Director de Área

“Nuevas estrategias para el control y

prevención de las enfermedades transmitidas por vector (ETVs)”

Dr. Cuauhtémoc Juan Humberto Lanz

Mendoza

humberto@insp.mx

Políticas e intervenciones en salud pública

CISEI

Instituto Nacional de Salud PúblicaNuevas estrategias para la prevención y Control de las

Enfermedades Transmitidas por Vectores

Dr. Humberto Lanz Mendoza

humberto@insp.mx

IMMPRESS Magazine.

Department of immunology. University of Toronto

1. Generalidades de la línea de

ETVs.

2. Mosquitos transgénicos.

3. El uso de Wolbachia para

interrumpir la trnasmisión.

4. ¿Vacunación en mosquitos?

5. Conclusión

Problema eje– Dificultades para la prevención y control de las ETVs en áreas endémicas y

y residuales de transmisión.

– Desconocimiento de los factores determinantes de la persistencia de la

transmisión.

– Necesidad de nuevas estrategias para la prevención de las ETVs que sean

amigables con el medio ambiente y costo-efectivas.

– Necesidad de adecuar las intervenciones de prevención y control a la

estructura eco-social y cultural de las comunidades afectadas

– Se requieren actividades dirigidas para inducir la participación comunitaria

en las actividades de control

– Necesidad de establecer mecanismos de vigilancia epidemiológica eficaces

– Ausencia a múltiples niveles gubernamentales y científicos de una visión

estratégica a largo plazo para fomentar la generación de conocimientos

sobre la ETVs.

• Justificación (relevancia)• Existen áreas en donde las medidas tienen efecto limitado.

• El decremento del control ocasiona un repunte de la

endemia y son fuente de brotes epidémicos

• Los factores condicionantes de esta situación no han sido

identificados.

• La percepción sobre estas enfermedades y su control y los

determinantes socioculturales de la interacción con el

personal operativo del Programa de Control requieren de

mejores estrategias.

Objetivo general

• Proporcionar nuevas estrategias de control de

las ETVs en base a:

– Desarrollo de nuevas estrategias de vigilancia

epidemiológica

– Desarrollo de nuevos métodos de control

– Desarrollo de nuevas estrategias de prevención

Obtener

información sobre

el parásito, el vector, el humano

y sus interacciones

Desarrollar

y evaluar

estrategias

comunitarias

Re-evaluar los

métodos de control

y establecer

alternativas

Interacción

vector-agente

causal

Obtener

información sobre

el parásito, el vector,

el humano y sus

interacciones

Desarrollo de vacunas

bloqueadoras de la

transmisión.

Identificación de las

moléculas que permiten

la transmisión de los

parásitos en sus vectores

Determinantes

moleculares y

ecológicos para la

transmisión las

ETVs

Evaluación del

diagnóstico y

tratamiento de

ETVs.

Análisis de las regiones

reguladoras de los genes

involucrados en la respuesta

inmune del los vectores

Desarrollo,

Implementación y

evaluación de pruebas

de diagnóstico

(humanos e insectos

vectores) para ETVs

Re-evaluar métodos

de control y

establecer alternativas

Obtener

información sobre

el parásito, el vector,

el humano y sus

interacciones

Desarrollar y

evaluar

estrategias

comunitarias

Re-evaluar los

métodos de control

y establecer las

alternativas

Bionomia de

mosquitos e

incriminación de

vectores

Evaluación

y manejo de

insecticidas

y agentes

alternativos de

control

Participación

comunitaria y

promoción

social

Interacción

vector-agente

causal

META A LARGO PLAZO

Sistemas de vigilancia y

control en áreas con

transmisión recurrente y

evaluación de nuevas

estrategias comunitarias

para la prevención de las

ETV’s.

META A MEDIANO PLAZOConocimiento actualizado

sobre la interacción parásito-

vector-humano y el ambiente

en áreas con transmisión

recurrente para recomendar

cambios y optimizar los

métodos de control.

Estrategias de vigilancia y control de

transmisión no-vectoriales.

Aspectos económicos de la enfermedad

IMMPRESS Magazine.

Department of immunology. University of Toronto

1. Generalidades de la línea de

ETVs.

2. Mosquitos transgénicos.

3. El uso de Wolbachia para

interrumpir la trnasmisión.

4. ¿Vacunación en mosquitos?

5. Conclusión

Desarrollo de mosquitos transgénicos

Dr. Humberto Lanz Mendoza CISEI

Dr. Raúl Noguez Moreno CISEI

Dr. Enrique Merino Pérez. IBT UNAM

Dr. Ildefonso Fernández Salas CRISP

Desarrollar una vacuna que evite la invasión del

patógeno en el intestino del mosquito.

