PRACTICA biologia - Instrumentacion Para La Investigacion

Manual de prácticas y talleres en Biología General - Universidad del Valle – Departamento de Biología F. Castro, C. Rosero, F. Rondón, - Enero 2006

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PRACTICA 1

INSTRUMENTACIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA

1. EL MICROSCOPIO COMPUESTO INTRODUCCIÓN

El Microscopio es un instrumento óptico que permite observar, medir y cuantificar objetos y organismos muy pequeños. El microscopio tiene dos propiedades importantes: El aumento y la resolución. El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos, es decir, la capacidad para percibir detalles. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo los veo como un solo punto borroso tendré menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos que distan de 0,5cm entre si. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras.

El poder de aumento se define como la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto. Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor que el tamaño real del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por ejemplo, si estamos utilizando un ocular de 10X y un objetivo de 45X, el aumento a que estamos viendo la preparación será: 1OX x 45X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces.

Existen diferentes tipos de Microscopios los cuales varían en su poder de resolución y aumento Los rangos aproximados de magnificación se encuentran entre 4X y 40X (Microscopio Estereoscópico), 20X-25X (Microscopio Simple o Lupa), 40X-1500X (Microscopio Compuesto), 10.000X-16.000X (Microscopio Electrónico), donde X es el número de veces que se aumenta el tamaño real del objeto. Además de estos existen algunos Microscopios especiales como los Microscopios de Contraste de Fase y los Microscopios Invertidos. Una comparación entre la forma como actúan los Microscopios Óptico, Electrónico de Transmisión y Microscopio Electrónico de Barrido. OBJETIVO El propósito del siguiente ejercicio es la adquisición de experiencia sobre el uso y cuidado del Microscopio. Así, podremos aprender; Primero: cómo disponer el Equipo para las observaciones; Segundo: los nombres de las diferentes partes del Microscopio y sus funciones; Tercero: la técnica de observar objetos y de preparar materiales para la


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observación, así como el ajuste y enfoque correctos; Finalmente, estudiaremos las formas de medir los tamaños de los objetos microscópicos. Al finalizar el Laboratorio Usted deberá haber adquirido destreza en el cuidado y uso del Microscopio. MATERIALES Cada estudiante debe traer: Láminas porta objetos Laminillas cubre objetos Bayetilla y papel toalla absorbente Suministrado por el laboratorio: Microscopio Papel milimetrado Papel periódico Papel de revista Aceite de inmersión PROCEDIMIENTO 1. Disposición del Microscopio: Al recoger El Microscopio tómelo con ambas manos, de tal forma que una lo sostenga por el Brazo, y la otra por debajo de la Base. Deposite o descargue el instrumento suavemente y oriéntelo de manera que el Brazo quede mirando hacia Usted. Enciéndalo y apáguelo con la menor intensidad lumínica; no mover ni golpear cuando este encendido. 2. Partes del Microscopio: Utilizando la figura 1. distinga los nombres de las distintas partes del Microscopio localizándolas en su propio aparato: Oculares, Objetivos, Revolver, Porta-Objetos, Diafragma-Iris, Condensador, Fuente de Iluminación, Base, Brazo, Platina, Carro Mecánico, Tornillo Macro y Micrométrico. Coloque el Objetivo de Menor Aumento (el más pequeño), haciendo rotar únicamente desde el revolver. Gradue la intensidad de luz reflejada y sea observable en el Condensador. Observe a través del Microscopio y ajuste el Diafragma, de manera que el Campo Visual se encuentre iluminado en forma homogénea. Si el Ocular o el Objetivo se encuentran empolvados o empañados, límpieles cuidadosamente con una porción de Papel Lente. NO USE en ningún caso, otro tipo de material para tal efecto. Si la visión no se aclara consulte al Instructor. 3. Preparación de Materiales: Los materiales para Observación Microscópica se colocan en una Lámina de Vidrio que generalmente es de 1" x 3 " y tiene el nombre de Porta-


