Nacional de Biotecnología Industrial

I er Seminario Nacional de Biotecnología Industrial El Salvador

Asociación Azucarera de El Salvador

1er Seminario Nacional de Biotecnología Industrial © El Salvador

Esta edición y publicación se hace gracias al apoyo del proyecto BID FOMIN administrado por la Cámara Agropecuaria y Agroindustrial de El Salvador (CAMAGRO) y la Asociación Azucarera de El Salvador. Autoría de los Contenidos: Gustavo Saura Laria. Edición Formato FIAGRO, Fundación para la Innovación Tecnológica Agropecuaria

Samuel Salazar Genovez Mayuly Ferrufino

Publicación FIAGRO San Salvador, diciembre de 2003 Fundación para la Innovación Tecnológica Agropecuaria Alameda Dr. Manuel Enrique Araujo Edificio Century Plaza, Nivel 4 San Salvador, El Salvador Tel: 267-0069 Fax: 267-0069 [email protected] www.fiagro.org.sv

Ier Seminario Nacional de Biotecnología Industrial

Índice Fundación para la Innovación Tecnológica Agropecuaria

Índice

1. Definiciones y Áreas de Aplicación de la Biotecnología Industrial…1

2. Crecimiento Microbiano y Cinética de Bioprocesos…5 3. Aspectos Básicos para la Recuperación de Productos…22

4. Bioproductos…27 5. Alcohol…43

6. Levaduras…49 7. Glosario…55


Definiciones y Áreas de Aplicación

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Fundación para la Innovación Tecnológica Agropecuaria

1. Definiciones y Áreas de Aplicación de la Biotecnología Industrial………………………………… Definiciones La Microbiología Industrial puede definirse como la parte de la Microbiología que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos. Desde otro punto de vista, puede decirse también que los procesos de la Microbiología Industrial constituyen aquellos procesos industriales catalíticos basados en el uso de microorganismos. Con el notable impulso que la Biotecnología ha tenido en los últimos años y la inclusión y difusión de otros términos como biotecnología de avanzada, biotecnología moderna, biotecnología de punta, biotecnología recombinante o tecnología del ADN recombinante, biotecnología e ingeniería genética, biotecnología y microbiología industrial, y hasta biotecnología negativa, etc., se ha complicado la comunicación entre los distintos especialistas y la interpretación adecuada de los términos empleados. Para poder clarificar esos términos, pensamos que es conveniente definir y delimitar los campos de la Biotecnología y de algunas disciplinas que la integran. La Biotecnología es una actividad multidisciplinaria que incorpora la aplicación de los principios científicos y de la Ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos para proveer bienes y servicios. Los agentes biológicos pueden ser células microbianas, animales, vegetales y enzimas. Se entiende por bienes a cualquier producto industrial relacionado con alimentos, bebidas, productos medicinales, etc., y por servicios a aquellos vinculados a la purificación de aguas y tratamiento de efluentes. Esta definición, que es la más conocida y aceptada por la mayor parte de los países, fue propuesta por la Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OECD)1. La Microbiología Industrial se ocupa de la producción de bienes y servicios con células microbianas. Por lo tanto, la Microbilogía Industrial representa una parte, seguramente la más importante, de la Biotecnología. La ingeniería genética comprende una serie de técnicas que permiten obtener un organismo recombinante, o sea, portador de un gen extraño proveniente de otras células, sean estas microbianas, vegetales o animales. Es una disciplina derivada de la Biología molecular que está incluida en la Biotecnología como herramienta fundamental para la obtención de microorganismos específicos a ser utilizados en la producción de bienes y servicios. El término tecnología del ADN recombinante puede considerarse sinónimo de ingeniería genética. Consideramos que los términos biotecnología de avanzada y biotecnología moderna no son adecuados. Cualquier tecnología o biotecnología avanza y se moderniza. Si los términos se aplican sólo a procesos con cepas de Ingeniería genética o a transplante de embriones o a la micropropagación vegetal por cultivos de tejidos o a la producción de especies vegetales mejoradas por cultivos de tejidos o a la producción de especies vegetales mejoradas por cultivos de anteras, etc., pueden confundirse mucho los conceptos. Y es que, con toda justicia, podemos incluir también en la biotecnología de avanzada, a las nuevas tecnologías de producción de alcohol, ya que son más modernas o de más avanzada con respecto a las citadas anteriormente. 1 http://www.oecd.org/. El grupo de 30 países miembros de la OECD (México es el único de Latinoamérica) comparte un compromiso por un estado democrático y por la economía de mercado. La OECD tiene un alcance mundial. Su trabajo cubre temas económicos y sociales desde la macroeconomía al intercambio, educación, desarrollo y ciencia e innovación.



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Tabla 1. Áreas de aplicación y ejemplos de productos obtenidos por microorganismos. Si se desea hacer una diferencia, tal vez sería conveniente referirse a la Biotecnología tradicional o convencional para denominar a los procesos conocidos con anterioridad al advenimiento de la Ingeniería genética. El término no convencional serviría para denominar a los procesos desarrollados posteriormente.

