Práctica #2 Medios de cultivo y técnicas de tinción

CENTRO BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NO. 128

Práctica No. 2 Utilización de medios de cultivo y técnicas de tinción

Sub-modulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas

Integrantes: Quistián García Hylary Estefanía, Ramírez Arellanos Génesis, Ramírez Hernández Jessica, Ramos Franco Michelle Valeria, Ramos Juárez Mario Antonio, Rangel Osorio Hugo Cesar, Rascón Castrejón Lizeth Guadalupe, Reyes Marcial Luis Diego, Ríos Palacios Selene.

Facilitadora: Ing. Jessica Alicia Acosta Bezada

Fecha: se inició el 29 septiembre del 2014 y se terminó el 08 octubre del 2014.

Introducción

Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. Durante esta práctica veremos cómo es que crecen los microrganismos en placas de medios de cultivos de una muestra de heces fecales de un animal. Además de esto observaremos la morfología de cada una de las bacterias que crecen.

También veremos las técnicas de tinción que las podremos definir como: una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelos dentro de células individuales.

Resumen

Esta práctica consistió en preparar un medio de cultivo selectivo para el crecimiento de bacterias Escherichia Coli en una población poli microbiana. Facilitando nutricionalmente su crecimiento con la utilización del medio Agar Eosina y azul de Metileno.

Se envolvió el material necesario (cajas Petri) para esterilizarlo ya que cuando el medio de cultivo estuvo listo y también esterilizado se añadió a este usando técnicas de vaciado. Una vez refrigerado por 24 horas se procedió a estriar en crecimiento. Una vez que se estrió se llevó de nuevo al refrigerador a 37ºC.

Se realizó la morfología de cada colonia en cada agar y después la morfología de cada bacteria realizando la técnica de Tinción De Gram, esta fue observada por medio de un microscopio compuesto.

Abstract

This practice consisted in prepare a selective culture medium for the growth of Escherichia Coli Bacterium in a polymicrobial population. Facilitating nutritionally it growth with the use of Eosin methylene blue agar.

It wrapped the necessary material (Petri dishes) for sterilization and that then the culture medium was ready and sterilized too was add using casting techniques. Once cooled for 24 hours proceeded to striate in growth. Once striate it brought back to the refrigerator in 98º F.

Morphology was performed of each colony on each Agar and then the morphology of each bacterial performing gram staining technique; this was observed by a compound microscope.

Debido a lo largo de la práctica y a la cantidad de materiales que se utilizó para su realización, esta se dividió en cuatro etapas.

ETAPA 1: Preparación de medios de cultivo, esterilización y vaciado

Material

Bascula


Espátula

Mecheros Bunsen

Matraz E.M 500 ml

Capsula

9 Cajas Petri

Papel canela

Reactivos:

Agar correspondiente (Agar Eosina y azul de metileno o EMB)

Agua destilada o potable

Procedimiento:

1) Se colocó en el matraz Erlenmeyer 400 ml de agua destilada y se le agregó 14.4 gr del agar eosina y azul de metileno.

2) Se mezcló la solución mientras se calentaba con la ayuda del mechero. Se hirvió durante un minuto y se retiró del fuego.

3) Se preparó las cajas Petri para su esterilización, así como el matraz.

4) Se esterilizó lo anterior a 121°C durante 15 minutos.

5) Se formó un triángulo de seguridad con mecheros bunsen y en medio de ellos se colocó una caja Petri previamente esterilizada. Se vació en ella 20 ml aproximadamente del medio de cultivo previamente esterilizado y se tapó. El procedimiento se repitió con el resto de las cajas Petri.

ETAPA 2: Estriado, siembra e incubación

Material:

Mecheros Bunsen

Cajas Petri con el agar correspondiente (4 agar nutritivo, 3 EMB)

Asas de inoculación

Vaso precipitado

Reactivo:

Muestra (Heces fecales de algún animal)


Procedimiento:

1) Se disolvió una pequeña parte de la muestra en agua suficiente.