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Objeto y/o Lámina y se cubren con Laminillas y/o Cubre-Objetos. Tanto éste como el Porta-Objetos deben estar ópticamente limpios, la limpieza del Porta-Objetos debe hacerse con agua y sosteniéndolo por los bordes y luego se frota suavemente con una Toalla de Papel Absorbente para secarlo. Los Cubre-Objetos son muy frágiles y por tanto deben manejarse con mucho cuidado, su limpieza debe hacerse en forma similar a la descrita antes teniendo así mismo el cuidado de no tocar la superficie con los dedos. Corte un cuadro de Papel Periódico que tenga unos 7 mm, que contenga la letra e. Colóquelo luego en el centro del Porta-Objetos con el lado derecho de la letra e hacía arriba. Ponga una gota de agua sobre el papel. Después de esperar unos segundos hasta que el agua haya empapado el papel, coloque la Laminilla o Cubre-Objetos sobre la preparación; evitando que queden burbujas de aire que pueden dificultar la observación. 4. Como enfocar El Microscopio: Coloque la preparación sobre la Platina en forma tal que el cuadro de papel quede justamente encima de la abertura y luego fije la Lámina mediante las Pinzas que hay en la Platina. Enfoque la letra e con la ayuda del movimiento de los Tornillos Macro , y Micrométricos. Es importante tener en cuenta que siempre que se haga una observación al Microscopio debe usarse en primer lugar el Objetivo de Menor Aumento. Describa la posición de la letra e (como es la imagen o su orientación) Mueva ahora la Lámina sobre la Platina de derecha a izquierda, mueva la Platina hacia delante o hacia atrás ¿en qué dirección se mueve la imagen?. Suba ahora el Tubo usando el Tornillo Macrométrico y rote el Revolver para cambiar a un Objetivo de Mayor Aumento (40X), enfoque nuevamente en forma lenta evitando quebrar la Lámina Porta-Objetos, conteste: ¿Ha cambiado la posición de la imagen con respecto a la observada con el Objetivo de Menor Aumento?, ¿Es el Campo de Observación mayor o menor?, ¿Es la Iluminación más o menos brillante que con el Objetivo de Menor Aumento?, Describa y compare lo observado en el Campo de Menor y Mayor Aumento. Retire la preparación cuidadosamente de la Platina y consérvela para observaciones posteriores. 5. Medidas Microscópicas: La Unidad de Longitud más frecuentemente usada en Microscopia es la micra o micrón “µ“que equivale a 1/1000 mm o 1/1’000.000 m. En los Laboratorios de Investigación se utiliza un instrumento, el Micrómetro o Retículo Micrométrico, sin embargo, es posible estimar el tamaño de los Objetos Microscópicos conociendo el diámetro del Campo correspondiente a cada Objetivo. Ejercicios: 1- Coloque un pedazo de papel milimetrado sobre la Platina de tal manera que al enfocar El Microscopio pueda observarlo, mida entonces el diámetro del campo correspondiente al objetivo de menor aumento en milímetros y su conversión en micras. También con los otros aumentos disponibles.


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2- Con el dato anterior es posible determinar el diámetro del Campo correspondiente a cualquiera de los Objetivos ópticos; se divide el diámetro encontrado por la razón entre las magnificaciones del Objetivo de trabajo y del Objetivo de menor aumento. Por ejemplo, sí el aumento del Objetivo de Mayor Aumento es de 100X y el otro es de 3.2 X, la razón mencionada será 100/3.2 =31.25 Si el campo correspondiente al objetivo de menor aumento tiene un diámetro de 1.500 µm, el diámetro del campo para el de mayor aumento es, de 1.500/31.25 = 48 µm. Calcule ahora el diámetro del campo correspondiente a todos los objetivos de su Microscopio, complete la información de la tabla en la pagina 18.

3- ¿Cuál es la dimensión de la letra e observada anteriormente en milímetros y en micras? 4- Monte ahora un pedazo de un grabado de una revista. ¿Cuántos puntos puede ver en el Campo del Objetivo de Menor Aumento?, ¿Qué distancia hay en promedio entre cada dos puntos? Este ejercicio proporciona un ejemplo del Poder de Resolución. Así, a “simple vista” solo podemos ver las diferentes densidades del grabado, mientras que con El Microscopio nos es posible distinguir puntos, es decir distinguimos o resolvemos los puntos.

