Neuroprotección en la Isquemia Cerebral.Experiencias con la Eritropoyetina Humana Recombinante

Dra. MV. Iliana Sosa Testé,1 Dr. CS. Jorge Daniel García Salman2

1 Médica Veterinaria Facultad de Veterinaria de la Universidad Agraria de La Habana Centro Nacional para la Producción deAnimales de Laboratorio (CENPALAB).2 Doctor en Ciencias de la Salud, Bioquímico Facultad de Medicina Manual Fajardo Dpto. de Neurología Experimental del Institutode Neurología y Neurocirugía. Resumen Las estrategias terapéuticas actuales se encuentran encaminadas al restablecimiento del flujo sanguíneocerebral y a la protección de las células nerviosas en las enfermedades cerebrovasculares. La búsquedade agentes neuroprotectores se ha dirigido al bloqueo de alguno de los eventos moleculares queacontecen en las células nerviosas como consecuencia de la isquemia. La eritropoyetina recombinantehumana constituye una propuesta reciente, que ha mostrado tener mecanismos de acciónneuroprotectores a más de un nivel, y que parece ser una opción prometedora a corto plazo. Su accióneritropoyética puede representar un inconveniente para tratamientos crónicos o en la prevenciónsecundaria. El uso de una eritropoyetina con bajo contenido en ácidos siálicos –con actividadneuroprotectora pero no eritropoyética– puede ser una buena opción. Esta molécula debiera administrarsepor una vía no sistémica como la vía intranasal, para prevenir su degradación hepática. La administraciónintranasal de una eritropoyetina recombinante humana con bajo contenido en ácidos siálicos ha mostradoser rápida y segura en su acceso al encéfalo, no estimula la eritropoyesis en tratamientos agudos ymuestra eficacia terapéutica en varios modelos de isquemia cerebral en roedores. Esta propuesta puedeconvertirse en una opción terapéutica en la enfermedad cerebrovascular.

Palabras clave: Isquemia cerebral, Neuroprotección, Eritropoyetina, Intranasal Abstract The current therapeutic strategies are oriented to reestablish the cerebral blood flow and to protect thenervous cells during cerebrovascular disease. Searching neuroprotective agents has been guided to blocksome of the molecular events that nervous cells suffer as a consequence of ischemia. Human recombinant erythropoietin constitutes a recent proposal, demonstrating to have neuroprotective mechanisms of actionat more than one level, appearing to be a short term promising option. Its erythropoietic action canrepresent an convenience for chronic treatments or in secondary prevention. The use of an erythropoietinwith low content of sialic acids –with neuroprotective activity but not erythropoietic– may be a good option. This molecule should be administered by a non systemic route as is the intranasal in order to prevent thehepatic degradation. Intranasal administration of human recombinant erythropoietin has shown to be quickand safe in accessing the brain, it does not stimulate erythropoiesis in acute treatments and it shows therapeutic effectiveness in several models of cerebral ischemia in rodents. This proposal can become atherapeutic option in cerebrovascular diseases. Key words: Cerebral ischaemia, Neuroprotection, Erythropoietin, Intranasal route.

________________________________________________________________________________ IntroducciónEntre las enfermedades neurológicas más frecuentes en el mundo, se encuentra la enfermedadcerebrovascular (ECV). Constituye la tercera causa de muerte en el mundo desarrollado y es la primera causa de invalidez y de demencia vascular, por lo que se considera una urgencia médica.1, 2 Afecta a un50% de la población mayor de 60 años. La mortalidad por esta enfermedad se incrementaexponencialmente con la edad, duplicándose cada 5 años.3 De acuerdo al tipo de accidente vascular pudeser hemorrágica o isquémica. La estrategia del tratamiento de la isquemia cerebral, en su fase aguda, tiene dos objetivos principales:restauración del flujo sanguíneo cerebral (reperfusión) y la limitación del daño neuronal(neuroprotección).4 Por lo tanto, la orientación terapéutica más importante en los pacientes con infartocerebral se dirigirá a mejorar el flujo sanguíneo cerebral y reducir o bloquear las consecuencias

metabólicas a nivel celular y subcelular.5 Los aspectos más importantes relacionados con el tratamiento de la ECV aguda son los concernientes a cuál tejido isquémico es el blanco del tratamiento, así como cuándo éste va a responder. Estos conceptos nterrelacionados acerca de la zona isquémica potencialmente reversible y de cuándo la misma podría responder a una variedad de modalidades terapéuticas son las bases de los esfuerzos actuales dirigidosa desarrollar tratamientos efectivos para la ECV aguda. Uno de los objetivos principales de lasinvestigaciones en esta área, es desarrollar fármacos que intervengan en la cascada isquémica yreduzcan la cantidad de tejido dañado. De este modo se podrá obtener un mejor resultado clínico,traducido no sólo en sobrevida, sino también en la calidad de vida de los pacientes que sufren eventosvasculares agudos.4 Muchos agentes neuroprotectores se han estudiado, por ejemplo, barredores de radicales libres,antagonistas ácidos, hipotermia, barbitúricos, bloqueadores de calcio, factores de crecimiento, y se haninvestigado otros por varios años. Aunque muchos de estos agentes evidencian efectos terapéuticos en estudios preclínicos con modelos de isquemia (ratas, ratones, o gerbos), ninguno de éstos ha probado concluyentemente efectos correspondientes en humanos.6 Las causas probables por las cuales estosucede son variadas, como son: la elección del modelo animal específico donde se planea evaluar elagente farmacológico, la ventana terapéutica, y la dosis empleada. Una de las mayores dificultades que enfrenta el desarrollo de un neurofármaco para su aplicación es quellegue al sistema nervioso central (SNC), es decir, que sea permeable a la barrera hematoencefálica(BHE). Una estrategia lógica para encontrar una solución a esta dificultad pudiera ser el uso de las mismasmoléculas que el cerebro utiliza ante diferentes injurias, con el objetivo de mantener la homeostasis.7, 8 Generalmente los productos neuroprotectores sintetizados son para se administrarlos por víaintracerebroventricular y parenteral. No obstante a esto, se estudia en la actualidad la vía intranasal, porgrupos de investigadores que han demostrado un eficiente acceso al SNC de muchos neurofármacos poresta vía. Algunas propuestas recientes van más allá de resolver parcialmente el problema de la cascada isquémicae invocan terapias combinadas y el uso de moléculas propias de la neuroprotección endógena.9, 10, 11, 12Un buen candidato de este tipo podría ser la eritropoyetina humana recombinante (rHu­EPO), que se haempleado en el tratamiento de la anemia por insuficiencia renal y en el cáncer. Desde la última década, seinvestiga el efecto de la rHu­ EPO en la protección de las células cerebrales frente al daño isquémico.13, 14, 15 El presente trabajo argumenta –a partir de los resultados de la literatura reciente sobre la isquemia cerebraly algunos aspectos sobre la neuroprotección– la alternativa de utilizar la rHu­EPO como un neuroprotectorpara la isquemia cerebral. Dentro de esta alternativa, argumentamos los beneficios de administrar por víaintranasal una rHu­EPO con bajo contenido de ácidos siálicos. DesarrolloAccidente cerebrovascular isquémico Un accidente cerebrovascular isquémico ocurre cuando una arteriaque suministra sangre al cerebro queda bloqueada, reduciendo repentinamente, o interrumpiendo el flujode sangre y, con el tiempo, ocasionando un infarto en el cerebro. Aproximadamente un 80% de todos losaccidentes cerebrovasculares son de tipo isquémico. Los coágulos son la causa más común de bloqueoarterial y de infarto cerebral.16 La isquemia cerebral puede producirse por diferentes causas quedisminuyan el flujo sanguíneo cerebral por debajo de un nivel crítico (desde 55ml/100g/ min hasta menosde 12ml/100g/min). La consecuencia primaria es la falta de oxígeno y glucosa necesarios para elmetabolismo cerebral.17 Al producirse la cascada de procesos durante la isquemia, comienzan los síntomas clínicos quecaracterizan la ECV.3, 18 La obstrucción de un vaso sanguíneo cerebral ocasiona un gradiente de flujo desangre en el territorio vascular afectado que da lugar a una zona central severamente hipoperfundida(núcleo isquémico), en tanto que en la periferia se establece una isquemia menos pronunciada (penumbraisquémica). La región de penumbra isquémica, donde el flujo residual es inferior al flujo normal einsuficiente para el mantenimiento de la función celular, permanece viable debido a la eficacia de lacirculación colateral. En el núcleo isquémico, con un flujo inferior al umbral del infarto, se produce unamuerte celular aguda, principalmente por necrosis.5 La presencia de la zona de penumbra en la isquemiaaguda, en animales y humanos, se ha establecido por varios estudios de tomografía por emisión depositrones y de imágenes de resonancia magnética. En la penumbra, la función neuronal eléctrica estaabolida, pero se conserva una actividad metabólica mínima que preserva su integridad estructural durantealgún tiempo, hasta que la producción de ATP cae por debajo del 50% de los niveles normales. Se hasugerido que la muerte en la zona de penumbra tiene características de apoptosis en lugar de necrosis.5

