FACULTADES DE QUETZALTENANGOUNIVERSIDAD RAFAEL LANDIVARFACULTAD DE NUTRICION

Nutrición bacteriana

Y medios de cultivo

CURSO: Microbiología y parasitologíaLic.: Alberto Rafael García

SECCION: “A” Fecha: 6 de Septiembre del 2012

NOMBRES: Eder Vásquez de León 1645608

Introducción.

La fisiología bacteriana comprende el estudio de a bacteriana comprende el estudio de las funciones realizadas por estos las funciones realizadas por estos microorganismos. Microorganismos.

Las bacterias son muy eficientes fisiológico Las bacterias son muy eficientes fisiológicamente, sintetizan en forma muy r sintetizan en forma muy rápida sus componentes pida sus componentes celulares, siendo la mayor celulares, siendo la mayoría autosuficientes auto suficientes a pesar de su simpleza estructural. pesar de su simpleza estructural.

En la bacteria se desencadenan una serie de En la bacteria se desencadenan una serie de procesos químicos que en conjunto constituyen el micos que en conjunto constituyen el metabolismo bacteriano

El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura.

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Índice:

Caratula …………………………………………………………….. ……1Introducción………………………………………………………………..2Índice …………………………………………………………….………. 3Nutrición y crecimiento bacteriano………………………………..........4Tabla 1……………………………………………………………….........4Fuentes de carbono y energía para el crecimiento bacteriano………5Tabla 2……………………………………………………………..……….6SOLUCIONES:…………………………………………………………….7El medio de cultivo………………………………………………………..8Condiciones generales para el cultivo de microorganismos……….141- disponibilidad de nutrientes adecuados…………………………….142- consistencia adecuada del medio……………………………………153- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases…………………164- condiciones adecuadas de humedad………………………………..165- Luz ambiental…………………………………………………………..166- pH………………………………………………………………………..167- Temperatura…………………………………………………………….168- Esterilidad del medio…………………………………………………..17La evolución de los medios de cultivo………………………………..…18Tipos básicos de medios de cultivo atendiendo a su estado físico:..19Atendiendo a su utilidad práctica:………………………………………..19Medios para aislamientos primarios:…………………………………….19Medios para identificación:……………………………………………….19Conclusiones:………………………………………………………………20Comentario:………………………………………………………………..21Bibliografía…………………………………………………………………22Anexos……………………………………………………………………..23

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Nutrición y crecimiento de las bacterias

Cada organismo debe encontrar en su ambiente todas las sustancias requeridas para la generación de energía y la biosíntesis celular. Los elementos o sustancias químicas de este ambiente que son utilizados para el crecimiento de las bacterias son denominados nutrientes o requerimientos nutricionales. En el laboratorio, las bacterias crecen en medios de cultivo que son diseñados para proveer todos lo nutrientes esenciales en solución para el crecimiento bacteriano.

En un nivel elemental, los requerimientos nutricionales de bacterias como E. coli son revelados por la composición elemental de la célula, que consiste en C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, y trazas de Zn, Co, Cu, y Mo. Los elementos se encuentran en forma de agua, iones inorgánicos, pequeñas moléculas, y macromoléculas que sirven tanto al rol estructural como funcional en las células. Las funciones fisiológicas generales de los elementos son resumidas en la siguiente Tabla.

Tabla 1. Principales elementos, sus fuentes y funciones en células bacterianas.

Elemento % de peso seco Fuente Función

Carbono 50 Componentes orgánicos o CO2

Principal constituyente de material celular

Oxígeno 20 H2O, componentes orgánicos, CO2, y O2

constituyente de material celular y agua celular; O2 es aceptor de electrones en la respiración aeróbica

Nitrógeno 14NH3, NO3, componentes orgânicos, N2

Constituyente de aminoácidos, nucleótidos de ácidos nucleicos, y coenzimas

Hidrógeno 8 H2O, componentes orgânicos, H2

Principal constituyente de componentes orgánicos y agua celular

Fósforo 3 Fosfatos inorgánicos (PO4)

Constituyente de ácidos nucleicos, nucleótidos, fosfolípidos, LPS, ácidos teichoic

Azufre 1SO4, H2S, So, componentes de azufre orgânico

Constituyente de cysteína, metionina, glutathione, varias coenzimas

Potasio 1 Sales de potasio Catión inorgánico celular principal y

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cofactor para ciertas enzimas