Tabla de ejercicio, Completar en la siguiente tabla los datos correspondientes:

OCULAR

OBJETIVO

AUMENTO

DIAMETRO

mm

DIAMETRO

µm

RELACION

3.2X

10X

40X

100X


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BIBLIOGRAFÍA BINNGNG, G. & H. ROHRER . 1985. Microscopio de efecto de tunel. Investigación y Ciencia, Octubre de 1985. pág 30 HAWELLS, M.R. & J. Kirz , 1991. Microscopia de Rayos X. Investigación y Ciencia. Abril 1991. pág 52. LICHTMANN. J. W. 1994. Microscopia cofocal. Investigación y Ciencia, Octubre 1994, pág 20. MADER, SILVIA 2004. Biología (Capitulo 1 paginas 1 a 4) McGraw Hill

WICKRAMASINGHE, H. K . 1989. Microscopio de sonda de barrido. Investigación y Ciencia, Diciembre 1989. pág 28. UN VISTAZO A LA RED http//www.funsci.com/fun3_it/sfera/sfera.htm http//www.chem.uniroma1.it/~chemus/pagine_sito/strumenti/strum_VET_SIN/16_strumenti/Microscopio.htm http//www.terra.es/personal/manmig/pages/microsco.htm http//www.newnet.it/capecchi/microscopi.htm http//www.salonhogar.com/ciencias/Microscopio/micro1.htm http//www.macprof.macity.it/test/microscope.html http//www.csic.es/hispano/patrimo/micro1/microevo.htm http//www.usuarios.iponet.es/jan3d/Microscopio http//www.ncsa.uiuc.edu/Edu/Fracta1_Home.html http//www2.comune.bologna.it/bologna/malpighi/mostra/micro3.htm http//cuhwww.upr.clu.edu/biología/micro/portada.htm http//usuarios.iponet.es/jan3d/2000/ordenador/MICROSCOPIO/Microscopio.html http//micro.fa.uam.es/Laboratorio/Microscopio.html http//www.ips.it/scuola/concorso_99/acqua_1/microsc.html http://www.csic.es/hispano/patrimo/micro1/microele.htm http://www.shimadzu.com.br/analitica/esp/Productos/Microscopio/SS550.htm http://edafologia.ugr.es/OptMine/intro/microsc.htm http://www.aldeaeducativa.com/aldea/tareas2.asp?which=40 http://www.drpez.com/drmicro.htm http://www.crosswinds.net/~librostecnicos/comofunciona/comofunciona23.html http://www.monografias.com/trabajos/microscopio/microscopio.shtml


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Figura 1. Microscopio Compuesto


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ANEXO 1 El Microscopio _________________________________________________________________________

¿Cómo funciona? Partes del Microscopio óptico _________________________________________________________________________ Aunque como es lógico, la forma y partes de un Microscopio pueden variar y varían de un modelo a otro, existen unas partes comunes que aparecen representadas a manera de esquema en el dibujo adjunto y cuya definición pasamos a comentar: 1. Lente Ocular: Conjunto de lentes especializadas en aumentar la Imagen previamente formada por el objetivo. Puede desmontarse a intercambiarse por otros con diferentes aumentos o funcionalidades; agujas para señalar, retículos para recuento. 2. Cilindro o Tubo porta-ocular: Tubo por cuyo interior avanza la luz desde el Objetivo. En los modelos más antiguos se movía, mediante una Cremallera, para conseguir el enfoque de la muestra, cosa que hoy suele realizarse con la Platina. Hoy día suele estar sustituido por varias piezas entre las que se incluyen Prismas para conseguir el uso en una postura más cómoda. 3. Revolver: Mecanismo Giratorio en el que se pueden situar varios Objetivos de manera que se consigan diferentes aumentos. 4. Lente Objetivo: Conjunto de Lentes responsables de aumentar y resolver (distinguir las diferentes partes) el objeto a observar. 5. Muestra: Objeto a observar que se coloca sobre una Lámina de Cristal (Porta-Objetos) y bajo otra aún más fina (Cubre-Objetos) la muestra ha de ser tan fina que la luz la atraviese (transparente) por ello se hace imprescindible el uso de colorantes: Técnicas de Tinción. 6. Platina: Soporte de la muestra. Puede moverse mediante Tornillos de Enfoque Grueso (Macrométrico) o Fino (Micrométrico). 7. Condensador Conjunto de lentes que focalizan la luz sobre la muestra.


