongos filamentosos causantes de micosis……………………………….………………..22
Practica No. 4. Identificación de hongos dermatofitos patógenos de humano………………………………………………………………………………….26
Practica No. 5. Métodos de conservación de hongos patógenos……………30
Practica No.6. Identificación de hongos levaduriformes………………………33
Practica No.7. Aislamiento del agente causal de mucormicosis (cigomicosis)……………………………………………………………………………38
Practica No. 8. Técnica de microcultivo para la identificación de hongos
patógenos de humanos……………………………………………………………….41
ANEXOS………………………………………………………………………………45-57
1
MISION Y VISION DEL IESCH
El Instituto de Estudios Superiores de Chiapas, tiene por Misión:
“Formar al ser humano, fomentando el desarrollo de actitudes, valores, habilidades
y conocimientos en pertinencia y vinculados con el entorno económico, social,
político y cultural que demanda nuestra región y el país”
Y por Visión:
“Ser una Institución integrada a los sectores productivos y sociales que conjunten
actividades docentes y de investigación con el servicio y mejora de nuestro estado
y país, acorde al proceso de globalización actual, fomentando excelencia y calidad”
2
MISION Y VISION DE LA LICENCIATURA en Químico Farmacéutico Biólogo.
Misión:
“Formar profesionales en Químico Farmacéutico Biólogo con capacidad para la
producción de bienes y servicios para la salud y para realizar actividades de
intervención, investigación y docencia que respondan a las necesidades
individuales y colectivas que demanda nuestra región y país, con una visión
integral del ser humano y con alto sentido de responsabilidad y humanismo”
Visión:
“Ser una licenciatura con alto nivel académico y amplio reconocimiento social,
líder en la formación de profesionales químico farmacéutico biólogo; integrada a
los sectores productivos y sociales que vincule actividades de docencia,
investigación y servicio, acorde al proceso de globalización actual, fomentando la
excelencia y la calidad en su quehacer diario”
3
PERFIL DEL EGRESADO
“El egresado de la carrera de químico farmacéutico biólogo deberá poseer los
conocimientos habilidades y aptitudes para poder colaborar en el equipo de salud
realizando funciones específicas en la investigación, desarrollo, preparación y control de
fármacos y medicamentos, teniendo la responsabilidad social para fabricar y/o distribuir al
público los medicamentos y la información necesaria de los mismos. Desarrollar,
supervisar, Investigar y realizar los procedimientos y técnicas analíticas en el área de la
salud colaborando en la resolución de problemas de salud relacionados con la
prevención, diagnóstico y control de enfermedades de acuerdo con la normatividad del
país y las recomendaciones internacionales. Participar en el establecimiento de la
normatividad que rige las actividades del área de Salud, colaborar en la verificación,
peritaje y supervisión del cumplimiento de las normas. Además de contar con los
conocimientos necesarios para incorporarse en estudios de postgrado, todo esto para
servir a la sociedad responsablemente contribuyendo así al desarrollo de su entorno
regional”.
4
Introducción a la Micología Médica
A través del curso, el alumno se percatara de que los hongos tienen una influencia
importante en la vida del hombre. Algunos hongos proporcionan al hombre
productos alimenticios, algunas enzimas utilizadas en procesos industriales,
colorantes, antibióticos, entre otros productos. Sin embargo muy pocos hongos
pueden ocasionar enfermedades en animales y seres humanos.
En el curso se estudiara la participación de los hongos en la vida del hombre como
causantes de enfermedades. La micología médica, como se ha visto, es un área
interdisciplinaria que se ocupa de los hongos que causan daño al hombre y que
esta patología está relacionada con otras especialidades médicas.
Al finalizar este laboratorio el estudiante podrá: conocer la estructura básica de los
hongos y su clasificación. Conocer características distintivas de los diferentes filos
de hongos de interés en micología medica. Conocer las técnicas de asepsia
básica al preparar laminillas de hongos para determinar el diagnostico de micosis.
Día a día, el número de infecciones causadas por estos agentes aumenta
principalmente los de tipo oportunista; sin embargo, en nuestro país no se cuenta
con datos epidemiológicos precisos que indiquen las tasas de morbilidad y
mortalidad en las micosis. Lo anterior se debe a diversos factores; entre ellos, no
se cuenta con suficiente conocimiento de estos padecimientos, no se hace un
diagnóstico diferencial adecuado y por lo tanto, las micosis pasan inadvertidas en
un gran número de casos. Estos problemas pueden resolverse si se cuenta con un
laboratorio de diagnóstico micológico, en donde labore personal capacitado con
conocimientos para desarrollar este tipo de trabajo. Por lo anterior, la parte
practica dedicada a la materia de micología medica; se enfocará a que el alumno
conozca las técnicas de laboratorio empleadas en la toma de muestras biológicas
empleadas en el diagnostico de las micosis, así mismo, el alumno obtendrá los
conocimientos y las herramientas necesarias para aislar e identificar el agente
fúngico involucrado en diferentes tipos de micosis de importancia medica.
5
REGLAMENTO DEL LABORATORIO
GENERALES:
El presente reglamento tiene como objetivo establecer las normas y conductas que deben presentar catedráticos, alumnos y laboratoristas en el transcurso de las prácticas de la materia de Bioquímica Inmunológica, para establecer los parámetros de calificaciones asignadas a los alumnos.
CAPITULO I
DEL LABORATORISTA
Artículo 1
El laboratorista permanecerá en el laboratorio en el horario que le corresponde.
Tendrá listo el material (cristalería, instrumental, reactivos y equipos) para las prácticas dentro del laboratorio, de acuerdo a lo solicitado por el profesor, con tres días de anticipación por lo menos.
Entregará con debida cortesía, el material a los alumnos y a los profesores durante el tiempo estipulado para cada sesión de laboratorio.
El material será entregado durante los primeros 15 minutos.
Recibirá y revisará que el material y el equipo estén en buen estado y en perfectas condiciones de limpieza,
Auxiliará a los profesores en la preparación de soluciones u otros reactivos que se requieran para el desarrollo de la práctica.
Orientará a los estudiantes en el manejo y cuidado del equipo.
Tendrá al día los inventarios físicos, de cristalería, instrumental, reactivos y equipo de laboratorio a su cargo y los entregará a fin de semestre a la Coordinación de la materia.
Mantendrá el equipo en su sitio procurando su correcta utilización y bajo controles de seguridad.
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Será el responsable absoluto de que el equipo de laboratorio este en perfecto estado de uso (limpio, funcionando, etc)
Controlará el regreso de material, equipo, etc, en el tiempo estipulado.
En casos estrictamente necesarios, se quedará unos minutos más para facilitar la práctica.
Al final del semestre le entregará a los alumnos un comprobante de No Adeudo de material de Laboratorio.
Esta prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio.
CAPITULO II
DE LOS ALUMNOS
Artículo 2
El alumno deberá llegar puntual a la hora correspondiente de la práctica. Se le dará una tolerancia máxima de 10 minutos, transcurrido ese tiempo, no podrá ingresar al laboratorio.
Es indispensable el uso de la bata dentro del laboratorio, no se permite el uso de filipina.
Esta prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio, cualquier incurrimiento en lo antes mencionado anulará el derecho a realizar la práctica.
