DETERMINACIÓN DEL TIEMPO ÓPTIMO DE OPERACIÓN EN FUNCIÓN DEL RENDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN POR HIDRODESTILACIÓN DEL ACEITE

ESENCIAL DE Psidium guajava, COLECTADO EN LA VEREDA SAN ANTONIO – HUILA.

NESTOR PERDOMO MOYANO

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA SEDE NEIVA FACULTAD E INGENIERÍA

PROGRAMA DE INGENIERÍA INDUSTRIAL NEIVA – HUILA

2015

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DETERMINACIÓN DEL TIEMPO ÓPTIMO DE OPERACIÓN EN FUNCIÓN DEL RENDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN POR HIDRODESTILACIÓN DEL ACEITE

ESENCIAL DE Psidium guajava, COLECTADO EN LA VEREDA SAN ANTONIO – HUILA.

NESTOR PERDOMO MOYANO

Trabajo de grado presentado para optar el título de INGENIERO INDUSTRIAL

Asesor

M.Sc. YASMÍN PÉREZ SUÁREZ

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA SEDE NEIVA FACULTAD DE INGENIERÍA

PROGRAMA DE INGENIERÍA INDUSTRIAL NEIVA – HUILA

2015

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NOTA DE ACEPTACIÓN

Presidente del Jurado

Jurado

Jurado

Neiva, Abril del 2015

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DEDICATORIA A Dios, a mis padres y demás familiares que en todo momento de mi vida han estado presentes, ahí a mi lado apoyándome, porque son mi principal fortaleza y pilares para seguir adelante.

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AGRADECIMIENTOS

A Dios, La Virgen y Santa Marta, por ser esa luz que siempre estuvo y estará iluminando mi camino hacia el bien. A mis padres, familiares y amigos, quienes con su apoyo incondicional siempre estuvieron ahí en cada momento de mi vida. A la Universidad Cooperativa de Colombia por haber permitido formarme en sus instalaciones y ser parte de sus alumnos, por brindarme desde el primer día de clases los conocimientos que me permitirán ser un profesional de éxito y crecer tanto a nivel profesional como personal y a todas sus directivas por el apoyo que me brindaron.

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CONTENIDO

Pág. INTRODUCCIÓN 13 1. INFORMACIÓN GENERAL 14 2. DESCRIPCION DEL PROYECTO 15 3. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE 17 3.1 FAMILIA MYRTACEAE 17 3.2 GENERO PSIDIUM 18 3.3 PRODUCTOS NATURALES NO MADERABLES PNNM Y SU IMPORTANCIA 18 3.4 LOS ACEITES ESENCIALES AE 20 3.5 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES 21 3.6 HIDRODESTILACIÓN 22 3.7 CROMATOGRAFÍA DE GASES CG 22 4. OBJETIVOS 24 4.1 OBJETIVO GENERAL 24 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 24 5. METODOLOGÍA PROPUESTA 25 5.1 RECOLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL BOTÁNICO 25

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5.2 PRETRATAMIENTO DEL MATERIAL BOTÁNICO 25 5.3 OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL FOLIAR POR HIDRODESTILACIÓN 25 5.4 IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE PSIDIUM GUAJAVA 27 5.5 DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS (DENSIDAD, TEMPERATURA DE EBULLICIÓN Y SOLUBILIDAD EN ETANOL) DEL ACEITE ESENCIAL DE PSIDIUM GUAJAVA. 27 5.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 27 6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 28 7. PRESUPUESTO 29 8. RESULTADOS ESPERADOS 30 9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31 10. CONCLUSIONES 48 11. RECOMENDACIONES 49 BIBLIOGRAFÍA 50 ANEXOS 54

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LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Equipo para hidrodestilación 26 Figura 2. Estructura química de 1,8-cineol, Limoneno y cariofileno según NIST 42

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LISTA DE GRÁFICAS

Pág. Grafica 1. Cuantificación de los componentes mayoritarios en el aceite esencial de las hojas de Psidium guajava. 41 Grafica 2. Propiedades de los Aceites Esenciales Preliminarmente 45 Grafica 3. Propiedades de los aceites esenciales en cada prueba 45 Grafica 4. Tiempo de operación vs. Volumen de aceite esencial 46 Grafica 5. Resultados de tiempo de operación y volumen del aceite esencial obtenidos desde la hora 0 a la hora 8. 47

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LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Clasificación taxonómica del Psidium guajava 36 Tabla 2. Resultados de Tiempo de operación y Volumen de Aceite Esencial obtenido 39 Tabla 3. Componentes mayoritarios del aceite esencial foliar de Psidium Guajava 40 Tabla 4. Identificación y cuantificación de los componentes mayoritarios en el aceite esencial de las hojas de Psidium guajava. 40 Tabla 5. Cuadro Resumen de Estructuras Químicas Presentes en AE. Psidium Guajava 42 Tabla 6. Propiedades del aceite esencial de Psidium guajava 44

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LISTA DE FOTOS

Pág. Foto 1. Determinación de las coordenadas del lugar de muestreo Vereda San Antonio, finca el Carmen. 31 Foto 2. Vista aérea de la Vereda San Antonio. 2015 32 Foto 3. Especies silvestres de Psidium guajava en San Antonio – Huila 33 Foto 4. Muestreo foliar de Psidium guajava 34 Foto 5. Hojas de Psidium guajava 35 Foto 6. Muestras foliares de Psidium guajava 36 Foto 7. Equipo para hidrodestilación 37 Foto 8. Aceite esencial obtenido por hidrodestilación de Psidium guajava 38

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LISTA DE ANEXOS

Pág. Anexo A. Informe Taxonomía Psidium guajava 35 Anexo B. Certificado de participación como ponente en el Encuentro Departamental de Semilleros de Investigación, REDCOLSI Nodo Huila 2013. Modalidad Propuesta de investigación. 47 Anexo C. Certificado de participación como ponente en el 2.do SIMPOSIO INTERNACIONAL DE AGROINDUSTRIA “ALIANZA HUILA TECNOLÓGICO “, NEIVA – HUILA 2013. 47 Anexo D. Certificado de participación como ponente en el Encuentro Departamental de Semilleros de Investigación, REDCOLSI Nodo Huila 2014. Modalidad propuesta de Investigación. 47 Anexo E. Certificado de participación como ponente en el XVII Encuentro Nacional y XI INTERNACIONAL de Semilleros de Investigación, REDCOLSI, TUNJA - BOYACÁ 2014. 47 Anexo F. Certificado de participación como ponente en la semana de ciencia y tecnología e innovación del 15 al 20 de octubre en la ciudad de Neiva – Huila 2014. Modalidad propuesta de Investigación. 47 Anexo G. Certificado de participación como ponente al premio REYMEL SERRANO URIBE convocatoria 2014 como idea de negocio. 47

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INTRODUCCIÓN Colombia goza de un amplio inventario de recursos naturales, cuya biodiversidad se ve favorecida por la variedad de sus ecosistemas. En el departamento del Huila se encuentran todos los climas y una gran variedad de suelos que facilitan la diversidad y extensión de la producción agrícola y ganadera; en él, predomina el clima templado, con una temperatura media de 24 ºC; como puntos extremos están las cumbres montañosas del Nevado del Huila, que forma parte del Parque Nacional Natural que lleva su mismo nombre, donde la temperatura permanece bajo 0ºC y las regiones cálidas de los valles de Neiva, Aipe y Villavieja, donde se encuentra el imponente desierto de La Tatacoa, con 35º C [2]. Teniendo en cuenta que la posición geográfica del departamento del Huila favorece el crecimiento de gran variedad de especies vegetales, entre las que se encuentran familias que producen aceites esenciales, que contienen compuestos aromáticos con principios activos para la elaboración de productos de interés para diferentes campos de la industria, se hacen necesarios los estudios de Bioprospección. Estos estudios son indispensables para conocer los recursos naturales y permitir la explotación de los mismos en un marco de sostenibilidad y sustentabilidad de las especies, garantizando la conservación de la biodiversidad y generando oportunidades de negocio1 2 3. Por lo anterior, se propone realizar un trabajo de bioprospección, con el cual se pretende evaluar el mejor tiempo de operación en función del rendimiento para la obtención del aceite esencial foliar de la especie Psidium guajava, extraído por hidrodestilación; también se identificaran los componentes mayoritarios del aceite esencial por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). Con este objetivo se busca determinar las mejores condiciones de operación para la obtención de los metabolitos secundarios ( terpenos , fenoles , alcaloides ) de esta especie que crece silvestre en la vereda San Antonio, en el departamento del Huila, la cual posee principios activos potenciales de interés para la industria, con posibilidades de aplicación en la agricultura4.