2) Se formó un triángulo de seguridad con mecheros bunsen, se trabajó dentro de esta zona para evitar la posible contaminación de los medios de cultivo.

3) Se tomó una de las cajas Petri con una mano y el asa de inoculación con la otra. Se procedió a esterilizar el asa y se tomó una pequeña cantidad de la muestra.

4) Con el pulgar se abrió la caja Petri y se comenzó el estriado del medio de cultivo con el asa de inoculación. El estriado que se uso fue uno simple con forma de “S” por toda la caja Petri en una sola dirección. Solo se inoculo con una cantidad de muestra, es decir no se tomó otra.

5) Se repitió el procedimiento con las 7 cajas Petri, y se procedió a su incubación.

ETAPA 3: Lectura de colonias

Material

Marcador

Mecheros Bunsen

Cajas Petri con muestra incubada anteriormente

Procedimiento

1) Se formó un triángulo de seguridad con mecheros Bunsen y se trabajó dentro de él para evitar la posible contaminación de bacterias. En ningún momento se abrió alguna de las cajas Petri.

2) Se procedió a realizar la lectura de colonias. Para ello primero se identificó los diversos tipos de colonias que había en cada caja Petri.

3) Se contó el número de cada tipo de colonias que había en cada caja Petri, para ello se vio la caja a contra luz para poder ver colonias que no eran muy claras, con ayuda del marcador se punteaba cada colonia contada, se tomó notas sobre su:

Forma

Borde

Superficie

Color


(Véanse los resultados)

ETAPA 4: Tinción y morfología bacteriana

Material

Portaobjetos

Cubreobjetos

Asa microbiológica

Mecheros Bunsen

Microscopio

Reactivos


Cristal violeta

Yodo-Lugol

Alcohol-Acetona

Safranina

Aceite de inmersión

Procedimiento

1) Se formó un triángulo de seguridad con mecheros Bunsen. La toma de muestras se realizó dentro de él.

2) Para la toma de muestras, se colocó en un portaobjetos una gota de agua, se colocó una caja Petri dentro del triángulo de seguridad para evitar una posible contaminación. Se esterilizó el asa

microbiológica, se abrió la caja y con el asa se tomó una parte de una de las colonias, esta se disolvió con movimientos circulares en la gota de agua previamente puesta en el cubreobjetos. Se volvió a esterilizar el asa.

3) Se tomó una muestra por cada colonia diferente en cada agar, cabe destacar que se marcó cada cubreobjetos con el número de agar y colonia a la que pertenece la muestra.

4) Se dejó secar las muestras colocadas en los portaobjetos. Una vez hecho esto se procedió a la tinción:

-Se pasó el portaobjetos con la muestra por la llama del mechero 3 veces rápidamente.

-Se le agregó una gota de Cristal violeta y se dejó actuar durante un minuto. Se enjuagó el portaobjetos hasta que el colorante dejó de escurrir.

-Se agregó una gota de Yodo-Lugol y se dejó actuar por un minuto. Se procedió a enjuagar.

-Se agregó una gota de Alcohol-Cetona y se dejó actuar durante 30 segundos. Se enjuagó.

-Por ultimó se agregó una gota de safranina y se dejó actuar por 30 segundos, posteriormente se volvió a enjuagar la muestra.

5) Se le agregó una gota de aceite de inmersión a la muestra y se le colocó un cubreobjetos.

6) Se procedió a su observación a través del microscopio y se identificó las distintas bacterias contenidas en la muestra.

(Véanse los resultados)

Resultados

En los diferentes cultivos se dio lugar a la formación de diversas colonias de microorganismos que se representan fácilmente en la siguiente tabla.

Medio de cultivo. Numero de caja Petri.Agar eosina y azul de metileno. 3

45

Agar nutritivo. 1267


Caja Petri. Colonia. Morfología de la colonia.


