NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES LARÍNGEAS

Libro virtual de formación en ORL 1

IV. LARINGE Y PATOLOGÍA CÉRVICO-FACIAL

Capítulo 111

NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES LARÍNGEAS

Dres. R. Charlone Granucci, A. Penagos Velez, C. Alvarez Marcos

Hospital Universitario Central de Asturias

INTRODUCCIÓN Y CONCEPTO Las neoplasias intraepiteliales escamosas (NIE), se conocen también como lesiones premalignas o precancerosas y tienen su origen en el epitelio de las vías aerodigestivas superiores (VAS). En el pasado el diagnóstico de estas lesiones era clínico, para después hacerse por métodos histopatológicos y morfocitométricos, hasta llegar a los actuales estudios genéticos y moleculares. Debemos entender a la NIE como “la forma más precoz de neoplasia maligna que con los medios actuales somos capaces de detectar”. Observaremos como según avanzamos en su estudio lesiones con un aspecto clínico inocente de leucoplasia o histopatología de displasia leve evolucionan a neoplasias invasivas si presentan ADN aneuploide o sobreexpresan proteína p53, e incluso lesiones con aspecto clínico-histológico de normalidad presentan alteraciones cromosómicas y moleculares precoces. Otro concepto que debemos manejar es el de “área o campo de cancerización”. La idea del epitelio inquieto o de riesgo tiene en el caso de las VAS una especial trascendencia. En él los agentes carcinogénicos actuarían en los genes de las células madre epiteliales, a nivel del sustrato suprabasal. La oncogénesis se produce sobre toda la extensión del epitelio de las VAS, pero con intensidad variable según las zonas. Este hecho dispararía el fenómeno neoplásico en distintos lugares, pero de forma sincrónica o metacrónica. La progresión distinta de las NIE múltiples se deberían a la mayor o menor alteración del ADN y a la conservación de alguno de los mecanismos normales del proceso proliferación/maduración. Por ese motivo aunque en las NIE hagamos un control local eficaz, si persisten los factores etiológicos, es posible que se desarrollen otras lesiones sincrónicas múltiples, difíciles de detectar clínicamente, que tengan una progresión invasiva (Figura 1).

Capítulo 111 Neoplasias intraepiteliales laríngeas 2

Figura 1. Esquema de los distintos tipos de carcinogenesis.

CLASIFICACIÓN Las clasificaciones más usadas en la clínica se sirven del estudio histopatológico clásico. CLASIFICACIONES BASADAS EN LA PRESENCIA DE QUERATOSIS E HIPERPLASIA

Figura 2. Hiperplasia y queratosis.

La queratosis se define como la presencia de láminas dequeratina en la superficie del epitelio, bien comoortoqueratosis en la que las células epiteliales mantienen elnúcleo, o paraqueratosis donde lo pierden (Figura 2). La queratina se observa clínicamente como una placablanquecina que se denomina leucoplasia. La mucosa de las VAS en condiciones normales esta cubiertapor un epitelio no queratinizado, por lo que su presencia esanormal. Para muchos autores la queratosis no guarda relación con eldesarrollo de la NIE potencialmente invasiva y representa unareacción defensiva superficial del epitelio frente a distintosagentes irritantes. Por ello, se incorporo el concepto


de atipia, que consiste en una serie de lesiones histológicas nucleares y tisulares con mayor trascendencia que la queratosis (Tablas I y II). A nivel tisular la orientación anormal de los núcleos (basalización o verticalización de su eje mayor), la presencia de queratina en el interior del epitelio (disqueratosis) y la pérdida del nivel horizontal en la unión epitelio-estroma (papilomatosis), nos sirven para reforzar el concepto de atipia. La atipia se gradúa en leve, moderada y grave según afecte, de la membrana basal a la superficie, al 1/3 inferior, 2/3 ó 3/3 de la altura del epitelio (Figuras 3, 4 y 5).

Tabla I. Clasificación según la queratosis y atipia Tipo histológico Porcentaje Progresión

Queratosis sin atipia 66% 3%

Queratosis con atipia leve 22% 7%

Queratosis con atipia moderada 2,5% 17%

Queratosis con atipia severa 9,5% 28%

Total 6,7%

* modificado de Sllamniku y cols. en un estudio de 921 pacientes

Otros autores utilizan como eje central de su clasificación la hiperplasia histológica, también conocida como clasificación de Kleinsasser. La hiperplasia se define como un aumento en la altura y espesor del epitelio escamoso debido al incremento del número de células (Figura2). Si este aumento se sitúa en el cuerpo mucoso de Malpighi la hiperplasia se denomina acantosis. Clínicamente la zona con hiperplasia está engrosada y pierde su brillo habitual. Al igual que la queratosis se considera una reacción del epitelio, sin lesión a nivel nuclear (Tabla II).

Tabla II. Clasificación según la hiperplasia y atipia

Tipo histológico Porcentaje Progresión

Hiperplasia simple 19% 6%

Carcinoma in situ 35% 50%

Total 21%

* modificado de Olde Kalter y cols., en un estudio de 93 pacientes


Figura 3. NIE de grado 1. Figura 4. NIE de grado 2. Figura 5. NIE de grado 3.