1 http://www.huila.gov.co/index.php?option=com_content&view=article&id=64645&Itemid=3859.

2 Biocomercio sostenible. 2003. Estudio del mercado colombiano de aceites esenciales. Instituto de

investigación de recursos biológicos Alexander Von Humboldt, Bogotá, Colombia. p 4. 3 MELGAREJO, L. M., J. SÁNCHEZ, A. CHAPARRO, F. Newmark, M. Santos-Acevedo, C.

Burbano y C. Reyes. Aproximación al estado actual de la bioprospección en Colombia Bogotá: Cargraphics, 2002. p 6-25. 4 PINZÓN-BEDOYA ML, PÉREZ SUÁREZ y, GÉLVEZ ORDÓÑEZ VM. Evaluación del

comportamiento del tiempo de operación sobre el rendimiento del aceite esencial de Psidium caudatum obtenido por extracción de arrastre con vapor de agua en planta piloto. Bistua. 2011:9(1): p 63.

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1. INFORMACIÓN GENERAL Seleccione con una X el trabajo de grado para el cual aplica, de acuerdo al nivel de formación: Pregrado☒ Posgrado☐

Información General

Título del Proyecto

Determinación del tiempo óptimo de operación en función del rendimiento para la obtención por hidrodestilación del aceite esencial de Psidium guajava, colectado en la vereda San Antonio – Huila.

Sede Neiva Facultad Ingeniería Programa Académico

Ingeniería Industrial

Datos Estudiante(s)

Nombre Nestor Perdomo Moyano C.C. 6.802.907

Correo electrónico

nestor.perdomo@campusucc.edu.co Teléfono(s) 3118121251

Nombre C.C.

Correo electrónico

Datos Director del trabajo de

grado

Nombre Yasmín Pérez Suárez C.C. 60.443.326

Correo electrónico

yasmin.perezs@campusucc.edu.co Teléfono(s) 3143860073

Formación M.Sc. en Química, Ingeniero de Producción Biotecnológica.

Datos Codirector del trabajo de grado

Nombre Diego Iván CAVIEDES Rubio

Correo electrónico

diego.caviedesr@campusucc.edu.co

Formación M.Sc. en Ecología y Gestión de Ecosistemas Estratégicos, Licenciado en Biología y Química.

Nombre del proyecto

registrado en el SUI

Grupo de Investigación

Grupo de Investigación en Administración de Operaciones y Producción (ADOPRO).

Nombre del Semillero

Semillero de Investigación CONCIENCIA.

Nombre de la Línea de

Investigación Producción y Agroindustria

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2. DESCRIPCION DEL PROYECTO La privilegiada posición geográfica de Colombia es uno de los factores con mayor relevancia que favorecen la biodiversidad que presenta el país, el cual posee alrededor de 35.000 especies de plantas vasculares, 2.890 especies de vertebrados y un número no determinado de insectos, micro algas y otros organismos. Muchos de estos recursos no se conocen y no se usan, y algunos de los que se usan como plantas, animales y microrganismos, no se aprovechan de la forma adecuada, por desconocer las condiciones óptimas para su manejo o sus usos potenciales. Las investigaciones en bioprospección permiten conocer detalladamente los recursos naturales y las condiciones de explotación de los mismos en un marco de sostenibilidad y sustentabilidad. Por tal motivo la bioprospección sobre aceites esenciales, revelan la importancia de dicho recurso en países en vía de desarrollo, pues son una alternativa de innovación y desarrollo tecnológico en los procesos productivos a escala piloto o industrial, con un potencial de aplicación nacional o internacional5 6. Las especies de la familia Myrtaceae son capaces de acumular sustancias fenólicas y aquellos están estrechamente relacionados con la actividad antioxidante debido a su capacidad para eliminar los radicales libres, proteger contra la peroxidación de lípidos y apagar las especies reactivas del oxígeno.Una evaluación de los extractos etanólicos de estas plantas Myrtaceae reveló altos niveles de compuestos fenólicos, así como una alta actividad antioxidante 7. En una investigación sobre la actividad biológica del aceite esencial de la Myrtaceae Melaleuca alternifolia, se reportó que la infusión de hojas de esta mirtácea se utilizaba para tratar el dolor de garganta y diversas afecciones dérmicas. Además de esto, en esta investigación se encontró que el aceite esencial de esta planta presenta actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral y antiprotozoaria. Adicionalmente tiene actividades antiinflamatoria y antioxidante.

5 Biocomercio sostenible. 2003. Estudio del mercado colombiano de aceites esenciales. Instituto de

investigación de recursos biológicos Alexander Von Humboldt, Bogotá, Colombia. p 4. 6 MELGAREJO, L. M., J. SÁNCHEZ, A. Chaparro, F. Newmark, M. Santos-Acevedo, C. Burbano y

C. Reyes. Aproximación al estado actual de la bioprospección en Colombia Bogotá: Cargraphics, 2002. p 6-25. 7 SALVADOR MJ, de Lourenco CC, ANDREAZZA NL, PASCOAL AC, STEFANELLO ME.

Capacidad antioxidante y contenido fenólico de cuatro plantas Myrtaceae del sur de Brasil. NatProd. Commun. 2011 Jul; 6 (7): 977-82.

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Las actividades antibacteriana y antifúngica son atribuidas a la presencia de terminen-4-ol y a el α-terpineol en el aceite esencial8. Otro género perteneciente a la familia Myrtaceae, con acción biológica relevante en sus extractos es el Psidium, ya que se ha usado tradicionalmente como antidiarreico en muchos países de América, incluyendo Cuba, y en otros continentes como África9 y presento actividad antibacterial 10. Dentro de este género se encuentran trabajos de investigación sobre la especie Psidium guajava, algunos de los cuales reportan actividad antibacterial11 y antioxidante 12; también efectos anticonceptivos13 y espasmolíticos 14. En el departamento del Huila, la especie Psidium guajava crece silvestre en zona de vida de bosque seco tropical, lo cual la hace abundante en la zona centro – norte de esta región. Actualmente no existen estudios de bioprospección sobre esta especie en esta zona del país, por lo que no se aprovechan adecuadamente los principios activos de la misma. Con base en lo anterior, se justifica un estudio sistemático a nivel de investigación aplicada como el presente trabajo, el cual está asociado con el concepto de productividad potencial dentro de un marco de desarrollo sostenible, en el que se busca determinar el tiempo de operación optimo en función del rendimiento del aceite esencial foliar de la especie Psidium guajava obtenido por el método de hidrodestilación y la determinación de la composición química del aceite esencial, a fin de identificar los principios activos de interés para la industria, reportados en los referentes bibliográficos.

8 VILA, ROSER y CAÑIGUERAL, Salvador. El aceite esencial de Melaleuca alternifolia en el

tratamiento de la vulvovaginitis. Revista de fitoterapia 2006; 6 (2): 119 – 128. 9 ECHEMENDÍASALIX, Carlos E. Y MORÓN RODRÍGUEZ, Francisco J. Tintura de hojas de

Psidium guajava L. en pacientes con diarrea aguda simple. REV CUBANA PLANT MED 2004; 9 (3). 10

ANAS K, JAYASREE PR, Vijayakumar T & Manish Kumar PR.In vitro antibacterial activity of Psidium guajava Linn. Leaf extract on clinical isolates of multidrug resistant Staphylococcus aureus. Indian Journal of Experimental Biology. Vol. 46, January 2008, pp. 41-46. 11

Abdelrahim, S.I.; Almagboul, A.Z.; Omer, M.E.A., y Elegami, A.Antimicrobial activity of Psidium guajava L. Fitoterapia, Volume 73, Issues 7–8, December 2002, pp713-715. 12

JIMÉNEZ-ESCRIG, Antonio; RINCÓN, Mariela; PULIDO, Raquel and SAURA-CALIXTO, Fulgencio. Guava Fruit (Psidium guajava L.) as a New Source of Antioxidant Dietary Fiber.J. Agric. Food Chem., 2001, 49 (11), pp 5489–5493. 13

SANTOS, F. A., RAO, V. S. N. and SILVEIRA, E. R. Investigations on the antinociceptive effect of Psidium guajava leaf essential oil and its major constituents. 1998. Phytother. Res., 12: 24–27. 14

MORALES MA, TORTORIELLO J, MECKES M, Paz D, LOZOYA X. Calcium-antagonist effect of

quercetin and its relation with the spasmolytic properties of Psidium guajava L. PubMed PMID: 8019109. 1994, 25(1):17-21.