Lógicamente el periodo de tiempo durante el cual la penumbra persiste, representa una ventana potencialde oportunidad terapéutica.2, 20 La viabilidad de las células en la zona de penumbra tiene un tiempolimitado ya que la disminución de las reservas de oxígeno y glucosa desencadena diversos procesospatológicos que pueden conducir a la muerte celular.21 De manera que la zona de penumbra constituye elblanco principal para la mayoría de las intervenciones médicas agudas aplicadas entre las 3 y 6 horaspost­ictal.22 Con la manifestación de necrosis del tejido después de 4­6 h de la isquemia, se produce el paso de lasproteínas séricas del plasma al líquido intersticial. Con esta perturbación comienza el edema tipovasogénico. Este tipo de edema se presenta 1­2 días después del ataque de isquemia, y causa un incremento de volumen de alrededor de 8 mL. Si el infarto del cerebro es grande, el volumen del tejidocerebral aumenta y se puede producir el fenómeno de herniación de las estructuras cerebrales. Encondiciones clínicas, este proceso se considera maligno; es la complicación más peligrosa de proceso agudo y una indicación para aplicar terapia de descompresión.23 Tratamiento de la isquemia cerebralActualmente, el tratamiento de la fase aguda de la isquemia cerebral comprende solamente medidasgenerales, ya que los tratamientos específicos todavía no están bien establecidos. Como primera pautaestá la atención inmediata, controlando aspectos generales como las funciones respiratoria y hemodinámica (deshidratación, control de la tensión arterial, mantenimiento de la función cardiaca). Parael tratamiento activo del edema cerebral se emplean diuréticos osmóticos como el manitol al 20%, aunquesu uso está justificado solamente por trabajos y observaciones empíricas. De manera que en la mayoríade los casos el tratamiento depende de los síntomas generales del paciente.3 El período durante el cual los cambios isquémicos pueden ser reversibles constituye la ventanaterapéutica.18, 24 Para los neurólogos una ventana terapéutica aceptable para un neuroprotector estáentre 4 y 6 horas. Teniendo en cuenta la fisiopatología del ictus se pueden derivar tres posibles estrategiasen el tratamiento orientadas a minimizar las consecuencias del accidente cerebrovascular isquémico: 1.Incrementar las reservas energéticas de las células (tratamiento profiláctico exclusivamente). 2. Minimizarel daño restableciendo la perfusión lo antes posible (terapias trombolíticas), y 3. Neuroprotecciónpropiamente dicha. La restauración temprana de la reperfusión del área afectada (terapia trombolítica) seha demostrado como una terapia farmacológica efectiva tanto en modelos animales como en ensayos clínicos,25 y la única aprobada para su uso en clínica. Se debe tener en cuenta también que si laisquemia es lo suficientemente prolongada, el tratamiento trombolítico no sólo no resulta efectivo, sinoque exacerba el daño por reperfusión. Por último, la neuroprotección consiste en impedir o limitar farmacológicamente la progresión de la cascada isquémica en el tejido cerebral, una vez que ésta se hainiciado.26 Según su mecanismo de acción primario, las estrategias neuroprotectoras se pueden clasificar en lossiguientes grupos27:1. Moduladores del sistema de aminoácidos excitadores.2. Moduladores del flujo de calcio.3. Activadores metabólicos.4. Agentes anti­edema.5. Inhibidores de la adhesión leucocitaria.6. Secuestradores de radicales libres.7. Promotores de la reparación de membranas e inhibidores de su degradación.8. Compuestos con efectos desconocidos. Para un futuro próximo, no sólo puede precisar de la combinación de sustancias neuroprotectoras, sino desu asociación con fibrinolíticos, al objeto de optimizar su efi­ cacia y permitir una mayor acción del efectoneuroprotector en el tejido recanalizado, reduciendo el posible daño por reperfusión y, posiblemente,ampliando en el tiempo la ventana terapéutica. En el campo experimental, sustancias como el anticuerpo anti­CD18 (anticuerpo antiadhesión de los leucocitos), en combinación con el fibrinolítico rt­PA, hanmostrado capacidad no sólo de reducción del volumen del infarto, sino de ampliación de la ventanaterapéutica frente a las sustancias utilizadas aisladamente.28 Resulta importante que se utilicen, a nivel experimental, combinaciones de sustancias neuroprotectoras,aunque no hayan demostrado eficacia clínica por separado, ya que la complejidad del proceso de laisquemia cerebral reduce sensiblemente las posibilidades de éxito en solitario.18 Neuroprotección

Bases de la neuroprotecciónLa neuroprotección es una estrategia de tratamiento terapéutico o también profiláctico, cuyo objetivofundamental es prevenir u oponerse a la pérdida neuronal patológica que ocurre en enfermedades del SNCde diferentes orígenes, como por ejemplo en el ictus, neurotrauma y enfermedades neuroinflamatorias yneurodegenerativas.29, 30 Las modernas técnicas de imagenes han mostrado que el volumen del infarto se extiende durante variosdías en los humanos.31 La lesión del cerebro inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, a nivelexperimental, también madura y crece como una función de tiempo. El área de penumbra isquémica secaracteriza por tener un flujo sanguíneo cerebral reducido sin propiedades de excitabilidad eléctrica, perodonde no se perturban irreversiblemente los gradientes de iones.32 De esta manera, la penumbraisquémica ofrece una ventana de tiempo extendida para la terapia de neuroprotectores. La penumbra isquémica puede visualizarse con diferentes técnicas de imágenes, y su recuperación oconversión al infarto, se ha documentado en los modelos experimentales. 33 Los estudios en animalesindican que si el suministro de la sangre no se restaura y el tejido no es protegido metabólicamente en unperíodo de 6 horas, la región de penumbra se deteriora y contribuye al agrandamiento centrífugo del centroisquémico. Se piensa, por consiguiente, que la terapia neurprotectora aguda también pudiera ayudar a lospacientes y que los neuroprotectores deben administrarse dentro de 6 horas.34 Por lo tanto, el objetivo fundamental de la neuroprotección es proteger aquella zona de penumbraisquémica, que es muy difícil de determinar en una clásica tomografía computarizada o resonanciamagnética –dada las características funcionales de estas técnicas– y por consiguiente, se requiererescatar para mejorar la calidad de vida de los pacientes afectados por un ictus (figura 1). En este principiose basa la mayoría de los estudios de fármacos para neuroprotección, además de promover los factoresneurotróficos que garanticen una neuroplastidad del tejido cerebral.