Caja Petri 1. 1 Forma circular, borde entero, superficie convexa, brillante a la luz, color blanco con tonalidad grasienta.

2 Forma circular, borde entero, superficie plana, color amarillo opaco.

3 Forma circular, borde entero, superficie convexa, color amarillo brilloso, viscosa.

4 Forma circular, borde filamentoso, superficie convexa, color gris brilloso con centro de color café.

Caja Petri 2. 1 Forma circular, borde entero, superficie convexa, color café en el centro.

2 Forma circular, borde entero, superficie convexa, color blanco y grasoso.

3 Forma circular, borde filamentoso, superficie convexa, color blanco con un centro de color café.

4 Forma circular, borde entero, superficie convexa, de color amarillo.

Caja Petri 3. 1 Forma circular, borde lobulado, color blanco, superficie planoconvexa.

2 Puntiforme, borde entero, superficie convexa, color morado claro.

3 Puntiforme, borde lobulado, superficie convexa, color morado oscuro.

Caja Petri 4. ---------- ----------Caja Petri 5. 1 Puntiforme, borde lobulado,

superficie convexa, color morado oscuro.

2 Puntiforme, borde lobulado, superficie convexa, color morado claro.

Caja Petri 6. 1 Puntiforme, borde entero, superficie convexa, color amarillo.

2 Puntiforme, borde lobulado, superficie convexa, color blanco opaco y cremoso.


Caja Petri 7. 1 Puntiforme, borde lobulado, superficie convexa, tonalidad cremosa.

2 Puntiforme, borde entero, superficie convexa, color amarillo.

Todos estos resultados conforman las colonias que resultaron de la muestra de heces fecales. Y por consiguiente se tienen los resultados morfológicos de las bacterias presentes en algunas muestras de los cultivos antes mencionados. Estos resultados se muestran en la siguiente tabla.

Caja Petri. Colonia. Morfología bacteriana.Caja Petri 1. 1

2 Staphylococcus Gram positivos.

3 Staphylococcus Gram positivos.

Caja Petri 2. 2 Diplococos Gram negativos.4 Staphylococcus Gram

positivos.Caja Petri 3. 2 Bacilos Gram negativos.

3 Bacilos Gram negativos.Caja Petri 4. ----------- -------------Caja Petri 5. 1 Bacilos Gram negativos.

2 Bacilos Gram negativos.Caja Petri 6. 1 Staphylococcus Gram

positivos.2 Diplococos Gram negativos.

Caja Petri 7. 1 Diplococos Gram negativos.2 Staphylococcus Gram

positivos.

Estos son los resultados que se obtuvieron al realizar la morfología de las colonias y de igual manera la morfología bacteriana, también en estos resultados se remarca que la caja Petri número cuatro no se pudo identificar las colonias que presentaban y de la misma forma su morfología bacteriana.

En estos resultados se resalta aquellas partes que pertenecen y hablan sobre a la utilización de los medios de cultivo y de la tinción de Gram.

Conclusiones

Quistián García Hylary: Para lograr una correcta identificación de bacterias hay ciertas cosas que se deben tomar en cuenta, de forma que los resultados obtenidos sean satisfactorios. El primero de estos es el medio de cultivo, este debe ser seleccionado de acuerdo a la utilización que se le va a dar, por ejemplo si

se busca sólo el crecimiento de bacterias se puede utilizar el Agar nutritivo, en cambio sí se busca diferenciar colonias se podría utilizar un medio diferencial como el EMB. Este a su vez debe cumplir con ciertos factores como humedad adecuada, nutrientes adecuados, pH adecuado, entre otros.El siguiente factor para un buen desarrollo de colonias es el estriado, este debe ser