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3. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE: 3.1 FAMILIA MYRTACEAE La familia Myrtaceae se caracteriza por tener arbustos o sufrútices de campos cerrados y árboles, con ritidoma frecuentemente lisa y brillante por descamación de la corteza, posee hojas opuestas (alternas: Myrcia anomala), simples, enteras, con puntuaciones translucidas; nervio marginal. Tiene cimas trifloras, omultíparas (inflorescencias paniculoides), racimos, (pseudo-) fascículos compactos, glomérulos. Las flores son heteroclamídeas, dialipétalas (raramente apétalas y con caliptra: Calyptranthes), actinomorfas, epíginas, 4-5(-6)-meras y hermafroditas. El botón floral con lobos calicinales libres o más raramente, totalmente cerrado rompiéndose alantesis (Calycorectes y Psidium). Sus estambres son numerosos. El ovario tiene 1-4(-10) lóculos 1-pluriovulados. Las bayas son frecuentemente coronadas por los lobos calicinos persistentes. Tiene 1-n semillas con testa generalmente cartilaginosa o membranácea 15. En México la familia Myrtaceae está representada por doce géneros que se distribuyen ampliamenteen regiones templadas, tropicales y semiáridas. La importancia económica de esta familia se basa principalmente en la extracción de la madera (Eucalyptus spp.), el consumo de frutos (Psidium spp.) y la apicultura (Eugenia spp.), entre otros usos16. En el Perú, esta familia es reconocida por presentar 20 géneros y 165 especies, la mayoría arbustos y árboles. El género más rico en especies endémicas es Eugenia. Las Myrtaceae endémicas se encuentran principalmente en las regiones Bosques Húmedos Amazónicos y Mesoandina, entre los 100 y 3600 metros de altitud 17. Dentro de los estudios encontrados sobre esta familia, se destacan los resultados obtenidos sobre la actividad biológica del aceite esencial de Melaleuca alternifolia, cuyo aceite esencial, presenta actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral y antiprotozoaria. Adicionalmente tiene actividades antiinflamatoria y antioxidante18.

15 Conservatoire et Jardín Botaniques, Ville de Genève (Suiza) y Missouri Botanical Garden, St-

Louis, MO (USA). 2001, pp 1-8. 16

REBOLLAR-DOMÍNGUEZ, Silvia y TAPIA-TORRES, Nery Alicia. Anatomía de la madera de dos especies de Eugenia (Myrtaceae) de Quintana Roo, México. Madera y Bosques 16 (1), 2010:85-98. 17

KAWASAKI, Lucia y HOLST, Bruce K. Myrtaceae endémicas del Perú. Rev. Perú. biol. 2006. Número especial 13(2): 463s - 468s. 18

VILA, Roser y CAÑIGUERAL, Salvador. El aceite esencial de Melaleuca alternifolia en el tratamiento de la vulvovaginitis. Revista de fitoterapia 2006; 6 (2): 119 – 128.

18

Otros estudios sobre Myrtaceas reportaron actividad antioxidante 19 y actividad antimicrobiana de Eugenia sp frente a cepas de mollicutes20. 3.2 GENERO PSIDIUM

Dentro de la familia Myrtaceas presenta el género Psidium, el cual posee arbustos o sufrútices de campos cerrados, hojas opuestas o verticiladas por tres, nervios laterales variables, con nervio marginal generalmente ausente. Las flores son axilares, solitarias o cimas trifloras rematadas por una flor central sésil, con botón floral con lobos calicinales distintos o totalmente cerrado rompiéndose al antesis. Las flores son pentámeras, con ovario con 4-10 lóculos, pluriovulados. El fruto contiene entre 1-2 semillas; las cuales se caracterizan por tener testa ósea; tiene lóbulos calicinales persistentes21. Un estudio demostró que las hojas de Psidium presentaron propiedades medicinales significativas. El extracto acuoso de las hojas en dosis de 400 mg/dL, tuvieron efecto estabilizador de la membrana eritrocítica in vitro. Además se encontró que mejoro los niveles detriglicéridos y colesterol en modelos de ratones en tejido hepático, mejorando el balance del perfil lipídico22. 3.3 PRODUCTOS NATURALES NO MADERABLES PNNM Y SU IMPORTANCIA Los Productos Naturales No Maderables se refieren a productos obtenidos mediante el aprovechamiento de los ecosistemas naturales, tales como los aceites esenciales 23 24.

19 SALVADOR MJ, de Lourenco CC, ANDREAZZA NL, Pascoal AC, STEFANELLO ME. Capacidad

antioxidante y contenido fenólico de cuatro plantas Myrtaceae del sur de Brasil. NatProd. Commun. 2011 Jul; 6 (7): 977-82. 20

SIMÕESBENFATTI, Camila; MENDES DE CORDOVA, Samuel; GUEDES, Alessandro; ALBERTON Magina, MICHELE Debiasi y MENDES DE CORDOVA, Caio Mauricio. Actividad antibacteriana in vitro de extractos brutos de especies de Eugenia sp frente a cepas de mollicutes. Rev Pan-Amaz Saude 2010; 1(2):33-39. 21

Conservatoire et Jardín Botaniques, Ville de Genève (Suiza) y Missouri Botanical Garden, St-Louis, MO (USA). 2001, pp 1-8. 22

RODRÍGUEZ AMADO, Rafael; LAFOURCADE PRADA, Ariadna y PÉREZ RONDÓN, Liana. Hojas de Psidium guajava L. Rev Cubana Farm [online]. 2013, vol.47, n.1. 23

Biocomercio sostenible. 2003. Estudio del mercado colombiano de aceites esenciales. Instituto de investigación de recursos biológicos Alexander Von Humboldt, Bogotá, Colombia. p 4. 24

MELGAREJO, L. M., J. SÁNCHEZ, A. CHAPARRO, F. NEWMARK, M. Santos-Acevedo, C. Burbano y C. Reyes. Aproximación al estado actual de la bioprospección en Colombia Bogotá: Cargraphics, 2002. p 6-25.

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Existen valiosos estudios relacionados con los Productos Naturales No Maderables PNNM, entre los que se encuentran: inventarios; investigación básica; estudios de extracción, producción, transformación y/o procesamiento; recopilación y validación de conocimientos y prácticas tradicionales y sondeos de mercado. Sin embargo, debido a la complejidad de los ecosistemas, biodiversidad y variedad de procesos y productos, no se dispone de la información necesaria para desarrollar planes de manejo integrales que garanticen el manejo sostenible de los recursos. En las últimas décadas se han realizado estudios pormenorizados con el fin de verificar la base científica de los usos tradicionales de algunas especies aromáticas, ya que estas han puesto de manifiesto que en la mayoría de los casos las acciones farmacológicas detectadas en algunas especies son debidas a algunos grupos de componentes presentes en el género Psidium, tales como polifenoles y aceites esenciales, siendo estos últimos los que acaparan mayor interés desde el punto de vista de las aromas y esencias, a la vez que son responsables de algunas de las más importantes actividades relacionadas con el género correspondiente25 26. También se han desarrollado programas de mejoramiento genético de la especie, a fin de contribuir con un uso más eficiente de los recursos fitogenéticos de los cultivos27. El Psidium presenta un uso etnobotánico amplio. Los principios activos de los componentes de su aceite esencial, poseen propiedades medicinales significativas. Por su astringencia, las hojas se utilizan en enfermedades de la piel, en diarreas 28 y para otras dolencias de estómago. Se ha utilizado como hemostática y antiséptica. Otros reportes indican acción antimicrobiana (29, 30, 31,

25 Biocomercio sostenible. 2003. Estudio del mercado colombiano de aceites esenciales. Instituto

de investigación de recursos biológicos Alexander Von Humboldt, Bogotá, Colombia. p 4. 26