Figura 1: Enfoque de la neuroprotección. Neuroprotección endógenaEn la isquemia también se activan mecanismos endógenos protectores.7, 8 Hace más de una década sedescubrió que, si bien la isquemia repetitiva inducía un daño mayor que la suma total en tiempo de losinsultos, el espaciamiento de los insultos podía inducir neuroprotección. Más tarde se descubrió que laaplicación de un insulto subletal induce en el tejido cambios que lo capacitan para resistir insultos letales posteriores. Otros estímulos, como la hipoxia y la depresión propagada cortical, provocan respuestas similares. Todostienen en común la inducción selectiva de genes específicos que actúan de forma concertada paraincrementar el potencial de supervivencia de las células nerviosas y promover la recuperación funcional. Laadministración de algunos de estos genes o de las proteínas que codifican ­entre las que se destacan losfactores neurotróficos­ ha permitido la obtención de resultados interesantes en modelos experimentales deisquemia global y focal, que se relacionan sobre todo con la inhibición de la apoptosis neuronal inducidapor la isquemia. Estos resultados inducen a pensar en un enfoque alternativo para la protección neuronal,que considera la respuesta endógena del cerebro como una opción prometedora para la terapéutica.9 Estos mecanismos son la base molecular de la tolerancia a la isquemia y se estudia muy en detalle porgrupos de investigadores.8, 35 Por ejemplo, un estímulo generado por un estado hipóxico es factor 1inducible por hipoxia (HIF­ 1). HIF­1 es uno de los sensores céntricos de la hipoxia e induce la expresión deproteínas con actividad angiogénica, eritropoyética y neuroprotectora.36 Se activan proteínas que ejercenun efecto neuroprotector en aproximadamente el 50% de la lesión estudiada. Esta protección incompletasugiere que hay otros mecanismos que también juegan un papel esencial en el precondicionamiento de laisquemia, tales como antiexcitatorios, antiinflamatorios, antiapoptóticos y programas de regeneración yreparación celular.8

En los últimos años se ha progresado de forma importante en el conocimiento de sustancias que actúan endiferentes puntos de la cascada, que conllevan a la muerte por necrosis o por apoptosis, y que interfierencon estos procesos prolongando la vida de la neurona.37, 38 Estos compuestos aparecen promisorioscomo neuroprotectores y son el objeto de estudio en animales de experimentación y ensayos clínicos en elhumano.37 La comprensión de estos mecanismos nos permitirían, en el futuro, inducir protección en pacientes comouna estrategia nueva salvaguardar el cerebro contra la hipoxia cerebral, ya que los resultadosmencionados demuestran que las celúlas del cerebro no es sólo desafían mecanismos deletéreos sino quetambién activan programas innatos que las protegen de la isquemia.7, 8 Medicamentos neuroprotectoresHasta el presente, no existe una droga que sea lo su­ ficientemente efectiva, específica y tenga accesoseguro al SNC, para ser usada como neuroprotector en enfermedades neurológicas en etapa aguda ocrónica. Además, la mayoría de los agentes o drogas utilizados como neuroprotectores efectivos enbiomodelos de isquemia fallan por no ser toleradas clínicamente.39 El conocimiento progresivo de la compleja fisiopatología de la isquemia cerebral, ha condicionado eldesarrollo de una gran cantidad de sustancias para bloquear, a diferentes niveles, la cascada isquémica.Muchas de estas sustancias han demostrado una considerable eficacia en diversos modelos animales deisquemia cerebral, especialmente reduciendo el tamaño del infarto. Sin embargo, el traslado de estosresultados a la clínica humana no ha sido exitoso.40, 41, 42 La excepción ha sido el activador tisular delplasminógeno (tPA),25 aunque tiene una utilidad limitada, por lo que todavía se continúa en la búsquedade terapias aplicables de una forma más general para el tratamiento de la isquemia aguda y el infartohemorrágico.40 La normalización del flujo sanguíneo cerebral (FSC) promueve una recuperación completa solo cuandotiene lugar muy precozmente y puede contribuir a evitar la extensión del infarto en las primeras 3­6 h(ventana para la reperfusión). De no ser así, la cascada isquémica se torna imparable y es inclusopotenciada por la reperfusión, que por sí misma es responsable de otros daños. Estos efectos pueden serminimizados mediante citoprotectores, dentro de un tiempo limitado denominado ventana de citoprotección,probablemente más amplia (8­12 h), antes de que la lesión se complete y se vuelva irrecuperable.2, 3 En lapráctica, el tiempo desde el establecimiento de los síntomas de la isquemia y su tratamiento, es un factorcrítico que determina la eficacia de la neuroprotección. Como se ha podido observar el conocimiento acerca de la fisiopatología de la isquemia cerebral, sumodelación en animales y la búsqueda de nuevos medicamentos que pudieran mejorar e incluso prevenirel daño al tejido isquémico es fuente inagotable de preguntas para las investigaciones en el campo de lasneurociencias. La rHu­EPO como neuroprotectorLa mayoría de los agentes terapéuticos neuroprotectores efectivos en biomodelos de isquemia fallan porno ser tolerados clínicamente.5, 43 Una estrategia lógica para encontrar una solución a esta dificultadpudiera ser el uso de las mismas moléculas que el cerebro utiliza ante diferentes lesiones44 en su luchapor mantener la homeostasis. La eritropoyetina humana recombinante (rHu­EPO) es uno de los diez productos más vendidos por labiotecnología mundial. Es una glicoproteína que se produce fundamentalmente en el riñón y estáinvolucrada en la proliferación, diferenciación y maduración de los eritrocitos y otras célulashematopoyéticas, aumentando el suministro de oxígeno a los tejidos.45, 46, 47 La observación de que la rHu­EPO es expresada en el cerebro y es regulada por el factor inducible porhipoxia­1 (HIF­1) (44,46) el cual es activado por una amplia variedad de estresores, ha estimulado eldesarrollo de estudios del efecto neuroprotector de la rHu­EPO en diferentes modelos de infartocerebral.48, 49, 50, 51, 52 Se ha comprobado que la eritropoyetina y su receptor (r­EPO) se expresan en el tejido cerebral, y que estaexpresión aumenta durante la isquemia cerebral, lo que sugiere su participación en un sistema neuroprotector endógeno en el cerebro de mamíferos.53, 54, 55 La efectividad de la rHu­ EPO comoneuroprotector se ha probado en modelos de daño del sistema nervioso en ratón, rata, gerbo y conejo,incluyendo la isquemia cerebral focal y global56, 57, 58, 59, 60 donde se ha demostrado que reduce lamuerte neuronal.