ÁREA MICROORGANISMOS PRODUCTOS SALUD Bordetella pertusis Clostridium tetani Vacuna triple Corynebacterium diphteriae Propionebacterium sp Vitamina B12 Penicillium chrysogenum Penicilina, Estreptomicina, Streptomyces sp. Varias Tetraciclina y otros antibióticos Bacillus sp. Rhizopus nigricans Compuestos esteroides Curvularia lunata Aspergillus ochraceus E. coli recombinante Interferon, Insulina Saccharomyces cervisiae Vacuna contra virus hepatitis E Recombinante ALIMENTOS Saccharomyces cernisiae Levadura de panificación Streptococcus lactis Yoghurt Lactobacillus bulgaricus Saccharomyces sp. Varios Vino, cerveza, Sidra Corynebaterium y Ácido glutámico y Brevibacterium sp.varias y otros aminoácidos auxotróficas diversas Acetobacter aceti Vinagre Bacillus sp. Varios Saborizantes Blakeslea trispora Streptomyces chrestomyceticus Carotenoides Dunaliella sp. Lactobacillus bulgaricus Streptococus sp. Varias Quesos Penicillum sp. Varias PRODUCCIÓN VEGETAL Rhizobium sp. (varios) Inoculantes de leguminosas Giberella fujikuroi Ácidos giberélico (estimulante de crecimiento vegetal) Bacillus thuringiensis Bioinsecticidas bacterianos Verticillium lecanii y fúngicos Metharhizium anisopliae PRODUCCIÓN ANIMAL Candida utilis, y otros Proteína unicelular Clostridium (varios) Paseurella multocida Vacunas Salmonella typhimurium Brucella abortus INSUMOS INDUSTRIALES Saccharomyces cervisiae Etanol Zymomonas sp Clostridium acetobutilicum Butanol, acetona Bacillus sp. (varios) Enzimas industriales Aspergillus (varios) (amilasas, proteasas, celulasas, Trichoderma reseii Glucosa, isomerasa, pectinasas) Aspergillus niger Ácido Cítrico Aspergillus niger Ácido Glucónico Xanthomonas campestris Goma Xantano MINERÍA Thiobacillus thioxidans y Cobre, Uranio y otros otras sp SERVICIOS Especies aerobias y Efluentes purificados anaerobias varias



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Áreas de aplicación Las áreas de aplicación de la Microbiología Industrial son muy variadas. A esto se debe su gran importancia y el gran impacto que tiene esta disciplina en la actualidad. Tal como se refleja en la tabla anterior, las principales áreas de aplicación de la Microbiología Industrial son: salud, alimentos, producción vegetal y animal, insumos industriales, minería y servicios. En primer lugar, se debe destacar la importancia de la Microbiología Industrial en el mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicación en la producción de compuestos de actividad farmacológica y vacunas. En la industria de alimentos, la aplicación de la Microbiología Industrial también es significativa. La aflicción de esta disciplina es esencial en la producción de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lácteos, etc. La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de producción vegetal y animal por un conjunto variado de procesos microbiológicos que se han enriquecido notablemente en los últimos años (como ha sucedido con otras áreas) con la utilización de técnicas de ingeniería genética. La aplicación en el área de la minería está relacionada con la biolixiviación, o sea, con el uso de microorganismos en la extracción de metales de minerales de baja ley. Finalmente, el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación de microorganismos en la purificación de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida. Varios ejemplos de productos y microorganismos empleados en las distintas áreas de aplicación de la Microbiología Industrial se pueden observar en la Tabla 1. Símbolos y unidades Es conveniente emplear símbolos y unidades correspondientes al sistema internacional. Pero es aún más importante que estos correspondan con aquellos que son utilizados por la mayoría de los investigadores y profesionales relacionados con la Microbiología Industrial. La Sección de Biotecnología de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC)2 estudió el problema y encomendó a una serie de expertos de varios países la confección de una lista de símbolos y unidades utilizadas. La lista fue sometida a la crítica de numerosos especialistas y fue finalmente publicada en inglés como guía general sobre símbolos y unidades en Biotecnología. Una traducción adaptada a la nomenclatura en español fue también preparada y publicada posteriormente. En la tabla 2 se dan algunos símbolos y unidades, expresados en el Sistema Internacional (SI). Descripción y/o definición Símbolo Unidad S.I * Unidades comunes Dimensiones de volumen Volumen V m3 l Energía de activación E J mol -1 cal mol-1 Presión La presión parcial lleva subíndices apropiados como PO2' presión P bar atm parcial de O2 Rendimiento Relación general de masa que expresa salida con respecto a la entrada. Debe ser dfinido con sub- Y - - índices como Yx/s' Yp/s' Yp/x Temperatura Absoluta T K K General t °C °C