MELGAREJO, L. M., J. SÁNCHEZ, A. CHAPARRO, F. NEWMARK, M. Santos-Acevedo, C. Burbano y C. Reyes. Aproximación al estado actual de la bioprospección en Colombia Bogotá: Cargraphics, 2002. p 6-25. 27

VALDÉS-INFANTE, Juliette; NERDO RODRÍGUEZ, Narciso; VELÁSQUEZ, Josefa Bárbara; SOURD, Darío Gaspar; GONZÁLEZ, Gonzalo; RODRÍGUEZ, Julio Alberto y ROHDE, Wolfgang. Herramientas para un programa de mejoramiento genético del guayabo (Psidium guajava L.) en Cuba. Agronomía Costarricense 36(2): 111-129. ISSN: 0377-9424 / 2012. 28

ECHEMENDÍA SALIX, Carlos E. Y MORÓN RODRÍGUEZ, Francisco J. Tintura de hojas de Psidium guajava L. en pacientes con diarrea aguda simple. REV CUBANA PLANT MED 2004; 9 (3). 29

Anas K, Jayasree PR, Vijayakumar T & Manish Kumar PR.In vitro antibacterial activity of Psidium guajava Linn. Leaf extract on clinical isolates of multidrug resistant Staphylococcus aureus. Indian Journal of Experimental Biology. Vol. 46, January 2008, pp. 41-46. 30

ABDELRAHIM, S.I.; ALMAGBOUL, A.Z.; OMEr, M.E.A., y ELEGAMI, A. Antimicrobial activity of Psidium guajava L. Fitoterapia, Volume 73, Issues 7–8, December 2002, pp713-715.

20

32, 33,34), cicatrizante, hipoglicémica, espasmolítica 35, 36 y anticonceptiva 37. Se reporta también actividad antioxidante 38, 39, hepatoprotectora, antialérgica, genotóxica citotóxica, cardiotónica, antiinflamatoria y anticatarral y otras40. 3.4 LOS ACEITES ESENCIALES AE Los aceites esenciales AE son mezclas homogéneas de compuestos químicos orgánicos, provenientes de una misma familia química, “terpenos” o “terpenoides” (ejemplo limoneno, carvona, α-humuleno, etc.), la unidad isopreno C5 en el esqueleto hidrocarbonado es característica estructural distintiva que los diferencia de otros productos naturales41. Los aceites esenciales están contenidos en glándulas o vesículas secretoras inmersas en los tejidos de las hojas, flores, corteza y semillas de los frutos de muchas especies. Las plantas pueden producir aceite esencial para muchos y diversos fines; por un lado protegen a la planta de plagas, enfermedades e inclusive la invasión de otras plantas, para atraer insectos y aves (polinizantes). Los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales

31 CANO ROMERO, Laura Elena. Efectos antimicrobiano y antiespasmódico del aceite esencial y

sus componentes mayoritarios presentes en las hojas de guajava (Psidium guajava L.). 2013. Universidad Autónoma de Querétano. Maestría en nutrición humana. pp 137. 32

DE SOUZA PRESTES, Luciana; DAMÉ SCHUCH, Luiz Filipe; HÖRNKE ALVES, Gabriela; ZIEMANN DOS SANTOS, Marco Aurélio; ALVES RODRÍGUEZ, María Regina y ARAÚJO MEIRELES, Mario Carlos. Evaluación de la actividad bactericida de aceites esenciales de hojas de guayabo, pitango y arazá. Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2011; 16(4)324-330. 33

MARTÍNEZ, María Julia; MOLINA, Nancy y BOUCOURT, Elisa. Evaluación de la actividad antimicrobiana del Psidium guajava L. (guayaba). Rev Cubana de PlantMed 1997; 2(1): 12-14. 34

VAZQUEZ-CAHUICH, Daniel Alejandro; ESPINOSA MORENO, Judith; CENTURION HIDALGO, Dora; VELÁZQUEZ MARTÍNEZ, José Rodolfo; BORGES-ARGAEZ, Rocío and Cáceres Farfán, Mirbella. Actividad antimicrobiana y composición química de los aceites esenciales de Malvaviscusarboreus Cav, Pimenta dioica (L.) Merr., Byrsonimacrassifolia (L.) Kunth y Psidium guajava L. 35

MORALES MA, TORTORIELLO J, MECKES M, Paz D, Lozoya X. Calcium-antagonist effect of quercetin and its relation with the spasmolytic properties of Psidium guajava L. PubMed PMID: 8019109. 1994, 25(1):17-21. 36

Ibid. 37

SANTOS, F. A., Rao, V. S. N. and Silveira, E. R. Investigations on the antinociceptive effect of Psidium guajava leaf essential oil and its major constituents. 1998. Phytother. Res., 12: 24–27. 38

JIMÉNEZ-ESCRIG, Antonio; RINCÓN, Mariela; PULIDO, Raquel and SAURA-CALIXTO, Fulgencio. Guava Fruit (Psidium guajava L.) as a New Source of Antioxidant Dietary Fiber.J. Agric. Food Chem., 2001, 49 (11), pp 5489–5493. 39

PALOMINO PACHECO, Miriam; GUIJA POMA, Emilio y LOZANO REYES, Nancy. Propiedades antioxidantes de la guayaba (Psidium guajava L.). RevSocQuím Perú. 75 (2) 2009. 40

RODRÍGUEZ AMADO, Rafael; LAFOURCADE PRADA, Ariadna y PÉREZ RONDÓN, Liana. Hojas de Psidium guajava L. Rev Cubana Farm [online]. 2013, vol.47, n.1. 41

MÁRQUEZ, SITLALI Diego. Evaluación del rendimiento en la obtención del aceite “Piperauritum Kunth” mediante la hidrodestilación asistida por microondas. 2011. Universidad Veracruzana, Facultad de Ciencias Químicas.

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presentan bioactividades notables (propiedades antifúngicas, antibacteriales y antioxidantes), atrayendo la atención de importantes sectores de la industria farmacéutica, de perfumes, cosmética y de alimentos, entre otras, por sus posibles y viables aplicaciones 42, 43. 3.5 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES Un aspecto de alto interés en la química de los aceites esenciales son los métodos de extracción ya que se ha determinado que la calidad del mismo depende en gran medida de la técnica utilizada44. Existen varios métodos para obtener el AE, pero la separación y purificación de líquidos por destilación constituye una de las técnicas más utilizadas para purificar líquidos volátiles. La destilación hace uso de la diferencia entre los puntos de ebullición de las sustancias que constituyen una mezcla. Las dos fases en una destilación son: la vaporización o transformación del líquido en vapor y la condensación o transformación del vapor en líquido. El método convencional para la extracción de aceites esenciales ha sido la destilación con vapor o la Hidrodestilación; sin embargo las altas temperaturas que se manejan en estos métodos, hacen que se pierdan los compuestos más volátiles del aceite o se descompongan aquellos que son termolábiles45. En esta técnica, factores como el tamaño de la partícula del material vegetal, el factor de empaquetamiento o densidad del lecho y el tiempo de extracción influyen en la composición y rendimiento de los aceites obtenidos. El conocimiento y el control de las variables de operación del proceso de extracción del aceite esencial, además de facilitar el aseguramiento de la calidad, permiten ajustar la composición del aceite a los requerimientos del mercado, de manera que sea posible el ofrecimiento de diferentes versiones del mismo aceite esencial46, 47.

42 Biocomercio sostenible. 2003. Estudio del mercado colombiano de aceites esenciales. Instituto

de investigación de recursos biológicos Alexander Von Humboldt, Bogotá, Colombia. p 4. 43

HENAO, Julieth; MUÑOZ, Leidy J.; PADILLA, Leonardo y RÍOS, Eunice. Extracción y caracterización del aceite esencial de Lippia origanoides H.B.K. “orégano de monte” cultivado en el Quindío y evaluación de la actividad antimicrobiana. 2010. Rev. Invest. Univ. Quindío (21): 82- 86. Armenia – Colombia. 44

SÁNCHEZ CASTELLANOS, Francisco J. Extracción de Aceites Esenciales. Experiencia Colombiana. II Segundo Congreso Internacional de Plantas Medicinales y Aromáticas. Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira. Octubre 19, 20 y 21 de 2006. 45

Ibid 46

PINZÓN-BEDOYA ML, PÉREZ SUAREZ Y, GÉLVEZ ORDÓÑEZ VM. Evaluación del comportamiento del tiempo de operación sobre el rendimiento del aceite esencial de Psidium caudatum obtenido por extracción de arrastre con vapor de agua en planta piloto. Bistua.2011:9(1): p 63.