Magnesio 0.5 Sales de magnesio

Catión inorgánico celular, cofactor para ciertas reacciones enzimáticas

Calcio 0.5 Sales de calcio

Catión inorgánico celular, cofactor para ciertas enzimas y un componente de endosporos

Hierro 0.2 Sales de hierro

Componente de citocromos y ciertas proteínas del hierro y un cofactor para algunas reacciones enzimáticas

La tabla anterior ignora la presencia de elementos en trazas en la nutrición bacteriana. Los elementos en trazas son iones metálicos requeridos por ciertas células en cantidades tan pequeñas que es difícil detectarlos (medirlos), y no es necesario agregarlos al medio de cultivo como nutrientes. Los elementos en trazas son requeridos en cantidades tan pequeñas que están presentes como “contaminantes” del agua u otros componentes del medio. Como iones metálicos, los elementos en trazas habitualmente actúan como cofactores para reacciones enzimáticas esenciales en la célula. Un elemento en traza de un organismo puede ser un elemento requerido por otro y viceversa, pero los cationes habituales calificados como elementos en trazas en la nutrición bacteriana son Mn, Co, Zn, Cu, y Mo.

Para crecer en la naturaleza o en el laboratorio, una bacteria debe tener una fuente de energía, una fuente de carbono y otros nutrientes requeridos, y un rango permisivo de condiciones físicas como concentración de O2, temperatura, y pH. A veces las bacterias son referidas individualmente o en grupos basados en sus patrones de crecimiento bajo varias condiciones químicas (nutricionales) o físicas. Por ejemplo, los fotótrofos son organismos que utilizan la luz como fuente de energía; los anaerobios son organismos que crecen sin oxígeno; los termofónicos son organismos que crecen a altas temperaturas.

Fuentes de carbono y energía para el crecimiento bacteriano

Todos los organismos vivos requieren una fuente de energía.

Los organismos que utilizan energía radiante (luz) son llamados fotótrofos.

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Los organismos que utilizan (oxidan) una forma orgánica de carbono son llamados heterotróficos o quimio (hetero) tróficos.

Los organismos que oxidan componentes inorgánicos son llamados litótrofos.

Los requerimientos de carbono de los organismos deben ser abastecidos con carbono orgánico (un componente químico con una unión de carbono-hidrógeno) o con CO2. Los organismos que utilizan carbono orgánico son heterotróficos y los organismos que utilizan CO2 como única fuente de carbono para el crecimiento son llamados autotróficos.

Así, sobre la base de las fuentes de energía y carbono para el crecimiento se pueden definir los cuatro principales tipos nutricionales de procariotas (Tabla 2).

Tabla 2. Principales tipos nutricionales de procariotas.

Tipo nutricional Fuente de energía Fuente de carbono Ejemplos

Fotoautotróficos Luz CO2

Cianobacteria, algunas bacterias Verde y Púrpura

Fotoheterotróficos LuzComponentes orgánicos

Algunas bacterias Verde y Púrpura

Quimioautotróficos o Litotróficos (Litoautotróficos)

Componentes inorgânicos, por ejemplo H2, NH3, NO2, H2S

CO2Pocas bacterias y muchas Archaea

Quimioheterotróficos o Heterotróficos

Componentes orgánicos

Componentes orgánicos

La mayoría de las bacterias, algunas Archaea

Casi todos los eucariotas son tanto fotoautotróficos (por ejemplo, algas y plantas) o heterotróficos (por ejemplo, animales, protozoos, hongos). La litotrofía es única para procariotas y la fotoheterotrofía, común en las bacterias verde y púrpura, sucede únicamente en muy pocas algas eucarióticas. La fotografía no ha sido encontrada en la Archaea.

Este esquema simple de la utilización del carbono, tanto carbono orgánico como CO2, ignora la posibilidad de que un organismo, si es autotrófico o heterotrófico, pueda requerir pequeñas cantidades de ciertos componentes orgánicos para el crecimiento porque son sustancias esenciales que el organismo es incapaz de sintetizar de los nutrientes disponibles. Tales componentes son llamados factores de crecimiento.

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La nutrición de todos los organismos implica el aprovisionamiento de energía para llevar a cabo las reacciones metabólicas, y el suministro de materiales para la síntesis celular.