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8. Diafragma: Sistema para controlar la cantidad de luz que llega al objeto. De esta manera se puede controlar la definición que, en muchas ocasiones se consigue reduciendo intensidad de la luz.

Figura 2 Microscopio compuesto con aditamentos para monitor de televisión. Para usos didácticos y

alto detalle en investigación....


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Lecturas complementarias

INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA

La Espectroscopía en general se fundamenta en la radiación electromagnética emitida o absorbida por las sustancias, representa una de las herramientas más poderosas en el análisis químico por su sensibilidad, sus técnicas son rápidas y fáciles, permitiendo agilidad y eficiencia en el trabajo de rutina en los laboratorios. La espectroscopia moderna parte de los trabajos desarrollados en 1859 por Robert Wilhelm Eberhard Bunsen (1811-1899) y Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887), profesores de química y de física en la Universidad alemana de Heidelberg, La radiación electromagnética es una forma de energía que se puede describir en función de sus propiedades ondulatorias. Las ondas electromagnéticas se desplazan a velocidades muy grandes y no exigen la presencia de ningún medio de soporte para su propagación, es decir, la onda resulta ser un medio de transmisión de energía a distancia. Esta transferencia de energía se llama radiación electromagnética porque las ondas se pueden producir por electricidad y por magnetismo. El espectro de la radiación electromagnética cubre un inmenso campo de longitudes de onda. Se aplican las reglas de Woodward-Hoffman las cuales sirven de referencia para identificar, y predecir la longitud de onda de máxima absorción (pico) en muchos compuestos que permiten su posterior identificación. La región UV en el análisis químico es importante para la determinación cuantitativa de muchos compuestos orgánicos. La región visible (V), proporciona medios para la determinación cuantitativa de cantidades muy pequeñas o trazas de la mayor parte de los compuestos inorgánicos. Cuando a través de un líquido se hace pasar un haz de luz blanca, parte de la radiación es absorbida por la muestra, la luz transmitida puede colorearse si algún componente presente en la muestra puede absorber a distintos niveles longitudes de ondas diferentes de la luz. Así, la absorción selectiva de la radiación electromagnética al atravesar una solución, da lugar a que el rayo emergente difiera del incidente. Para poder evaluar la luz dispersada por un espectroscopio se coloca a la salida del mismo un detector que es capaz de medir la cantidad de fotones que componen la luz que nos llega del objeto estelar en cada longitud de onda. Estos detectores pueden ser desde películas fotográficas hasta fotómetros o cámaras. Cuando a un espectroscopio se le coloca uno de estos detectores en su salida se le suele denominar espectrógrafo. Los instrumentos usados para el análisis espectroscópico en general, tienen como partes fundamentales: a) Fuentes de la radiación (foco estable de energía radiante)


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b) Monocromador (prisma o redes de difracción) c) Recipientes transparentes para contener la muestra y el disolvente. d) Detector de la radiación que mide la señal de salida del instrumento Entre otras de las aplicaciones de la espectroscopía uv/v se encuentran: 1. Se pueden identificar especies no absorbentes haciéndolas reaccionar selectivamente con sustancias químicas dando productos que absorben fuertemente en las regiones UV/V. 2.. Combinando ciertos aspectos de la Cinética Química permite predecir el tiempo de vida media y el tiempo al 90% de los sustancias químicas.

. Figura 3. Espectrofotómetro

En 1860, Bunsen y Kirchhoff publicaron un importante trabajo sobre la espectroscopia, del Tratado de Análisis Química Cualitativa en la que se esquema del nuevo instrumento, procedente del artículo publicado por estos autores en 1860 así como un ejemplo de su modo de empleo.