22

3.6 HIDRODESTILACIÓN Esta técnica consiste en sumergir material vegetal parcialmente en agua dentro de un alambique, usando el vapor saturado a presión atmosférica para llevar a estado de ebullición el agua, el vapor del agua es inyectado con la presión suficiente para vencer la resistencia hidráulica del lecho de la especie vegetal. El vapor entra en contacto con el lecho, para calentar la materia prima y liberar el aceite esencial contenido; esta solución acuosa (agua y hojas) se difunde a través de las membranas de las células y el aceite se vaporiza inmediatamente desde la superficie. Este proceso continua hasta que se remueve todo el aceite contenido en las glándulas de la planta. Los componentes oxigenados del aceite son mas solubles en el agua hirviendo (unas 100 veces más) que los hidrocarburos análogos. Por esta razón, en las etapas iniciales, los componentes se liberan de acuerdo con su grado de resistencia, antes que por sus puntos de ebullición. Posteriormente, a medida que avanza el proceso, los compuestos se separan en función de su temperatura de ebullición, siendo la última fracción muy rica en sesquiterpenos (terpenos, monoterpenos sesquiterpenos) y sus análogos oxigenados. Otro factor que juega un papel importante durante la extracción mediante esta técnica, es el contenido de compuestos grasos (lípidos) en la planta, ya que son poco volátiles y, en cierto modo, retienen la fracción de hidrocarburos volátiles, los cuales muestran más afinidad por los compuestos grasos que por los compuestos oxigenados 48, 49, 50. 3.7 CROMATOGRAFÍA DE GASES CG La Cromatografía de Gases GC, se realiza en un cromatógrafo de gases cuyos componentes son: la fase móvil, el sistema de inyección de la muestra o inyector, la columna, ubicada en un horno termostato y el detector. La cromatografía de gases se usa ampliamente en el análisis de aceites esenciales, donde la complejidad de la muestra puede ser un reto. Muchos de estos productos son frágiles e importantes comercialmente y se utiliza la cromatografía de gases para

47 ARANGO, Oscar; HURTADO, Andrés; CASTILLO, Patricia y SANTACRUZ, Mónica. Estudio de

las condiciones de extracción por arrastre con vapor del aceite esencial de Laurel de Cera (Morella pubescens). 2009. Universidad de Nariño. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Vol. 7 Núm. 2. 48

SÁNCHEZ CASTELLANOS, Francisco J. Extracción de Aceites Esenciales. Experiencia Colombiana. II Segundo Congreso Internacional de Plantas Medicinales y Aromáticas. Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira. Octubre 19, 20 y 21 de 2006. 49

MONSALVE SALAMANCA, Luz Adriana. Comparación de la composición química de los aceites esenciales de las plantas de Lippia alba (Mill) N. E Brown, provenientes de diferentes regiones de Colombia. 2007. Universidad Industrial de Santander. Facultad de Ciencias. Escuela de Química. 50

RUIZ NOVA, Carlos Alberto. Estudio de los Metabolitos secundarios volátiles de Lippia origanoides H.B.K., en tres estados fenológicos. 2008. Universidad Industrial de Santander. Facultad de ciencias. Escuela de Química.

23

cuantificar componentes específicos que podrían ser indicativos de calidad del aceite y para detectar adición de compuestos clandestinos como antioxidantes así como componentes utilizados como diluyentes. Para identificar tentativamente los componentes de un aceite esencial, se emplea la comparación de sus tiempos de retención con los de los patrones analizados bajo las mismas condiciones de operación. Sin embargo los tiempos de retención dependen de muchas variables, como el modo de inyección, los cambios de temperatura o el flujo de los gases y el diseño del equipo, entre otros. Por esto, se hace necesaria la introducción de parámetros que sean más reproducibles, como los tiempos de retención relativos y los índices de retención. Estos últimos se calculan a partir de los tiempos de retención y luego se comparan con los de sustancias a las que se les asignan valores arbitrarios de índices de retención, de los cuales los más utilizados son los Índices de Kobats, que han sido definidos con respecto a los tiempos de retención de una serie de n-alcanos 51, 52.

51 MONSALVE SALAMANCA, Luz Adriana. Comparación de la composición química de los aceites

esenciales de las plantas de Lippia alba (Mill) N. E Brown, provenientes de diferentes regiones de Colombia. 2007. Universidad Industrial de Santander. Facultad de Ciencias. Escuela de Química. 52

OLGUÍN PÉREZ, Laura Patricia y RODRÍGUEZ MAGADAN, Héctor M. Métodos en Biotecnología. Cromatografía de Gases. 2004. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Biotecnología.

24

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL Determinar el tiempo óptimo de operación en función del rendimiento para la obtención por hidrodestilación del aceite esencial de Psidium guajava colectado en la vereda San Antonio – Huila. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Identificar taxonómicamente la especie Psidium guajava colectada en la vereda San Antonio – Huila.

Obtener aceite esencial de Psidium guajava por el método de hidrodestilación.

Evaluar el tiempo óptimo de operación en función del rendimiento del aceite esencial foliar de Psidium guajava obtenido por hidrodestilación

Identificar por CG-EM los componentes mayoritarios presentes en el aceite esencial foliar obtenido de Psidium guajava.

Determinación de las propiedades fisicoquímicas (Densidad, Temperatura de ebullición y solubilidad en etanol) del aceite esencial de Psidium guajava.

25

5. METODOLOGÍA PROPUESTA A continuación se describen cada una de las actividades realizadas, con las que se dio cumplimiento a los objetivos planteados: 5.1 RECOLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DEL MATERIAL BOTÁNICO Se colectaron muestras vegetales de tipo foliar de individuos de la especie Psidium guajava, en las inmediaciones de la vereda San Antonio, departamento del Huila, utilizando para ello un criterio de selección basado en la recolección aleatoria de hojas de diferentes estados de longevidad (hoja joven, hoja adulta y hoja envejecida). Se enviaron muestras al Herbario Catatumbo – Sarare de la Universidad de Pamplona, donde se realizó la identificación taxonómica de la especie. Las muestras restantes fueron secadas al aire libre en un lugar seco y se dispusieron para la extracción del aceite esencial. 5.2 PRETRATAMIENTO DEL MATERIAL BOTÁNICO Se limpió el material botánico, separando el material inorgánico y orgánico ajeno a las hojas como: polvo, tallos, flores, frutos e insectos. Posteriormente se lavó cada una de las muestras con agua destilada y se procedió al fraccionamiento de las mismas, mediante el corte del material vegetal (hojas) en partes pequeñas (Aproximadamente 1x1 cm), para aumentar el área de contacto (hojas– agua). 5.3 OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL FOLIAR POR HIDRODESTILACIÓN Debido a las dificultades presentadas en la Universidad Cooperativa de Colombia sede Neiva, para instalar el destilador en acero inoxidable, se optó por realizar la hidrodestilación en un equipo pequeño en vidrio. Ver Figura 1. Este equipo está compuesto por una manta de calentamiento conectada a energía 110 V (1), donde reposan dos balones de vidrio de cuello esmerilado con capacidad de 4000 ml, uno que contiene la mezcla solido-liquido (hojas-Agua) (2), unido al siguiente por donde pasa la mezcla gaseosa (3) y finalmente dos refrigerantes en espiral (4) con entrada (5) y salida (6) de agua, conectados a un reservorio con embudo de decantación (7). Para obtener el aceite esencial de Psidium guajava, se utilizaron las muestras de hojas secas y fragmentadas (Sólido) y se depositaron con agua (Líquido) en el equipo anteriormente mencionado, manejando una relación sólido-líquido 1:5. La

26

cantidad de sólido (hojas) de 400 gr utilizado para cada montaje y la de líquido (agua) de 2000 ml. Figura 1. Equipo para hidrodestilación

Fuente. El autor

Se realizaron montajes en el equipo para la obtención de aceite esencial por hidrodestilación, con tiempos de operación de tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6), siete (7) y ocho (8) horas; operando cada uno de estos tiempos por triplicado, para reportar el promedio de estas medidas. Una vez concluido el proceso de hidrodestilación, se procedió a separar el aceite esencial del agua, utilizando para esto la técnica de decantación, la cual permitió evacuar fácilmente el material condensado. Las muestras de aceite esencial obtenidas en la hidrodestilación se secaron con Sulfato de Sodio anhidro (Na2SO4), luego se rotularon y almacenaron en recipientes de vidrio color ámbar para evitar el contacto con la luz y se conservaron a temperatura de -4 °C.