CLASIFICACIÓN BASADA EN LA PRESENCIA DE DISPLASIA Es la mas utilizada para clasificar las lesiones preinvasivas y la que utiliza la OMS. La displasia une a las características de la atipia celular los cambios estructurales (Tabla III). Se gradúa de forma progresiva en leve, moderada y grave, según afecte al 1/3 inferior o basal, 2/3 inferiores (basal y medio), o todo el epitelio (basal, medio y superior)(Tabla IV). Esta clasificación tiene un carácter pronóstico evolutivo hacia el carcinoma invasivo, según aumenta el grado de la displasia. Tiene la ventaja de que sitúa como principal cualidad de las lesiones a la displasia, que presenta cambios similares a los de una verdadera neoplasia (Tabla III). No diferencia la displasia grave del carcinoma in situ clásico, que en el epitelio de las VAS es un hallazgo excepcional.

Tabla III. Hallazgos morfológicos en la displasia microscópica y ultramicroscópica

Displasia microscópica Atipia celular: Hipercromatismo nuclear Polimorfismo nuclear* Aumento núcleo/citoplasma* Mitosis aumentadas y atípicas* Cambios estructurales: Retraso y diferenciación anormal * (basalización) Queratosis, disqueratosis*

Ensanchamiento unión epitelio-estroma Displasia ultramicroscópica Alteraciones celulares: Anormalidades nucleolares Distribución cromática anormal Alteraciones organelas citoplasma Membrana basal: Plegamientos ensanchamientos Discontinuidad, laminación Espacio intercelular: Ensanchamiento Espongiosis Rotura desmosomas Corion: Células inflamatorias, exocitosis Aumento colágeno y colágeno anormal Linfáticos dilatados * También se observan en la ultramicroscópica


La línea hipotética de separación entre displasia y neoplasia invasiva es la membrana basal, siendo la progresión natural de la displasia desde la zona germinativa basal y suprabasal hacia la zona madurativa superior del epitelio, en relación al espacio aéreo de las VAS. La evidencia clínica muestra que por cada seis casos de carcinomas infiltrantes, sólo diagnosticamos uno de lesión preinvasiva. La mayoría de los tumores tienen una carcinogénesis brusca y no pasan por los pasos intermedios de NIE, quizás debido a que los agentes carcinogénicos alteran con distinta intensidad los genes de las células germinales. Si la alteración genética es intensa y se pierde por completo el equilibrio maduración/proliferación, la NIE progresaría de forma explosiva desde la zona germinativa en contacto con la membrana basal, pasando la lesión de displasia leve a carcinoma infiltrante (Figura 1). CLASIFICACIÓN BASADA EN EL GRADO DE MALIGNIDAD Introduce el término ya comentado de NIE que asocia alteraciones en la proliferación (atipias) junto a otras en la maduración (disqueratosis). Considera a estas lesiones como neoplasias incipientes, eliminando los confusos términos de displasia y carcinoma in situ, además de establecer que la neoplasia surge del desequilibrio entre maduración y proliferación. Las NIE de grado 1 y 2 (bajo grado) se corresponden con la displasia leve y moderada, mientras que las NIE de grado 3 (alto grado) equivale a la displasia grave (Tabla V). Es la clasificación es la que recomendamos y seguiremos en este capítulo.

Tabla IV. Clasificación según la displasia

Tipo histológico Porcentaje Progresión

Hiperplasia y/o queratosis sin displasia leve

73% 2%

Displasia moderada 13% 12.7%

Displasia grave-carcinoma in situ 14% 23%

Total 8,6%

* modificado de Hellquist y cols., en un estudio de 160 pacientes


FRECUENCIA Y LOCALIZACIÓN No existen estadísticas exhaustivas de la incidencia de las lesiones preinvasivas como ocurre en el cáncer escamoso de cabeza y cuello (CECC). En España las estadísticas más importantes se presentan en el cáncer de laringe, donde se alcanzan cifras superiores a las de los países anglosajones, a expensas de los tumores supraglóticos. El carcinoma invasivo desarrollado debe pasar necesariamente por una fase inicial de NIE, que se diagnostica en función de la velocidad de progresión de la enfermedad neoplásica y del tiempo de demora en el diagnóstico. Sólo el 6,7% de los cánceres de laringe tienen una biopsia previa de NIE. En la localización anatómica de estas lesiones hay dos regiones que destacan, la cavidad oral y la laringe glótica. En la región oral se dan con mas frecuencia en el suelo de la boca (43%), seguida por la lengua (25%), labio (24%), paladar (19%) y trígono retromolar (12%). En el caso de la laringe el motivo de consulta es la disfonía, asentando la mayor parte de las lesiones en la laringe glótica (66-97%). En la laringe supraglótica, al contrario de lo que ocurre en los carcinomas invasivos la frecuencia de estas lesiones es menor (3-25%). SEXO Y EDAD Hay una incidencia desproporcionada del sexo masculino frente al femenino, siendo la relación de 8-9 varones por 1-2 mujeres. La edad en la que se diagnostican se sitúa entre los 50 y 60 años, aumentando también de forma proporcional al grado de displasia. Los varones con displasia leve tienen una edad media de 57 años, 61 para las moderadas y 64 para las graves, siendo esta última similar a la de los carcinomas invasivos. La edad en el sexo femenino es significativamente menor (6-8 años) en todos los grados de NIE. ETIOLOGÍA Los factores etiológicos tanto endógenos como exógenos que disparan la carcinogénesis en las VAS son los mismos que en los CECC, que han sido más estudiados, y por eso vamos a referirnos casi siempre a ellos. Se produce una alteración en el contenido genético de las células germinales suprabasales, acumulándose dicha alteración o su producto de forma progresiva en el epitelio, hasta que es detectada. El daño genético se debe a la acción de carcinógenos químicos como el 3-4 benzopireno del humo del tabaco que se adhiere a las proteínas básicas del ADN, modificando el crecimiento y la maduración celular. La acumulación de p53 del tipo autóctono en el epitelio normal es inducida por el benzopireno y la nitrosamina del humo de tabaco. La mutación del gen p53, la historia de alcohol y tabaco y la presencia de CECC se asocian frecuentemente y de forma progresiva. Así, la mutación se presenta en el 58% de los pacientes con CECC que son fumadores y bebedores, en el 33% de los que sólo fuman y en el 17% de los que no fuman ni beben cuando se diagnostica la neoplasia. En los pacientes fumadores y bebedores con CECC hay gran variedad de mutaciones de bases, siendo las más frecuentes GC-AT (31%) y GC-TA (21%). Los pacientes que sólo fuman presentan la mutación GC-AT en el 40%, pero los no bebedores ni fumadores tienen la mutación de


