Método de tinción policromático que utiliza una coloración nuclear y

coloraciones citoplasmáticas competitivas

TINCIÓN PAPANICOLAOU

Tinción nuclear

Buena definición del detalle nuclear evidenciando el patrón cromatínico

Diferentes grados de diferenciación celular y

actividad metabólica

HEMATOXILINA

Tinción citoplasmáticapolicromática

ORANGE GEOSINA

LIGHT GREEN

• Tinción contrastante

• Tranparencia citoplasmática

FIJACIÓNDetener el metabolismo celular conservando su estructura e

impidiendo la degradación celular .

El déficit por fijación produce alteración de la tinción.

Las células se tornan eosinófilas (no hay patrón de tinción diferente) y la coloración con hematoxilina es subóptima.

Para una tinción Papanicolaou ÓPTIMA es necesaria una CORRECTA Y RÁPIDA FIJACIÓN.

Cuál es el fijador satisfactorio ?

Debe penetrar las células rápidamente para que la morfología celular sea mantenida.El encogimiento celular debe ser mínimo y uniforme de forma que no ocurran distorsiones morfológicas.

Debe favorecer la permeabilidad de las tinciones a través de las barreras celulares y ser apropiado para los métodos de tinción usados.

Debe proteger la adhesión celular a la lámina Debe ser bactericida, no tóxico y permanente El fijado debe ser inmediato. No debe dejarse secar antes

de ser fijado

REHIDRATARSin fijación previa

Colocación durante 3 a 5 minutosen solución con 50% de agua destilada y

50% de Glicerina

Fijadores adecuados para tinción Papanicolaou

Alcohol 96%: inmersión completa de la muestra, al menos 10 minutos.

Spray fijador (contiene una base de alcohol y cera-carbón): rociar el preparado a una distancia no menor de 15 a 20 cm.

ColoracionesHEMATOXILINA

El componente activo es la HEMATEINA, combinada con metales (como el aluminio),forma un compuesto con carga neta positiva (Grupos básicos)

unión Fuerzas electrostáticas

compuesto con carga neta negativa, Grupos aniónicos de sustancias Ácidas

ADN

OTRAS SUSTANCIAS CITOPLASMÁTICAS

ÁCIDASEsta en SOLUCIÓN ACUOSA,

por lo que el extendido debe HIDRATARSE previamente al baño de inmersión

METODO PROGRESIVO: se tiñe el núcleo con la intensidad del color deseado

MÉTODO REGRESIVO: se sobre tiñe con una hematoxilina no acidificada y luego se remueve el exceso de tinción con ácido clorhídrico

ARN

ORANGE G

Tinción proteica ácida( carga neta negativa)

Monocromática( de tinte naranja brillante/ amarrillo anaranjado)

Penetra rápidamente el citoplasma, compite con la eosina y en menor medida con el Light Green

Es una SOLUCION ALCOHÓLICA, por lo que el preparado debe deshidratarse previamente

Molécula pequeña( penetra fácilmente estructuras densas)

EASOLUCIÓN ALCOHÓLICA,

por lo que deben DESHIDRATARSE los extendidos previamente

Esta constituída por 2 tinciones:

1) EOSINA: es un ÁCIDO PURO, que se une principalmente a proteínas citoplasmáticas.

Es una molécula más grande que el orange GDímero: naranjaMonómero: rosado a rojizo

Células superficiales GR y proteínas del nucleolo

2)LIGHT GREEN: es un colorante ÁCIDO que posee también grupos básicos que se une principalmente a proteínas citoplasmáticas.

Es una molécula más grande que la eosina.

El agregado de ácido fosfotúngstico (PTA) le confiere un efecto mordiente

Permitiendo la actividad del colorante en la solución EA a un pH mas alto.

Puede actuar como contrastante al competir en su unión a proteínas con la eosina.

