INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA REALIZAR DETERMINACIONES DE DENSIDAD.

EXISTE RELACIN ENTRE SU DENSIDAD Y SU CONCENTRACIN

IMPORTANCIA DE LA SOLUBILIDAD DE LOS CARBOHIDRATOS

MUY TIL PARA DETERMINAR SU CONCENTRACIN.EXACTO SLO PARA SOLUCIONES DE PURA SACAROSA.AMPLIAMENTE USADO PARA APROXIMAR VALORES PARA OTRAS SOLUCIONES AZUCARADAS.

NDICE DE REFRACCIN DE LOS CARBOHIDRATOS

FACILITA AL MTODO PARA MEDIR LA CONCENTRACIN DEL AZCAR EN SOLUCIN.

MTODO BASADO EN MEDICIONES POLARIMTRICAS.

GENERALMENTE UTILIZADO CON SACAROSA Y ALMIDN.

ROTACIN PTICA DE LOS CARBOHIDRATOS

EL GRUPO CETO O ALDEHDO REDUCIRN SOLUCIONES ALKALINAS DE SALES METLICAS AL METAL XIDO O LIBRE.

LA REACCIN ENTRE EL AZCAR Y EL SULFATO CPRICO NO ES ESTEQUIOMTRICA Y PROPORCIONA XIDO CUPROSO MUY DEPENDIENTE DE LAS CONDICIONES DE LA REACCIN.

PROPIEDADES REDUCTORAS DEL GRUPO CETO O ALDEHDO

MONOSACRIDOS + CIDO FUERTE + CALOR SUBSTANCIAS QUE SE CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G. FENOL) PARA PROPORCIONAR COMPLEJOS COLOREADOS.

PRDIDA DE AGUA Y FORMACIN DE DERIVADOS DEL FURFURAL.

(SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL CIDO, EL TIEMPO Y LA VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO)

REACCIONES DE CONDENSACIN DE LOS CARBOHIDRATOS

FORMACIN DE TER (E.G. METIL TERES)

ESTERIFICACIN (E.G. ACETATOS DE ALDITOL)

IMPORTANTES EN LA PREPARACIN DE DERIVADOS VOLTILES PARA LA CROMATOGRAFA GAS-LQUIDO.

REACCIONES DE SUSTITUCIN DE LOS CARBOHIDRATOS

SOLUBILIDAD.- VARA ENORMEMENTE

DEXTRINAS (ALMIDONES DE VARIAS COMPOSICIONES PARCIALMENTE HIDROLIZADOS)

AMILOPECTINA Y GLUCGENO.- SE DISPERSAN PARCIALMENTE EN AGUA CALIENTE.

PROPIEDADES DE LOS POLISACRIDOS

SUBSTANCIAS PCTICAS.- SOLUBLES EN AGUA CALIENTE A MENOS QUE CONSTITUYAN UN COMPLEJO CON Ca.

GOMAS, MUCLAGOS, ARABINOXILANOS, -GLUCANOS.- SOLUBLES EN AGUA

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

CELULOSA, ALGUNOS MANANOS Y XILANOS, HEMICELULOSA.- INSOLUBLES EN AGUA.

EN GENERAL LOS POLISACRIDOS SON INSOLUBLES EN ALCOHOLES ACUOSOS CON FUERZAS POR ARRIBA DE 75 A 80% (v/v).

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

EL ALMIDN FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON EL YODO EN SOLUCIN DE NaCl/KI.

LOS POLISACRIDOS SULFATADOS DE LAS ALGAS DE TIPO CARRAGENO FORMAN COMPLEJOS CON LOS COMPUESTOS CUATERNARIOS DE AMONIO

FORMACIN DE COMPLEJOS DE LOS POLISACRIDOS

LA MAYORA DE LOS POLISACRIDOS SON SUJETOS A LA HIDRLISIS EN PRESENCIA DE CIDOS DILUIDOS.

LA MAYORA DE LOS COMPONENTES DE LA HIDRLISIS SON ESTABLES EN LOS CIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)

HIDRLISIS DE LOS POLISACRIDOS

LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA HIDRLISIS CIDA (SE NECESITAN 72% (p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA)

LOS RESIDUOS DE CIDO URNICO DE UN POLISACRIDO CONFIEREN ESTABILIDAD EN EL ENLACE GLUCOSDICO ADYACENTE.