27

5.4 IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE PSIDIUM GUAJAVA De acuerdo con lo planteado en la propuesta inicial de investigación, se pretendía realizar la determinación y confirmación de calidad y cantidad de los compuestos mayoritarios volátiles presentes en la muestra, seleccionándola de acuerdo al tiempo de operación que mayor rendimiento de aceite esencial presentara. Se había programado utilizar el método de Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM), en el laboratorio especializado con las normas ISO de la Universidad Industrial de Santander UIS (CENIVAM). Teniendo en cuenta que los costos de los análisis eran elevados y que los resultados de estos no eran fundamentales para dar cumplimiento con el objetivo general de este proyecto, se decidió no realizarlos. 5.5 DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS (DENSIDAD, TEMPERATURA DE EBULLICIÓN Y SOLUBILIDAD EN ETANOL) DEL ACEITE ESENCIAL DE PSIDIUM GUAJAVA. Utilizando los equipos, materiales y reactivos necesarios para determinar algunas propiedades fisicoquímicas del aceite esencial, se realizaron en el laboratorio los análisis para medir densidad, temperatura de ebullición y solubilidad en etanol de cada una de las muestras obtenidas en el proceso de hidrodestilación. Las medidas mencionadas se realizaron por triplicado, reportando como resultado el promedio. La densidad del aceite esencial se determino por el método de picnómetria.

)(

)(

mlVolumen

gMasaDensidad (1)

La temperatura de ebullición se determino con tubo thiele a 20 grados centígrados y la solubilidad en etanol se determino a temperatura de 20°C. 5.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS Se utilizaron como herramienta estadística para el tratamiento de la información los software Excel y statgraphics plus para determinar el mejor tiempo de operación, comparando la cantidad de aceite esencial obtenido en los tiempos de operación de cada corrida.

28

6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

MESES

N° ACTIVIDAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1

Recolección, tratamiento e identificación

taxonómica del material botánico.

X X X

2 Pretratamiento del material botánico.

X X

3 Obtención del aceite

esencial foliar por hidrodestilación.

X X

4

Identificación de los componentes

mayoritarios del aceite esencial de Psidium guajava.

X X

5

Determinación de las propiedades

fisicoquímicas (Densidad,

Temperatura de ebullición y

solubilidad en etanol) del aceite esencial de

Psidium guajava.

X X

6 Análisis estadístico de los resultados.

X X

7 Entrega del informe final.

X

29

7. PRESUPUESTO

Presupuesto Global de la Propuesta por Fuentes de Financiación, (En pesos).

RUBROS JUSTIFICACIÓN

FUENTES(En pesos)

CONADI * Contrapartida

1** Total

Materiales y Suministros

Clasificación taxonómica de la especie vegetal. Análisis de Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas CG-EM. 20 frascos color ámbar tamaño pequeño

800.000 1.200.000 2.000.000

Salidas de campo

Cinco (5) salidas a campo para reconocimiento de la zona. Cinco (5) salidas a campo para recolección de material botánico.

200.000 200.000

Bibliografía

TOTAL 2.200.000

30

8. RESULTADOS ESPERADOS

Clasificación Descripción53

Producto ☒

Productos de Generación de

Nuevo Conocimiento

Son aquellos aportes significativos al estado del arte de un área de

conocimiento, que han sido discutidos, validados que lleguen a

ser incorporados a la discusión científica, al desarrollo de las

actividades investigativas, académicas y a la práctica

tecnológica

Artículos A ☐

Artículos B ☐

Libros de Investigación ☐

Capítulos en Libros de Investigación ☐

Patentes ☐

Variedad vegetal ☐

Productos de Apropiación

Social del Conocimiento

La apropiación social del conocimiento se entiende como un

proceso y práctica social de construcción colectiva, donde

actores que pueden ser individuos, organizaciones o comunidades, se involucran en interacciones que les

permiten intercambiar saberes y experiencias, donde el

conocimiento circula, es discutido, puesto a prueba, usado y llevado a

la cotidianidad.

Proyectos y programas de investigación con participación ciudadana

☐

Eventos de participación ciudadana ☐

Programas Pedagógicos de fomento a la investigación científica, al desarrollo y la innovación

☐

Programas o proyectos de extensión universitaria o de Responsabilidad social

☐

Redes de fomento de la Apropiación Social

☐

Proyecto de comunicación del conocimiento

☐

Generación de contenidos (documentos) ☒

Generación de contenidos (multimedia) ☐

Participación Eventos Científicos ☒

Participación Redes de Conocimiento ☐

Productos de Formación de

Recursos Humanos

Se consideran los siguientes productos: la generación del

espacio para asesorar y desarrollar las actividades implicadas en la

realización de una tesis o trabajo de grado que otorgó el título de

magister, especialista o profesional; ejecución de proyectos de I + D + i

54

con formación y apoyo a programas de formación.

Trabajo de Grado de Maestría ☐

Trabajo de Grado Especialización ☐

Trabajo de Grado de Pregrado ☒

Proyectos I + D+ i con formación ☐

Apoyo a Programas de Formación ☐

53Definiciones de los tipos de productos resultados de investigación e innovación, de acuerdo a lo propuesto por

Colciencias.

54I + D + i: Investigación, Desarrollo e innovación

31

9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A continuación se presentan los resultados obtenidos para este trabajo de grado: Recolección e identificación taxonómica del material botánico. El lugar de muestreo es la Vereda San Antonio ( finca el Carmen ) , municipio de Neiva, departamento del Huila, la cual limita al norte con el municipio de Tello , al oeste con el corregimiento de fortalecillas , al sur con el corregimiento rio las ceibas y al este con el departamento del Caquetá .Se encuentra ubicada a 22 kilómetros de la sede principal de la Universidad Cooperativa de Colombia de Neiva, a una altura de 542 metros y en las coordenadas de latitud (N2°58’0.012’’) y longitud (E-75°0’0’’. Para determinar la posición del lugar de muestreo se utilizó un Sistema de Posicionamiento Global GPS maps 62s GARMIN. Ver foto 1:

Foto 1. Determinación de las coordenadas del lugar de muestreo Vereda San Antonio, finca el Carmen.

Fuente: El autor.

Los resultados obtenidos permitieron ubicar el lugar de muestreo en un mapa, mediante el uso de Google. Ver foto 2:

32

Foto 2. Vista aérea de la Vereda San Antonio. 2015 Fuente: GOOGLE corporation

Se tomaron muestras de especies de Psidium guajava que se encontraron en estado silvestre en la vereda San Antonio, finca el Carmen del municipio de Neiva, departamento del Huila. En la Foto 3., se muestran algunos de los individuos muestreados:

33

Foto 3. Especies silvestres de Psidium guajava en San Antonio - Huila

Fuente: El autor

Se colectaron muestras vegetales de tipo foliar de individuos de la especie Psidium guajava. Los muestreos se realizaron en horas de la mañana, iniciando a las 8:00 a.m. En la Foto 4 se muestra la imagen del estudiante Nestor Perdomo Moyano colectando el material foliar de Psidium guajava en la Vereda San Antonio:

34

Foto 4. Muestreo foliar de Psidium guajava Fuente: El autor.

El criterio de selección de las muestras foliares fue aleatorio, el cual incluyó hojas de diferentes estados de longevidad (hoja joven, hoja adulta y hoja envejecida). Ver Foto 5.

35

Foto 5. Hojas de Psidium guajava

Fuente: El autor.

Parte de las muestras colectadas se enviaron al Herbario Catatumbo - Sarare de la Universidad de Pamplona, donde se realizó la identificación taxonómica de la especie. Esta actividad se logro gracias a un convenio de cooperación gestionado a través de este proyecto, el cual se firmo entre la Universidad de Pamplona y la Universidad Cooperativa de Colombia. El informe que presento el director del Herbario Catatumbo – Sarare de la Universidad de Pamplona, M.Sc. Luis Roberto Sánchez Montaño, sobre la clasificación taxonómica de esta especie se encuentra en el Anexo A. Este informe reporto la siguiente información:

Hoja joven

Hoja adulta

Hoja envejecida

36

Tabla 1. Clasificación taxonómica del Psidium guajava

Taxonomía de la guayaba

Reino Plantae División Streptophyta Clase Equisetopsida C. Agardh Subclase Magnoliidae Novák ex Takth. Superorden Rosanae Takht. Orden Myrtales Juss. Ex Bercht. & J. Presl. Familia Myrtaceae Juss. Género Psidium L. Especie Psidium guajava L.