• Alcohol etílico 50% por 20 minutos• Agua destilada o corriente• Hematoxilina 1 min• Virar en agua destilada o corriente • Alcohol etílico 96º• Alcohol etílico 96º• Orange G (OG6) 3 min• Alcohol etílico 96º• Alcohol etílico 96º• EA 3 min• Alcohol etílico 96%• Alcohol etílico 100%• Alcohol /xilol (50% de alcohol absoluto y 50% de xilol puro)• Xilol puro 5 min• Montaje

ProtocoloRemoción de la cera del

Spray fijador

Respetar el tiempo para evitar hipercromasia

Aclaramiento, otorgan la transparencia citoplasmática

Montaje

Unión del portaobjeto con el cubreobjeto

Medio de Montaje

PERFECTA VISCOSIDAD SECARSE RÁPIDO PERMANCER TRANSPARENTE QUIMICAMENTE NEUTRO E INACTIVO IGUAL INDICE DE REFRACCIÓN DEL VIDRIO

BALSAMO DE CANADARESINAS SINTÉTICAS

MalinolHistocladEntallan

PermountContinental Pharma

Distirene 100 gr, dibutilftalata 25 gr y xilol o tolueno 350 ml

Material: preferentemente vidrio

Espesor entre 0,13 y 0,17mm

24x 50 o 60mm

Porta y cubreobjeto deben tener superficie plana y paralelas….

Y debido a que el medio de montaje no se mezcla con el alcohol, los preparados deben ser primeros inmersos en xilol y….no dejar secar antes de colocar el balsamo con el cubreobjeto

Evaluación de resultadosLa tinción es evaluada con 4 OBSERVACIONES:

1. INTENSIDAD DEL TINTE AZUL DEL CITOPLASMA DE LAS CÉLULAS INTERMEDIAS

2. INTENSIDAD DEL COLOR VERDE EN CÉLULAS INTERMEDIAS

3. INTENSIDAD DEL COLOR ROJO EN CÉLULAS SUPERFICIALES

4. COLOR DE LAS CÉLULAS PARAKERATÓSICAS

0 sin tinción citoplasmática 4 núcleo=citoplasma CONTRASTE NUCLEO-CITOPLASMA

0 sin tinción 4 intensa

0 sin tinción1 Rojo (monómero Eo) 2 Rojo anaranjado( dímero Eo)3 Naranja (Eo y orange G)4 Amarillo (orange G)

CONTRASTE OPTIMO: VALOR BAJO DEL 1 y VALOR ES ALTO DEL 2 Y 3

DIFERENCIACIÓN ENTRE SUPERFICIALES E

INTERMEDIAS

Variación de los resultados de tinción dentro de la muestra

FONDO: fibrina, necrosis y sangre tienen tendencia a teñirse con eosina, entonces las células se tornan rojizas en lugar de verdosas

AGRUPAMIENTO CELULAR GRUESO Y POBREMENTE EXTENDIDO: células central rojo –anaranjadas y las periféricas, verdosas. Pobre detalle cromatínico.

FIJACIÓN: los sectores desprovisto de moco tienden a secarse más rápido, son afines a la eosina. Las células con citoplasma frágil, tienden a amontonarse y secarse y se pierde el detalle nuclear.

SECTORES BIEN FIJADOSNO AGRUPADOS

CON FONDO LIMPIO O ESCASO

ESTANDARIZAR:

TIEMPOS DE COLORACIÓNCANTIDAD DE BAÑOS, SUMERGIDASCANTIDAD DE LAVADOSESTADO DE LA BATERIA

• Filtrar el alcohol y el xilol si se observan sobrantes • El alcohol absoluto debe mantenerse al 100% y el xilol

puro• Control del PH de manera rigurosa( medir al comienzo

y final de la semana de trabajo)• Filtrar la hematoxilina diariamente• Cambiar cada 100 extendidos los colorantes Orange G

y EA• Remover una vez a la semana todas las soluciones• Lavar con agua destilada las cubetas de tinción, dejar

secar al aire• Excurrir los extendidos antes de pasar a la siguiente

cubeta• Cambiar el agua diariamente

Recomendaciones

Hematoxilina PH < 4EA PH 5OG PH <5 >6

Bibliografía

• Boon Mathilde E., Suurmeijer Albert J. H.: The Pap smear, 1º edición, Leiden, Holanda. Columb Press Leyden, 1991. p.265 – 275.

https://www.youtube.com/watch?v=hCeG1psMRgI

Coloración de zinc nielsen

Muestra clínica mas usual

Muchas Gracias