Desarrollar mosquitos transgénicos con genes tóxicos

que confieran resistencia a la infección con Plasmodium

y dengue.

Nuevas estrategias para bloquear el desarrollo del

patógeno en el mosquito.

Aumentar el conocimiento de la biología de los

patógenos en el mosquito.

Identificar moléculas clave en el desarrollo de los

patógenos.

Identificar componentes clave de la respuesta inmune

del mosquito que elimine a los patógenos de la malaria

y el dengue.

Generar tecnología para prevenir la transmisión de

enfermedades por mosquitos.

PARA CUMPLIR ESTOS OBJETIVOS NECESITAMOS:

Vector del Dengue.

• Mosquito Ae. aegyptise asocia muy estrechamente con los humanos.

• Recipientes artificiales en gran medida sus más importantes lugares de cría.

• Distribuida en el mundo, generalmente dentro de los límites de los 45° de latitud Norte y de los 30° de latitud Sur.

ano

sistema

circulatorio

oviducto

glándula

s

salivales

intestino

Intestino

posterior

probosis

cerebro

tubos de

Malpighi

tráqueas

corazón

Dibujo: Raúl Noguez Moreno

Aedes aegypti

Virus dengue

Intestino

medio

• Siguiendo la ingestión de una alimentación sanguínea (A) todos los patógenos entran en el intestino medio (B). Los virus entran a las células epiteliales del intestino (D), se replican, salen de las células, y viajan a través de la hemolinfa que se encuentra en el hemocele (E) a las glándulas salivales (H), donde se vuelven a replicar y permanecen hasta ser introducidos a un hospedero vertebrado .

TRANSMISION BIOLÓGICA DE

ARBOVIRUS.

The origin of the bacterial immune response. Martínez-Borra et al 2012.

En : Self and nonself ed López-larrea C.

CAS9-gRNA COMO HERRAMIENTA PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS

ELEMENTOS DE TRANSFORMACIÓN EN LA GENERACIÓN DE MOSQUITOS

TRANSGENICOS

P RDL tTAVP2

rel EtetO

RNA2CAS9

gfp

PROMOTOR

ESTADIO

ENBIONARI

O

PL/a

Expresión n el

cuerpo

PROMOTOR

ESTADIO

ORGANO

ESPECÍFICO

Suicida = disminución

del vector

Recombinación

sitio específica de

la construcción

CAS9-gRNA como estrategias de generación de mosquitos transgénicos de

Aedes aegypti

Construcción genéticaCAS9SECUENC

IA SEÑAL

NÚCLEOPnosCAS9nos pgRNA

gRNA

Cromosoma

de A.

aegypti

PURPOSE

Expresses Cas9 under control of

nanos promoter and 3'UTR. For germ

line restricted genome engineering in

Drosophila melanogaster.

DEPOSITING LAB Simon Bullock

PUBLICATION

Port et al Proc Natl Acad Sci U S A.

2014 Jul 7. pii: 201405500.

SEQUENCE INFORMATION

Depositor Sequences: Full (1)

Addgene Sequences: Partial (4)

El plásmido pnos-CAS9-nos expresa la proteína CAS9 en sistema de insectos

DISEÑO DE LA CONTRUCCIÓN DEL PLASMIDO PARA LA EXPRESIÓN DE gRNA en Aedes aegypti

CMV ENHANCER

U6P

gRNARSG

TER III

Diseño y construcción del plásmido para la expresión del gRNA

En general se pueden hablar de dos modelos

El modelo de sustitución de población

(resistente).Supresión poblacional

Desarrollo modelo de Aedes aegypti

transgénicos para reducir las poblaciones.

Suicida = Supresión

poblacional

P SyR a tTAVP2

Letal tetO gfp

tTA Promotos

Sry AlfaP-M

RNApol II

relE PL7a GFP

PAS-TER PAS-TER PAS-TER

Promotor de

Fase

embrionaria

OP

TC

Estrategia Molecular para el control poblacional de Insectos.

(Dominante letal de dos componentes

MuerteSobrevivencia

Selección del Mosco

transgénico verdes

fluorescentes

Modulo efector Marcador genético

Fase

embrionaria

sin tetraciclina

Fase

embrionaria

con tetraciclina

El modelo de sustitución de población

(resistente).

Desarrollo de Aedes aegypti transgénicos

para reducir bloquear la replicación del

DENV, en Chiapas, sur de México.