p53 GC-AT en el 60%. Esta última mutación que podemos considerar endógena se debe a la metilación del di nucleótido guanosina-fosfato-citidina y además de ser predominante, pero no exclusiva en la población no fumadora, se observa en tumores de colon sin relación con el tabaco. El alcohol actúa como solvente de los hidrocarburos aromáticos policíclicos y facilita su penetración a través del epitelio hasta la capa suprabasal germinativa, además de inhibir la actividad ciliar. Los pacientes bebedores que no fuman no suelen presentar mutaciones en p53. Una vez que se altera el contenido genético, así como los mecanismos que regulan su función (oncogenes y antioncogenes), se desarrolla la neoplasia sin que dichos mecanismos sean capaces de frenarla. El contenido genético también puede estar alterado por la exposición a radiaciones ionizantes y a ciertos virus como el del papiloma humano (VPH) de los serotipos 6, 11, 16, 18 y 33. En los carcinomas invasivos de laringe se han detectado por hibridación in situ y PCR secuencias de ADN del VPH en el 12-28% de los casos, la mayoría del serotipo 16 (80%), pero sólo en el 2-9% de las NIE, no siendo un dato a tener en cuenta en el inicio de la carcinogénesis, aunque sí con el consumo de tabaco. La teoría más aceptada para explicar la implicación del VPH sugiere que el ADN viral se integra en el genoma de las células epiteliales, expresando las oncoproteínas E6 y E7 que alteran el control del ciclo celular ejercido por los genes supresores p53 y Rb, favoreciendo así la proliferación celular incontrolada. Se ha visto relación entre el aumento de polisomías en el cromosoma 9, la presencia de coilocitosis y la expresión de p53. Actualmente se conocen un centenar de tipos de VPH que están clasificados en formas de alto y bajo riesgo, según su tendencia a favorecer la progresión tumoral. Así, los tipos 6 y 11 son formas de bajo grado y en cambio el 16 es de alto grado, al detectarse en casi un tercio de los casos con cáncer de laringe. A pesar de estos hallazgos, existe una gran controversia sobre la implicación del VPH en la carcinogénesis laríngea. Otro factor que se ha visto implicado en el desarrollo de la NIE y del CECC es la enfermedad por reflujo faringo-laríngeo. La secreción gástrica por su contenido en ácido clorhídrico causa inflamación crónica de la mucosa laríngea, con clínica de disfonía, disfagia, sensación de cuerpo extraño y tos. Las formas severas dan lugar a granulomas, úlceras o pólipos en las cuerdas vocales. Se ha observado además que la secreción ácida se asocia con NIE y carcinomas invasivos, de forma similar a lo que ocurre en la ERGE con la metaplasia de Barret que es origen de adenocarcinomas. Se ha detectado mayor incidencia de reflujo faringo-laríngeo en pacientes con CECC (80%) que en la población general (19%). Hay casos de cáncer laríngeo sin exposición al tabaco y alcohol, con reflujo como único factor de riesgo, llegando a estimar el riesgo atribuible a esta patología en un 5-14%. Aún así, sigue existiendo también una gran controversia sobre si se trata de un factor inductor o es sólo un promotor de la carcinogénesis. Un efecto similar a la secreción ácida gástrica sobre la mucosa laríngea se produce por el reflujo duodeno-gastroesofágico de los pacientes con una gastrectomía, pero en ese caso la secreción es alcalina por su contenido en sales biliares. La exposición laboral a ciertas sustancias puede explicar la diferencia geográfica del cáncer laríngeo no atribuible a los hábitos tóxicos de cada zona. Hay estudios que relacionan el CECC con el níquel, polvo de madera, asbesto, barnices y pinturas, fibra de vidrio y fibras textiles…, pero estos resultados son muy controvertidos y en muchos casos sesgados por la exposición concomitante al tabaco y alcohol.