Aunque todavía se investiga el mecanismo neuroprotector de la rHu­EPO, se ha planteado que su acciónestá mediada por receptores que se encuentran en las paredes del endotelio vascular y en losastrocitos.54, 55 Los mecanismos de la rHu­EPO como agente neuroprotector parecen ser multifactoriales.La rHu­EPO puede mediar la neuroprotección indirectamente restaurando el flujo sanguíneo al tejidodañado o actúa directamente sobre las neuronas por activación de numerosas vías de señalizaciónmolecular. La molécula de rHu­EPO aumenta la expresión de enzimas antioxidantes y reduce la formaciónde radicales libres mediada por el óxido nítrico, a través de un mecanismo que involucra la Janus TyrosinKinase 2 (JAK2) y el factor nuclear NF­κB.44, 61 Su acción antioxidante también se sustenta en elrestablecimiento de las actividades de la catalasa citosólica y la glutatión peroxidasa en eritrocitos, lo cualprotege contra el estrés oxidativo a través de la reducción de la peroxidación lipídica.62 Se ha demostrado que la rHu­EPO tiene también actividad neurotrófica, lo cual implica un efecto de mayorlatencia que la inhibición de la apoptosis60, 62 y disminuye la excitotoxicidad neuronal, la cual seencuentra involucrada en muchas formas de lesión cerebral. La rHu­EPO promueve la angiogénesis como respuesta a la hipoxia y el daño neuronal, al igual que otrascitocinas inducidas por HIF­1,63, 64, 65, 66 estimulando la formación de pequeños microvasos a través dela interacción con su receptor en los vasos sanguíneos.54, 55 Su acción antiapoptótica está dada por la activación mediada por r­EPO de JAK2, que conlleva a laactivación del NF­κB y la sobreexpresión de los genes inhibidores de la apoptosis XIAP y c­IAP2.62, 63,64, 65, 66 En el hipocampo del gerbo, la rHu­EPO es capaz de proteger las neuronas del daño isquémicopor sobreexpresión del gen antiapoptótico Bcl­x.60 La rHu­EPO inhibe la expresión de Bax en célulasPC12, e incrementa la expresión de Bcl­XL, miembro del grupo de las proteínas antiapoptóticas Bcl­2.52,61 Además estimula la supervivencia celular inhibiendo el complejo MAPK y PI3K/Akt que promueve la apoptosis.60 La rHu­ EPO se ha identificado como un mediador potente de la tolerancia a la isquemia.8 Lamolécula actúa en las vías de transducción de señales y activadores de la transcripción que convergen enel efecto neuroprotector de la familia de las proteínas BCL contra la apoptosis.60 Todo lo anterior sugiere que sus efectos comprenden el control del balance de expresión de moléculas pro­ y anti­apoptóticas.45 La neuroprotección atribuida a la rHu­EPO puede deberse también a su efecto antiinflamatorio.67 Laadministración de rHu­EPO en el modelo de isquemia focal en ratas disminuye notablemente la migraciónde células inflamatorias al tejido isquémico, atenuando la producción de citocinas proinflamatorias y disminuyendo el tamaño de la lesión.18, 55, 60 La inflamación aumenta la lesión cerebral por varios mecanismos, incluso inhibe directamente laproducción de EPO local.68 De hecho, aunque la eritropoyetina es producida en el cerebro después de laisquemia, su expresión es inhibida notablemente por citocinas inflamatorias y por especies reactivas deoxígeno.61, 63 Esto podría contribuir al conocimiento del papel de estos mediadores en la patogénesis deisquemia y explicar por qué la administración exógena de rHu­EPO puede ser especialmente beneficiosa. Se plantea también que la rHu­EPO podría ejercer su efecto antiinflammatorio por inhibición de laseñalización molecular por parte de las neuronas dañadas. En experimentos in vitro69, 70, 71, 72 que usancocultivos de células gliales y neuronales donde la muerte neuronal esta asociada con la liberación defactores que inducen la liberación de TNF por células gliales, se han encontrado evidencias convincentesde que la acción antiinflamatoria de la rHu­ EPO protege dichas células. Teniendo en cuenta las propiedades de rHu­EPO, Ehrenreich y colaboradores realizaron el primer ensayoclínico con rHu­EPO en isquemia cerebral aguda, con una ventana terapéutica dentro de las primeras 8 h.Los autores reportaron una reducción significativa del área infartada en los pacientes tratados, asociadacon una notable recuperación neurológica y una mejoría clínica, un mes después de la isquemia.73 Elincremento de los niveles de rHu­EPO en suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) sugieren que la rHu­EPOcruza la barrera hematoencefálica dañada y protege de manera efectiva ante el daño isquémico cerebral,como ha sido reportado por otros investigadores.54 No se han observado efectos colaterales tras eltratamiento con rHu­EPO en la isquemia o en otras enfermedades neurodegenerativas. 47 Los resultados obtenidos por Ehrenreich y colaboradores, indican que la rHu­EPO mejora la oxigenación del tejidocerebral y reduce el volumen de infarto, confiriéndole un excelente aval para su utilización comoneuroprotector contra la isquemia cerebral. Se ha reportado el uso de rHu­EPO en modelos de animales de hemorragia subaracnoidea,74 hemorragiaintracraneal, 75 trauma craneoencefálico76, 77, 78 y en el daño de la médula espinal.79, 80 También se hademostrado que reduce el daño neuronal funcional en modelos de encefalitis81, 82 y esclerosismúltiple,83, 84 mejora la neuropatía del diabético85 y la isquemia de la retina.86 Recientemente se ha