Antiviral = Resistencia Sustitución poblacional

SCORPINACP/AAPP PL7a

Promotores de

glándulas de intestino

y salivales

Efector

Promotor

constitutivo

Marcador genético

SECUENCIA DE CONTROL PERFIL DE EXPRESIÓN TIPO DE

EXPRESIÓN

PROMOTOR SEXO TEJIDO TEMPORALID

AD

PL7a INDISTINTO METABOLICAMENTE

ACTIVOS

CONSTITUTIV

O

ACTINA5 (Citoesqueleto de

actina)

MACHOS/HEM

BRAS

TODOS LOS

TEJIDOS

CONSTITUTIV

O

AgCP (Carboxipeptidasa) HEMBRAS INTESTINO MEDIO ORGANO

ESPECÍFICO

AAPP Anopheles Anti-

Platelet Protein

(Proteína anticoagulante)

HEMBRAS GLANDULAS

SALIVALES

ORGANO

ESPECÍFICO

Syr a (Factor de

transcripción de fase

embrionaria)

MACHOS/HEM

BRAS

NO DETERMINADO EMBRIÓN

Marcado

r

genético

Expresión

específica de

péptidos

antimicrobianos

Moscos

suicidas

CLONACIÓN DE PROMOTORES PARA LA EXPRESIÓN DE GENES EN Aedes

Construcción de plásmidos para la generación de

moscos transgénicos resistentes a virus dengue

BamHI

oriscorpinaPAS-TER

p1Del-Scorpine

(Sin 6His)

BamHI

oriGFP PAS-TER

PL7a

scorpine

pRN218

PCp/AAPP

BamH I

PAS-TER

Corte y

empalme

PmeI

GFP PAS-TER

PVAC

Sal I

Sal I

pMIBV5HisBoriPAS-TER

XbaI

scorpina

NotI

BamH I

NotI

Xb

aI

NotI XbaI

BamHI

oriGFP TER

PL7a Promotor de

proteína ribosomal

scorpine

pRN218

BamH I

TER

NotIXbaI

PCp Promotor

de

Carboxipetidasa

AAPP Promotor

de Pirasa

Elemento de transformación para generar

mosquitos resistentes de A. aegypti a virus

dengue

Modulo efector Modulo marcador genético

Secuencia de fusión

péptido de secreción

BamHI

GFP TERscorpine

pRN218

BamH I

TER

NotIXbaI

Modulo efector Modulo marcador genético

20 bases locus A.

aegypti

(sitio de recombinación)

20 bases locus A.

aegypti

(sitio de recombinación)

CP AAPP

a) b)

c)

Figura 2. Expresión de EGFP en larvas de Aedes aegypti transformadas. GFP positivas (a) y no

transformadas (b) larvas de mosquito.

8 kDa

1 2 3

Figura. 3.- Ensayo de transferencia Western de larvas de mosquito

transformadas y no transformadas. Carril 1, escorpina nativa purificado

del veneno del escorpión africano; carril 2, extracto proteico de larvas

transformadas; carril 3, extracto proteico de larvas no transformadas.

P RDL tTAVP2

rel EtetO

RNA2CAS9

gfp

SCORPINA

P

CP/AAPP

PROMOTOR

ESTADIO

ENBIONARI

O

Pax6

EXPRESIÓN

EN OJOS

PROMOTOR

ESTADIO

ORGANO

ESPECÍFICO

1)

2)

Antiviral = resistencia

Suicida = disminución

del vector

Recombinación

sitio específica de

la construcción

CRISPR-CAS9 como estrategias de generación de mosquitos transgénicos de

Aedes aegypti

Construcción genética

CAS9SECUEN

CIA

SEÑAL

NÚCLEOPnosCAS9nos pgRNA

gRNA

Resumen

1) Se desarrollaron las herramientas para la generación de mosquitos

transgénicos para la expresión de diferentes efectores para

reducir las poblaciones de mosquitos o para evitar las transmisión

de virus.

2) Se requiere establecer las condiciones más adecuadas de

transformación.

3) Se caracterizarán diferentes líneas transgénicas donde se evaluarán

la inserción eficiente y la expresión de los efectores.

4) Es posible transferir esta tecnología al sector salud.

IMMPRESS Magazine.

Department of immunology. University of Toronto

1. Generalidades de la línea de

ETVs.

2. Mosquitos transgénicos.

3. El uso de Wolbachia para

interrumpir la transmisión.

4. ¿Vacunación en mosquitos?

5. Conclusión

Wolbachia

• Wolbachia es α-proteobacteria– Decendiente del grupo de bacterias gam negativas

• Relacionada a mitocondria– Que se fusiono a los ancestros eucariotas hace aproximadamente 2 mil millones de años

• Es una bacteria endosimbionte obligada de artrópodos y nemátodos (no se puedecultivar)– Forma parte del dominio de eubacterias

• Se encuentra en tejidos reproductivos y se hereda verticamente a través del citoplasma unicamente de la madre.