Algunas dietas ricas en fruta, vegetales y vitaminas C y E se asocian a menor riesgo de CECC, por su poder antioxidante, al proteger el ADN de las alteraciones producidas por los radicales libres. El déficit de vitamina A juega también un papel de interés al ser protectora del epitelio, como veremos al referirnos a la terapéutica. La inmunidad que se encuentra frecuentemente alterada en los CECC, no presenta cambios importantes en estas lesiones precoces, por lo que no se tiene una clara constancia de si se trata del origen de la carcinogénesis o del bloqueo debido a la invasión tumoral. Por último, aunque no se ha reconocido en el CECC un claro componente hereditario debido a su fuerte relación con la exposición al tabaco y alcohol, sólo un grupo reducido de todos los fumadores desarrollan cáncer, teniendo los familiares directos de los pacientes con CECC tres veces más riesgo de tener un tumor en las VAS. Esto pone de manifiesto la susceptibilidad genética a los agentes carcinogénicos. Esta predisposición estaría mediada por la inestabilidad cromosómica, la actividad de enzimas detoxificantes y los mecanismos de reparación del ADN. DIAGNÓSTICO Describimos los procedimientos que por su utilidad constatada pueden ser utilizados en el diagnóstico de las NIE de la laringe. Realizaremos el diagnóstico sobre varios aspectos: Clínico Como ya hemos comentado las dos localizaciones más frecuentes donde se observan estas lesiones son la cavidad oral y la laringe glótica. La forma más frecuente de presentación es la placa blanquecina típica sobre la mucosa o leucoplasia, resultado de un mecanismo reactivo-defensivo de formación de queratina. En el 80% de las leucoplasias no se observa en la histología hallazgos compatibles con NIE. Otras lesiones observadas son la eritroplasia con aspecto enrojecido y el papiloma queratógeno que es como la leucoplasia pero bien delimitado y sobreelevado. El paciente que presenta una lesión en la laringe glótica suele consultar por disfonía, diagnosticándose la enfermedad en ese momento. Además de la laringoscopia indirecta clásica, son procedimientos de rutina la fibroscopia y videoestroboscopia. La fibroscopia permite la observación de zonas difíciles como la subglotis. La videoestroboscopia observa la progresión de la onda mucosa, detectando cambios mínimos o ausencia en la vibración, modificándose el grado de vibración de los pliegues con la progresión de la lesión histológica. Las zonas sospechosas de NIE pueden también ser seleccionadas por autofluorescencia al introducir una sonda de fibra óptica con luz láser de 400 nm (azul) y 640 nm (roja) de longitud de onda. Los patrones de fluorescencia son distintos para el epitelio normal, displasia y carcinoma. Otra técnica habitual es la microcirugía laríngea clásica con anestesia general que puede asociarse a la utilización de endoscopios rígidos con ópticas de 0, 30, 70 y 120º, observando así con gran precisión y nitidez toda la laringe, incluso el borde inferior de los pliegues vocales y la subglotis. Así, podemos definir mejor la extensión lesional y por su efecto tridimensional apreciar pequeños relieves. Una modificación de la endoscopia rígida es la endoscopia de contacto y tinción con azul de metileno. Consiste en teñir las células de la superficie epitelial y observar con aumentos de 60x y 150x. Con esta técnica podemos objetivar signos de atipia celular, aunque no el estado de la membrana basal. La irregularidad y el pleomorfismo nuclear nos hacen sospechar la infiltración, siendo útil para diferenciar el epitelio normal, la queratosis y la NIE de los carcinomas infiltrantes.


No hay que olvidar en relación al “campo de cancerización”, la posible presencia de otra neoplasia asociada, que se observa más en relación al incremento del grado de progresión de la NIE. Histopatológico Este diagnostico, que emplea el estudio básico con hematoxilina y eosina, consiste en demostrar la presencia de atipia o displasia intraepitelial (Figuras 2, 3, 4 y 5). En la evolución de la NIE se observa una progresiva sustitución de la arquitectura normal por células similares a las del estrato basal, siendo el resultado del desequilibrio entre maduración/proliferación. El polimorfismo e hipercromatismo nuclear y las mitosis atípicas son frecuentes y fáciles de observar con este procedimiento, pudiendo así valorar la intensidad de las NIE según el grado de malignidad (Tabla V). Tabla V. Clasificación de la neoplasia intraepitelial escamosa (NIE) en grados de malignidad

Tipo histológico

1) Hiperplasia escamosa con o sin queratosis

2) NIE grado 1. Atipias en la zona basal

3) NIE grado 2. Atipias en la zona basal y media. Disqueratosis individual 4) NIE grado 3. Atipias en todo el epitelio. Disqueratosis individual o en perlas. Queratosis superficial.