descrito su acción cardioprotectora en perros,56, 87 y además su uso como tratamiento en laesquizofrenia,88 la hipoxia perinatal89, 90, 91 y el cáncer.92, 93 debido a sus efectos estimuladores sobrela plasticidad neuronal, pudiera tener efectos sobre la recuperación a largo plazo en pacientesdiscapacitados por ECV o enfermedades neurodegenerativas.94 Administración intranasal de rHu­EPO con bajo contenido en ácidos siálicos (rHu­EPOb)Actualmente, en los estudios preclínicos y clínicos donde se ha utilizado la rHu­EPO como neuroprotector,se han empleado las vías intraperitoneal e intravenosa. 47,50,52,95 Esto constituye un riesgo potencial deestimulación de la eritropoyesis, la cual incrementaría la viscosidad de la sangre. Una sangre menos fluidaconllevaría a un empeoramiento de la hemodinámica cerebral en la región afectada. El tratamiento crónicocon rHu­EPO en la prevención secundaria podría elevar las cifras de hematocrito en los pacientes, lo cualpodría introducir una complicación adicional en el caso de que se presentara un accidente cerebrovascular.Por lo tanto, la búsqueda de derivados de rHu­EPO sin actividad eritropoyética, pero que conserven suspropiedades neuroprotectoras, ha sido propuesta por varios grupos de investigadores y ha sido coronadapor el éxito en la práctica con derivados asialilados y carbamilados.56, 96 En nuestro caso, usamos una molécula de eritropoyetina con bajo contenido en ácidos siálicos, similar a laeritropoyetina sintetizada en el cerebro en condiciones de isquemia.45, 49 Esta molécula tendrá que evadirsu paso por el hígado donde sería degradada antes de llegar al SNC. Por lo tanto, la vía intravenosaestaría contraindicada de antemano en este caso. Una posibilidad factible, aunque poco explorada, sería laadministración intranasal. Existen reportes del uso de la vía intranasal para hacer llegar moléculas al SNC.97, 98 Se ha demostradoel paso al cerebro de otras proteínas con actividad trófica o neuroprotectora por esta vía.99 En trabajosrecientes se ha demostrado la efectividad de la vía intranasal de la rHu­EPO para el tratamiento del dañoisquémico en modelos de isquemia focal en rata100 y en modelos de isquemia unilateral permanente eisquemia bilateral transitoria en el gerbo de Mongolia, en este caso tratando con rHu­EPOb.102, 102, 103 La región olfatoria tiene atributos anatómicos y fisiológicos únicos que definen vías extracelulares eintracelulares hacia el SNC, que evaden la BHE.104, 105 En la parte superior de la cavidad nasal seencuentran las terminales nerviosas responsables de conducir la información del olor. Por los orificios de laplaca cribiforme pasan los haces de cordones nerviosos que constituyen el tracto olfativo del SNC, que se extiende desde la base del cerebro a diferentes regiones subcorticales. Esto permite que una administración de pequeñas cantidades de rHu­EPO penetre rápidamente al cerebro y difunda por ellíquido intersticial. Por lo tanto, la vía intranasal puede ser utilizada para el tratamiento profiláctico y/oterapéutico del SNC.106 Estudios recientes han demostrado que la rHu­EPOb marcada con I125 administrada por vía intranasal enel gerbil de Mongolia llega a regiones del cerebro en al menos 5 minutos y su contenido va disminuyendode forma gradual de la región frontal a la caudal.107 Otra evidencia en el primate Macaca fascicularis esque el contenido de eritropoyetina en el LCR se incrementó en alrededor de de 1500 veces a los 5 minutostras la administración intranasal, mientras que el pico de rHu­EPOb después de la administraciónintravenosa fue encontrado a los 15 minutos, con un incremento de sólo 400 veces. Esta sería una ventajaadicional del uso de la vía intranasal, que podría ser más segura y rápida que la vía endovenosa.107 El edema del hemisferio correspondiente a la oclusión permanente de la carótida no fue observado cuandola rHu­EPOb fue aplicada por la vía intranasal en el gerbo de Mongolia. En el mismo modelo, se logró unareducción significativa de la mortalidad, así como de los signos clínicos de infarto a las 24 h, obteniéndoseuna supervivencia de 66% en hembras y de 73% en machos al tratarlos con rHu­EPOb, contrastado con un47% y un 57% al tratarlos con vehículo, respectivamente.103 La incidencia de eventos histopatológicos en el tejido cerebral a los 7 días de la oclusión unilateral de lacarótida fue significativamente menor en animales tratados con rHu­ EPOb por vía intranasal, durante los 4días posteriores a la oclusión.108 En el modelo de oclusión bilateral de las carótidas durante 6, 8 y 10 min,el tratamiento con rHu­EPOb logró disminuir la muerte neuronal retardada en el sector CA1 delhipocampo.101 En ambos modelos se ha encontrado un efecto preservador de la conducta de habituaciónen la actividad exploratoria espontánea, en animales tratados con rHu­EPOb, lo cual evidencia laconservación de la integridad estructural en las regiones cerebrales relacionadas con el aprendizaje y lamemoria a corto y largo plazo.108 Además han sido investigadas por nuestro grupo las potencialidades del tratamiento con rHu­EPOintranasal en el modelo unilateral permanente del gerbo de Mongolia, retardando el comienzo deltratamiento por 6, 12 y 18 horas. Se registró la mortalidad asociada a la isquemia durante los 7 díasposteriores a la cirugía. Se comparó la actividad exploratoria espontánea antes de la oclusión y 7 días

después. Los resultados muestran una supervivencia mayor en los grupos de animales que recibieron eltratamiento inmediatamente y con un retardo de 6 y 12 horas, que los que recibieron vehículo. En todos losgrupos tratados se observa una conducta de habituación mayor en la actividad exploratoria a los 7 díasque antes de la oclusión, indicando una integridad de los procesos de aprendizaje y memoria, mientrasque el grupo tratado con vehículo no hubo diferencia. A los 7 días se encontró una pérdida de la habituación en el grupo tratado con vehículo, respecto al grupocontrol no isquémico, lo cual no fue hallado en ninguno de los grupos tratados. Los resultados sugieren unaventana terapéutica del tratamiento utilizado de al menos 12 horas para los eventos agudos de la isquemiahemisférica, que pudiera extenderse a las 18 horas en animales con un daño menos severo (resultados no publicados). En el modelo de oclusión de la arteria cerebral media en ratas durante 2 horas, los animales tratados conrHu­ EPOb por vía intranasal mostraron menores volúmenes de tejido isquémico y un mejor estado clínicoa las 48 horas (resultados no publicados). Los resultados obtenidos por nuestro grupo en roedores,muestran eficacia terapéutica tanto en la fase aguda y crónica de la isquemia, como en modelos deisquemia reperfusión, sugiriendo la presencia de efectos neuroprotectores en la estructura y la función cerebral. Estos resultados constituyen evidencias indirectas del paso de la molécula de rHu­EPOb por lavía intranasal en condiciones de isquemia y en cantidades equivalentes a la dosis terapéutica. En laactualidad, la seguridad es una de las mayores exigencias que tiene cualquier producto biotecnológico. Enel caso de la vía intranasal, se ha demostrado en ensayos muy recientes, que la rHu­EPO con bajocontenido de ácidos siálicos ­estudiado por nuestro grupo­ no estimula los factores hematopoyéticos enratones B6D2F1 y en el M. fascicularis no se modifican los parámetros sanguíneos de hemoglobina yhematocrito a 14 días de la administración de rHu­EPOb intranasal (resultados no publicados). En conclusión, la estrategia de neuroproteger en el ictus es actualmente muy discutida entre los clínicos.Sin embargo, es una propuesta de la investigación en las neurociencias –con una fuerte base teórica yresultados preclínicos– la utilidad de algunas moléculas como la rHu­EPO, cuyo uso ha resultado ser muyimportante en enfermedades cerebrovasculares y degenerativas, convirtiéndose en un excelente candidatocomo citoprotector en el humano. La administración por vía intranasal de rHu­ EPOb constituye una víaalternativa viable y prometedora para futuros estudios clínicos, donde su utilización crónica en laprevención de accidentes cerebrovasculares es una posibilidad potencial. Bibliografía1. Annual Health Statistcs report, 1999, 21. 2. Hill MD, Hachinski V. Stroke treatment: Time is brain. Lancet 1998, 352 (Suppl): 10­14. 3. Miranda Q. J. A. Enfermedades cerebrovasculares. Editorial Oriente. Instituto Cubano del Libro, 2004. 4. Lainez J.M., Santonja J.M. Historia natural de la enfermedad vascular cerebral. En: Castillo J, Alvarez,Sabin J, Marti Vilalta JL, Martinez E, Matias Guiu J. Manual de enfermedades vasculares cerebrales. JRProus, 55, 1999. 5. Rodríguez M. L., Galvizu S.R., Alvarez G.E. Neuromodulación farmacológica en la enfermedadcerebrovascular. Temas actualizados. Rev. Cubana Med 2002, 41(2). 6. Fisher M. Finklestein S.P., Furlan J.A., Goldstein B.L., Gorelinck P.B., Kaste M., Kennedy R.L.,Traysman R.J. Recommendations for standarts regarding preclinical neuroprotective and restorative drugdeveloment. Stroke 1999, 30, 2752. 7. García Salman J.D. Protección neuronal endógena: un enfoque alternativo. Rev Neurol 2004, 38(2), 150. 8. Dirnagl U, Simon RP, Hallenbeck JM. Isquemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends inNeurocience 2003, 26 (5): 248­254. 9. García Salman J.D. Protección neuronal endógena: un enfoque alternativo. Rev Neurol 2004; 38(2): 150. 10. Dirnagl U, Simon RP, Hallenbeck JM. Isquemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends inNeurocience 2003; 26 (5): 248­254. 11. Villa Pia, Bigini P., Mennini Tiziana, Agnello D., Laragione Teresa, Cagnotto A., et al. Erythropoietin

selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronalapoptosis. J Exp Med 2003; 198: 971. 12. Weiss MJ. New Insights into erythropoietin alfa: Mechanisms of Action, Target Tissues, and clinicalapplication. Oncologist 2003; 18 (Suppl 3). 13. Sakanaka M, Wen TC, Matsuda S, Masuda S., Morishita E, Nagao M, and Sasaki E. In vivo evidencethat eritropoietin protects neurons from ischemic damage. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95:4635–4640. 14. Marti H.H. Erythopoietin and hypoxic brain. Review article. Journal of Experimental Biology 2004; 207:3233. 15. Van der Meer P, Voors A., Lipsic E, van Gilst W, van Veldhuisen D. Erythropoietin in cardiovasculardiseases. European Heart Journal 2004; 25(4): 285­291. 16. Castillo J, Martí­Vilalta JL, Martínez­Vila E, Matías­ Guiu J. Manual de enfermedades vascularescerebrales. Barcelona, España, 1999. 17. Guevara García Mariela, Rodríguez Raisa, Álvarez León Alina, Riaño Montalvo Annia, Rodríguez P.C.Mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad cerebrovascular isquémica, Rev Cubana Med 2004;43(4). 18. Fisher M. El objetivo del tratamiento en la enfermedad cerebrovascular aguda y los enfoquesterapéuticos neuroprotectores. Rev Neurol 1999; 29:536­544. 19. Castillo J, Rodríguez I. (). Biochemical Changes and Inflammatory Response as Markers for BrainIschaemia: Molecular Markers of Diagnostic Utility and Prognosis in Human Clinical Practice.Cerebrovascular Diseases 2004; 17:7­18. 20. Romano J G.. Tratamiento Agudo del Infarto Cerebral. Revista Ecuatoriana de Neurología 2005; (14):1­3 21. Hossmann K. A. Pathophysiology and Therapy of Experimental Stroke. Cellular and MolecularNeurobiology 2006; (26): 7/8, October/November. 22. Kwakkel G, Kollen B, Lindeman E. Understanding the pattern of functional recovery after stroke: Factsand theories. Restorative Neurology and Neuroscience 2004; 22:281­299. 23. Dombovy ML, Bach­y­Rita. P. Clinical observations on recovery from stroke. Adv Neurol 1988; 47: 265­276. 24. Danica B. Stanimirovic, Dejan V. Micic, Marina Markovic, Maria Spatz, Bogomir B. Mrsulja. Therapeuticwindow for multiple drug treament of experimental cerebral ischemia in gerbils. Neurochemical 1994; Vol 192):189­194. 25. NINDS rt­PA stroke study group Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. N Engl J Med1995; 333:1581­7. 26. Pérez Asensio FJ. Isquemia cerebral focal transitoria en rata: caracterización y utilidad del modelo de lasutura intraluminal en el estudio de estrategias neuroprotectoras. Tesis para optar al grado de doctor enciencias biológicas. Universidad de valencia, 2005. 27. Dorman PJ, Counsell CE, Sandercock AG. Recently developed neuroprotective therapies for acutestroke. A qualitative systematic review of clinical trials. CNS Drugs 1996; 5:457­74. 28. Takano K, Tatlisumak T, Formato J. A glycine site antagonist attenuates infarct size in experimentalfocal ischemia: postmortem and diffusion mapping studies. Stroke 1997; 28: 1255­63. 29. Sirén AL y Ehrenreich H. EPO ­ a novel concept for neuroprotection. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci2001; 251: 179–184.

30. Grasso G, Sfacteria A, Cerami A, Brines M. Erythropoietin as a tissue­protective cytokine in brain injury:what do we know and where do we go? Neuroscientist 2004; 10:93­98. 31. Karonen JO, Vanninen RL, Liu Y, Ostergaard L, Kuikka JT, Nuutinen J, Vanninen EJ, Partanen PL,Vainio PA, Korhonen K, Perkiö J, Roivainen R, Sivenius J, HJ. A Combined diffusion and perfusion MRIwith correlation to single­photon. Stroke 1999; 30:1583­1590.

32. Astrup J, Siesjö BK, Symon L. Thresholds in cerebral ischemia: The ischemic penumbra. Stroke 1981;12: 723­725. 33. Heiss WD. Ischemic penumbra: evidence from functional imaging in man. J Cereb Blood Flow Metab2000;20:1276­1293. 34. Muir K.W. and Grosset D.G. Neuroprotection for acute stroke. Making clinical trials work. Stroke 1999;30,180. 35. Weih, M., Kallenberg, K., Bergk, A., Dirnagl, U., Harms, L., Wernecke, K.D., and Einhaupl, K.M.Attenuated stroke severity after prodromal TIA: A role for ischemic tolerance in the brain? Stroke 1999;30:1851– 1854. 36. Prass, K., Scharff, A., Ruscher, K., Lowl, D., Muselmann, C., Victorov, I., Kapinya, K., Dirnagl, U., andMeisel, A. Hypoxia­induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke 2003;34:1981– 1986. 37. García­Galloway E, Arango C, Pons S, Torres­Alemán I. Glutamate excitotoxicity attenuates insulin­likegrowth factor­I prosurvival signaling. Mol Cell Neurosci 2003; 24:1027­37. 38. Cardona­Gómez GP, Arango­Dávila C, Gallego­Gómez JC, Pimienta H, García­Segura LM. Estrogeninhibits glycogen synthase kinase­3b and modulates the interaction of the microtubule­associated proteinTau with glutamate receptor subunits in post­ischemic hippocampus: implications for hormonalneuroprotective mechanisms. Mol Brain Res 2004; 25:178­187. 39. Doppenberg, E.M; Choi, S.C; Bullock, R. Clinical trials in traumatic brain injury: what can we learn fromprevious studies? Neuroprotective agents – Third international conference. Ann NY Acad Sci 1997;825:305­22. 40. Diener H­C. For the European and Australian Lubeluzole Ischemic Satroke Study Group Multinationalrandomised controlled trial of lubeluzole in acute ischaemic stroke. Cerebrovascular Diseases 1998; 8:172. 41. Grotta J. For the US and Canadian Lubeluzole Ischemic Stroke Study Group Lubeluzale treatment ofacute ischemic stroke. Stroke 1997; 28: 2338. 42. Davis S.M., Alber G.W., Diener H.C., Lees K.R. and Norris J. Termination of acute stroke studiesinvolving selfotel treatment: ASSIST Steering Committee. Lancet 1997; 32:349. 43. Fisher M. The ischemic penumbra—identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis2004; 17(1):1–6. 44. Digicaylioglu M, Garden G, Timberlake S, Fletcher L, Lipton SA. Acute neuroprotective synergy oferythropoietin and insulin­like growth factor I. Ugeskr Laeger 2004; 101: 9855. 45. Jelkmann W. Molecular biology of erythropoietin. Intern Med 2004;43:649–659. 46. Wenger RH, Gassmann M. Oxygen(es) and the hypoxiainducible factor­1. Biol Chem 1997; 378:609–16. 47. Gassmann M, Heinicke K, Soliz J, Ogunshola OO, Marti HH, Hofer T, Grimm C, Heinicke I, Egli B.Nonerythroid functions of erythropoietin. Adv Exp Med Biol 2003; 543:323. 48. Kalialis LV, Olsen NV. Erythropoietin­­a new therapy in cerebral ischemia?. Ugeskr Laeger 2003; 165:

2477. 49. Eid T, Brines M. Recombinant human erythropoietin for neuroprotection: what is the evidence?. ClinBreast Cancer 2002; 3: 109­15. 50. Marti H, Bernaudin M, Petit E, Bauer C. Neuroprotection and Angiogenesis: Dual role of erythropoietinin brain ischemia. News of Physiology Science 2000; 15: 225­229. 51. Lipšic E, Schoemaker R., van der Meer P, Voors A., van Veldhuisen D., van Gilst W. Protective effectsof erythropoietin in cardiac ischemia: from bench to bedside. 2006; Chapter 8. 52. Bernaudin M, Marti HH, Roussel S, Divoux D, Nouvelot A, MacKenzie ET, Petit E. A potential role forerythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19: 643– 651. 53. Marti HH, Wenger RH, Rivas LA, et al. Erythropoietin gene expression in human, monkey and murinebrain. Eur J Neurosci 1996; 8:666–676. 54. Juul SE, Anderson DK, Li Y, et al. Erythropoietin and erythropoietin receptor in the developing humancentral nervous system. Pediatr Res 1998; 43:40–49. 55. Siren AL, Fratelli M, Brines M, et al. Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemiaand metabolic stress. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:4044–4049. 56. Leist M, Ghezzi P, Grasso G. Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but noterythropoietic. Science 2004;305:239–242. 57. Catania MA, Marciano MC, Parisi A, Sturiale A, Buemi M, Grasso G, Squadrito F, Caputi AP, Calapai G.Erythropoietin prevents cognition impairment induced by transient brain ischemia in gerbils. Eur. J.Pharmacol 2002; 437: 147– 150. 58. Belayev L, Khoutorova L, Zhao W, et al. Neuroprotective effect of darbepoetin alfa, a novel recombinanterythropoietic protein, in focal cerebral ischemia in rats. Stroke 2005;36:1071–1076. 59. Siren AL, Knerlich F, Poser W. Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic/hypoxicbrain. Acta Neuropathol 2001; 101: 271­276. 60. Sadamoto Y, Igase K, Sakanaka M, Sato K, Otsuka H, Sakaki S, Masuda S, Sasaki R. Erythropoietinprevents place navigation disability and cortical infarction in rats with permanent occlusion of the middlecerebral artery. Biochem Biophys Res Commun 1998; 253: 26– 32. 61. Calapai G, Marciano MC, Corica F, Allegra A, Parisi A, Frisina N, Caputi AP, Buemi M. Erythropoietinprotects against brain ischemic injury by inhibition of nitric oxide formation. Eur J Pharmacol 2000; 401:349– 356. 62. Chattopadhyay A, Choudhury TD, Bandyopadhyay D, Datta AG. Protective effect of erythropoietin onthe oxidative damage of erythrocyte membrane by hydroxyl radical. Biochem Pharmacol 2000; 59: 419–425. 63. Cerami A, Brines M, Ghezzi P, Cerami C, Itri LM. Neuroprotective properties of eripthopoietin alfa.Nephrol Dial Transplant 2002; 17 (Suppl 1), 8. 64. Olsen NV. Central nervous system frontiers for the use of erythropoietin. Clin Infect Dis, 37 (Suppl 4),S323, 2003. 65. Juul S. Erythropoietin in the central nervous system, and its use to prevent hypoxic­ischemic braindamage. Acta Paediatr Suppl 2002; 91, 36­42. 66. Chong ZZ, Kang JQ, Maiese K. Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of Akt1and mitochondrial modulation of cysteine proteases. Circulation 2002;106:2973–2979.

67. Agnello D, Bigini P, Villa P, Mennini T, Ceremi A, Brines M, Ghezzi P. Erythropoietin exerts anti­nflammatory effect on the center nerves system in the model of experimental autoinmuneencephalomyelitis. Brain Res 2002;952: 128­134. 68. Arango­Davila C, Escobar­Betancourt M, Cardona­ Gómez GP, Pimienta­Jiménez H. Fisiopatología dela isquemia cerebral focal: aspectos básicos y proyección a la clínica. Rev Neurol 2004; 39 (2): 156­165. 69. Chong ZZ, Kang JQ, Maiese K. Erythropoietin fosters both intrinsic and extrinsic neuronal protectionthrough modulation of microglia, Akt1, Bad, and caspase­mediated pathways. Br J Pharmacol 2003; 138:1107 – 1118. 70. Nagai A, Nakagawa E, Choi HB. Erythropoietin and erythropoietin receptors in human CNS neurons,astrocytes, microglia, and oligodendrocytes grown in culture. J Neuropathol Exp Neurol 2001; 60:386–392. 71. Anagnostou A, Lee ES, Kessimian N. Erythropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect onendothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990; 87:5978–5982. 72. Ruscher K, Freyer D, Karsch M, et al. Erythropoietin is a paracrine mediator of ischemic tolerance in thebrain: evidence from an in vitro model. J Neurosci 2002; 22:10291–10301. 73. Ehrenreich H, Hasselblatt M, Dembowski C, Cepek L, Lewczuk P, Stiefel M, Cerami A, Brines M, SirenAL. Erythropoietin therapy for acute stroke is both safe and beneficial. Mol Med 2002; 8:495­505. 74. Alafaci C, Salpietro F, Grasso G. Effect of recombinant human erythropoietin on cerebral ischemiafollowing experimental subarachnoid hemorrhage. Eur J Pharmacol 2000;406: 219–225. 75. Sinn D, Chu K, Lee S, et al. Erythropoietin has neuroprotective effects with functional recovery inexperimental intracerebral hemorrhage. 57th Annual Meeting of the American Academy of Neurology. 2005;S48.008:http://www.abstracts2view.com/aan/ 76. Lu D, Mahmood A, Qu C, et al. Erythropoietin enhances neurogenesis and restores spatial memory inrats after traumatic brain injury. J Neurotrauma 2005; 22:1011–1017. 77. Yatsiv I, Grigoriadis N, Simeonidou C. Erythropoietin is neuroprotective, improves functional recovery,and reduces neuronal apoptosis and inflammation in a rodent model of experimental closed head injury.Faseb J 2005. 78. Lu D, Mahmood A, Qu C. Erythropoietin enhances neurogenesis and restores spatial memory in ratsafter traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2005; 22:1011–1017. 79. Celik M, Gokmen N, Erbayraktar S. Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologicdisability in experimental spinal cord ischemic injury. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99:2258–2263. 80.Gorio A, Gokmen N, Erbayraktar S. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injuryand markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad SciUSA. 2002; 99:9450–9455. 81. Li W, Maeda Y, Yuan RR, et al. Beneficial effect of erythropoietin on experimental allergicencephalomyelitis. Ann Neurol 2004;56:767–777. 82. Zhang J, Li Y, Cui Y. Erythropoietin treatment improves neurological functional recovery in EAE mice.Brain Res 2005;1034:34–39. 83. Sattler MB, Merkler D, Maier K, et al. Neuroprotective effects and intracellular signaling pathways oferythropoietin in a rat model of multiple sclerosis. Cell Death Dier 2004; 11(Suppl 2): S181–S192. 84. Diem R, Sattler MB, Merkler D. Combined therapy with methylprednisolone and erythropoietin in amodel of multiple sclerosis. Brain 2005;128:375–385. 85. Bianchi R, Buyukakilli B, Brines M. Erythropoietin both protects from and reverses experimental diabeticneuropathy. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:823– 828.