De acuerdo con el reporte anterior, se determino que la muestra foliar colectada en el Municipio de San Antonio - Huila, corresponde a la especia Psidium guajava L. Pretratamiento del material botánico. La parte restante del material botánico colectado en campo, se limpió, separando el material inorgánico y orgánico ajeno a las hojas como: polvo, tallos, flores, frutos e insectos. Foto 6. Muestras foliares de Psidium guajava

Fuente: El autor

37

Posteriormente se lavó cada una de las muestras con agua destilada y se procedió al fraccionamiento de las mismas, mediante el corte manual del material vegetal (hojas), en partes pequeñas (aproximadamente 1x1 cm), para aumentar el área de contacto (hojas – agua). Una vez fraccionadas, las muestras se homogenizaron mediante la mezcla de ellas en un contenedor grande, a fin de garantizar que en cada prueba, estuvieran presentes todo tipo de hojas (jóvenes, adultas y envejecidas). Obtención del aceite esencial foliar por hidrodestilación. De acuerdo con la metodología diseñada, se realizaron los montajes planeados en un equipo destilador por el método de hidrodestilación. Este equipo está compuesto por una manta de calentamiento conectada a energía 110 V (1), donde reposan dos balones de vidrio de cuello esmerilado con capacidad de 4000 ml, uno que contiene la mezcla solido-liquido (hojas-Agua) (2), unido al siguiente por donde pasa la mezcla gaseosa (3) y finalmente dos refrigerantes en espiral (4) con entrada (5) y salida (6) de agua, conectados a un reservorio con embudo de decantación (7). En la Foto 7., se puede observar el equipo utilizado para realizar la hidrodestilación: Foto 7. Equipo para hidrodestilación

Fuente: El autor

38

Para obtener el aceite esencial de Psidium guajava, se utilizaron las muestras de hojas secas y fragmentadas (Sólido) y se depositaron con agua (Líquido) en el equipo anteriormente mencionado, manejando una relación sólido-líquido 1:5. La cantidad de sólido utilizado para cada montaje fue de 400 g y la de líquido de 2000 ml. Se realizaron montajes en el equipo para la obtención de aceite esencial por hidrodestilación, con tiempos de operación de tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6), siete (7) y ocho (8) horas; operando cada uno de estos tiempos por triplicado, para reportar el promedio de estas medidas. Una vez concluido el proceso de hidrodestilación, se procedió a separar el aceite esencial del agua, utilizando para esto la técnica de decantación, la cual permitió evacuar fácilmente el material condensado. En la Foto 8., se puede observar el aceite obtenido luego de 6 horas de operación del hidrodestilador.

Foto 8. Aceite esencial obtenido por hidrodestilación de Psidium guajava

Fuente: El autor

Las muestras de aceite esencial obtenidas en la hidrodestilación se secaron con Sulfato de Sodio anhidro (Na2SO4), posteriormente se almacenaron en recipientes de vidrio color ámbar para evitar el contacto con la luz y se conservaron a temperatura de -4 °C.

39

Luego de secar el aceite se procedió a determinar el volumen que se obtuvo en cada montaje. Los resultados se pueden observar en la Tabla 2:

Tabla 2. Resultados de Tiempo de operación y Volumen de Aceite Esencial obtenido

Tiempo (t) de operación (h)

Numero de Prueba

Volumen (V) obtenido en la

prueba (ml)

Promedio del Volumen (V) de aceite esencial para cada tiempo

de operación (ml)

3

1 1,8 1,63 2 1,6

3 1,5

4

1 1,8 1,96 2 1,9

3 2,2

5

1 2,0 2,23 2 2,3

3 2,4

6

1 2,4 2,46 2 2,4

3 2,6

7 1 2,5 2,56 2 2,5

3 2,7

8

1 2,5 2,60 2 2,6

3 2,7

Identificación de los componentes mayoritarios del aceite esencial de Psidium guajava. De acuerdo con lo planteado en la propuesta inicial de investigación, se pretendía realizar la determinación y confirmación de calidad y cantidad de los compuestos mayoritarios volátiles presentes en la muestra, seleccionando dicha muestra, de acuerdo al tiempo de operación que mayor rendimiento de aceite esencial presentara. Se había programado utilizar el método de Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM), en el laboratorio especializado con las normas ISO de la Universidad Industrial de Santander UIS (CENIVAM). Teniendo en cuenta que los costos de los análisis eran elevados, que no se contaba con presupuesto y que los resultados de estos no eran fundamentales para dar cumplimiento con el objetivo general de este proyecto, se decidió no realizarlos. Sin embargo para presentar un panorama general sobre la calidad del aceite esencial de esta especie, se opto por referenciar a algunos autores, quienes en sus investigaciones reportaron la composición química del aceite esencial del Psidium guajava. La Tabla 3., presenta los resultados de la revisión bibliográfica:

40

Tabla 3. Componentes mayoritarios del aceite esencial foliar de Psidium guajava

AUTOR AÑO

PAIS

COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL FOLIAR

Cano Romero, Laura Elena

2013 México

Cineol (R)–limoneno (S)–limoneno β–cariofileno

De Souza, et al. 2011 Brasil

Limoneno 1,8–cineol Terpinen–4–ol α–terpineol β–cariofileno

Padilla, et al. [32] 2010 Venezuela

Humuleno 1,8–cineol β–cariofileno β–bisaboleno Sesquifelandreno Oxido de cariofileno

Torres, et al. [33] Argentina

Cariofileno 1,8–cineol Limoneno β–pineno α–pineno

En 2009 en un estudio del departamento de farmacia de la facultad de química de la Universidad Nacional Autónoma de México se obtuvo el aceite esencial de la hoja de Psidium guajava por el método de hidrodestilación. Así mismo, se llevó a cabo la identificación de los componentes mayoritarios del aceite esencial por cromatografía de gases (CG) acoplado a espectrometría de masa (EM). El análisis del aceite esencial de las hojas de Psidium guajava indico la presencia de 30 compuestos, 4 de estos representan el 30.78% del total de componentes presentes en la esencia y son: el R-limoneno (14.87%), el segundo el S-limoneno (7.14%) y eucaliptol o Cineol (4.03%). en el cuadro se muestran los componentes mayoritarios identificados en el aceite esencial de la especie vegetal objeto de estudio. Tabla 4. Identificación y cuantificación de los componentes mayoritarios en el aceite esencial de las hojas de Psidium guajava.

NOMBRE DEL COMPUESTO ÁREA (%)

R-limoneno 11.7169

s-limoneno 5.6270

β-cariofileno 3.7345

1.8-cionol (eucaliptol) 3.1753

α-pineno 2.7418

5.7- dimetil – (R)-1.6-octadieno 2.7463

41

Continuacion Tabla 4.

NOMBRE DEL COMPUESTO ÁREA (%)

Acetofenoma 2.7463

Geranil vinil eter 2.0456

Copaeno 2.0456

3.7- dimetil-1,3,7-octatrieno 1.1212

Grafica 1. Cuantificación de los componentes mayoritarios en el aceite esencial de las hojas de Psidium guajava.

De acuerdo con la revisión bibliográfica presentada anteriormente, se demuestra que en el estudio de Cano 2013, el componente mayoritario del aceite esencial de Psidium guajava fue el Cineol; en el estudio de De Souza et al., 2011, el componente mayoritario del aceite esencial fue el Limoneno; en el estudio de Padilla et al., 2010, el componente mayoritario fue el Humuleno y en el trabajo Torres et al., fue el Cariofileno. El Limoneno y el Cariofileno fueron los componentes del aceite esencial de Psidium guajava más frecuentes encontrados en las muestras analizadas por los autores referenciados

42

Los compuestos mayoritarios del aceite esencial foliar de Psidium guajava, se encuentran en la National Institute of Standards and Technology NIST, con las siguientes estructuras químicas: Ver Figura 2:

Figura 2. Estructura química de 1,8-cineol, Limoneno y cariofileno según NIST55

Tabla 5. Cuadro Resumen de Estructuras Químicas Presentes en AE. Psidium Guajava

NOMBRE CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURA

1,8-cineol

Se obtiene de las hojas de las diversas especies vegetales

.Líquido miscible con alcohol, su olor varía entre el de la menta y

el de la trementina.

pineno

Es un compuesto químico de la familia de los Monoterpenoides bicíclicos, se encuentra en la

resina, tallos y hojas de varias plantas.