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

LA MAYORA DE LOS RESIDUOS DE CIDO URNICO SE LIBERAN EN COMBINACIN CON OTRO RESIDUO, PRODUCIENDO UN DISACRIDO EXTREMADAMENTE RESISTENTE A LA HIDRLISIS CIDA.

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACRIDOS

PREPARACIN DE LA MUESTRA

CUANDO LOS AZCARES ESTN EN SOLUCIN

GASES DISUELTOS.- REMUVANSE DE LOS PRODUCTOS CARBONATADOS O FERMENTADOS MEDIANTE VACO

DETERMINACIN DEAZCARES LIBRES

PIGMENTOS.- PUEDEN INTERFERIR CON LAS REACCIONES. EXISTEN MUCHAS MANERAS DE ELIMINARLOS (E.G. CARBN O SALES DE PLOMO)

ACETATO DE PLOMO BSICO.- INTERFERIR CON LOS MTODOS POLARIMTRICOS.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

ACETATO DE PLOMO NEUTRO.- FORMA PREFERENTE DE USO. SE UTILIZA COMO UNA SOLUCIN ACUOSA SATURADA. SE ELIMINA EL EXCESO AADIENDO YA SEA OXALATO DE SODIO O POTASIO.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

DESPROTEINIZACIN

LAS PROTENAS INTERFIEREN CON LAS DETERMINACIONES REDUCTORAS Y COLORIMTRICAS. EL USO DE TCA (CIDO TRICLOROACTICO) ES DEMASIADO FUERTE PARA DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN SOLUCIN CONTIENE DISACRIDOS O FRUCTOSA.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

MTODOS ACEPTABLES:

ADASE ETANOL O ACETONA AL 70% (v/v). LA MAYORA DE LAS PROTENAS COAGULARN Y SE PODRN FILTRAR O CENTRIFUGAR.

DESPROTEINIZACIN DE LAMUESTRA

b) PRECIPITACIN CON METALES PESADOS BAJO CONDICIONES ALKALINAS. EJEMPLO: LA SOLUCIN CARREZ PRECIPITA PROTENAS, ABSORBE ALGUNOS COLORES, Y ROMPE EMULSIONES.

DESPROTEINIZACIN DE LAMUESTRA

SE AADE A LA MUESTRA LQUIDA SOLUCIN CARREZ I (HEXACIANOFERRATO DE POTASIO, K4[Fe(CN)6]3H2O),

SE AADE A LA MUESTRA SOLUCIN CARREZ II (SULFATO DE ZINC (ZnSO47 H2O), Y SOLUCIN DE NaOH.

SE ENFRA, SE DILUYE A UN VOLUMEN DETERMINADO Y SE FILTRA.

PROCEDIMIENTO

SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UN EXTRACTOR SOXHLET

SE AADE LA MUESTRA AL ETANOL AL 80% (v/v, CONCENTRACIN FINAL) HIRVIENDO. LOS POLISACRIDOS SON INSOLUBLES Y EL CALOR INACTIVA A LAS ENZIMAS.

PREPARACIN DE LA MUESTRAINCLUYENDO LA EXTRACCIN DE AZCAR

PUEDE AADIRSE CARBONATO DE CALCIO PARA NEUTRALIZAR LOS CIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE STOS PUEDEN OCASIONAR LA HIDRLISIS DE LOS POLISACRIDOS.

TAMBIN SE DEBE USAR EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN BUFFER PARA EVITAR LA HIDRLISIS CIDA

PREPARACIN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIN DE AZCAR

EN CASO DE QUE SE NECESITE ELIMINAR EL ETANOL DEL EXTRACTO PREVIO AL ANLISIS SE PUEDE REALIZAR ESTE PASO MEDIANTE VACO. TAMBIN SE PUEDE REALIZAR CALENTANDO LEVEMENTE EN BAO MARA BAJO CAMPANA DE EXTRACCIN O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.

PREPARACIN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIN DE AZCAR

MTODOS QUMICOS

MTODO FLUORIMTRICO

MTODOS ENZIMTICOS

CROMATOGRAFA DE GASES

CROMATOGRAFA LQUIDA

MTODOS FSICOS

MTODOS DE ANLISIS DECARBOHIDRATOS

REACCIONES DEL H2SO4 Y CARBOHIDRATOS

CIDO FENOL SULFRICO

FUNDAMENTO.- PROVIENE DE LOS PRODUCTOS DE REACCIN Y DEGRADACIN DEL CIDO Y EL AZCAR.