Entrando al laboratorio, el alumno deberá entregar los requisitos de la práctica a realizar de lo contrario se anulará dicha práctica.
Se deberá entregar un “Reporte de Práctica” 8 días después de haberla realizado. El contenido del mismo será indicado por el catedrático.
El alumno deberá cumplir con al menos el 80% de asistencias en el laboratorio durante todo el ciclo escolar, para evitar la baja del curso práctico.
El Material biológico necesario para la realización de las prácticas será proporcionado por los alumnos, el incumplimiento de esta disposición anulará el derecho a realizar la práctica.
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El alumno deberá solicitar el material de laboratorio con un máximo de 3 días de anticipación, mediante un vale a los laboratorista, de lo contrario perderá el derecho de realizar la práctica.
Cualquier material que resulte dañado durante la realización de la práctica deberá ser repuesto por el alumno a más tardar en 8 días, de lo contrario perderá el derecho de realizar la siguiente práctica y su calificación de ese mes será anulada.
La calificación de laboratorio constituirá el 20% de la calificación global de la materia.
El alumno presentará un examen teórico de la práctica, durante el transcurso de la realización de la misma.
La calificación de cada práctica estará integrada por el reporte, la evaluación teórica de la práctica y el desempeño durante la misma.
La calificación mínima aprobatoria es de 6.0
Es requisito indispensable aprobar la teoría para validar la calificación del Laboratorio.
Los alumnos que reprueben más del 20% del total de las prácticas, se verán obligados a presentar un Examen teórico-práctico Final del Laboratorio, como requisito indispensable para poder tomar en cuenta el porcentaje correspondiente al Laboratorio para la calificación final de la materia.
CAPITULO III
DE LOS PROFESORESArtículo 3
El profesor deberá llegar 10 minutos antes del inicio de la práctica para verificar el orden y funcionamiento del material de laboratorio que se empleará en el desarrollo de la misma.
La calificación de laboratorio constituirá el 20% de la calificación global de la materia.
El alumno presentará un examen teórico de la práctica, durante el transcurso de la realización de la misma.
La calificación de cada práctica estará integrada por el reporte, la evaluación teórica de la práctica y el desempeño durante la misma.
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La calificación mínima aprobatoria es de 6.0
Los alumnos que reprueben más del 20% del total de las prácticas, se verán obligados a presentar un Examen teórico-práctico Final del Laboratorio, como requisito indispensable para poder tomar en cuenta el porcentaje correspondiente al Laboratorio para la calificación final de la materia.
Está prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio.
Las calificaciones mensuales deberán entregarse al profesor titular a más tardar 5 días antes de la aplicación del examen mensual.
Se deberán entregar al profesor 10 reactivos referentes a lo revisado durante el mes para su inclusión en el examen mensual teórico, a mas tardar 5 días antes de la aplicación de este,
Se deberá proporcionar junto con las calificaciones, la relación de alumnos que adeudan material, así como las inasistencias para su contabilización.
MEDIDAS DE SEGURIDAD QUE DEBE TOMAR DURANTE EL DESARROLLO
DE LA PRÁCTICA.
1. Leer antes su práctica. En ocasiones se le pedirá traer materiales y si no los
trae no podrá efectuar su práctica.
2. Traiga consigo siempre material de limpieza, como franela, detergente y
jabón neutro.
3. No coloque mochilas sobre su mesa de trabajo.
4. Tenga consigo siempre su manual de prácticas o diagrama de flujo de la
misma.
5. Efectué solo lo que se le señala. Lo demás podría ocasionar riesgos.
6. Tome en cuenta las fuentes flamables: equipo eléctrico, mecheros, tuberías
de gas, fuentes de calor, etc.
7. No utilice equipos de comunicación mientras trabaja en el laboratorio.
9
8. No pruebe ni huela las sustancias químicas a menos que se lo indique su
profesor.
9. No se frote los ojos con las manos mientras se este trabajando, si necesita
hacerlo use un pañuelo apropiado.
10.Antes de succionar pipetas, lávelas y séquelas para no contaminar los
reactivos.
11.Nunca mezcle sustancias químicas a menos que el procedimiento se lo
indique.
12.Si la meza de trabajo se ensucia, inmediatamente debe limpiarla con una
toalla húmeda para eliminar los residuos de los reactivos.
13.Deseche las sustancias según las instrucciones de su profesor.
14.Cuando ponga a calentar tubos de ensayo, debe hacerlo inclinado este 45°
C. en dirección opuesta a sus compañeros y usted.
15.Use pinzas para manejar recipientes calientes.
16.No utilice la boca para pipetear sustancias químicas, use una perilla.
17.En caso de quemaduras, avise al encargado de laboratorio o a su profesor.
18.Siempre deje limpia su mesa de trabajo y lave el material que utilizo con
agua y jabón, con un enjuague final con agua destilada.
19.Cuando utilice aparatos especiales, entréguelos limpios.
20. Entregue el material, reactivos y equipos.
21.Al concluir la practica quítese la bata y lávese las manos.
MANEJO DE EQUIPO Y CRISTALERIA.
a. Cerciórese que la cristalería este limpia y sin daño al recibirla.
b. Si va a aplicar calor a la cristalería, revise que sea tipo Pyrex.
10
c. Si usted daño cristalería, debe inmediatamente informarlo al encargado de
laboratorio.
d. Toda la cristalería se lava con jabón y los tubos de ensayo se colocan en la
gradilla boca abajo.
e. No utilice termómetros como agitadores.
f. Utilice espátulas limpias para recoger los reactivos sólidos.
g. Limpie los goteros y las pipetas antes de usarlas para evitar
contaminaciones.
h. Cuando tenga que utilizar equipos de los cuales desconozca su
funcionamiento pregunte al profesor.
MANEJO DE REACTIVOS.
i. Antes de usar un reactivo químico lea cuidadosamente la etiqueta, este le
indica nombre, formula, concentración. Tome lo que necesita y cierre el
recipiente.
ii. No use ningún reactivo que no posea etiqueta.
iii. Mantenga los reactivos en el lugar indicado por su profesor. Los ácidos y
base fuertes manténgalos alejados de su mesa de trabajo.
iv. Para medir volúmenes de ácidos y bases concentrados, use probetas o
buretas. Nunca pipetas.
v. Al usar reactivos evite tocarse los ojos o la boca.
vi. Mucho de los solventes que se utilizan en laboratorio son flamables, entre
ellos están el metanol, la acetona, el éter y el hexano. Por ello deben
mantenerse lejos de mecheros encendidos y deben de manejarse en
campanas de extracción de vapores.
vii. Los ácidos y base fuertes deben de manejarse en campanas de extracción
de vapores.
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viii. Al verter al drenaje ácidos y bases fuertes deje correr mucha agua para
diluirlos.
ix. No vacié al drenaje material insoluble como grasas, ceras, vidrios, etc.
x. Si se derramara cualquier reactivo sobre su piel u ojos, avise de inmediato
a su profesor.
xi. No introduzca pipetas, goteros o cualquier otro objeto en los reactivos,
salvo los que este utilizando para evitar contaminación.
xii. No mezcle el contenido de varios tubos a menos que lo indique el
procedimiento, puede causar explosiones, calentamiento o vapores tóxicos.
xiii. Vierta la solución concentrada en la menos concentrada para evitar
reacciones violentas.
xiv. Si se produjera derrame de sustancias volátiles, apague mecheros y equipo
y limpie el área.
xv. Lee las etiquetas de los reactivos para ver si es toxico, inflamable, irritante o
corrosivo.