55 http://www.nist.gov/

1,8-cineol Limoneno

Cariofileno

43

Continuación Tabla 5

NOMBRE CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURA

CARIOFILENO

Es un componente de muchos

aceites esenciales, especialmente el aceite de

clavo de olor, el aceite de los tallos y las flores.

LIMONENO

Es una sustancia natural que se extrae del aceite de las

cáscaras de los cítricos y que da el olor característico a los

mismos. Pertenece al grupo de los terpenos

TERPINEN-4-OL

Es un terpeno con un peso molecular de 154.249. Está

considerado como el principal ingrediente activo de aceite

esencial.

β-pineno

Es un monoterpeno, un

compuesto orgánico que se encuentra en las plantas.

Determinación de las propiedades fisicoquímicas (Densidad, Temperatura de ebullición y solubilidad en etanol) del aceite esencial de Psidium guajava. Utilizando los equipos, materiales y reactivos necesarios para determinar algunas propiedades fisicoquímicas del aceite esencial, se realizaron en el laboratorio los análisis para medir densidad, temperatura de ebullición y solubilidad en etanol de cada una de las muestras obtenidas en el proceso de hidrodestilación. Las medidas mencionadas se realizaron por triplicado, reportando como resultado el

44

promedio. La densidad del aceite esencial se determinó por el método de picnómetria, la temperatura de ebullición se determinó con tubo thiele y la solubilidad en etanol se determinó a temperatura de 20°C. En la Tabla 4., se encuentran los resultados de los análisis de las propiedades anteriormente mencionadas. Tabla 6. Propiedades del aceite esencial de Psidium guajava

45

Los resultados obtenidos, muestran valores de 0.9221, 0.9220, 0.9218, 0.9215, 0.9216 y 0.9219 para tiempos de operación de tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6), siete (7) y ocho (8) horas, respectivamente. A pesar de que los valores obtenidos no son exactos a los encontrados en la bibliografía, estos coinciden con los reportados por Torres y colaboradores, el cual fue de 0.9189 [33] y los de Padilla et al., quienes reportaron un valor de 0.9111 g/ml [32]. La diferencia entre los valores para densidad presentados en esta investigación y los reportados en otros trabajos puede ser por error en la manipulación de los materiales. Con una desviación media en (3) horas de 0,00006, (4) horas de 0,00006, (5) horas 0,00025, (6) horas 0, 00015, (7) horas 0,00010 (8) 0,00012. Grafica 2. Propiedades de los aceites esenciales Preliminarmente Las Propiedades del aceite esencial en tiempo de operación Vs densidad preliminar denuestan el tiempo en ejecución para cada muestra de densidad. Grafica 3. Propiedades de los Aceites Esenciales en Cada Prueba

46

Análisis estadístico de los resultados. Teniendo en cuenta que este proyecto es un trabajo preliminar para una futura investigación sobre aceites esenciales, se pretende optimizar el tiempo de operación para la hidrodestilación del aceite esencial de Psidium guajava. Se utilizó como herramienta estadística los softwares Excel, statgraphics plus para determinar el mejor tiempo de operación, evaluando la cantidad de aceite esencial obtenido en cada corrida. En la Grafica 4., se evidencia que a medida que aumenta el tiempo de operación, también aumenta el volumen de aceite esencial obtenido. De acuerdo a lo anterior, se puede decir que el tiempo de operación óptimo para obtener aceite esencial de Psidium guajava por el método de hidrodestilación, es de ocho (8) horas, pues con este tiempo de operación se aprecia un mayor volumen de aceite que en corridas con menor tiempo. También es importante resaltar que en corridas con mayor tiempo de operación, se obtiene más aceite,

47

pero esta diferencia no es matemáticamente significativa; además, los componentes volátiles y semivolátiles del aceite esencial se verían afectados por la temperatura del proceso. Debido a que la Densidad, la Temperatura de ebullición y la solubilidad en etanol son propiedades intrínsecas de la materia, la diferencia entre los valores obtenidos en las medidas de estas propiedades, no es matemáticamente significativa. Grafica 5. Resultados de tiempo de operación y volumen del aceite esencial obtenidos desde la hora 0 a la hora 8.

48

10. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, se puede concluir lo siguiente: El tiempo de operación óptimo para obtener aceite esencial de Psidium guajava por el método de hidrodestilación, es de ocho (8) horas, pues con este tiempo de operación se consigue mayor volumen de aceite sin afectar los compuestos volátiles y semivolátiles. La muestra foliar colectada en la Vereda San Antonio, municipio de Neiva, departamento del Huila corresponde a la especie de Psidium guajava. La Densidad, la Temperatura de ebullición y la solubilidad en etanol son propiedades intrínsecas de la materia, demostrándose esto en los valores medidos en diferentes replicas sobre una propiedad, los cuales tienen una diferencia muy pequeña de error matemáticamente significativa, que es debida a la manipulación de los materiales utilizados para determinar la mencionada medida. De acuerdo a los referentes bibliográficos que apoyan este trabajo, se puede decir que el aceite esencial de Psidium guajava es rico en : 1,8-cineol, (R) –limoneno (S)–limoneno , β–cariofileno ,Terpinen–4–ol , α–terpineol , β–cariofileno ,Humuleno , Sesquifelandreno , Oxido de cariofileno , β–pineno , α–pineno. (Ver Anexos B, C, D, E, F, G). Teniendo en cuenta los reportes de los referentes bibliográficos, Moreno et al, 2010, en un estudio sobre Myrtaceae reporto que por cada 100 g de hojas, obtuvo 2,11 ml de aceite esencial, mostrando un valor distinto a lo obtenido en el presente trabajo, pues por cada 100 g de hojas de Psidium guajava, se obtuvieron 0,5 ml de aceite.

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11. RECOMENDACIONES Una vez concluido este trabajo, se recomienda investigar sobre otros aspectos relacionados con la extracción y la caracterización de aceites esenciales obtenidos de especies vegetales aromáticas silvestres o cultivadas en el departamento del Huila. 1. Extender los estudios de bioprospección a otras especies nativas del

departamento del HUILA.

2. Trabajar en conjunto con otras entidades encargadas de investigación para facilitar equipos y reactivos para el desarrollo de trabajos relacionados con este tipo de investigación.

3. Analizar con mayor detenimiento los componentes mayoritarios presentes en

los aceites esenciales por medio de los estudios de cromatografía de gases (CG) y espectrometría de masa (EM).

4. Evaluar para cada tiempo de operación, la muestra de aceite esencial por CG-EM, a fin de determinar si la Temperatura afecta la presencia de los componentes volátiles.

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BIBLIOGRAFÍA

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ANEXOS

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Anexo A. Informe Taxonomía Psidium guajava

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Anexo B. Certificado de participación como ponente en el Encuentro Departamental de Semilleros de Investigación, REDCOLSI Nodo Huila 2013. Modalidad Propuesta de investigación.

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Anexo C. Certificado de participación como ponente en el 2.do SIMPOSIO INTERNACIONAL DE AGROINDUSTRIA “ALIANZA HUILA TECNOLÓGICO “, NEIVA – HUILA 2013.

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Anexo D. Certificado de participación como ponente en el Encuentro Departamental de Semilleros de Investigación, REDCOLSI Nodo Huila 2014. Modalidad propuesta de Investigación.

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Anexo E. Certificado de participación como ponente en el XVII Encuentro Nacional y XI INTERNACIONAL de Semilleros de Investigación, REDCOLSI, TUNJA - BOYACÁ 2014.

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Anexo F. Certificado de participación como ponente en la semana de ciencia y tecnología e innovación del 15 al 20 de octubre en la ciudad de Neiva - Huila 2014. Modalidad propuesta de Investigación.

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Anexo G. Certificado de participación como ponente al premio REYMEL SERRANO URIBE convocatoria 2014 como idea de negocio, ocupando el 2° lugar.