NIE 1 y 2: NIE de bajo grado. NIE 3: Alto grado

La disqueratosis o presencia de queratina en zonas anómalas del interior del epitelio es otro dato que nos ayuda al diagnóstico, teniendo además interés pronóstico. Un paso importante en la progresión hacia carcinoma invasivo es la continuidad de la membrana basal y la actividad del corion subepitelial, que también ayudan a establecer el diagnóstico. Aunque no es un diagnóstico específico, la reacción inflamatoria subepitelial acompaña frecuentemente a las NIE y debemos interpretarla como una respuesta defensiva frente a la progresión. Citométrico, inmunohistoquímico y genético La presencia de aneuploidía tanto en la citometría de imagen como en la de flujo es considerada como el resultado de la alteración del contenido de ADN y establece el diagnostico, no apareciendo en los controles de sujetos sanos no fumadores. En la inmunohistoquímica el marcador p53 es el más estudiado. No se expresa en los controles de mucosa sana de sujetos no fumadores, pero sí en más del 50% de las NIE, de forma progresiva según el grado de displasia. En sujetos fumadores sin lesiones macroscópicas p53 se expresa en el 10%. Es frecuente observar tinciones positivas a p53 en los márgenes de resección de CECC que


en clínica e histopatología parecen sanos, sobre todo con un patrón de tinción lineal en las células basales. Estos pacientes presentan mayor número de recidivas locales, siendo la p53 diagnóstica de la enfermedad en estado precoz. Los estudios cromosómicos con hibridación in situ por fluorescencia (FISH) han probando también su efectividad en los bordes mucosos sanos y pueden ser empleados para el diagnóstico genético de las NIE. PRONÓSTICO Al igual que el diagnóstico también gira en torno a varios ejes. Clínico-histológico Debemos tener presente múltiples variables como el sexo, la edad, el hábito tabáquico, su persistencia e intensidad, junto a la imagen clínica, localización, tratamiento y evolución. Son importantes también los factores histológicos que se relacionan con la progresión invasiva como son la disqueratosis, la displasia y el grado de NIE. La disqueratosis es un marcador de progresión, apareciendo en el 50% de las NIE que invaden el estroma. Morfocitométrico Los estudios clínicos e histológicos clásicos presentan muchas dificultades para establecer el pronóstico, debido a que son procedimientos subjetivos y pueden presentan grandes variaciones entre el mismo observador o diferentes. Por tal razón se han desarrollado métodos que buscan hacer objetivas las alteraciones, permitiendo una cuantificación de los datos obtenidos en las preparaciones histopatológicas. Entre estos procedimientos tenemos la morfometría en la cual se evalúa la forma, el tamaño y la orientación de los núcleos por medio de un sistema de análisis digital de imagen. En esta prueba se puede aplicar la estereología, sistema en el cual se miden los núcleos en tres dimensiones con varias secciones. Tanto con el sistema de análisis digital de imagen como por estereología podemos evaluar el perímetro, área, forma, número y orientación de los núcleos epiteliales en las diferentes zonas. Estas medidas han permitido establecer un índice que incluye la orientación vertical de los núcleos y su número, de tal forma que se relaciona un marcador de maduración con otro de proliferación. Este índice se define como índice de progresión histométrico o IPH, obteniendo una especificidad del 82% y una sensibilidad del 100% para predecir la progresión (Figuras 6 y 7).


Figura 6. Morfometría de una NIE 1. El eje de orientación nuclear es variable según las zonas del epitelio.

Figura 7. Morfometría de una NIE 3. El eje de orientación nuclear tiene un predominio vertical.

Otra de las técnicas aplicadas es la citometría de imagen que consiste en realizar una selección de los núcleos en las zonas sospechosas de epitelio. Los núcleos se tiñen con la técnica de Feulgen, donde la intensidad de la tinción es proporcional al contenido de ADN. Las lesiones con un contenido anormal de ADN (aneuploidía) progresan con mayor frecuencia a carcinoma invasivo. Tanto la morfometría como la citometría de imagen son sistemas complementarios en los modelos de progresión de las NIE. La citometría de flujo citada al hablar del diagnóstico, al medir gran número de núcleos es muy sensible para detectar ADN aneuploide, pero poco específica al no valorar de forma exclusiva los núcleos epiteliales, siendo más adecuada para el estudio de los CECC que en las NIE (Figuras 8 y 9).

Figura 8. Citometría diploide. Figura 9. Citometría aneuploide.