Riesgo biológico
PREPARACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO:
La mesa de trabajo debe ser con cubierta de acero inoxidable, o cualquier material
plástico resistente al calor, humedad y corrosión, la cual debe mantenerse limpia y
12
en buen estado de conservación. Contar con suficiente iluminación, natural o
artificial, sin reflejos molestos sobre el analista. Sin objetos sobre de ella que
vayan de ninguna manera intervengan en el trabajo.
Distribuir los materiales dentro del área de trabajo en tal forma que el movimiento
del material se realice de izquierda a derecha y siempre dentro del espacio
suficiente para realizar las maniobras con fluidez. Al concluir la última actividad en
la mesa de trabajo, proceder a su limpieza.
El analista estará provisto de bata manga larga, limpia y en buen estado. Bajo
ninguna circunstancia fumar, masticar o hablar en tanto se realiza el trabajo.
Criterios de Calificación
Parte practica:
13
Se evaluara la asistencia a la práctica (es necesario asistir para poder reportar).
Diagrama de flujo
Reporte de práctica
Formato de reporte de practica
El reporte de la práctica se realizará en forma de artículo científico eligiendo como
modelo alguna revista de micología y debe de contener lo siguiente:
Titulo
Resumen
Introducción
Material y métodos
Discusión
Conclusión
Bibliografía
Cuestionario.
Practica No. 1. Toma de muestras clínicas para el diagnostico de micosis
cutáneas ó superficiales (dermatofitosis).
Objetivo
14
Conocer y realizar las diferentes técnicas de la toma de muestras para el
diagnóstico micológico en pacientes con infecciones causadas por dermatofitos.
Introducción
Para determinar el agente causal de las infecciones causadas por hongos es
necesario realizar estudios de laboratorio que orienten la búsqueda y aislamiento
del hongo implicado. Para ello se requiere de la toma de muestra clínica.
La confiabilidad de los resultados que se obtienen, a partir de los procedimientos
de laboratorio para el diagnóstico micológico, dependerá en gran parte de la toma
adecuada de la muestra biológica. La muestra biológica debe ser abundante y la
técnica de toma, se elegirá de acuerdo con el tipo de micosis por investigar.
Los dermatofitos son un grupo de hongos queratinofílicos, pero su presencia en la
piel y anexos (uñas, pelo) no siempre implica enfermedad. Son organismos
microscópicos adaptados a la vida parasitaria, de distribución mundial, según su
adaptación pueden ser geófilicos, zoófilicos y antropófilicos
Los dermatófitos constituyen un conjunto de hongos filamentosos superiores con
actividad queratinolítica y capacidad para parasitar la piel y las faneras de los
animales y el hombre. Son patógenos primarios. Pertenecen a tres géneros:
Epidermophyton (E. floccosum), Microsporum (M. canis, M. gypseum y otras) y
Trichophyton (T. mentagrophytes, T. interdigitale, T. rubrum).
Material
Cajas Petri de vidrio estéril
Guantes de látex estériles
Rollos de cinta transparente adhesiva.
15
Tijeras
Portaobjetos
Gotero
Mechero
Cuadritos (8X8 cm) de Papel filtro estériles
Mangos de bisturí con hoja.
Asas micológicas.
Cuadros de alfombra “moqueta” estéril de 5 cm por lado.
Cajas Petri con Saboraud simple
Cajas Petri con Saboraud más antibiótico (mycosel).
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Reactivos
Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%.
Equipo
Microscopio óptico
Procedimiento
Para la toma de muestra del material biológico en uñas, realizar un raspado muy
del área afectada con ayuda de un bisturí, el cual, previamente ha sido pasado a
la flama y dejado enfriar cerca de la flama. La toma de material se realizará
colocando la punta del bisturí por debajo de la lámina ungueal y raspando
firmemente; tratando de llegar al límite entre la zona sana y la afectada visualizado
clínicamente. Las escamas obtenidas colocarlas en cajas Petri de vidrio estéril.
Para la toma de muestra de escamas provenientes de piel, realizar un raspado
muy cuidadoso de la misma forma que se realizo el anterior. También, en este
caso tomar escamas por medio de la técnica de la cinta adhesiva y pegar la cinta
sobre el portaobjeto.
16
Para la toma de muestra de escamas provenientes de piel cabelluda, es necesario
frotar intensamente el área afectada con la “moqueta”, dejando caer las escamas
en caja Petri de vidrio estéril.
Envolver la caja Petri con papel estraza y etiquetar (fecha y lugar, sexo, edad y
zona corporal que procede la muestra).
Realizar prueba de KOH: en un portaobjeto colocar una gota de KOH al 15% y
sobre está colocar las escamas. Colocar el cubreobjetos y pasar la preparación
por la flama del mechero 3 veces. Dejar reposar por 5-10 minutos. Observar al
microscopio con los objetivos de 10X y 40X las preparaciones; buscando las
estructuras fúngicas que caracterizan una muestra positiva al examen directo con
KOH. Inocular las muestras positivas en placas con Saboraud simple y en placas
con Saboraud más antibiótico (Mycosel). Incubar a temperatura ambiente durante
5-15 días. Observar consecutivamente la aparición de colonias y transferir cada
una de ellas a placas nuevas con Saboraud simple o Mycosel, dependiendo de la
procedencia de la colonia.
Cuestionario
1. Describir otra técnica empleada en la toma de muestra clínicas procedentes de
micosis.
2. ¿Cuál es la importancia de realizar una buena toma del material biológico para
el diagnostico de micosis?
3. ¿Cuáles son las características a observar en un examen directo con KOH en
las preparaciones realizadas a partir de escamas de piel y sus anexos?
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4. Postula una nueva técnica útil para la toma de material biológico procedente de
micosis superficiales o sistémicas. También puedes modificar las ya existentes y
explicar en qué consiste dicha modificación. En ambos casos explica los
beneficios y perjuicios de dicha técnica.
Bibliografía
Arenas R. 2002. Dermatofitosis en México. Rev. Iberoamericana Micológica. 19:
63-67.
Arano M. y Castañeda E. 2003. Micosis humanas. Procedimientos diagnósticos.
Exámenes directos. 2ª edición. Instituto Nacional de Salud. Colombia.
Kane J., Summerbell R., Singler L., Krajden S. y Land G. 1997. Laboratory
Handbook of Dermatophytes. A clinical Guide and Laboratory of Dermatophytes
and other filamentos fungi from. Publishing company.
Koneman EW y Roberts GD. 1992. Micología practica de laboratorio. 3a edición.
Editorial Médica Panamericana. Argentina.
López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón-
Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de
laboratorio. 2ª edición. Trillas. México.
Practica No.2. Primoaislamiento de hongos patógenos de humano a partir de
muestras biológicas infectadas.
Objetivo
18
Obtener cultivos puros de agentes infecciosos causantes de micosis de
importancia medica.