MTODOS QUMICOS

EL AZCAR SE TORNA PRINCIPALMENTE HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O FURFURAL (F) LOS CUALES SON REALMENTE DETERMINADOS LEYENDO LA ABSORBANCIA A 490nm

H2SO4

CONC.

FENOL + CARBOHIDRATO AMARILLO NARANJA

CALOR

CIDO FENOL SULFRICO

H+ H+

POLISACRIDOS MONOSACRIDOS F + HMF

CIDO FENOL SULFRICO

ES SENCILLOES RPIDOSENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES DE AZCAR (E.G. 5g)ESPECFICO PARA CARBOHIDRATOS.NO EXISTE INTERFERENCIA CON PROTENAS

VENTAJAS DEL MTODO

A MENUDO NO ES NECESARIA LA CLARIFICACIN DE LA MUESTRALOS REACTIVOS SON BARATOS Y ESTABLESCOLOR ESTABLERESULTADOS REPRODUCIBLESRESULTADOS CONFIABLES

VENTAJAS DEL MTODO

LOS CARBOHIDRATOS QUE NO PROPORCIONAN HMF Y F EN LA DESCOMPOSICIN CIDA RESULTAN EN UNA AMPLIA GAMA DE COLORES. POR TANTO EL MTODO NO MIDE TODOS LOS CARBOHIDRATOS

DESVENTAJAS DEL MTODO

MIDE LA MAYORA DE LOS CARBOHIDRATOS PERO LA INTENSIDAD DEL COLOR VARA AMPLIAMENTE ENTRE LOS CARBOHIDRATOS, POR LO QUE SE DEBE SELECCIONAR UNO DE ELLOS COMO REFERENCIA

DESVENTAJAS DEL MTODO

LA PROPORCIN DE H2SO4 ES MUY IMPORTANTE YA QUE SE ADICIONA H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA MUESTRA ACUOSA.

SE DEBE EVITAR LA CONTAMINACIN PROVENIENTE DEL PAPEL FILTRO O POLVO DE CELULOSA

DESVENTAJAS DEL MTODO

FUNDAMENTO

EL MTODO ES BSICAMENTE IGUAL AL DEL FENOL PERO EL COLOR QUE SE OBTIENE ES AZL VERDE Y SE LEE A UNA ABSORBANCIA DE 620nm.

TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS QUE EL MTODO ANTERIOR.

ANTRONA CIDO SULFRICO(9,10 DIHIDRO-9-OXOANTRACENO)

AZCAR + LKALI FRAGMENTOS DE AZCAR REDUCTOR

+

Cu(OH)2 COMPLEJO DE COBRE DE

TARTRATO Y CITRATO

OH

H2O + Cu2O ---- CuOH ---- Cu+ + MEZCLA DE CIDOS DE

AZCAR

DETERMINACIONES DE AZCARES REDUCTORES

FUNDAMENTO

DOS SOLUCIONES :

SOLUCIN A: SULFATO DE COBRE CRISTALINO

SOLUCIN B: TARTRATO DE SODIO Y POTASIO (O CITRATO DE SODIO) + HIDRXIDO DE SODIO (O HIDRXIDO DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)

SOLUCIN DE FEHLING

FUNDAMENTO

EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA PRECIPITACIN DEL HIDRXIDO CPRICO

EL LKALI ENOLIZA A LOS AZCARES Y PROVOCA SU ROMPIMIENTO EN FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN OXIDARSE INMEDIATAMENTE: Cu++ (CPRICO) ES REDUCIDO A Cu+ (EL IN CUPROSO)

SOLUCIN DE FEHLING

FUNDAMENTO

A MEDIDA QUE LOS IONES Cu++ SE REDUCEN POR LOS FRAGMENTOS DE AZCAR, LOS IONES Cu+ SE COMBINAN CON LOS IONES HIDROXILO PARA FORMAR HIDRXIDO DE COBRE (DE COLOR AMARILLO, Cu+).

SOLUCIN DE FEHLING

FUNDAMENTO

EL CuOH REDUCIDO PIERDE H2O EN PRESENCIA DE CALOR PARA DAR COMO RESULTADO XIDO CUPROSO INSOLUBLE (Cu2O)

SOLUCIN DE FEHLING

FUNDAMENTO

LA DETERMINACIN DEL COBRE REDUCIDO SE PUEDE LLEVAR A CABO POR GRAVIMETRA, VOLUMETRA, O POR MTODOS ELECTROLTICOS.