86. Becerra SP, Amaral J. Erythropoietin—an endogenous retinal survival factor. N Engl J Med2002;347:1968– 1970. 87. Yatsiv I, Grigoriadis N, Simeonidou C. Erythropoietin is neuroprotective, improves functional recovery,and reduces neuronal apoptosis and inflammation in a rodent model of experimental closed head injury.Faseb J. 2005. 88. Ehrenreich H, Degner D, Meller J, et al. Erythropoietin: a candidate compound for neuroprotection inschizophrenia. Mol Psychiatry 2004; 9:42–54. 89. Sola A, Rogido M, Lee BH, et al. Erythropoietin after focal cerebral ischemia activates the Janus kinase­ignal transducer and activator of transcription signaling pathway and improves brain injury in postnatal day 7rats. Pediatr Res 2005; 57: 481–487. 90. Kumral A, Gonenc S, Acikgoz O. Erythropoietin increases glutathione peroxidase enzyme activity anddecreases lipid peroxidation levels in hypoxic­ischemic brain injury in neonatal rats. Biol Neonate 2005;87:15–18. 91. Chang YS, Mu D, Wendland M, et al. Erythropoietin improves functional and histological outcome inneonatal stroke. Pediatr Res 2005;58:106–111. 92. Weiss Mitchell J. New Insights into erythropoietin alfa: Mechanisms of Action, Target Tissues, andclinical aplication. Oncologist 2003; 18, Suppl 3. 93. Bohlius J, Langensiepen S, Schwarzer G, et al. Recombinant human erythropoietin and overall survivalin cancer patients: results of a comprehensive metaanalysis. J Natl Cancer Inst 2005; 97:489–498. 94. Shingo T., Soracan S.T., Shimazaki T., Weis S. Erythropoietin regulates the in vitro and production ofneuronal progenitors be mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci 2001; 21:9733 – 9743. 95. Wang L. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis andimproves neurological function in rats. Stroke 2004; 35: 1732. 96. Erbayraktar S, Grasso G, Sfacteria A, Xie QW, Coleman T, Kreilgaard M, Torup L, Sager T, ErbayraktarZ, Gokmen N, Yilmaz O, Ghezzi P, Villa P, Fratelli M, Casagrande S, Leist M, Helboe L, Gerwein J,Christensen S, Geist MA, Pedersen LO, Cerami­Hand C, Wuerth JP, Cerami A, Brines M.Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo. Proc NatlAcad Sci USA 2003; 100:6741­6746. 97. Sakane, T., Akizuki, M., Yoshida M., Yamashita, S., Nadai, T., Hashida M., and Sezaki H. Transport ofcephalexin to the cerebrospinal fluid directly from the nasal cavity. J Pharm Pharmacol 2000;43: 449­451. 98. Frey HW, Liu J, Chen X, Thoner RG, Fawcett JR, Ala TA, Rahman YE. Delivery of 125 I­NGF to thebrain via the olfatory Route. Drug Delivery 1997; 4: 87­92. 99. Thorne RG, Emory CR, Ala TA, Frey WH. Quantitative analysis of the olfactory pathway for drugdelivery to the brain. Brain Res 1995; Sep 18;692(1­2):278­82. 100. Yu YP, Xu QQ, Zhang Q, Zhang WP, Zhang LH, Wei EQ. Intranasal recombinant human erythropoietinprotects rats against focal cerebral ischemia. Neurosci Lett 2005; Oct 14,387(1):5­10. 101. Subirós Nelvis, García Rodriguez JC, Gonzalez B, Sosa I, García Salman JD. Evaluación histológicadel efecto de la Eritropoyetina vía intranasal, sobre la muerte neuronal retardada en gerbos sometidos aisquemia cerebral transitoria. Estudio preliminar. 7º Congreso Virtual Hispanoamericano de AnatomíaPatológica 2005 ; http://www.conganat.org/445.pdf. 102. Sosa l, García Rodríguez JC, García Salman JD, Subiros N, González C, Rodríguez Ya, Delgado R,Santana J. Eritropoyetina humana recombinante (rHu­EPO CIM) por vía nasal como neuroprotector en elIctus. Libro resumen Congreso Caribeño de ICTUS 2005; Santiago de Cuba. 103. Sosa I, García Rodríguez JC, García Salman JD, Santana J, Subirós N, González C, Rodríguez J,Cruz J. Intranasal administration of recombinant human erythropoietin exerts neuroprotective effects on

postischemic brain injury in Mongolian gerbils. Pharmacologyonline 2006;.1: 100­112. 104. Hilger PA. Applied anatomy and physiology of the nose. In Boies Fundamentals of Otolaryngology, 6thted., ed. G.L Adams, L.R. Boies, and P.A Hilger, Philadelphia: W. B. Saunders 1989;177­195. 105. Illum L. Nasal drug delivery­possibilities, problems and solutions. J Control Release 2003; 7: 187­198. 106. Banks AW. Are the extracelluar pathways a conduit for the delivery of therapeutics to the brain?Current Pharmaceutical Design 2004; 10:1365­70. 107. Sosa I; Cruz J, Santana J.; Mengana Y, García­Salman JD; Muñoz A; García T; García Rodríguez JC.Paso de la molécula de eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácido siálico alsistema nervioso central por la vía intranasal en los modelos del Meriones unguiculatus y el primate nohumano Macaca fascicularis. Rev Salud Animal In press 2007. 108. Subiros N. Eritropoyetina humana recombinante con bajo contenido de ácidos siálicos. Efectoneuroprotector de su administración nasal sobre la isquemia cerebral. Tesis de Maestría en Neurociencias,Centro de Neurociencias de Cuba. Febrero; 2007.