Inmunohistoquímico y molecular El gen p53 se localiza en el cromosoma 17 y participa en la reparación del ADN dañado por los agentes carcinógenos. Detiene el ciclo celular asociándose a la ciclina CDK y a p21. Induce también la apoptosis de las células epiteliales cuando la lesión del ADN es irreparable. Si el gen pierde la heterocigosidad, bien por delecciones (60%) o mutaciones puntuales (18%), su alteración codifica una proteína mutada que no cumple sus funciones normales. Se han propuesto modelos de carcinogénesis donde el gen precursor que inicia el cambio desde la hiperplasias escamosa hacia la NIE se localiza en 17p y correspondería a p53. Por lo tanto la sobreexpresión de p53 podría estar relacionada con el desarrollo precoz de las NIE y su progresión a carcinoma invasivo. La expresión de p53 es progresiva según se incrementa el grado de displasia, desde el 50-60% en displasia leve, pasando por el 85% en displasia grave y alcanzando el 90% en el cáncer invasivo de laringe. Se demostró que en los márgenes peri tumorales normales o displásicos hay expresión de p53 en el 20-25%, relacionándose con mayor número de recidivas locales. No se ha observado positividad en sujetos sanos no fumadores. Cuando la proteína mutada p53 se expresa por inmunohistoquímica, podemos detectar las mutaciones del gen, por medio de amplificación con PCR, en un 27% de los casos. La positividad inmunohistoquímica de p53 sin mutaciones detectables es frecuente, mientras que las mutaciones con inmunorreactividad negativa son menos comunes. Se ha propuesto que en las primeras fases de las NIE hay un incremento de la proteína normal, y posteriormente una mezcla de la proteína natural con la mutada. Durante el proceso de invasión desaparece la proteína normal expresándose solo la mutada, disminuyendo el contenido total. Es frecuente observar inmunorreactividad en displasias leves y moderadas, pero son muy escasas las mutaciones, mientras que en la displasia severa y el carcinoma in situ disminuye el nivel de p53 natural, aumentando las mutaciones y la proteína mutada. Mediante la técnica de amplificación con PCR se han estudiado las mutaciones del gen p53 en la saliva de los pacientes con CECC, demostrándolas en un 70%. Es una vía de futuro para el diagnóstico y pronóstico de las NIE y del CECC. La proteína p16 interviene en el ciclo celular, alcanzando sus niveles más altos durante la fase de síntesis de ADN. Actúa inhibiendo las quinasas dependientes de ciclina (ciclina D1/cdk4) para seguir fosforilando, frenando el ciclo celular en la fase G1. El gen que codifica la proteína p16 se denomina CDKN2A y se encuentra en el locus 9p21. La perdida de heterocigosidad del gen por delección se detectó por PCR en el 77% de los CECC, el 62% de las displasias adyacentes y en más del 50% de los márgenes peritumorales de aspecto normal. Se puede demostrar la delección cuando está alteración está presente en el 50% de las células, siendo un marcador precoz de transformación a nivel molecular. La proteína mutada no realiza las funciones de freno propias de p16 y las proteinquinasas persisten en su actividad entrando la célula en el ciclo de forma permanente. La proteína p16 mutada inactiva la ruta Rb, actuando sobre Rb y p53. La delección es frecuente que afecte también a otras proteínas que intervienen en el ciclo celular como la proteína p15 (CDKN2B) que inhibe la proliferación del


TGF β, p18 (CDKN2C), p19 (CDKN2D) y p14 que bloquea la inhibición de MDM2 sobre la actividad p53. Todas ellas son el resultado de la traducción de genes con actividad supresora próximos en el cromosoma 9p21. El antígeno nuclear de proliferación celular o PCNA es una proteína relacionada con la ADN polimerasa delta en la replicación del ADN, demostrando su máxima expresión en la fase S del ciclo celular. Su expresión se correlaciona con la diferenciación y las atipias de las células tumorales. La tinción positiva de PCNA y p53 junto a la aneuploidía, medida por citometría de imagen, permite pronosticar la evolución hacia carcinoma invasivo en el 82% de los casos. La PCNA también se expresa en la zona superior del epitelio en las NIE de alto grado. Ki67 es una proteína del núcleo de las células proliferantes que se expresa en la fase G1-S. En los tumores invasivos su expresión indica mayor agresividad y posibilidad de metástasis, mientras que en las lesiones preinvasivas es un marcador muy fidedigno de los grados de NIE. La ciclina D1 es una proteína nuclear que juega un papel importante en el ciclo celular durante la fase G1-S. El gen responsable de su codificación (PRAD-1) se localiza en el cromosoma 11q13. Este gen está amplificado en el 30-50% de los cánceres de laringe. La mutación de PRAD-1 produce sobreexpresión de la ciclina D1 que está relacionada con la progresión de NIE a cáncer invasivo. En condiciones de estrés celular se produce la activación de p53 y p21 que inhiben la formación de proteinquinasas dependientes de la ciclina, bloqueando el ciclo en la fase G1. La ciclina D1 se expresa en el 76% de las NIE laríngeas, aunque de forma inconstante, con variaciones según el lugar de la muestra, pues hay zonas de epitelio normal sin atipias con patrón de tinción anormal. La expresión de ciclina D1 se encuentra aumentada en el margen displásico o de epitelio normal que rodea el tumor invasivo. La ciclina D1 es junto a p53 un marcador útil para identificar las NIE con riesgo de progresión. El factor alfa de crecimiento transformante (TGF alfa) junto con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) también han sido utilizados para identificar la carcinogénesis en cabeza y cuello. El EGFR es el resultado del protooncogen C-erb que está localizado en el cromosoma 7p12-13 y presenta una actividad específica tirosinquinasa, regulando el crecimiento celular. Se expresa en el carcinoma invasivo sin que esta expresión varíe en relación con el grado de diferenciación, aunque también se observó en la mucosa “sana” de sujetos fumadores y bebedores. En este sentido se demostró en pacientes con CECC que la mucosa normal adyacente al tumor presentaba expresión de EGFR el doble más fuerte que en sujetos sanos. La expresión de EGFR permanecía estable en el paso de hiperplasia a displasia, incrementándose en la displasia leve hasta alcanzar niveles máximos en el carcinoma invasivo. El TGF alfa se eleva en la displasia leve en relación con la mucosa normal, sin embargo no aumenta su valor según se incrementa el grado de la displasia. Así, en las leucoplasias verrucosas proliferantes de la cavidad oral el TGF alfa tiene valores altos igual que en el carcinoma invasivo. La amplificación de genes (EGFRmRNA - TGF-alfamRNA) ha permitido detectar su presencia en la mucosa normal de individuos con CECC. La expresión de EGFR tiene importancia en el crecimiento celular del carcinoma escamoso y se considera un marcador específico de tumor. La inhibición de la expresión ha frenado el crecimiento en los carcinomas invasivos, aunque no el de la mucosa normal, pudiendo emplearse como terapia complementaria. . En el epitelio humano se han establecido patrones normales para diferentes tipos de queratinas según su peso molecular, como marcadores de cornificación, proliferación, estratificación y específicos de células epiteliales. En el epitelio de la laringe sometido a agentes carcinogénicos se ha observado la expresión de Ck 14 en áreas diferenciadas con disminución hasta desaparecer de Ck 13, iniciando la expresión de Ck 1 en las NIE de alto grado.