Introducción
Para el diagnóstico de laboratorio se realizan examen directo o frotis y cultivo a
partir de la muestra biológica. Los hongos crecen bien en medios artificiales y
tienen requerimientos nutritivos simples, una fuente de carbono orgánico,
generalmente en azúcar, y de nitrógeno suelen ser los elementos suficientes para
obtener un buen crecimiento. Junto a ellos, un soporte sólido, el agar, permite a
los hongos filamentosos el desarrollo del micelio aéreo, donde se localizan las
estructuras reproductoras y el desarrollo de colonias en el caso de las levaduras.
El medio de cultivo más utilizado para los hongos es el medio de Saboraud, que
reúne estas características y un pH de 5.6, que dificulta el crecimiento bacteriano.
La adición al medio de antibióticos como el cloranfenicol o la gentamicina, que
inhiben el crecimiento de las bacterias contaminantes, o antifúngicos especiales
(como la actidiona o cicloheiximida) que inhiben el crecimiento de muchos hongos
no patógenos, transforman al medio de Saboraud en un medio más selectivo. Los
medios de cultivo después de sembrados, se incuban en condiciones aerobias y la
temperatura óptima suele ser 25-30 ºC para los agentes de micosis superficiales y
los oportunistas y de 35-37ºC para los que producen infecciones profundas. Los
hongos levaduriformes dan lugar en 24-48 horas a colonias de aspecto y
morfología similar a las bacterianas. El desarrollo de las colonias de los hongos
filamentosos es mucho más variable; algunos crecen muy lentamente, pero sus
colonias son muy características y en general se diferencian fácilmente de las
levaduras.
Material
Guantes de látex estériles
Rollos de cinta transparente adhesiva.
Tijeras
19
Portaobjetos
Gotero
Mechero
Mangos de bisturí con hoja.
Asas micológicas.
Cajas Petri con Saboraud simple
Cajas Petri con Mycosel.
Parafil
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Reactivos
Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%.
Equipo
Microscopio óptico
Procedimiento
Inocular en medio de Saboraud las muestras biológicas positivas al examen
directo con KOH al 15%. Incubar a temperatura ambiente durante 5-15 días hasta
observar el crecimiento de colonias fúngicas.
Trasferir cada una de las colonias obtenidas en una nueva placa con medio de
Saboraud y otra placa con Saboraud adicionada con cicloheximida. Incubar
durante 1-8 días, hasta observar una colonia de crecimiento definido.
Sellar con parafil la orilla de la caja Petri de los cultivos puros obtenidos y guardar
en refrigeración dichas muestras.
Cuestionario
20
1. ¿Qué es un cultivo puro?
2. ¿Cuál es la finalidad de contar con un cultivo puro en un laboratorio de
micología médica?
3. ¿En que difieren los cultivos de hongos filamentosos al de hongos
levaduriformes?
4. ¿Porque el primoaislamiento de hongos patógenos de humano en medios de
cultivo en Saboraud se realiza en placas con y sin antibiótico?
Bibliografía
Arango M. y Castañeda E. 2003. Micosis humanas. Procedimientos diagnósticos.
Exámenes directos. 2ª edición. Instituto Nacional de Salud. Colombia.
Cabañes J. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Revista Iberoamericana
de Micología. ISBN: 84-607-3050-6.
López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón-
Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de
laboratorio. 2ª edición. Trillas. México.
Koneman E. y Roberts G. 1992. Micología practica de laboratorio. 3a edición.
Editorial Médica Panamericana. Argentina.
Practica No.3. Morfología macroscópica y microscópica colonial de hongos
filamentosos causantes de micosis.
Objetivo
21
Analizar y observar la morfología fúngica a nivel macroscópica y microscópica
para identificar a nivel de genero el agente etiológico de micosis causadas por
hongos filamentosos.
Introducción
La identificación rutinaria de hongos patógenos en el laboratorio de micología se
basa fundamentalmente en criterios morfológicos, macroscópicos y microscópicos.
Por ello, el diagnóstico de micosis incluye la identificación del agente causal,
mediante el uso de medios de cultivo.
A partir del cultivo se observa y analiza las características de la colonia, lo que
permite orientar el procedimiento de laboratorio para la identificación del hongo.
Debe de reconocerse si el hongo aislado es una levadura u hongo filamentoso
(hialino o dermatiaceo).
Los hongos filamentosos se identifican a nivel de género especie por la morfología
del micelio, pero sobre todo por las características microscópicas de sus esporas
asexuadas y los elementos que las originan. Para conseguir la producción de
esporas a veces se requieren medios de cultivo especiales que facilitan la
esporulación. Las estructuras reproductoras asexuadas (conidioforos) son muy
frágiles y para poder observarlas al microscopio sin distorsionarlas o destruirlas se
emplean técnicas especiales (microcultivo). Los hongos no esporulados (micelio
estéril) son difícilmente identificables.
Material
Guantes de látex estériles
Rollos de cinta transparente adhesiva.
Tijeras
22
Portaobjetos y cubreobjetos
Gotero
Mechero
Mangos de bisturí con hoja.
Asas micológicas.
Cajas Petri con Saboraud simple
Cajas Petri con Mycosel.
Parafil
Lupa
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Reactivos
Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%.
Frascos con azul de lactofenol.
Equipo
Microscopio óptico
Procedimiento
Observación macroscópica de hongos
1. Con el asa recta coger una pequeña cantidad de micelio y depositarlo, sin
extender la muestra, sobre la superficie del medio de cultivo de Saboraud. Repetir
23
la operación con cada uno de los distintos tipos de colonias fúngicas que se
analicen. Incubar las placas entre 5-7 días a 20-25 ºC.
2. Con la lupa observar y anotar las siguientes características: a. tipos de colonias
fúngicas; b. grado de crecimiento; c. aspecto de las colonias: forma, textura
superficial y color; d. formación y tipo de exudado; e. producción de pigmentos y f.
olor.
Observación microscópica de hongos.
1. Partiendo de una colonia de hongos de un cultivo puro y utilizando un asa de
micología ó bien un asa de picadura, colocar en la punta un pedazo de cinta
adhesiva y con mucho cuidado colocarla sobre la colonia.
2. El fragmento de cinta, con mucho cuidado colocarlo sobre un portaobjetos, el
cual previamente se ha colocado una gota de azul de lactofenol.
3. Colocar un cubre y absorber con papel de filtro el exceso de colorante.
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la función del azul de lactofenol en la preparación?
2. ¿Cuáles son las características taxonómicas macroscópicas y microscópicas
para identificar en los hongos filamentosos?
3. Menciona y describe otras técnicas empleadas en la identificación de hongos
patógenos de humano diferente a la taxonómica.
Bibliografía
Cabañes F. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Revista Iberoamericana
de Micología. ISBN: 84-607-3050-6.
24
Fernández R., Segundo C., Arenas R., Silva D. y Guzmán A. 2002. Determinación
de las variedades de Trichophyton mentagrophytes en10 casos de dermatofitosis
de Paraguay. Bioquímica 27: 41-45.
Ballesté R., Fernández N., Mousqués N., Xavier B., Arteta Z., Mernes M. y
Gezuele E. 2000. Dermatofitosis en población asistida en el Instituto de Higiene.
Revista Medica Uruguay 16: 232-242.
Practica No. 4. Identificación de hongos dermatofitos patógenos de humano.