EL PESO DEL Cu2O SLO ES APLICABLE A MUESTRAS RELATIVAMENTE PURAS.

SOLUCIN DE FEHLING

LA REDUCCIN DEL COBRE Y LA OXIDACIN DE LOS AZCARES NO ES ESTEQUIOMTRICA .

LA PRODUCCIN DE XIDO CUPROSO VARA, DEPENDIENDO DEL REACTIVO LKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE CALENTAMIENTO Y LA CONCENTRACIN DE AZCARES EN LA MUESTRA

DESVENTAJAS DEL MTODODE FEHLING

LOS AZCARES DIFIEREN EN SU HABILIDAD PARA REDUCIR LA SOLUCIN CPRICA, POR TANTO, LA TITULACIN (O PESO O ABSORBANCIA) DEBEN SER CONVERTIDOS EN (mg DE COBRE) Y POSTERIORMENTE SE RECURRIR A TABLAS PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIN DE AZCAR PRESENTE EN LA MUESTRA

DESVENTAJAS DEL MTODODE FEHLING

FUNDAMENTO

NaOH + Cu++ + AZCAR REDUCTOR Cu+ + AZCAR

(Cu2O) OXIDADO

LA DETERMINACIN DEL Cu2O PUEDE SER GRAVIMTRICA, PERO ES GENERALMENTE MEJOR TITULAR EL XIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UNO DE LOS SIGUIENTES MTODOS (SE LLEVAN MUCHO TIEMPO):

MTODO DE MUNSON WALKER

EL Cu2O REACCIONA CON EL IN FRRICO (Fe+++) EL CUAL ES REDUCIDO AL IN FERROSO (Fe++). POSTERIORMENTE EL IN FERROSO ES TITULADO (+2 +3) CON PERMANGANATO (+3, ROSA +2, INCOLORO)

1) Cu2O + Fe2(SO4)3 2FeSO4 + CuSO4 + CuO

TITULACIN DEL PERMANGANATO DE POTASIO

2) 10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4

5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

TITULACIN DEL PERMANGANATO DE POTASIO

SE OXIDA EL Cu+ A Cu++ CON CIDO NTRICO. POSTERIORMENTE SE HIERVE LA MUESTRA PARA ELIMINAR EL EXCESO DE HNO3

HNO3

Cu2O Cu(NO3)2

TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO

SE AADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIN DE KI

2I- + 2Cu++ 2Cu+ + I2

TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO

SE TITULA EL I2 LIBERADO CON UNA SOLUCIN ESTNDAR DE TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3)

S2O3-2

I2 + I- I3- S4O6-2 + 3 I-

(TRIIODURO)

SE USA ALMIDN COMO INDICADOR: AZL INCOLORO

TITULACIN DEL TIOSULFATO DE SODIO

NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES AZCARES REDUCTORES.

SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100 A 200mg DE GLUCOSA POR DETERMINACIN.

DESVENTAJAS DEL MTODO

AZCAR REDUCTOR + Cu++ Cu+ + AZCAR

REDUCTOR

MTODO SOMOGY I-NELSON

PROCEDIMIENTO:

MTODO SOMOGY I-NELSON

Reactivo de Somogy i NaCO3 - Carbonato de sodioNaHCO3 Bicarbonato de SodioKaNaC4H4O6 Tartrato de Sodio PotasioCuSO45H2O Sulfato de CobreReactivo de Nelson(NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonioNa2HAsO7H2O Arsenato de SodioH2SO4 cido Sulfrico

Reactivos para el Mtodo de Somogy i y Nelson para azcares reductores

FUNDAMENTO

ESTE MTODO ES POSIBLE CUANDO LOS COMPUESTOS ABSORBEN RADIACIN A LONGITUD DE ONDA CORTA Y LUEGO EMITEN RADIACIN A UNA LONGITUD DE ONDA MS LARGA.

