UAS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA

Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Biología Molecular Aplicada

Beltrán Agramón Juan Carlos, Camacho Ureta Elisa Analí, Colin Ojeda Arturo,

Espinoza Morales Lluvia Briseida, Gómez Rodríguez Alicia Vianey, Medina Bastidas

Diana Vanessa y Solis Medrano Silvia Carolina

Dr. Héctor Samuel López Moreno Grupo 5-1 (equipo #8)

ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO

Deficiencia de G6PD Fibrosis quística Fenilcetonuria Distrofia muscular

Raimann, 2008

Alteración de un gen Defecto enzimático

Alteraciones bioquímicas Fenotipos desadaptativos propios de cada patología

Fenilcetonuria (PKU)

PKU es el desorden genético del metabolismo de aminoácidos más común causado principalmente por la deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa (PAH), como resultado de mutaciones en el gen PAH que codifica para dicha enzima.

Ramírez y colbs, 2007

Antecedentes de la fenilcetonuria

1934 Dr. Ivar Asbjorn Folling “imbecilitas fenilpirúvica” Años 70´s Jervis Bloqueo metabólico y deficiencia de la PAH 1996 Robert Guthrie Pruebas de detección para PKU

Williams et al. 2008

Deficiencia de PAH

Phe: 77 ± 18 μmol/l Tyr: 81 ± 23 μmol/l

PKU clásica (Phe: > 1200 μmol/L) PKU moderada (Phe: 600-1200 μmol/L) HPA leve (Phe: ≥250 , <600 μmol/L)

Williams et al. 2008

Vref

Bioquímica de la PKU

Williams et al. 2008

Fenilalanina Hidroxilasa

Williams et al. 2008

50 KDa, 452 aminoácidos

Fenilalanina Hidroxilasa

Williams et al. 2008

Estructura secundaria de PAH

Genética de la PKU

Williams et al. 2008

Variaciones del gen PAH

Williams et al. 2008

• Mutaciones puntuales

• Deleciones pequeñas o grandes • Defectos de empalme

• Polimorfismos silenciosos

• Mutaciones sin sentido

• Inserciones

• Mutaciones intrónicas que regulan el splicing de ARNm

• Mutaciónes en el promotor del gen PAH

Cromosoma 12

12q22-24.1

gen PAH

Correlación genotipo/fenotipo en el gen PAH

• Mutaciones que afectan tanto a la cinética de la PAH y su estabilidad.

• Mutaciones que alteran las propiedades cinéticas, pero no tienen ningún efecto sobre la estructura de PAH.

• Mutaciones que no alteran la cinética normal, pero demuestran menor la estabilidad in vitro e in vivo.

Fazeli y Vallian, 2011

PKU como desorden multifactorial

• Barrera hematoencefálica

• Grados de transaminación y descarboxilación

• Degradación de proteosoma por defectos de la proteína de la enzima PAH

• Efectos de polimorfismos en la transcripción del gen

Fazeli y Vallian, 2011

Epidemiología

Vela-Amieva 2009

Frecuencia de los errores innatos del metabolismo encontrados en una cohorte de pacientes en Monterrey, México.

Manifestaciones clínicas de la fenilcetonuria

Williams et al. 2008

Vómito Eccemas Retraso mental Irritabilidad Epilepsia Otros como: parkinsonismo, anormalidades en los ojos (hiperpigmentación), decoloración de la piel y el cabello, sensibilidad a la luz, diástasis dentaria e hipoplasia del esmalte, sindactilia, epicanto y pie plano.

Detección y diagnóstico de la PKU

Método de Guthrie

Barba, 2004

Detección y diagnóstico de la fenilcetonuria

• DGGE

• Secuenciación automática

• Marcadores de polimorfismos: • STR • VNTR • PCR-RFLP

• Análisis de MLPA (amplificación multiplex dependiente de ligación de

sondas) en pacientes con PKU

• RT-PCR

Detecta mutaciones puntuales en el gen PAH

DGGE

Michiels et al. 1996.

Secuenciación automática

Mediante el uso de primers específicos que flanqueen del exón 5 al 12 del gen PAH, y su posterior secuenciación para mutaciones puntuales.

Dworniczak et al.1989

Detección de mutaciones y diagnóstico prenatal de fenilcetonuria a partir de técnicas para detectar polimorfismos

• STR (Short Tandem Repeats) o microsatélites

• VNTR (variable Number of Tandem Repeats)

• RFLP

• ADN linfocitos de sangre periferica (PX con PKU y portadores) y ADN vellosidad corionicas (embriones).

Análisis de MLPA (amplificación multiplex dependiente de ligación de sondas) en pacientes con PKU

Schouten J.P. et. al, 2002, 1-13

Análisis realizado en pacientes p274 con una deleción en el gen PAH con 5 exones removidos (c.353 - ?_912 + ?del) (A) electroferograma con asteriscos sobre los picos indicando los exones con deleción (E4, E5, E6, E7 y E8) del ADN del paciente comparado con otro control de ADN. (B) la gráfica muestra los radios del paciente P274 y las áreas relativas del pico (RPA) determinada para cada exón del gen PAH. Utilizando los siguientes valores de referencia: radio de RPA – 1= dosis normal; radio de RPA – 0.5 = deleción de heterocigoto. IGF1 y ASCL1 son controles correspondientes a los genes de flanqueo para el gen PAH en el kit de MLPA.

Análisis de MLPA (amplificación multiplex dependiente de ligación de sondas) en pacientes con PKU

Calí F et al. 2010

Análisis CMDA realizado en el paciente P628 con una deleción del gen PAH removido del exón 6 (c.510 - _706 del +?). (A) En el electroferograma, el asterisco encima del pico indica el exón eliminado (E6) en el ADN del paciente en comparación con el ADN de control. (B) la gráfica muestra las proporciones del paciente P628 y el control del área relativa del pico (RPA) determinado por los exones del gen PAH. Los valores de referencia son los siguientes: radio de RPA- 1 = dosis normal; radio de RPA - 0,5 = eliminación heterocigota. MLH1 y MYE son sondas de control utilizados en el análisis CMDA.

CMDA

Calí F et al. 2010

RT-PCR

Calí F et al. 2010

Gracias