Objetivo
25
Identificar las estructuras taxonómicas claves en la identificación de hongos
causantes de micosis superficiales
Introducción
Las lesiones epidérmicas causadas por dermatofitos son eritematosas, vesiculares
o hiperqueratósicas, más o menos inflamatorias dependiendo del paciente. Los
cabellos y las uñas cuando se afectan son frágiles por lo que se fragmentan con
facilidad. Estas lesiones, son el resultado conjunto de la invasión del estrato
córneo por el hongo, la liberación de sus productos metabólicos, algunos con
propiedades antigénicas y enzimáticas (queratinasas, colagenasas, elastasas), así
como de la respuesta inflamatoria del hospedero, expresada en la epidermis y la
dermis.
El mecanismo de infección es por contacto directo con el agente infeccioso,
aunque se requiere de ciertas condiciones que favorezcan su desarrollo, como la
humedad, el calor y la maceración local. La intensidad de la enfermedad depende
de la cepa o las especies de dermatofito y de la sensibilidad del huésped al hongo
en particular, así como la idiosincrasia de cada huésped. Cuando una o más
esporas se depositan en la capa cornea, penetran en ella, desarrollando
filamentos hialinos y septados. En general los artroconidias del hongo germinan y
dan lugar a la formación de hifas y las lesiones se inician como una ámpula
eritematosa.
Los hongos causantes de dermatofitosis pertenecen a tres géneros:
Epidermophyton (E. floccosum), Microsporum (M. canis, M. gypseum y otras) y
Trichophyton (T. mentagrophytes, T. interdigitale, T. rubrum).
Material
Guantes de látex estériles
Rollos de cinta transparente adhesiva.
Tijeras
26
Portaobjetos y cubreobjetos
Gotero
Mechero
Mangos de bisturí con hoja.
Asas micológicas.
Cajas Petri con Saboraud simple
Cajas Petri con Mycosel
Lupa
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Reactivos
Frascos con hidróxido de potasio (KOH) a 15%.
Frascos con azul de lactofenol.
Equipo
Microscopio óptico
Procedimiento
Observación macroscópica de hongos
27
1. Con el asa recta coger una pequeña cantidad de micelio y depositarlo, sin
extender la muestra, sobre la superficie del medio de cultivo de Saboraud. Repetir
la operación con cada uno de los distintos tipos de colonias fúngicas que se
analicen. Incubar las placas entre 5-7 días a 20-25 ºC.
2. Con la lupa observar y anotar las siguientes características: a. tipos de colonias
fúngicas; b. grado de crecimiento; c. aspecto de las colonias: forma, textura, borde
de la colonia, superficial y color; d. formación y tipo de exudado; e. producción de
pigmentos.
Observación microscópica de hongos mediante técnica de cinta adhesiva
1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola
únicamente por los extremos.
2. Cerca del mechero se abre la caja y se presionar cuidadosamente la cinta
transparente sobre la periferia de la colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol,
previamente colocado en el centro del portaobjetos. La cinta funcionará como
cubreobjetos por lo que se deberá aplanar cuidadosamente, evitando la formación
de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con
los objetivos 10X y 40X.
Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos,
esporangióforos, esporangiolos, rizoides, etc., que ayuden a la identificación
taxonómica.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la utilidad del uso de hidróxido de potasio a 15% en un examen directo
de uñas o cabellos en la búsqueda de dermatofitos?:
28
2. Describe las colonias obtenidas en las placas y menciona si consideras que se
trata de hongos dermatofitos y porque.
3. Describe las lesiones humanas originadas por dermatofitos en el cuerpo
humano.
4. ¿Cuáles son las características taxonómicas macroscópicas y microscópicas
para identificar los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton?.
Bibliografía
Arenas R. 2002. Dermatofitosis en México. Rev. Iberoamericana Micológica. 19:
63-67.
Arano M. y Castañeda E. 2003. Micosis humanas. Procedimientos diagnósticos.
Exámenes directos. 2ª edición. Instituto Nacional de Salud. Colombia.
Cabañes F. 2001. Identificación de hongos dermatofitos. Asociación Española de
Micología. Pfizer. Revista Iberoamericana de Micología. 84:607-610.
Rubio M., Rezusta A., Gil J. y Ruesca B. 1999. Perspectiva micológica de los
dermatofitos en el ser humano. Revista Iberoamericana Micología16: 16-22.
Practica No. 5. Métodos de conservación de hongos patógenos.
Objetivo
29
Conocer los principales métodos de conservación empleado en las cepas de
hongos filamentosos.
Introducción
La conservación de organismos es una estrategia principal para la preservación de
la especies. Para evitar la degeneración y el envejecimiento de las cepas es
necesario preservarlas adecuadamente y retardar, hasta donde sea posible, los
cambios degenerativos normales que ocurren en las células. La declinación de las
características deseables de una cepa, se han atribuido a diferentes factores que
actúan en el almacenamiento de la misma, tales como: carencia o agotamiento de
los nutrientes en el medio de cultivo; acumulación de secreciones tóxicas propias
del metabolismo del hongo; alteración del pH en el medio (acidez o alcalinidad);
disminución en la concentración de oxigeno y la consecuente acumulación de C02.
Entre los diversos procedimientos de conservación utilizados para hongos, se
destacan como favoritos el cultivo periódico en cuñas en agar, bajo aceite mineral,
conservación de esporas en tierra, arena o silica gel, cepas liofilizadas,
congelación en nitrógeno liquido y en agua destilada. Se pueden resumir estos
métodos agrupándolos en tres apartados, que son: Métodos de elección o de
conservación a largo plazo, mediano plazo y otros métodos.
La elección de los métodos tiene en cuenta varios factores, según sea el objetivo
de la colección así como la disposición de recursos destinados para tal finalidad.
Material
Guantes de látex estériles
30
Tijeras
Mechero
Mangos de bisturí con hoja.
Asas micológicas.
Cajas Petri con Saboraud simple
Cajas Petri con Saboraud más antibiótico.
Parafil
Micropipetas de 100 y 1000 microlitros
Puntas para ambas micropipetas
Gradilla para tubos eppendorf
Tubos eppendorf
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Agua destilada estéril
Reactivos
Glicerol al 10%
Procedimiento
Las cepas de hongos filamentosos cultivadas en placas de medio sólido
destinadas a la conservación se procederá de la forma siguiente: cortar una
porción de la colonia en cuadritos de 1mm x 1mm aproximadamente. Los
cuadritos de micelio colocarlos en glicerol (10%) y guardados a -80 °C en un
ultracongelador. También se almacenó a -20°C una copia de las cepas anteriores
en tubos con medio solido. Repetir este procedimiento para la conservación de
hongos levaduriformes.
En un tubo eppendorf con agua destilada estéril (1500 µl) suspender esporas del
hongo a conservar y guardar en refrigeración.
31
Cuestionario
1. ¿Cuál es la importancia de la preservación de cepas fúngicas en el laboratorio
de micología medica?
2. Menciona y explica otros métodos de conservación utilizados en la preservación
de cepas de hongos patógenos.
3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la preservación de cepas de hongos
en aceite, como glicerol?
Bibliografía
Kane J., Summerbell R., Singler L., Krajden S. y Land G. 1997. Laboratory
Handbook of Dermatophytes. A clinical Guide and Laboratory of Dermatophytes
and other filamentos fungi from. Publishing company.