En la nutrición heterótrofa, las reacciones catabólicas representan la forma de aprovisionamiento de energía, para lo cual es necesario que exista alguna molécula donadora de electrones para los procesos de producción energética, ya sea la fermentación o la respiración, esta última aerobia o anaerobia. Pero además, estos mismos nutrientes son los utilizados para los procesos de biosíntesis.

En la nutrición autótrofa existe un paso previo, la fotosíntesis (quimiosíntesis), durante el cual el organismo fabrica sus propias moléculas orgánicas a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Además, la energía necesaria para llevar a cabo esta síntesis se obtiene de dos fuentes diferentes: la energía solar o las reacciones químicas.

El metabolismo bacteriano representa uno de los mayores puzzles para el estudiante de bioquímica, ya que presenta todos los tipos de nutrición posible, y todas las rutas metabólicas posibles. El análisis detallado de dichos metabolismos representa una prueba de fuego que mide el grado de comprensión alcanzado con respecto a los diferentes procesos metabólicos estudiados.

Veamos, a continuación, diferentes clasificaciones de las bacterias.Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en:

Si la energía procede de radiaciones: bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser:

· Fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas.

· Fotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas.

q Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de óxido-reducción: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser:

· Quimiolitotrofas: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas.

· Quimioorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas.Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:

q Litotrofas: son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2S0, NH3, NO2-, Fe, etc.).

q Organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos, proteínas, alcoholes...).

SOLUCIONES:1. Los procesos asimilativos se refieren a la utilización de los compuestos para

producir la energía para la asimilación reductora del carbono. En los procesos asimilativos, los productos finales, en este caso los nitratos, son productos de desecho (residuos) que se acumularán en el suelo para alimentar a las plantas.

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En los procesos disimilativos, los compuestos que antes se utilizaban como fuente de electrones ahora son utilizados como receptores de electrones al final de la cadena transportadora de electrones. En este caso, los nitratos son los receptores de electrones, que de esta manera se reducen, produciendo como residuo sustancias como el nitrógeno gaseoso.

2. Las bacterias nitrificantes son quimiolitrotrofas.

3. Fotolitotrofas, fotoorganotrofas y quimiolitotrofas son bacterias autótrofas. Las bacterias quimioorganotrofas son bacterias heterótrofas.

4. Las bacterias quimiorganotrofas tienen un metabolismo semejante al de los animales. Se caracteriza por utilizar moléculas orgánicas complejas para su nutrición, de manera que la energía necesaria para los procesos anabólicos la obtienen de la oxidación de dichas moléculas orgánicas. La diferencia fundamental con respecto a los organismos autótrofos es que carecen de procesos de fotosíntesis (o quimiosíntesis), ya que no es necesaria una transformación energética, puesto que las moléculas orgánicas utilizadas ya contienen energía química lista para ser liberada.

5. Un grupo de bacterias oxida el amoniaco a nitritos con el fin de obtener la energía necesaria para llevar a cabo el Ciclo de Calvin, dejando los nitritos como residuos.

Otro grupo de bacterias utilizan estos nitritos como receptores de electrones en el final de la cadena de transporte electrónico de la respiración. Son grupos de bacterias diferentes, y en ambos casos, los compuestos utilizados participan en dos procesos metabólicos diferentes. Las secuencias de las reacciones tienen lugar en sentido contrario, ya que en un caso la secuencia es oxidativa y en otro caso la secuencia es reductora.

6. La nitrificación y la desnitrificación son dos procesos independientes en la naturaleza, llevados a cabo por grupos diferentes de bacterias.

7. Las bacterias desnitrificantes tienen respiración anaerobia, ya que el aceptor final de electrones no es el oxígeno, sino los nitratos. Sin embargo, del esquema de la nitrificación no podemos decir qué tipo de respiración tienen las bacterias nitrificantes, ya que las reacciones nos proporcionan la oxidación de los donadores en los procesos de reducción del carbono, no la reducción de los aceptores al final de la respiración.

El medio de cultivo

El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura.

• El sustrato de cultivo. La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o menos sólido. El crecimiento en suspensión

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está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de células hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje:

La mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden de disgregación tisular o de tumores formados por células adheridas y mantienen esa característica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse.

Los cultivos en suspensión suelen coincidir con los de aquellas células que “in vivo” son circulantes, en general células sanguíneas. El gran interés que tiene el cultivo de células sanguíneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterización de los cultivos en suspensión. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulación y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante por ej. Tripsinización, posibilidad de cultivo en mayor escala pues sólo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que se pierden las interacciones (espaciales, de adhesión, etc...).

Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes:

Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilización.

Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica.

Plástico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación. El plástico más empleado es el polietileno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofílica. El tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro. Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos orígenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas celulares de crecimiento difícil. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX).

Actualmente es de gran interés, especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas, el uso de membranas plásticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cámara se representa en la figura.

Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (polietileno), de sephadex o poliacrilamida en forma de pequeñas bolas

("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se mantienen en suspensión.

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Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos, de paladio (Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967).

Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, Matrigel, etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/mL) añadido al medio, o con colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares, y especialmente de las células epiteliales.

Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular. Se han descrito métodos para la reconstitución de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular (Reid y Rojkind, 1979). Estos resultados refuerzan la noción cada vez más extendida de que las interacciones célula-matriz extracelular son determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación.

Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratón).

"Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación del medio, o modificación del sustrato. Una de las monocapas más empleadas son los fibroblastos de ratón 3T3 irradiados.

Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional: geles de colágeno

(Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colágeno (Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera análoga a como lo hacen en el tejido de origen: células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular, mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada (Yang y col., 1981).

Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.

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Interfases líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las interfases líquido- líquido o líquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965).

Haces microcapilares permeables (“hollow fiber”). Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio.

Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son: placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3,5, 6,0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de líneas.

Multiplicas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. Ascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la reducción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión. oller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadoras dotados de oller". Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a la producción de gran número e células. Incubador tipo “roller” “Roller bottles” fase gaseosa. Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono: oxígeno. Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares son cubiertas con la tensión atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior. Se ha propuesto (McKeehan y col., 1976) que los requerimientos e selenio en el medio podrían ser debidos a su papel en la detoxificación de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin proteínas séricas. dióxido de carbono. El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3

De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión

CO2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH correcto. Sin embargo, emplean otras sustancias taponadoras en la formulación de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior de pH en el medio, así como una mayor capacidad taponadora (los denominados Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966

Aunque aparentemente podría ser posible prescindir del bicarbonato en la formulación del medio, esto se ha revelado falso, debid probablemente a que la ausencia de bicarbonato sódico desplazaría la ecuación [1] hacia la derecha, de modo que tendería

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a desaparece el CO2 disuelto y eventualmente el ión bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura, 1974).

Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su producción de CO endógeno, haciéndolas independientes de la aportación de CO2 exógeno.

En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO2, cuya concentración esté equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. durante el clonaje) es necesario añadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentración celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO2frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha producción de ácido recomendable, por la elevada producción de CO2 endógeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. Estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio.

Propiedades físicas. Las características del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensión superficial. PH y capacidad taponadora. El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 aunque existen pequeña variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7,4 y 7,7 y células transformadas lo hacen en el margen de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), células epidérmicas pueden ser mantenidas a pH 5,5 (Esfinge y col., 1979). El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6,5, azul-rojo a p 7,6 y púrpura a pH 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH. La solución taponadora empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosférico, a pesar de su escasa capacidad taponadora, debido a: bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solución taponadora de elección por su elevada capacidad taponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con Cexterno, debe estar a concentración doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3).

Osmolaridad. Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260

320 mOsm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la húmeda ambiente.

La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor. Hay que tener ecuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a osmolaridad del medio.

Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un buen control dé está en la incubación. Influye

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asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH de las medias 0,2 unidades debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y despuajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo.

Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinil pirrolidon

(Birch y Pitch, 1971).

Tensión superficial. La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en el cultivo en suspensión donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues estos casos se producen un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza cuello del recipiente de cultivo.

Condiciones fisiológicas. Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el establecimiento das líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extracto

Brionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) l más complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisable un suplemento de suero entre el 5 y el 20%.

A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109 (Evans y co

A aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir

Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue siendo empírica. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son:

Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la suplementación con suero bovinfetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el

laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio

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de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado

más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe

reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión

de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio

de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe

estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos

medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se

añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la preparación de medios de

cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al

enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento

de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificarte pero se emplea mucho menos ya que

bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los

hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el

valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los

microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden

para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por

ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y

no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y

amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el

crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado

por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por

completo al propio medio.