MTODO FLUORIMTRICO

EXTRACCIN CON ISO-BUTIL METIL CETONA.REACCIN CON HIDRACIDA DE CIDO p-HIDROXIBENZOICOADICIN DE REACTIVO Y LECTURA A UNA EMISIN DE 470nmEXCITACIN A 454nm

DETERMINACIN DE GLUCOSA POR EL MTODO FLUORIMTRICO

INFORMACIN GENERAL

REQUIEREN DE UN EXTRACTO NEUTRO O CIDO LIBRE DE ALCOHOLES Y METALES PESADOS (NO SE PUEDEN USAR SALES DE PLOMO PARA CLARIFICAR LOS EXTRACTOS)

MTODOS ENZIMTICOS

SON POSIBLES PARA UN GRAN NMERO DE CARBOHIDRATOS O COMPUESTOS RELACIONADOS:

MONOSACRIDOS

DISACRIDOS

POLISACRIDOS

ALOCHOLES Y POLIOLES

CIDOS

APLICACIN DE LOS MTODOSENZIMTICOS

GLUCOSA

EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS SIGUIENTES REACTIVOS PARA LA DETERMINACIN DE GLUCOSA:

BUFFER,

o DIANISIDINA 2HCl (CROMGENO REDUCIDO)

CATALASA

GLUCOSA OXIDASA

FUNDAMENTO

GLUCOSA

OXIDASA

H2O + O2 + GLUCOSA LACTONA DE CIDO D-GLUCNICO + H2O

CATALASA

H2O2 H2O + O2

O2 + CROMGENO INCOLORO, REDUCIDO CROMGENO AZL OXIDADO

REACCIONES

LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES Y DESPUS DE LA HIDRLISIS ENZIMTICA

DETERMINACIN ENZIMTICA DE SACAROSA/GLUCOSA

A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA FOSFORILACIN DE GLUCOSA MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES ESPECFICAMENTE OXIDADA POR EL NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON LA FORMACIN DE NADP REDUCIDO.

DETERMINACIN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIN

HK

GLUCOSA + ATP G6P + ADP

G6P-DH

G6P + NADP+ GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+

EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIN ES ESTEQUIOMTRICO CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE MIDE MEDIANTE EL AUMENTO EN ABOSROBANCIA A 334, 340 365 nm.

REACCIONES

A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA ENZIMA -FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A GLUCOSA Y FRUCTOSA:

-FRUCTOSIDASA

SACAROSA + H2O GLUCOSA + FRUCTOSA

EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y DESPUS DE LA INVERSIN ENZIMTICA

INVERSIN ENZIMTICA.

FUNDAMENTO

LOS AZCARES SON COMPUESTOS POLIHIDROXI UNIDOS FUERTEMENTE POR HIDRGENO YA SEA A AGUA O A ELLOS MISMOS EN CRISTALES. POR TANTO, TIENEN PUNTOS DE FUSIN MUY ALTOS (200-300C)

CROMATOGRAFA DE GASES

LOS AZCARES SE PUEDEN CONVERTIR EN DERIVADOS VOLTILES POR MTODOS DE UN PASO ANTES DE SER SUJETOS A ANLISIS POR CG. LOS MS CONVENIENTES PARECEN SER: ACETATOS DE ALDITOL, METIL TERES, Y TRIMETISILIL TERES.

CROMATOGRAFA DE GASESFUNDAMENTO

LA ALTA TEMPERATURA PUEDE OCASIONAR LA DEGRADACIN TRMICA DE LOS AZCARES, PARTICULARMENTE LA PRDIDA DE AGUA PARA FORMAR DERIVADOS ANHIDRO.

LOS TRIMEISILIL TERES TIENEN LA VENTAJA DE LA COMBINACIN DE ESTABILIDAD Y VOLATILIDAD QUE PERMITEN LA DETERMINACIN POR CG DE OLIGOSACRIDOS DE HASTA 7 CARBONOS

CROMATOGRAFA DE GASESFUNDAMENTO

SE PREPARAN DERIVADOS VOLTILES DE CARBOHIDRATOS

SE INYECTAN EN LA COLUMNA CALIENTE DEL CG

LOS DERIVADOS VOLTILES PASAN A DIFERENTES VELOCIDADES A TRAVS DE LA COLUMNA CON UNA CORRIENTE LEVE DE GAS ACARREADOR

CROMATOGRAFA DE GASESPROCEDIMIENTO

LOS COMPONENTES SEPARADOS ALCANZAN EL FINAL DE LA COLUMNA Y EL DETECTOR.

LA SEAL GENERADA POR EL DETECTOR CONDUCE A LA PLUMILLA DE LA CARTA REGISTRADORA A OBTENER UN PICO PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIN DE LA SUBSTANCIA.