Koneman EW y Roberts GD. 1992. Micología practica de laboratorio. 3a edición.
Editorial Médica Panamericana. Argentina.
López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón-
Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de
laboratorio. 2ª edición. Trillas. México.
Practica No.6. Identificación de hongos levaduriformes
Objetivo
32
Conocer el procedimiento micológico empleado en la identificación de hongos
levaduriformes.
Introducción
Entre los hongos levaduriformes los géneros más importantes en patología son
Candida y Cryptooococcus, ambos de distribución universal. Las infecciones por
cándida son, junto con las causadas por los dermatófitos, las infecciones fúngicas
más frecuentes.
Candida es un hongo dimórfico comensal del cuerpo humano y reside en las
mucosas, tubo digestivo, aparato respiratorio alto y piel del hombre y otros
animales vertebrados, así como en detritus y alimentos. Sin embargo, pueden
producir infecciones por un factor predisponente local o general, por lo que puede
considerarse sin error grave a Candida como un género oportunista. En tejido
parasitado por este hongo se observan levaduras con seudomicelio y micelio
verdadero. El género Candida está formado por diversas especies (C. albicans, C.
tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii y otras). Presentan una forma
ligeramente ovalada y un tamaño de 2 a 4 μm por 3 a 7μm 5. Las especies de
Candida crecen bien en medios bacteriológicos usuales y en el medio de
Sabouraud. Entre las 48-72 horas dan lugar a colonias macrocópicamente visibles.
Los hongos levaduriformes se identifican mediante pruebas metabólicas, de modo
semejante a las bacterias. La identificación de las levaduras se realiza con el
estudio macro y micromorfológico de las colonias y para establecer el diagnóstico
de especie se requieren otras pruebas morfológicas adicionales (clamidosporos y
tubos germinales) y pruebas bioquímicas (asimilación de hidratos de carbono,
degradación de la urea, asimilación de inositol, entre otras).
Material
Cubreobjetos y portaobjetos
33
Asas bacteriológicas
Placas de agar Saboraud
Placas de agar de Malta
Mechero
Pinzas estériles
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Material Biológico
Cultivo de levaduras
Reactivos
Lugol
Cristal violeta
Safranina
Equipo
Microscopio óptico
Procedimiento
Observación macroscópica de levaduras
34
1. Dividir una placa de agar Saboraud en dos zonas.
2. Sembrar en estría por agotamiento, cultivos frescos de levaduras. Lectura de
resultados en el microscopio. Utilizar el objetivo que resulte más adecuado
partiendo siempre del de menor aumento.
4. Realizar una tinción Gram para cada levadura (Gram positiva):
Tinción de Gram
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto
2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el
exceso de colorante.
3. Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el portaobjeto con 2 gotas de lugol por
30 segundos.
4. Lavar cuidadosamente el frotis con agua.
5. Inclinar el portaobjetos y aplica gota a gota el decolorante dejando que escurra
hasta que no fluya más la tintura. Inmediatamente lavar con agua.
6. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.
7. Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso con una toalla
de papel y dejar secar al aire.
Observación microscópica de levaduras
35
1. Inocular una placa de agar de malta mediante estrías por agotamiento.
Tomando una pequeña parte de una colonia aislada de la levadura se realizan
estrías en tres zonas de la placa, sin retomar nuevo inoculo entre una y otra; de
este modo habremos dispuesto un inoculo decreciente máximo en la zona 1 y más
escaso en la zona 3. Es importante, con vistas a la colocación de la placa en el
microscopio para su observación, que el inoculo quede separado
aproximadamente 15 mm del borde de la placa.
2. Colocar un cubreobjetos estéril las zonas inoculadas. Si los cubreobjetos se
esterilizan a la llama, asegurarse de que estén totalmente fríos antes de su
colocación.
3. Incubar a temperatura ambiente y en la oscuridad (o bien a 28-30 ºC en estufa
de cultivos durante 48 h). Reincubar 24 h. más si fuese necesario.
4. Observación microscópica: micelio, blastosporas.
a. Situar la placa sin tapa sobre la platina del microscopio.
b. Realizar la observación con objetivo 10X. Realizar el enfoque y posteriores
manipulaciones con mucha precaución, evitando tocar el cubreobjetos o los
bordes de la placa con el objetivo. Desplazar la placa manualmente para recorrer
otras zonas.
Cuestionario
1. ¿Qué muestras biológicas se deben tomar para confirmar el diagnóstico de
candidosis cutánea?:
2. ¿Qué exámenes de laboratorio solicitaría para confirmar el diagnóstico de
candidosis diseminada o sistémica?:
3. Anote tres pruebas de laboratorio que sirvan para determinar las especies de
Candida:
4. ¿Cuál es la diferencia entre micelio y pseudomicelio?
Bibliografía
36
Aguirre J. 2002. Candidiasis orales. Rev. Iber. Mic. 19: 17-21
Ballesté R, Salvatella R. 2004. Manual de toma de muestra para estudio
bacteriológico, parasitológico y micológico. Selección, recolección, conservación y
transporte. Montevideo: Departamento de Laboratorio Clínico. Hospital de
Clínicas. Facultad de Medicina.
Mendoza M. 2005. Importancia de la identificación de levaduras. Rev. Soc. Ven.
Microbiol. 25: ISSN 1315-2556.
Practica No.7. Aislamiento del agente causal de mucormicosis (cigomicosis).
37
Objetivo
Aislar e identificar a hongos causantes de mucormicosis a partir de sustratos
orgánicos colonizados usualmente por estos hongos.
Introducción
La cigomicosis se caracteriza por un cuadro agudo rinocerebral o pulmonar que se
asocia con invasión vascular, trombosis e infartos. Ocurre principalmente en
pacientes diabéticos descompensados y en individuos inmunocomprometidos,
como aquellos con trasplante de órganos. Es una enfermedad causada por
hongos oportunistas de la clase Zygomycetes, orden Mucorales de los géneros
Mucor, Rhizopus, Rhizomucor y Absidia.
El diagnóstico de laboratorio se hace con el examen directo y/o estudio
histopatológico donde se observan hifas cenocíticas. Los hongos involucrados en
esta enfermedad crecen rápidamente (48-72 horas) en el medio Saboraud dando
lugar a colonias características. Su identificación como zigomicetos es
relativamente fácil, por su micelio ancho no tabicado y presencia de esporas
asexuadas internas; pero su adscripción precisa a un género y aun más a una
especie es en ocasiones muy difícil.
Las muestras biológicas útiles son: secreción nasal, bucal, ocular, expectoración,
lavado bronquial y fragmentos de tejido.
Material
38
Microscopio compuesto
Placas con medio de Saboraud
Pinzas
Aguja de inocular en forma de “L”
Lámpara de alcohol
Portaobjetos y cubreobjetos
Botellas de azul lactofenol
Papel toalla (papel absorbente)
Desinfectante (Lysol®)
Asa bacteriológica
Procedimiento
Traer pan y fruta en procesos de colonización por hongos (dejar 8-10 en proceso
de descomposición).