• Estudios con marcadores moleculares indican que hay transferencia vertical intra e inter especie.

• Genoma secuenciado (1,060,850 bp) con 961 genes que codifican

para proteinas.

• No se pueden cultivar.

• No hay herramientas genéticas para su manipulación

• Baja infectividad de insecto a insecto, pero se transmite a través de

procesos sexuales a la descendencia

• Poco estudiados.

Wolbachia como modelo de estudio.

Tree of Life

Wolbachia se hereda como un organélo (herencia citoplásmica o materna)

Virtualmente

solo hereda el

núcleo

Hereda además del núcleo

todo lo se encuentra el

citosol (mitocondria, pe

Wolbachia).

Incompatibilidad Citoplásmica

El uso de Wolbachia como programa para el control de moquitos

Liberación contínua de

mosquitos machos con

Wolbachia.

Aún no no se conoce el mecanismo

genético que controla la IC Por lo

cual no se ha desarrollado esta

tecnología.

a) La transferencia horizontal puede

afectar otros organismo benéficos.

b) Hay reportes La refractavilidad contra

un virus (dengue, pero se ha encontrado

que genera una mayor factibilidad de

infección contra otro (fiebre amarilla).

Desventajas

IMMPRESS Magazine.

Department of immunology. University of Toronto

1. Generalidades de la línea de

ETVs.

2. Mosquitos transgénicos.

3. El uso de Wolbachia para

interrumpir la trnasmisión.

4. ¿Vacunación en mosquitos?

5. Conclusión

Memora inmunitaria en

mosquitosObjetivo:

• Estudiar una posible inducción anticipatoria de la respuesta

inmunitaria de Anopheles albimanus contra Plasmodium berghei y

de Aedes aegypti contra virus dengue

Infección de Anopheles albimanus con

Plasmodium berghei

Infección de Aedes aegypti con

Virus dengue y bacterias.

Isabel Salazar y cols. BMC Microbiology

2007. 7: 1.-13

Resultados

Oo

cy

sts

nu

mb

er

Short time period Long time period

0

5

10

15

20

25

30

35

Control Priming Control Priming

Prevalencia Periodo corto: Priming 32.66% Testigo 76%

Prevalencia periodo largo: Priming 37.03% Testigo 91.3%

χ2 = 483.6, d.f. = 1, P < 0.0001

(Log-Rank test, χ2 = 32.8, P < 0.0001.

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

0 5 10 15 20 25 30 35

Control

Priming

Mosquitoesage (d)

Cu

mu

lative

su

rvia

l

Secondchallenge

Supervivencia de mosquitos con “priming”.

Especificidad de la protección

Control P. chabaudi P. berghei

Oo

cyst

sn

um

be

r

Expresión de péptidos antimicrobianos durante el priming

a

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 6 12 18 24 48 8 d 0 6 12 18 24

Re

lati

ve

Ex

pre

ss

ion

(X P

.b./

Xn

.i.)

Attacin

Cecropin

Gambicin

b

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 6 12 18 24 48 8d 0 6 12 18 24

Re

lati

ve

Ex

pre

ss

ion

(X

P.b

/X n

.i.)

First challenge Second challenge

Intestino

Tejido abdominal

Costo del priming en la oviposición

Parasites number

Control Priming Control Priming

With eggs Withouteggs

Para

sit

es n

um

ber

Parasites number

Control Priming Control Priming

With eggs Withouteggs

Para

sit

es n

um

ber

Métodos de control

de Insectos

Ventajas Desventajas

Químico 1) Efectividad alta

2) Baratos

3) Fácil aplicación

1) Generación de resistencia

2) No hay especificidad (dañan insectos benéficos).

3) Contamínate en el ambiente,

4) Potencialmente teratógenos y carcinógenos.

Wolbachia 3) Podría ser relativamente baratos. 1) Son obligadamente intracelulares, por lo que no se pueden cultivar fuera de las

células del huésped.

2) No hay herramientas genéticas para manipular este organismo.

4) Baja Infectividad de insecto a insecto; pero se trasmiten a través de los procesos

sexuales a la descendencia

Se requiere la liberación de mosquitos infectados.

5) No son específicos (pudiendo perjudicar especies importantes y generar un

desequilibrio ecológico).

2) Poco estudiados.

3) La protección contra un tipo de virus o patógeno no protege contra otro, o puede dar

mayor susceptibilidad.

Genética Clásica Programas de este tipo han funcionado para el

control de población de insectos.

