1

1

PCR

(Polymerase chain reaction)

Reaccin en cadena de la polimerasa

2da parte

Biotecnologa 2015

Joan Mir i Ferr

(1893-1983 )

2

PCR en tiempo real / Real-Time PCR / qRT-PCR

PCR cuantitativo de alta precisin y

reproducibilidad.

Sistemas de deteccin fluorescente.

La cantidad de fluorescencia emitida es

proporcional a la cantidad de producto

amplificado en cada ciclo.

Los termocicladores poseen un detector que

mide la emisin de luz de las muestras.

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., and Griffith, R. (1992).

"Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences"

Biotechnology 10:413417

PCR CUANTITATIVO

2

3

R Q

Reportero Quencher

A T C G G Sonda

Taqman

oligonucleotido diseado para hibridizar con la secuencia del DNA a

amplificar que contiene dos

fluorocromos:

R

Q

Ubicado a 5(disponibles varios para permitir

reacciones mltiples. Ej: 6-carboxilfluorescena)

Ubicado a 3 (6-carboxi-tetrametil-rodamina)

4

INTERCALADORES

BROMURO DE ETIDIO

MINOR GROOVE BINDERS

SYBR GREEN

Cuantificacin de DNA mediante la

unin de sustancias fluorescentes.

Tipos de unin al DNA:

3

5

Rn: fluorescencia

Threshold: umbral sobre la lnea de base

CT: ciclo en el cual la Rn esta por encima de la lnea de base

(NTC: no template control)

6

Gran variacin en la cantidad de producto

Muy poca variacin en la cantidad de producto

4

7

8

Diluciones sucesivas (1/5)

del templado inicial

5

9

Log C0

CT

C0: cantidad inicial de DNA genmico

10

A260 : 1 50 g/ml DNA (0.01: 500 ng/ml)

Ethidium bromide fluorescence ( 0.1 0.05 g )

Southern blot ( 1 - 10 pg )

(~ 0.1 g DNA humano) PCR

(~10 g DNA humano) (Gen copia nica)

--------------------- ----

---------------------------------------------

Algunas consideraciones sobre

lmites de deteccin de la PCR

6

11

FIGURE 5.

Titration curve to estimate threshold of detection of target kinetoplast DNA by the LV-B1 polymerase chain

reaction (PCR) and Southern hybridization using serial dilutions of Leishmania panamensis total DNA. A,

Agarose electrophoresis of PCR products. B, Southern hybridization analysis of the products. Lane 1, molecular

mass marker (1-kb DNA ladder); lanes 28, PCR products generated from the following amounts of L.

panamensis DNA: 3 g, 3 ng, 3 pg, 0.3 pg, 30 fg, 3 fg, and 0.3 fg; lane 9, monocyte DNA (0.6 g) from a

healthy control donor; lane 10, negative PCR control (minus DNA). The lower limit of detection was 3 fg of

DNA in the PCR and 0.3 fg in the Southern hybridization. bp = basepairs.

Am. J. Trop. Med. Hyg., 72(4), 2005, pp. 423-429

Copyright 2005 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene

AMPLIFICATION OF HUMAN DNA BY PRIMERS TARGETED TO LEISHMANIA KINETOPLAST DNA AND POST-

GENOME CONSIDERATIONS IN THE DETECTION OF PARASITES BY A POLYMERASE CHAIN REACTION

Carolina Vergel, John Walker, and Nancy G. Saravia

Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, Cali, Colombia

3 g 3 ng 3 pg 0.3 pg 30 fg 3 fg 0.3 fg

12

Se plantea que el contenido de ADN de una clula humana es de aproximadamente 5 pg, pudindose

inferir que en 100 ng de ADN de placenta existen cerca de 20 000 clulas. Tambin se conoce que en 1 pg

de ADN de PVH hay involucrados unos 70 000 genomas virales. La relacin que se establece entre los

planteamientos anteriores y los resultados del ensayo de sensibilidad (70 000/20 000) permiten concluir

que nuestro sistema es capaz de detectar 3,5 partculas virales por cada genoma diploide celular.

1n 100p 10p 1p 100f 10f 1f 0.1f 1n 100p 10p 1p 100f 10f 1f 0.1f

Southern blot ~10 ug DNA / PCR ~ 0.1 ug (100 ng) DNA ----- PCR ~ 100 veces mas sensible