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1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos

casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del

crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de

donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de

estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de

los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno

y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar

directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y

otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a

muchos medias sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente

pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,

magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,

generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer

de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado

semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto

de fusión de este solidificarte y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad,

pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente

extendido en el laboratorio.

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3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno

normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero

los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en

una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos

microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias

(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un

metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los

cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las

estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que

mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se

deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los

microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH

neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar

que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento

bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos

normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y

43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a

temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos

crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los

saprofítos tienen rangos más amplios.

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8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la

aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el

crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios.

El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza

vapor de agua a presión como agente esterilizante)

La evolución de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en

el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los

primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de

cultivo y la utilización del agar como solidificarte, marcan dos importantes puntos de

inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld,

que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base

de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño)

y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo

puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata

como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido,

diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido

transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias

microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación

con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar

(polisacárido extraído de algas rojas) como solidificarte.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal

planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas

bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las

bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran

importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron

este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el

crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos

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metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes

del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores

de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción

de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Tipos básicos de medios de cultivo atendiendo a su estado físico:

Líquidos

Semisólidos

Sólidos

Atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de

organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con

materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros

factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre,

Schaeadler, etc.) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad)

se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de

bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancias

añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-

Vancomicina) enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora

competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito,

medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que

satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su

identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:

Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las

peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de

las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la

identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

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Conclusiones:

Los medios de cultivo son soluciones acuosas donde se desarrollan los microorganismos. El desarrollo de los microorganismos solo ocurre en presencia de los nutrientes requeridos (que dependen del microorganismo particular).

Los componentes de un medio de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuación se describe que es general la necesidad de utilizar: agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificaste

Se pueden utilizar sustancias puras o mezclas de sustancias orgánicas Como sustancias puras más comunes se encuentran los azúcares: Frecuentemente son utilizados como fuente de carbono y energía por los microorganismos. Entre ellos, es común el empleo de monosacáridos como la glucosa, disacáridos como la lactosa y polisacáridos como el almidón. Ciertas bacterias no pueden utilizar los carbohidratos como nutrientes y se emplean otras sustancias puras (aminoácidos, ácidos grasos) o mezclas de sustancias orgánicas.

La nutrición de todos los organismos implica el aprovisionamiento de energía para llevar a cabo las reacciones metabólicas, y el suministro de materiales para la síntesis celular.

En un nivel elemental, los requerimientos nutricionales de bacterias como E. coli son revelados por la composición elemental de la célula, que consiste en C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, y trazas de Zn, Co, Cu, y Mo. Los elementos se encuentran en forma de agua, iones inorgánicos, pequeñas moléculas, y macromoléculas que sirven tanto al rol estructural como funcional en las células. Las funciones fisiológicas generales de los elementos son resumidas en la siguiente Tabla.

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Comentario:

Un organismo para que pueda subsistir necesita encontrarse en un ambiente necesario y las sustancias necesarias para el requerimiento de evolución. En un nivel elemental, los requerimientos nutricionales de las bacterias cualesquiera que sean son revelados por la composición elemental de la célula, que consiste en diferentes compuestos C, H, O, N, S, P, K, y otros. Estos compuestos pueden estar en forma de agua, iones inorgánicos, moléculas y macromoléculas que funcionan para el rol estructural de estas bacterias o virus.

El cultivo se realiza en medio artificial, mediante la mescla de componentes purificados o de soluciones complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones adecuadas sobre soportes del medio exterior.

Debe de cumplir varios aspectos para la proliferación disponibilidad de nutrientes adecuados, consistencia adecuada del medio, presencias de oxigeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio, y los tipos básicos de cultivo es su estado físico: líquido, semisólidos, sólidos.

Entre algunas bacterias tenemos las nitrificantes que son quimiolitrofas, fotolitotrofas, fotoorganotrofas y quimiolitrofas son bacterias autótrofas, hay bacterias quimioorganotrofas que son bacterias heterótrofas.

En general la necesidad de utilizar: agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificaste

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Bibliografía

ESTUDIO DE LA FISIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS PROFESORA: ELCI VILLEGAS

Soluciones Cultivos Celulares Protocolos y técnicas Cultek www.biologia.edu.ar/bacterias/nutric~2.htm Bioquímica de los seres vivos

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Anexos:

Medio de cultivo

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Nutrición bacteriana

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