CROMATOGRAFA DE GASESPROCEDIMIENTO

FUNDAMENTO

LA GRAVEDAD ESPECFICA DE UNA SOLUCIN DE AZCAR ES UNA FUNCIN DE LA CONCENTRACIN DE SOLUTO A UNA TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA DE OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA GRAVEDAD ESPECFICA DE LA SOLUCIN, PERO ESTE MTODO PROPORCIONA UNA APROXIMACIN A LA CANTIDAD DE AZCAR PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZCAR RELATIVAMENTE PURA

MTODOS FSICOSDENSIMETRA

EL INSTRUMENTO DE MEDICIN ES UN HIGRMETRO (TAMBIN UTILIZADO PARA MEDIR SLIDOS SOLUBLES TOTALES).

SE HA DISEADO UN HIGRMETRO ESPECIAL PARA LEER EL % DE AZCAR DIRECTAMENTE A 20C (GRADOS BRIX).

DETERMINACIN PORDENSITOMETRA

EL NDICE DE REFRACCIN DE UNA SOLUCIN DE AZCAR ES UNA MEDIDA DE SU CONCENTRACIN.

LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZCARES DE IGUAL CONCENTRACIN TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO NDICE DE REFRACCIN

NDICE DE REFRACCINFUNDAMENTO

SE DETERMINA EL NDICE DE REFRACCIN DE LA SOLUCIN AZUCARADA A 20C MEDIANTE UN REFRACTMETRO ABB O UN REFRACTMETRO MANUAL.

SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA EL % DE SLIDOS SOLUBLES TOTALES (COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE NDICES DE REFRACCIN A % DE SACAROSA COMO FACTORES DE CORRECCIN.

NDICE DE REFRACCINPROCEDIMIENTO

LA RADIACIN SE COMPORTA COMO SI TUVIERA UN COMPONENTE ELCTRICO Y UNO MAGNTICO. ACTAN COMO SI ESTUVIERAN DISPUESTOS EN NGULOS RECTOS UNO CON RESPECTO AL OTRO.

HAY MILLONES DE RAYOS QUE PROVIENEN DE LA FUENTE LUMINOSA.

LA DIRECCIN DE LOS COMPONENTES ELCTRICOS Y MAGNTICOS ES PURAMENTE ALEATORIA, AS QUE SE TIENE RADIACIN NO POLARIZADA.

POLARIMETRAFUNDAMENTO

SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS SUS COMPONENTES ELCTRICOS Y MAGNTICOS EN LA MISMA DIRECCIN, LA RADIACIN SER POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR.

POLARIMETRAFUNDAMENTO

CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLCULA ASIMTRICA (UN COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO).

LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES LLAMADO COMPUESTO PTICAMENTE ACTIVO (e.g. GLUCOSA).

SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRA LA LUZ POLARIZADA NO SER AFECTADA.

POLARIMETRAFUNDAMENTO

EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA COMPAGINAR VISUALMENTE LOS MATICES DE UN COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE REGRESO A SU POSICIN ORIGINAL.

SE MIDE EL GRADO DE ROTACIN REQUERIDO.

POLARIMETRAFUNDAMENTO

DEPENDIENTE DE:

LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA.LONGITUD DE LA CELDANATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU CONCENTRACINTEMPERATURA

MAGNITUD DE LAROTACIN

POLARMETRO: USA LUZ MONOCROMTICA Y LEE EN GRADOS ANGULARES (SE DEBE RELACIONAR CON LA CONCENTRACIN DE AZCAR).

SACARMETRO: USA LUZ BLANCA Y LEE LA CONCENTRACIN DE AZCAR DIRECTA.

POLARMETROS vs SACARMETROS

SE UTILIZAN ESTOS MTODOS PARA LA PRODUCCIN DE ALIMENTOS O INGREDIENTES DE LOS MISMOS.

PARA PURIFICAR UNA PROTENA DE UN ALIMENTO PARA POSTERIOR ESTUDIO EN EL LABORATORIO.

SEPARACIN DE PROTENASMTODOS

LOS MTODOS DE SEPARACIN DE PROTENAS EXPLOTAN LAS DIFERENCIAS BIOQUMICAS EN LA SOLUBILIDAD DE LAS MISMAS, SU TAMAO, CARGA, CARACTERSTICAS DE ADSORCIN, AFINIDAD BIOLGICA POR OTRAS MOLCULAS.

LAS TCNICAS SE UTILIZAN PARA PURIFICAR PROTENAS INDIVIDUALES A PARTIR DE MEZCLAS COMPLEJAS.