Realizar una preparación con azul de lactofenol mediante la técnica de cinta
adhesiva, en las regiones de micelio oscuro que ha invadido el pan. Observe
primero bajo el microscopio. Al mismo tiempo tomar un fragmento de micelio de la
región donde se realizo la preparación anterior, e inocular en placas con agar de
Saboraud. Incubar a temperatura ambiente hasta observar la presencia de
colonias. Etiquetar.
Las preparaciones con caracteres taxonómicos correspondientes a Rhizopus,
analizar la morfología colonial en el cultivo y describirla.
Cuestionario
39
1. Observe ahora la laminilla preparada de Rhizopus y compárela con la que usted
preparó. Localice e identifique de nuevo las hifas, el micelio y los esporangios.
2. Observe también la laminilla preparada de conjugación de Rhizopus y trate de
encontrar diferentes etapas de formación de una cigoespora.
3. ¿Cómo se forma una cigoespora?. ¿Estás esporas son de reproducción sexual
o asexual
Bibliografía
Torres T., Araiza J., Sánchez V. y Arellano A.2007. Mucormicosis por Rhizopus
azygosporus en paciente con diabetes mellitus tipo 2 y bocio tóxico difuso.
Reporte de 1 caso. Revista de Endocrinología y Nutrición. 15:109-114.
Carrada T. 2007. Mucormicosis rinorbital: relación clínico-radiológica,
histopatología y tratamiento. Med Int Mex. 23:256-60.
Torres-Narbona M., Guinea J. Muñoz P. y Bouza E. 2007. Zigomicetos y
zigomicosis en la era de las nuevas terapias antifúngicas. Rev Esp Quimioterap,
20: 375-386.
Practica No. 8. Técnica de microcultivo para la identificación de hongos
patógenos de humanos.
40
Objetivo
Observación de estructuras fúngicas de valor taxonómico necesarias para la
identificación de hongos patógenos mediante la creación de laminillas.
Introducción
La técnica de microcultivo es un buen método que permite la identificación de
hongos de importancia médica; mediante la observación de estructuras
características presentes en las diferentes cepas fúngicas.
Cuando el crecimiento ya está presente en el medio de cultivo primario, los
fragmentos miceliales son transferidos a un microcultivo. El microcultivo permite
observar al hongo mientras se está desarrollando, promueve la esporulación y nos
permite observar al microscopio estructuras reproductoras asexuales
(conidióforos) que son muy frágiles sin distorsionarlas ni destruirlas. Se
recomiendan dos medios para el microcultivo: harina de maíz con 1% de glucosa,
a fin de estimular la producción de pigmento de T. rubrum, y agar dextrosa de
Saboraud (ADS) para poder ver la morfología normal de la disposición de los
conidios y de los apéndices micélicos.
El microcultivo de hongos filamentosos se realiza al inocular el hongo sobre los
bordes de un cuadrito pequeño de agar. Luego se cubre con un cubreobjeto y se
incuba dentro de una cámara húmeda a 25 ºC. La incubación dependerá del
tiempo que demore el hongo en presentar sus estructuras reproductivas.
Para realizar el microcultivo de hongos levaduriformes; la levadura es sembrada
en estrías paralelas sobre agar maíz e incubado en cámara húmeda a 25 ºC, por
lo general entre 2 a 3 días. Cada especie presenta características
micromorfológicas particulares que permiten orientar y confirmar el diagnóstico a
nivel de especie. Entretanto, no se debe emplear como única técnica de
diagnóstico, generalmente se realiza en paralelo con las pruebas bioquímicas.
Material
Papel filtro (Whatman No.1)
41
Pinzas
Mango de bisturí con hoja
Placas de Saboraud
Placa de agar de medio estandar (PDA)
Mechero
Barniz transparente de uñas
Caja Petri de vidrio estéril
Triangula de vidrio
Asa bacteriológica
Portaobjetos y cubreobjetos
Matraz Erlenmeyer de 1000 ml
Papel absorbente
Pipetas Pasteur con bulbo de hule
Reactivos
Azul de lactofenol
Glicerol al 10%
Solución de lactofenol sin colorante
Equipo
Microscopio óptico
Procedimiento
Parte 1.
42
1. En una caja Petri colocar un triángulo de vidrio con la ayuda de pinzas.
2. Sobre el triángulo colocar un portaobjetos
3. Sobre el portaobjetos, colocar un bloquecito de agar de medio estandar (PDA), previamente preparado, de 1 X 1 cm.
4. De cada cepa, sembrar por piquete en las cuatro caras iguales del bloquecito de agar.
5. Una vez inoculado, colocar un cubreobjetos sobre éste
6. Adicionar 10 ml de Glicerol al 10% a la base de la caja Petri, teniendo cuidado de no tocar el portaobjetos.
7. Tapar la caja e incubar a la temperatura y tiempo necesarios para su crecimiento
Parte 2.
Preparación de la muestra
1 .A partir de los microcultivo previamente obtenidos, se quita el cubreobjetos con unas pinzas y se lleva a tinción.
2.- Se desecha el bloquecito de agar y el portaobjetos usado se lleva también a tinción. Nota: Cuidando de no maltratar el crecimiento miceliar.
Tinción de la muestra
a).- Calentar 500 ml de agua destilada a ebullición en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml para producir el vapor que fijará la tinción.
b).- Colocar un papel filtro (Whatman No.1) sobre el micelio el cual deberá cubrir el área de crecimiento, tanto en el portaobjetos como en el cubreobjetos.
c).- Adicionar solución de azul de lactofenol por goteo sobre el papel hasta sólo humedecer.
d).- Exponer al calor de vapor de agua el portaobjetos y cubreobjetos durante 5 minutos aproximadamente (hasta que se liberen los primeros vapores de color).
43
e),- Se procede a hacer lavados con solución de lactofenol sin colorante, ésto con el objeto de desaparecer el exceso de colorante, el lavado se llevará a cabo hasta el momento en que no escurra colorante de la muestra.
9.- Cubrir la muestra teñida con un cubreobjetos o portaobjetos según sea el caso, evitando la formación de burbujas.
g).- Limpiar el exceso de solución con papel absorbente y aplicar una capa de barniz de uñas en la orilla de los portaobjetos con el fin de fijar la muestra y no dañar las estructuras.
h).- Una vez seco el barniz se procede a observar al microscopio óptico las diferentes estructuras de la cepa correspondiente y así identificar a qué género pertenece.
Cuestionario
1. ¿Qué es un microcultivo?
2. ¿Qué ventajas nos proporciona la técnica de microcultivo en el diagnostico de micosis?
3. ¿Consideras que el empleo de esta técnica es suficiente para identificar al agente infeccioso que este causando enfermedad en el paciente? ¿Por qué?
4. ¿Qué modificación harías en esta técnica para hacerla más eficiente en la identificación de hongos patógenos causantes de micosis?
Bibliografía
Rippon J. 1998. Micología Médica. Hongo y Actinomicetos Patógenos. 3ª edición.
Interamericana Mc Graw-Gill. México. Pág.259-261.
López-Martínez R., Méndez-Tovar L., Hernández- Hernández F., Castañón-
Olivares R. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnostico de
laboratorio. 2ª edición. Trillas. México.
ANEXOS
44
MEDIOS DE CULTIVO
Agar dextrososa de Sabouraud (ADS).