Figura 4. Espectrómetro


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Esquema del funcionamiento del espectroscopio: El grabado que representa un modelo de espectroscopio semejante al de la exposición, que procede de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Valencia. Su funcionamiento puede ser fácilmente comprendido a través del esquema que se encuentra reproducido a continuación. El tubo "B" contiene la lente de observación y el tubo "A" está destinado al paso de la luz que se pretende analizar. El tubo "C" contiene una imagen fotográfica de una escala, hecha sobre una lámina de vidrio, de manera que la posición de cada raya espectral puede determinarse sobre esta escala. La imagen procedente del tubo "A" se refracta sobre el prisma "P" mientras que la imagen de la escala se refleja sobre una las caras del prisma, de modo que se pueden observar ambas imágenes a través del ocular situado en "B". (Figura 4.) El objetivo de un espectroscopio es la dispersión de la luz en sus diferentes longitudes de onda para que pueda ser analizada. No es de extrañar, por tanto, que la pieza fundamental de un espectroscopio sea su elemento dispersor. Existen dos principios ópticos fundamentales que permiten dispersar la luz, la refracción diferencial y la interferencia. El primero da lugar a los espectroscopios de prisma y el segundo a los basados en redes de difracción. Existen también elementos dispersores híbridos, que suelen ser la combinación de un elemento de cada. Independientemente del diseño del espectroscopio y de su elemento dispersor, su característica fundamental es la resolución espectral (R). Este parámetro indica la capacidad del espectroscopio para separar dos líneas muy próximas: TIPOS: Espectrofotómetros de Absorción Atómica Espectrofotómetro de Fluorescencia Espectrofotómetro uv-visible Espectroscopía con prisma: Espectroscopía con red de difracción - Prisma (o red) objetivo: Es el más sencillo de todos los montajes es el prisma objetivo. Consiste en colocar un prisma delgado pero lo suficientemente grande como para cubrir el objetivo del telescopio. El prisma es entonces colocado delante del objetivo de modo que resulta innecesaria ninguna óptica adicional ya que los rayos de luz inciden ya paralelos sobre el prisma. Esto tiene la gran ventaja de que se puede obtener un gran número de espectros al mismo tiempo. Espectrógrafos de rendija: Es el tipo de espectrógrafo más extendido en los observatorios profesionales. Este montaje se coloca a la salida del Telescopio Clásico.


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Figura 5. Montaje clásico con prisma

Figura 6. Montaje clásico con red de difracción


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Figura 7. ¿Cómo construimos el espectroscopio sencillo?

Otros instrumentos para el estudio en la microscopia del mundo biológico.

MICROTOMOS

Del griego (micro = pequeño, tomo= cortar). Permite cortes en serie de igual y cualquier espesor, facilitando reconstruir de este modo la estructura interna de alguna estructura. Consiste en un tubo con una pinza que sostiene el cilindro de médula y una platina que sobre la cual se hace resbalar la navaja. Un tornillo hace ascender muy lentamente el objeto con navajas bien afiladas. Se pueden hacer cortes de 0,005 y 0,01 mm. Para fijar los objetos embebidos en parafina se utilizan bloques de madera o de metal. La cuchilla se encuentra con un ángulo de 5 – 8o al objeto. Entre más dura o fría este la parafina más delgado se podrá hacer el corte. El grosor regular de los cortes se halla cerca de 7-10 micras. Cuanto más delgadas son las células tanto más delgadas hay que cortarlas (hasta 5 micras). Para células adultas 10 micras es suficiente, a partir del tejido incluido en parafina. Se encuentran diferentes tiopos: microtomo convencional, de rotación o Minot - europeo), deslizamiento (americano), en tejido congelado (criostato) o en tejido incluido en plástico para estudio ultraestructural (ultramicrotomo).