Otros marcadores de interés en las NIE incluyen la COX-2 (inflamación), PIK3CA (3q26.3), eIF4E (4q21-q25) que serían proteínas y genes implicados también en la transformación-progresión de estas lesiones y de los CECC, pero su descripción exhaustiva sobrepasa los objetivos que se pretenden en este capítulo. Cromosómico y genético Las alteraciones genéticas que acontecen en el proceso de la carcinogénesis se han estudiado por medio de FISH con sondas centroméricas específicas para determinados cromosomas, sin que sean observadas en pacientes sanos no fumadores. Dentro de las alteraciones encontradas que se denominan aneuploidía cromosómica tenemos monosomías y trisomías. En el 50% de las displasias aparecen trisomías en 1, 7, 14 y monosomías en 9. No hay aneuploidía cromosómica en otras lesiones laríngeas benignas distintas a la NIE, ni en la mucosa de sujetos sanos. Las alteraciones genéticas en la mucosa de aspecto normal apoyan la teoría del campo de cancerización, pudiendo emplearse como biomarcadores para valorar el riesgo de progresión. Los estudios en los márgenes peritumorales con histología normal en CECC permitieron observar gran número de aneuploidías cromosómicas, siendo el cromosoma 15 el que presenta mayor cantidad de estas alteraciones. La FISH podría ser de utilidad en las NIE permitiendo detectar la neoplasia desde su inicio sin evidencia de alteraciones histológicas. La hibridación genómica comparativa o CGH es otra vía del estudio de los cromosomas, en la cual se compara el ADN estudio, marcado con fluorescencia verde, con un ADN control marcado con fluorescencia roja, realizando su hibridación en metafase, observando por microscopía de fluorescencia y proceso digital de imagen ambas secuencias. Cuando predomina la fluorescencia verde indica ganancia, y cuando predomina la fluorescencia roja indica perdida de material genético en las distintas regiones cromosómicas. Este procedimiento se ha empleado en los carcinomas invasivos, pero también podría tener aplicación en las lesiones preinvasivas. Molecular Detecta la sobreexpresión del gen o su pérdida de heterocigosidad. Se emplea la técnica de la PCR o modificaciones de ella como la PCR-RT (transcriptasa inversa) basada en el análisis de microsatélites, demostrando por electroforesis su sobreexpresión o perdida. Se observa pérdida de heterocigosidad en el 85% de los carcinomas invasivos, 65% de las displasias y 47% de mucosas normales de pacientes con carcinoma de orofaringe. Las alteraciones de la región 9p21 producen la proteína p16 mutada que, como ya hemos visto, se expresa en la NIE. La delección de 9p21 se observa en el 71% de los bordes displásicos en los CECC. También es frecuente la delección 3p, especialmente 3p14 y 3p21, demostrando por microsatélites la inestabilidad del cromosoma 3p en el 57% de estos carcinomas. La amplificación del protooncogen PRAD-1 en la región cromosómica 11q13 produce la expresión de ciclina D1 y se observa en el 34% de los CECC. También se han realizado estudios moleculares que demuestran la amplificación de los oncogenes H-ras y C-myc, este ultimo en relación con la displasia histológica de colon. Recientemente se ha desarrollado la MLPA “Multiplex ligation probe amplification” que permite cuantificar en un solo experimento hasta 42 genes diferentes. Esta técnica emplea mínima cantidad de ADN (50 ng) que se amplifica por PCR, por lo que es muy adecuada en el estudio de las NIE donde las muestras suelen ser pequeñas. Las sondas están predeterminadas y dependen del tipo de


tumor (carcinoma escamoso, adenocarcinoma...), siendo esto una limitación de la técnica, aunque podrían diseñarse sondas “a la carta” para estudiar otros genes. Son muy pocos los estudios realizados con MLPA en NIE, por lo que se abre una vía de investigación muy prometedora. En las lesiones preinvasivas, los bordes de resección y los segundos tumores de campo la MLPA puede ser especialmente útil, al estudiar gran número de genes en muestras tisulares muy pequeñas. En un estudio preliminar realizado en NIE de laringe y mucosa de fumadores sin patología clínica, observamos pérdidas génicas en CDKN2A o p16 (9p21), CDKN2D o p19 (19p13) y TP53 (17p13), que fueron más frecuentes en las NIE, sin observar ganancias (Figura 10).