realizado de manera adecuada para obtener una buena formación de colonias. No debe tocar las orillas de la caja Petri porque el conteo resultaría complicado.El siguiente paso es la identificación de las diferentes colonias obtenidas así como el número en que se encuentran cada una (lectura de colonias y morfología de colonias). Lo siguiente que se debe hacer es la morfología bacteriana y para ello se debe realizar una toma de muestras y una tinción diferencial (en este caso Tinción de Gram).Al llevar a cabo la tinción es de suma importancia respetar los tiempos cuando se agrega una sustancia, ya que sí esto no se lleva a cabo de forma adecuada puede dañar las bacterias y no se lograría observar nada. El último paso es la morfología bacteria, en esta parte después de realizar la tinción (y si se llevó de forma adecuada) será posible ver la forma que tienen las bacterias, así como será posible definir si son Gram Positivas o negativas, y de igual forma su identificación.

Ramírez Arellanos Génesis: En esta práctica se aprendió la importancia de preparar medios de cultivo, de que materiales pueden ser hechos, los distintos tipos de cultivos que pueden desarrollarse en el laboratorio, así como su clasificación, sus características principales, los distintos tipos que pueden servir para identificar diferentes bacterias, así como las condiciones que estos deben tener .De acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que es de gran importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo, añadir la cantidad de solución exacta y disolverla correctamente para obtener los resultados esperados.

Ramírez Hernández Jessica: Se llegó a la conclusión de que un medio de cultivo correcto de acuerdo a su utilización es necesario para observar el tipo de bacteria o bacterias que queremos identificar, en este caso Escherichia coli. El tipo de estriado es importante para cada tipo de medio de cultivo. Ya que se requirió

el crecimiento de cierto tipo de bacterias fue el de crecimiento.La morfología de colonia va estrechamente relacionada con la de bacteria aunque en esta última fue necesaria una tinción, específicamente una diferencial: de Gram. Se debe a que sin la primera no se pudo haber tenido el orden para realizar la segunda y posteriormente identificar.La esterilización y desinfección es fundamental en cada uno de los procedimientos realizados, ya que se previene la contaminación de nuestro medio de cultivo y de nosotros.Escherichia Coli de acuerdo a la tinción de Gram es una bacteria en forma de Bacilos Gram negativa debido a la delgada capa de peptidoglucano que hace que después del alcohol pierda el colorante añadido. Son bacterias anaerobias facultativas pues crecen con o sin oxígeno.

Ramos Franco Michelle: En mi conclusión el Streptococcus es una bacteria muy contagiosa o principalmente algo ya conocido que varias personas las tienen ya muy presentes en la vida, esta bacteria se ha observado que se puede generar muy rápidamente, como en los agares que al cultivarlos sabemos que todas esas bacterias pueden ser contagiosas al olerlas y que existen miles de ellas.En el microscopio son muy fáciles de observarlas y para poder observarlas existen técnicas de tinción que ya aquí vienen publicadas, que esta práctica utilizamos la técnica de tinción Gram para saber si son negativas o positivas.

Ramos Juárez Mario: Es necesario saber las técnicas de tinción para poder saber cuáles la forma correcta de identificar bacterias y microorganismos, para cuales bacterias se hará por eso es necesario saberlas todas y cómo funcionan y en que bacterias funcionan, las técnicas de tinción son muy difíciles de aprender para ello hay que estudiar y practicar las diferentes técnicas que hay. Gracias a las técnicas de tinción se logró apreciar las bacterias y los hongos de manera correcta que había en el cultivo.


Rangel Osorio Hugo: Bueno en esta práctica vimos cómo es que hay un medio especifico en que las bacterias crecen tanto como de temperatura y también como de nutrientes que reciben del medio. A partir de las heces fecales vimos q crecieron diferentes colonias específicamente de 3 a 4 colonias de cajas Petri y había aproximadamente por caja 200 colonias de bacterias diferentes, en conclusión además de que esta práctica me ayudo a ver lo que hay en las heces fecales también supimos cómo es que se hace un medio de cultivo y también a observar (para saber cómo se hace en ocasiones futuras) un método de tinción que como ya sabemos nos sirve para observar mejor los microorganismos y sus organelos.