SEPARACIN DE PROTENASFUNDAMENTO GENERAL

ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA DE SEPARACIN DE PROTENAS PARA SU PURIFICACIN SE DEBE CONOCER: SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO ISOELCTRICO, SUS PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIN, ALGUNA CARACTERSTICA QUE LA DISTINGA DE LAS DEMS PROTENAS.

CONSIDERACIONES GENERALES

LOS MS COMNES SON:

PRECIPITACIN

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN DE TAMAO

MTODOS DE PURIFICACIN DE PROTENAS

FUNDAMENTO

LA SEPARACIN POR PRECIPITACIN EXPLOTA LAS DIVERSAS DIFERENCIAS EN SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS EN SOLUCIN.

LAS PROTENAS SON POLIELECTROLITOS Y SUS CARACTERSTICAS DE SOLUBILIDAD ESTN DETERMINADAS POR EL TIPO Y CARGA DE AMINO CIDOS EN LA MOLCULA.

SEPARACIN POR CARACTERSTICAS DE SOLUBILIDAD DIFERENCIAL

CAMBIANDO EL pH DEL BUFFERFUERZA INICACONSTANTE DIELCTRICATEMPERATURA

PRECIPITACIN DIFERENCIALDE LAS PROTENAS

SALADO (SALTING OUT)

LAS PROTENAS TIENEN PERFILES DE SOLUBILIDAD NICOS EN SOLUCIONES DE SAL NEUTRAS.

LAS BAJAS CONCENTRACIONES DE SALES NEUTRAS AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS.

PROCEDIMIENTOS

SI SE AUMENTA LA FUERZA INICA DE LA SOLUCIN LAS PROTENAS SE PRECIPITAN.

ESTE ES UNO DE LOS PRIMEROS PASOS DE SEPARACIN DE PROTENAS. STAS SE PUEDEN SEPARAR DE UNA MEZCLA MUY COMPLEJA CON ESTE MTODO.

SALADO (SALTING OUT)FUNDAMENTO

SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4]. SE USA COMNMENTE DEBIDO A QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE.

TAMBIN SE PUEDEN USAR: NaCl, O KCl.

SALADO (SALTING OUT)REACTIVOS

PUNTO ISOELCTRICO (pI). DEFINIDO COMO EL pH AL QUE UNA PROTENA NO TIENE CARGA NETA EN SOLUCIN.

LAS PROTENAS SE AGREGAN Y PRECIPITAN EN SU pI DEBIDO A QUE NO EXISTE REPULSIN ELECTROSTTICA ENTRE MOLCULAS.

PRECIPITACIN ISOELCTRICAFUNDAMENTO

LAS PROTENAS TIENEN DIFERENTES pIS, POR TANTO, PUEDEN SER SEPARADAS AJUSTANDO EL pH DE LA SOLUCIN.

CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA SOLUCIN AL pI DE UNA PROTENA STA PRECIPITA. SI LAS DEMS PROTENAS TIENEN OTROS pIS STAS PERMANECERN EN SOLUCIN

PRECIPITACIN ISOELCTRICAFUNDAMENTO

FUNDAMENTO

LOS PESOS MOLECULARES DE LAS PROTENAS SON DE 10 000 A MS DE

1 000 000. POR TANTO, EL TAMAO ES UN PARMETRO A EXPLOTAR PARA SU SEPARACIN.

LA SEPARACIN REAL OCURRE BASADA EN EL LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL ES EL RADIO PROMEDIO DE LA PROTENA EN SOLUCIN Y ES DETERMINADO POR LA CONFORMACIN DE LA PROTENA.

PRECIPITACIN DE PROTENASPOR TAMAO

Es la fuerza de friccin experimentada por objetos esfricos movindose en el seno de un fluido viscoso. La velocidad de los movimientos de dichos objetos es baja.

LEY DE STOKES

FUNDAMENTO

SE UTILIZA PARA SEPARAR MOLCULAS EN SOLUCIN MEDIANTE EL USO DE MEMBRANAS SEMIPERMEABLES QUE PERMITEN EL PASO DE PEQUEAS MOLCULAS PERO NO DE LAS GRANDES.

PROCEDIMIENTOSDILISIS

LA SOLUCIN PROTICA ES COLOCADA EN UN TUBO O BOLSA DE DILISIS QUE SE AMARRA O SUJETA POR UN EXTREMO.

EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA UNA VEZ QUE SE HA COLOCADO LA MUESTRA Y SE COLOCA EL TUBO O BOLSA EN UN GRAN VOLUMEN DE AGUA O BUFFER (GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MS GRANDE QUE LA CANTIDAD DE MUESTRA EN EL TUBO O BOLSA DE DILISIS).

DILISISPROCEDIMIENTO

LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR DIFUNDEN FUERA DEL TUBO DE DILISIS.

EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA ADENTRO DEL TUBO.

LA SOLUCIN PROTICA DE ADENTRO DEL TUBO A MENUDO ES DILUIDA DURANTE LA DILISIS DEBIDO A DIFERENCIAS EN FUERZA OSMTICA ENTRE LA SOLUCIN Y EL AGUA O BUFFER DE LA DILISIS

DILISISFUNDAMENTO

SE PUEDE UTILIZAR ESTE MTODO PARA CONCENTRAR PROTENA ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DILISIS CON POLIETILENGLICOL, EL CUAL ABSORBE AGUA Y CONCENTRA LA SOLUCIN DENTRO DE LA BOLSA DE DILISIS.

EL EQUILIBRIO DE LA DILISIS SE PUEDE USAR PARA DETERMINAR LA ESTEQUIOMETRA DE LA UNIN PROTENA-LIGANDO.

APLICACIONES DEL MTODO DE DILISIS

CASO DE LA CASENA DE LA LECHE

FUNDAMENTO

EL QUESO ES LA CUAJADA DE LA LECHE, BSICAMENTE UN GEL DE CASENA .

GELIFICACIN DE LAS PROTENAS

SE BASA EN LA ACIDIFICACIN DE LA LECHE MEDIANTE ENZIMAS PROTEOLTICAS.

LAS ENZIMAS ACTAN EN UN RANGO PTIMO DE 36-39C.

SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA DE QUIMOSINA Y PEPSINA DE CERDO CON UNA ENZIMA COAGULADORA OBTENIDA DE UN HONGO.

FORMACIN DE LA CUAJADA

LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO EN LA CONVERSIN DE LAS MICELAS DE FOSFOCASEINATO DE CALCIO DISPERSAS EN FORMA COLOIDAL EN EL QUESO.

LAS MICELAS DE CASENA EN LA LECHE PUEDEN DESESTABILIZARSE POR LA ENZIMA QUIMOSINA. STA ES EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS GOTAS O TABLETAS DE CUAJO.

FORMACIN DE LA CUAJADA

LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA PRIMERA ETAPA EN LA COAGULACIN DE LA LECHE.

CAUSA LA DIVISIN DE UN ENLACE ESPECFICO, EL ENLACE PEPTDICO DE FENIL-ALANINA-METIONINA.

ROMPE LA PORCIN CIDA RICA EN CARBOHIDRATOS DE LA MOLCULA DEL RESTO HIDROFBICO PRIMARIO O para-k- CASENA.

EFECTOS DE LA QUIMOSINAEN LA FORMACIN DEL QUESO

CON LA PRDIDA DE LA PORCIN CIDA DE LA MOLCULA, EL RESTO DE LA k-CASENA YA NO ESTABILIZA LAS MICELAS. STAS SE APROXIMAN UNAS A OTRAS Y SE UNEN, PROBABLEMENTE POR ENLACES HIDROFBICOS Y FORMAN UNA RED TRIDIMENSIONAL QUE ATRAPA LA FASE ACUOSA DE LA LECHE.

EFECTOS DE LA QUIMOSINAEN LA FORMACIN DEL QUESO

LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL CALCIO DE LA MICELA. EL COAGULO DE LA LECHE FORMADO POR LA ACCIN DEL CUAJO ES EL FOSOFOCASEINATO DE CALCIO.

EL GEL FORMADO POR EL CUAJO ES FIRME, ELSTICO.

EFECTOS DE LA QUIMOSINAEN LA FORMACIN DEL QUESO

39-40C

LA LECHE NO DEBE SOBRECALENTARSE ANTES DE AADIR EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE FORMA GEL STE SER DBIL DEBIDO, EN PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO POR EL CALOR ENTRE LA

-LACTOGLOBULINA Y LA k-CASENA. STA LTIMA SE HACE RESISTENTE AL EFECTO DE LA QUIMOSINA.

TEMPERATURA PTIMA DEFORMACIN DE LA CUAJADA