Figura 10. MLPA con 42 sondas donde se observan ganancias (>1,2) y pérdidas (<0,8).

TRATAMIENTO Demostrado el proceso evolutivo de las NIE a neoplasia invasiva creemos que el enfoque terapéutico debe ser multidisciplinar y cumplir las mismas premisas que cualquier tratamiento oncológico: eliminar de forma completa la lesión, garantizar la función de ser posible y evitar la recidiva de la enfermedad. Preventivo Los agentes exógenos implicados en la carcinogénesis como el alcohol y tabaco son los causantes del desarrollo de las NIE en la mayoría de las ocasiones. Producida la lesión, es imprescindible dejar de fumar pues el daño genético persiste, acumulándose en el epitelio de las VAS, disparando la carcinogénesis y provocando nuevas neoplasias.


Médico Se basa en la acción protectora de la vitamina A sobre los epitelios. Se utilizan los retinoides sintéticos del tipo isotretinoína (ácido 13-cis retionoico) a dosis elevadas de 1,5 mg/Kg/día por tres meses y luego una dosis de mantenimiento de 0,5 mg/Kg/día durante nueve meses hasta completar el año. Se pueden observar efectos secundarios como sequedad de piel, queilitis, conjuntivitis, alteraciones intestinales, hepáticas y trigliceridemia que muchas veces llevan a la suspensión del tratamiento. Radioterapia Existe una gran controversia entre la cirugía y la radioterapia para los pacientes con este tipo de lesiones ya que los resultados de ambos métodos son muy parecidos. Sin embargo, la cirugía es el método de primera elección reservando la radioterapia como una opción de rescate. Las indicaciones actuales para la radioterapia son las NIE de alto grado, extensas y difusas, o los pacientes que rechacen la cirugía, asociando en estos casos la radioterapia con los retinoides sintéticos. Cirugía En primer lugar está la microcirugía clásica que se realiza por vía endoscópica, con visión a través del microscopio. Se busca extirpar la lesión en toda su extensión sin lesionar estructuras importantes para la función vocal como el ligamento tiroaritenoideo. La endoscopia rígida y de contacto mejora el rendimiento de esta técnica al facilitar resecciones completas. La técnica de la microcirugía debe ser delicada con el fin de extirpar toda la lesión y dejar márgenes de 2-3 mms de bordes sanos, pero con máximo respeto a las estructuras fonatorias. Se debe valorar el despegamiento de la lesión, sospechando en caso de dificultad e infiltración una neoplasia invasiva que replantearía el tratamiento inicial. Una vez extirpada la lesión debemos fijarla y orientarla para facilitar al patólogo el estudio de sus bordes. Otra alternativa de gran interés es la cirugía láser que también se realiza por vía endoscópica. El tipo de láser más utilizado es el de CO2, que condensa la energía lumínica de forma monocromática para cortar y vaporizar las zonas patológicas. Se debe utilizar en el modo de pulso o superpulso, con hidrodisección del pliegue vocal para preservar el ligamento. El modo de superpulso puede modularse hasta la intensidad más baja, dado que en las NIE no hay infiltración y no es necesario profundizar en la resección. Con menos potencia la resección es más laboriosa, pero se evita el daño tisular. A diferencia de la microcirugía clásica, el campo permanece exangüe y el corte es mas preciso, garantizando los bordes y la exéresis completa. En las NIE laríngeas suele ser suficiente la exéresis simple haciendo la disección en el espacio de Reinke, o a lo sumo una decorticación mucoligamentosa con extirpación de la mucosa y ligamento, respetando el músculo. El control postoperatorio debe ser exhaustivo cada 6 semanas para vigilar la cicatrización y las recidivas tempranas. En las NIE de alto grado y carcinomas microinfiltrantes la cirugía láser consigue el 90% de curaciones, siendo necesarias nuevas reintervenciones en el 24-30% de los casos en los dos primeros años. La cirugía láser se puede repetir hasta seis sesiones en caso de recidiva, reservando la radioterapia y la cirugía abierta como 2º y 3º escalón de tratamiento. La función vocal después de la resección se mantiene en niveles muy aceptables, mejorando la amplitud de vibración de la onda


mucosa, así como la mayoría de los parámetros del estudio vocal (jitter, shimmer y espectrograma). Cuando hay radioterapia o cirugía previa la función vocal se ve más alterada después de la cirugía láser.

Podemos concluir resumiendo que si estamos frente a una NIE de bajo grado, la microcirugía clásica produciría curaciones similares y menos alteraciones en la función vocal. Si la NIE es de alto grado, el láser es el método de elección, consiguiendo buen control terapéutico, y manteniendo una función vocal aceptable. Resumimos todo este proceder diagnóstico y terapéutico en el algoritmo de la figura 11.

Figura 11. Algoritmo diagnóstico-terapéutico de las NIE laríngeas. Palabras clave: Neoplasia intraepitelial laríngea, displasia epitelial, lesión preinvasiva, carcinogénesis, progresión tumoral.


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NEOPLASIAS INTRAEPITELIALES LARÍNGEAS

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