Composición:
Dextrosa 40.0
Peptona de Caseína 5.0
Digerido Pancreático de Tejido Animal 5.0
Agar Bacteriológico 15.0
pH 5.6 ± 0.2
Método:
Suspender 65 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación
suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Evitar el
sobrecalentamiento. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión)
durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en
placas Petri estériles.
Sabouraud más antibiótico (mycosel).
Composición:
Dextrosa 40.0 gr
Peptona de Caseína 5.0 gr
Digerido Pancreático de Tejido Animal 5.0 gr
Agar Bacteriológico 15.0 gr
pH 5.6 ± 0.2
Estreptomicina (0,5 gr/l)
Cicloheximida (0,5 gr/l).
Procedimiento:
45
Se prepara de igual forma al medio de Agar Dextrosa de Saboraud (ADS), con la
diferencia que después de esterilizarse y dejar enfriar se añaden soluciones de
antibióticos para hacerlos más selectivos, tales como estreptomicina (0,5 gr/l) y
cicloheximida (0,5 gr/l). Almacenar a 4 ºC.
Total a utilizar para los dos medios de cultivo anterior: Frasco con 450 gr de
medio de ADS
Almacenamiento: 2-30° C.
Caducidad: 5 años en frasco cerrado.
Placa de agar de medio estandar (PDA)
Composición:
Papa 200 gr
Dextrosa 10 gr
Agar 20 gr
Agua destilada 1000 ml
Procedimiento:
Pelar y cortar la papa en trozos pequeños. Disolver la dextrosa en agua y agregar los demás ingredientes. Hervir 30 minutos y filtrar con gasa. Completar el volumen. Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos. Repartir.
Total a utilizar: 2 papas medianas para preparar un litro.
Almacenamiento: 2-30° C.
Caducidad: 15 días.
Placas de agar malta
46
Composición:
Glucosa 10 gr
Extracto de malta 3 gr
Peptona 5 gr
Agar 20 gr
Agua destilada 1000 ml
Preparación:
Mezclar todos los ingredientes y calentar a fuego lento hasta hervir. Esterilizar la mezcla a 120 ºC durante 15 minutos.
Total a utilizar: preparar un litro.
Almacenamiento: 2-30° C.
Caducidad: 15-20 días.
Agar harina de maíz
Composición:
Harina de maíz 62,5 gr
Agua destilada 1500 ml
Tween 80 15 gr
Agar 19 ml
Procedimiento:
47
Disolver la harina de maíz en el agua destilada. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Filtrar a través de papel filtro y reconstituir el anterior volumen. Añadir el agar. Añadir el tween 80. Esterilizar a 120 ºC durante 20 minutos.
Total a utilizar: preparar un litro.
Almacenamiento: 2-30° C.
Caducidad: 20-30 días.
Agar Lactrimel de Borelli
Composición:
Harina de arroz 14 gr.
Leche esbeltes 14 gr.
Miel de abeja 7 gr.
Agar 14 gr.
Agua destilada 1000 ml
Procedimiento:
Mezclar todos los ingredientes y calentar a fuego lento hasta hervir. Esterilizar la mezcla a 120 ºC durante 15 minutos.
Total a utilizar: preparar 500 ml.
Almacenamiento: 2-30° C.
Caducidad: 20-30 días.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
48
Hidróxido de potasio
Composición
Hidróxido de potasio 10 gr
Agua destilada 100 ml
Procedimiento:
Mezclar para disolver totalmente el KOH. Guardar a temperatura ambiente en frasco de color ámbar. Se puede agregar glicerina al 10% para tener preparaciones de mayor duración reduciendo la evaporación. También se puede agregar dimetilsulfóxido (DMSO) al 40% para reducir o eliminar la necesidad de calentar el preparado.
Solución de lactofenol
Composición:
Solución A:
• Fenol (cristales) 20 gr
• Acido láctico al 87 % 20 gr
• Glicerina 40 ml
• Mezclar.
Solución B:
• Azul de algodón 0,05 gr
• Agua destilada 20 ml
Preparación:
49
1. Se calienta el agua y se añade el fenol previamente fundido, seguido del Acido láctico y de la glicerina.
2.- Solución azul de lactofenol
Se añade 0.05 % de azul de algodón (azul de metilo) a la solución de lactofenol, previamente preparada.
Mezclar las soluciones A y B. Conservar a temperatura ambiente hasta por seis meses.
Antibióticos
Stock: solución a) disolver cloranfenicol concentración 0.25 gr/ml en 10 ml de alcohol etílico 96 °C. Solución b) disolver cicloheximida concentración 0.5 gr/ml en 10 ml de agua destilada estéril. Mezclar a y b.
COLORACION Ó TINCIÓN DE GRAM
Solución de cristal violeta
Solución A
Cristal violeta 4,0 gr
Etanol 20,0 ml
Procedimiento:
Disolver el colorante en etanol y diluir la solución al 1:10 en agua destilada.
Solución B
Oxalato de amonio 0,8 gr
Agua destilada 80,0 ml
Procedimiento:
50
Disolver el oxalato en el agua destilada. Mezclar una parte de la solución A con
cuatro partes de la solución B.
Solución de yodo (lugol).
Yodo 1 gr
Yoduro de potasio 2 gr
Procedimiento:
Disolver el yodo y el yoduro en 5 ml de agua destilada y completar a un volumen
de 240 ml con agua destilada.
Glicerol al 10%
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL DE LABORATORIO
Cajas Petri de vidrio estéril 150 x 15 mm (20 piezas).
Cajas Petri de plástico 150 x 15 mm (200 piezas).
Rollos de cinta transparente adhesiva de 1 cm de ancho y de bollo pequeño (6
piezas).
Tijeras pequeñas (6 piezas).
Portaobjetos (una caja).
Cubreobjetos (una caja).
Gotero (6 piezas).
Mechero (6 piezas).
Papel filtro (Wtatman No1) 1 pliego de 50X50 cm
Magitel (1 paquete)
Mangos de bisturí con hoja (5 piezas).
Asas micológicas (6 piezas).
Cuadros de alfombra “moqueta” estéril de 5 cm por lado (15 piezas).
Micropipetas de 100 y 1000 microlitros (1 pieza de cada capacidad)
Puntas para ambas micropipetas (100 piezas)
51
Papel toalla (papel absorbente) (2 rollos).
Desinfectante (Lysol®) (2 frascos de 1 litro o 900 ml).
Gradilla para tubos eppendorf (1pieza).
Tubos eppendorf (100 piezas).
Parafil (1 rollo).
Lupa (5 piezas).
Bolsas de plástico de cierra fácil (Ziploc) 15X30cm aproximadamente (50 piezas).
Micropipetas de 100 y 1000 microlitros (1 pieza de cada medida).
Puntas para ambas micropipetas (100 piezas de cada medida).
Gradilla para tubos eppendorf (2 piezas).
Mechero (5 piezas).
Pinzas estériles (5 piezas).
Triangula de vidrio (6 piezas).
Matraz Erlenmeyer de 1000 ml (6 piezas).
Pipetas Pasteur con bulbo de hule (10 piezas con sus tapones respectivos)
Azul de lactofenol (6 frascos de 25 ml cada frasco).
Solución de lactofenol sin colorante (un frasco de 20 ml).
Glicerol al 10%
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Anexo de practica No.4.
Anexos de la práctica No.6
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