1) Requiere de infraestructura para la generación de esterilidad de mosquitos.

2) Se requieren estudios de optimización del proceso de esterilización de mosquitos.

3) Genera residuos radioactivos contaminantes.

4) Se requiere de personal altamente especializado en la producción de mosquitos

estériles.

5) Impacto negativo en la salud del personal expuesto a la radiación.

6) Altamente costoso.

Mosquitos transgénicos 1) Puede evitar la diseminación del patógeno o

disminuir o del mosquito.

2) Podría ser la estrategia para exterminar una especie

de mosquito peligrosa para la humanidad.

1) Se debe de comprar o desarrollar la tecnología propia.

2) Se deben de liberar constantemente para generara la refractabilidad a patógenos o

para disminuir la población de insectos,; por que la población transgénica tiende a

desaparecer.

3) Muchos de los modelos transgénicos no han sido probados en campo y muchos de

ellos están en alguna etapa previa de desarrollo.

Dr. Rául Noguez Moreno

Tipos de Control Biológico (Ventajas y desventajas).

TIPO DE

CONTROL

GENÉTICO

SUBTIPO DEFINICIÓN REQUERIMIENTOS VENTAJA DESVENTAJA

I) Control

Genético clásico

de insectos

Tecnología del Insecto

Estéril (SIT Steril Insect

Techology)

La genética clásica utiliza

mutaciones inducidas para generar

esterilidad o disminuir su

capacidad reproductiva

Instalaciones especiales para el uso

de radioactividad

Ha sido probada su

efectividad en diversos

insectos.

1) Es muy costoso respecto a

otras tecnología genéticas

Se generan desechos

radioactivo.

2) Se exponen los seres

humanos involucrados en el

proceso.

3) Se debe de liberar

constantemente mosquitos

irradiados.

4) Se debe de optimizar la dosis

de radiación para tener el

óptimo de esterilidad/viabilidad

y competitividad sexual.

II) Mosquitos

transgénicos

a) Mosquitos refractarios Mosquitos que expresan un

péptido o proteína que evita la

infección del mosquito por el virus

o patógeno.

1) Efector antiparasitario y viral

2) Expresión órgano o tejido

específico

1) Evita la diseminación del

patógeno

2) No extermina a una

especie.

No presenta ventaja

reproductiva.

b) Dominante Letal de

Uno y Dos Componentes

Mosquito que en el que porta un

gen que en el contexto herocigoto

despliega el fenotipo letal.

1) Requieren de un gen letal.

2) El gen letal debe ser fuertemente y

específicamente regulado para

expresarse durante el desarrollo del

mosquito y en el medio ambiente.

1) Disminuye la población

del insecto.

2) Teniendo Líneas

transgénicas se pueden

reproducir en el laboratorio a

un coste mas bajo que la

estrategia SIT, y menos

elaborado.

1) Se debe de comprar o

desarrollar la tecnología propia.

2) Se deben de liberar

constantemente para disminuir

la población de insectos, por

que la población transgénica

tiene a desaparecer.

c) Fenotipo Sin vuelo Insectos incapaces de volar por un

defecto en la musculatura de las

alas.

1)Expresión de una versión del gen

de actina mutante órgano o tejido

específico.

1) Evita la diseminación del

mosquito.

Disminuye la población del

insecto.

1) Se debe de comprar o

desarrollar la tecnología propia.

2) Se deben de liberar

constantemente para disminuir

la población de insectos, por

que la población transgénica

tiene a desaparecer.

d) Gene Drive

(Genéticamente Dirigido;

GD).

Es la práctica de "estimular una

herencia predispuesta o sesgada de

genes particulares para alterar

poblaciones enteras”.

Se requiere de usar un gen egoísta o

el sistema de CRISPR-CAS9 para

favorecer el sesgo genético.

Requiere de un gen efector o blanco

para el control del patógeno o

favorecer incremento de su frecuencia

genética.

1) Favorece su permanencia y

sustitución de poblaciones.

2) Requiere de mucho menos

insectos liberados para

disminuir una población.

3) Podría ser la estrategia

para exterminar una especie

de mosquito peligrosa para la

humanidad

No han sido probados en

campo y muchos modelos de

GD están en alguna etapa

previa de desarrollo.

Tipos de Control Genético (Requerimientos, Ventajas y desventajas).

Dr. Rául Noguez Moreno

Para la elaboración de constancias,

favor de enviar lista de

participantes presenciales con:

Lic. Reina Norma Espíritu Bolaños

Videos y presentaciones anteriores en:

http://www.espm.mx

-Videoconferencias

https://www.facebook.com/espm.insp

sac26@insp.mx