Rascón Castrejón Lizeth: Los medios de cultivo en un laboratorio de microbiología son de suma importancia ya que, son instrumentos de diagnóstico de bacterias patógenas dentro de los individuos. Los medios de cultivo son un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio En microbiología se emplea medios de cultivos por la simple razón que los organismos a estudiar necesitan una fuente de energía, para vivir y así desarrollarse, por tal motivo, la preparación de los medios de cultivos varían ya que deben de prepararse según las necesidades nutricionales del organismo, esto es fundamental para su estudios. Esto consta en disponibilidad de nutrientes, presencia (o ausencia) de oxígeno y distintos gases, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, pH, temperatura, adecuados para el microorganismo. Una vez cultivados dichos microorganismos no podemos dejar de lado las técnicas de tinción que muy importantes para el estudio de microorganismos inertes. Para las técnicas de tinción se aplica un colorante simple (un solo colorante) o diferencial (dos o más colorantes). Esto nos servirá para una mejor visualización y con ellos un mejor análisis de los microorganismos deseados.

Reyes Marcial Luis Diego: Dentro de un laboratorio de microbiología se hacen diversos estudios y análisis que buscan encontrar un dato que les proporcione una respuesta convincente de una incógnita. Existen varios tipos de análisis, pero los comunes y los que se usaron en esta práctica, fueron aquellos que buscan identificar los organismos presentes en una muestra.En esta práctica en especial se tomó una muestra diluida de heces fecales que después se cultivó para desarrollar ciertas habilidades, que entre ellas se comprendía el aprendizaje general sobre los medios de cultivo, su preparación, las técnicas de vaciado, la manera de inocular, el estriado, la morfología tanto bacteriana como de colonias, y entre otras cosas las tinciones para analizar las bacterias.Como ya se dijo anteriormente, en esta práctica se desarrollaron estos diferentes aspectos, pero de igual manera se fortalece lo aprendido anteriormente y los tipos de medidas preventivas y de seguridad que se deben tener al manejar microorganismos y al realizar este tipo de procedimientos.Al final se concluye, que como se muestra en los resultados de la práctica, se desarrollaron diferentes tipos y formas de colonias que a su vez contenían diversos microorganismos, como los diplococos y también los bacilos. Pero para poder anteriormente saber que conformaban estas colonias se realizó la técnica de la tinción de Gram y con ello se pudo observar claramente la forma y color de las que se tornaban los diferentes tipos de microorganismos.Con ello y tal vez más, se tiene que todos estos procedimientos son de vital importancia en el estudio de la microbiología, y al trabajar en este ámbito. Por ello quizá es, de una manera estricta, comprender y aprender de ello, y además nunca perderlo de vista.

Ríos Palacios Selene: Estudiamos con fines morfológicos y funcionales las muestras de colonias, cultivándolas proporcionándoles técnicas de tinción para


darles una mejor exploración y exposición al tema.Se consiguió un buen resultado puesto que hubo crecimiento de microorganismos en los medios de cultivos realizados por los compañeros y por los propios de la mesa.Se habla también del gran aporte en el conocimiento con trabajos y tareas previamente elaboradas con respecto a las técnicas utilizadas, al buen manejo y a la aplicación de la teoría en la práctica.Nos familiarizamos con las técnicas empleadas para la manipulación de microorganismo; Así como el manejo del microscopio óptico para la visualización de microorganismos y las tinciones más comunes en el laboratorio de Microbiología.

Discusión

“Los medios de cultivo en microbiología”

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

“Tinción”

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades

de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

Se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

“Importancia de los medios de cultivo”

Los medios de cultivo bacterianos, son de suma importancia en la Microbiología ya que gracias a ellos podemos explorar algunos tipos de bacterias, su composición, su alimentación, la manera en que se reproducen y cuan patógenos son. Gracias a estos medios podemos incubar las bacterias provenientes de cualquier lugar.