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Es un instrumento insustituible en las investigaciones sobre tejidos humanos (Patología) y de otras especies, así como en el estudio de vegetales. Los tejidos son sometidos a un tratamiento previo que consiste en la fijación o estabilización, deshidratación y aclaramiento, para luego ser incluídos en parafina o plástico y, de este modo, poder ser cortados con el Micrótomo, en partes tan finas (por ejemplo, de 5 micrones de espesor) como para que, previa coloración, o no, puedan ser observadas en el microscopio.

Figura 8- Micrótomo de rotación

Figura 9. Micrótomo de deslizamiento


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Fijación FORMALDEHIDO : En solución min. 37% y exento de ácido. Se utiliza para minimizar los procesos que ocurren después de la muerte del tejido y fijar las estructuras en su estado original. La fijación de los extendidos celulares se debe hacer inmediatamente después de tomada la muestra, cuando aún está húmeda. Inclusión Para la visualización microscópica la muestra debe ser extremadamente delgada (aprox. 1-5mm). El tejido o biopsia se debe impregnar en una substancia que sea más dura que el tejido mismo. Debe ser fácil de cortar con el micrótomo y no debe influir en las características de coloración. Los medios clásicos utilizados son parafinas y celulosa para microscopia y resinas artificiales para microscopia electrónica. Las parafinas son mezclas de hidrocarburos saturados, cuyo punto de fusión incrementa con el aumento de la longitud de la cadena. Para procesos Histológicos se emplean cadenas de 20 a 35 átomos con puntos de fusión de 38 - 58°C.

Parafina enriquecida con polímeros de alta pureza, con o sin Dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO incorporado a la parafina permite una infiltración rápida de la muestra y garantiza una total penetración del tejido y los polímeros aseguran un incremento en la plasticidad de la muestra, después de la inhibición. El alto grado de pureza elimina la necesidad de filtrar repetidas veces y adicionalmente la forma y el color de la muestra no es alterado.

Deshidratación y Desparafinización En los laboratorios de Histología se usa comúnmente un solvente como el xileno, que puede producir daños en el medio ambiente y la salud por los vapores que emana.

NEO-CLEAR es un substituto del xileno, se puede utilizar en lugar de éste en todas las etapas del Histoprocesamiento sin alterar los tiempos, calidad ni cualidad de la coloración. Es completamente inodoro, no varían los tiempos de procedimiento y no aumenta el consumo de otros solventes

Coloraciones para Microscopía: Permiten la observación de diferentes estructuras celulares lo cual ha sido de gran importancia para el diagnóstico. Teniendo en cuenta las características de las diferentes coloraciones se logra resaltar estructuras que antes eran difíciles de distinguir. Hay coloraciones básicas, ácidas, así como naturales y sintéticas. Con coloraciones básicas por ejemplo azul de metileno, azur, se resaltan las estructuras ácidas de núcleo celular, como la cromatina; e igual, las coloraciones ácidas como la eosina tiñen las proteínas básicas, como las enzimas lisosomales en los gránulos.

La imagen microscópica, su intensidad y grado de color, dependen finalmente de la calidad de la coloración, de la solución de trabajo (pH, concentración, estabilidad, etc.) y del


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procedimiento técnico. Entre los colorantes se encuentran: fuscina acida, carmin, rojo congo ,eosina azulada, fast green , rojo neutro, sefrina o sudan, negro orange g, azúl de metileno, verde malaquita.


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MAPA CONCEPTUAL : PRACTICA 1. INSTRUMENTACIÓN PARA LA INVESTIGACION E N BIOLOGÍA E INTRODUCCIÓN A LA ESPECTOFOTOMETRÍA


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DIAGRAMA DE FLUJO : PRACTICA 1. . INSTRUMENTACIÓN PARA LA INVESTIGACION EN BIOLOGÍA E INTRODUCCIÓN A LA ESPECTOFOTOMETRÍA


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ESQUEMAS: PRACTICA 1. . INSTRUMENTACIÓN PARA LA INVESTIGACION EN BIOLOGÍA

1. Diámetro del campo visual: papel milimetrado

2. Poder de Aumento: La dimensión de la letra “e”

3. Poder de resolución: tramado de revista

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