BibliografíaBritaniaLab. (s.f.). Recuperado el 10 de Octubre de 2014, de

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/nutritivoagar.htm

BritaniaLab . (s.f.). Recuperado el 10 de Octubre de 2014, de http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/embagar.htm

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Mª Concepción Casado González, G. T. (2012). http://libroslaboratorio.files.wordpress.com/. Recuperado el 10 de Octubre de 2014, de http://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-un-laboratorio-de-microbiologc3ada.pdf

Anexos

Galería fotográfica

Agar Nutritivo:

Medios de cultivos selectivos

Para realizar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones

experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que nos permite obtener cultivos microbianos.

Al realizar este procedimiento, es necesario tomar en cuenta que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; y es necesario tomar precauciones para impedir que éstos contaminen los cultivos con los que estamos trabajando. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

Agar Nutritivo

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.


Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento

Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Siembra

En superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que se destine.

Incubación

En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.

Resultados

Características del medio

Medio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB)

Es una combinación del medio de Levine y el de Holt-Harris y Teague, contiene una mezcla de peptonas según Levine y presenta dos carbohidratos lactosa y sacarosa.

Este medio de cultivo permite una diferenciación muy clara entre las colonias de organismos fermentadores de lactosa y aquellos que no la fermentan; el contenido de eosina y azul de metileno inhiben en cierto grado organismos Gram positivos. La presencia de sacarosa permite para algunos miembros del grupo coliforme fermentarla con más facilidad que la lactosa. Las colonias lactosa positiva son azules a moradas con brillo metálico o poseen centros oscuros con periferias

transparentes incoloras y las que son negativas en lactosa o sacarosa, se observan incoloras o rosa pálido transparentes.

Sembrar el medio de cultivo con la muestra de ensayo por estría cruzada. Incubar 24 – 48 h a 35ºC. PREPARACION: Rehidratar 36 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC. Vaciar en cajas de Petri estériles. Conservar a temperatura ambiente.

Siembra:

En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.

Características del medio:

Placas preparadas: color púrpura. La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.

Observación de estreptococos

El género Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos gran positivos pertenecientes al filofirmicutes1 y al grupo de las bacterias ácido lácticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo de un eje. Las especies de estreptococos que producen enfermedades son:

• Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis impétigo.

• Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitisen neonatos y trastornos del embarazo en la mujer.

• Neumococo: Streptococcus pneumoniae es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad.

• Streptococcus viridans es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales.


• Streptococcus mutans causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de estreptococos viridans.

Características:

La mayoría de las especies de Streptococcus son anaerobios facultativos, y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono (crecimiento capnofílico). Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar carbohidratos produciendo ácido láctico y también son catalasa negativas a diferencia de los estafilococos.

Tinción

Aparte de la tinción de Gram existen otros tipos de métodos como los mencionados a continuación:

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos

suaves (ácido-alcohol resistente) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistente).

TINCIONES ESTRUCTURALES

Son tinciones para la observación al microscopio óptico de determinadas estructuras de los microorganismos, estas tinciones incluyen la visualización de cápsulas, endosporas, flagelos etc.

Tinción de cápsulas

La cápsula es una estructura que rodea externamente la pared de algunos microorganismos y constituye una barrera física que protege a la célula del ambiente externo, proporcionando numerosas ventajas a los microorganismos que son capaces de sintetizarla, por ejemplo, en las bacterias patógenas la cápsula permite la adhesión al hospedador o protege de la fagocitosis, en otros casos incrementa las posibilidades de sobrevivir en condiciones de desecación en bacterias que colonizan ambientes naturales, o bien previenen el ataque de algunos virus, en otras ocasiones son importantes factores de virulencia en algunas especies clínicamente relevantes como es el caso de Streptococcus pneumoniae y también proporcionan importantes ventajas al facilitar la adhesión a superficies sólidas.

Práctica #2 Medios de cultivo y técnicas de tinción

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