2 http://www.iupac.org/



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Tiempo Identificar los períodos mediante subíndices td para tiempo de dupli- t s min,h cación tl para tiempo de latencia Concentración Biomasa, concentración X Kg m -3 gl-1 Número total N - - Sustrato S Kg m -3 mgl-1, gl-1 Producto P Kg m -3 mgl-1, gl-1 Símbolos para conceptos de Velocidad Crecimiento, velocidad rx Kg m-3 sec-1 gl-1 h-1 Crecimiento, velocidad específica µ s-1 h-1, d-1 Dilución, velocidad D s-1 h-1, d-1 Flujo volumétrico o caudal F m3 s-1 l h-1 Mantenimiento, coeficiente de tér- mino no asociado al crecimiento relacionado con consumo de m s-1 h-1 sustrato Productividad Utilizar subíndices apropiados para r Kg m-3 s-1 gl-1 h-1 biomasa rx y rp para producto

*S.I.: Sistema Internacional de unidades

Tabla 2. Algunos símbolos y unidades empleados en Microbiología Industrial.


Crecimiento Microbiano y Cinética de Bioprocesos

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2. Crecimiento Microbiano y Cinética de Bioprocesos…………………

Crecimiento microbiano Los microorganismos (mo) son los seres vivos más universales que se conocen. Pueden vivir y desarrollarse en los ambientes más disímiles, desde las aguas termales de los géiseres a temperaturas cercanas a los 100° C, hasta en las regiones de hielos perpetuos. Con relación a los nutrientes, pueden utilizar diferentes sustratos de las más variadas características y composiciones. Para comprender los procesos biológicos, se debe conocer cinética de los mo. Por ejemplo, es necesario saber cual es el efecto de los diferentes factores sobre las tasas de producción de las células y sus metabolitos. La información sobre la influencia de factores externos es raramente relacionada con las reacciones básicas que participan en los procesos biológicos. Sin embargo, los avances en el conocimiento de los sistemas enzimáticos y sus funciones, la regulación del crecimiento y la formación de productos, ha facilitado la generalización y el control de los bioprocesos a escala industrial y el incremento de los rendimientos.

Medidas del crecimiento Es muy difícil medir la tasa de crecimiento y multiplicación a partir de una sola célula individual. Aunque se han diseñado procedimientos para sincronizar el crecimiento de una población completa y así simular el crecimiento de una célula individual, esto ha tenido poca aplicación en los laboratorios de investigaciones y mucho menos a nivel comercial. Por tanto, el crecimiento y la multiplicación son usualmente medidos a partir de poblaciones en diferentes etapas y, a partir de ahí, se infieren los valores correspondientes a una célula individual. El crecimiento se refiere a dos aspectos: al incremento en la cantidad (peso) de la biomasa en el cultivo y al aumento del conteo de células debido a la multiplicación. Desde que el tamaño de la célula crece significativamente, la tasa de crecimiento y de multiplicación no volverá a ser la misma, salvo en muy contadas ocasiones. Reconociendo este hecho, Monod1, en 1949, comenzó a usar los términos: concentración másica celular y concentración celular. La concentración se emplea con menos frecuencia como criterio de crecimiento y multiplicación y su determinación es mucho más laboriosa que los métodos densitométricos o gravimétricos. Sin embargo, en dependencia de los propósitos del estudio, puede medirse el conteo total de células, las células viables, etc. Las células pueden ser contadas directamente bajo el microscopio en una cámara de conteo celular. La correcta medición presupone la distribución homogénea de las células en los campos y un número suficiente de células en las ventanas individuales de la cámara. Procesos de tinción especiales hacen posible la diferenciación de las células vivas de las muertas. Sin embargo, ninguno de los métodos disponibles hoy en día es totalmente confiable. La determinación exacta de las células vivas requiere del plaqueo directo en agar solidificado, incubación y, posteriormente, de la lectura, y conteo de las colonias formadas. Aun así, la exactitud no es completa, ya que dos células próximas pueden formar una sola colonia. Adicionalmente, la dilución de la suspensión debe ajustarse de forma que el número de colonias formadas no sea muy pequeño (reduciría la exactitud de la determinación), ni muy grande (aumentaría la

1 Jacques Lucien Monod. Premio Nobel de Medicina en 1965. Bioquímico francés que ayudó en mucho a dilucidar la forma en que los genes regulaban el metabolismo de la célula, controlando la biosíntesis de las enzimas.



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probabilidad de solapamiento de colonias adyacentes). El número óptimo se encuentra entre 30 y 150 colonias por placa. La concentración másica por su parte, puede ser medida directa o indirectamente. En el método directo, las células son previamente separadas del medio, lavadas y se mide el volumen de sedimento o su peso seco. La separación puede hacerse por medio de centrifugación o filtración, aunque es preferible el primer método. En el caso de la centrifugación, esta debe ser efectuada siempre bajo idénticas condiciones en tubos estándar previamente calibrados y las células de un volumen fijo deben secarse hasta peso constante. Como las células van acompañadas de líquido madre, que aún contiene nutrientes sin usar, el proceso de lavado debe ser realizado con mucho cuidado. Como alteARNtiva, puede medirse otro componente celular como la proteína, el nitrógeno o el fósforo. La medición se complica por la variabilidad del contenido de agua en la célula y las variaciones en la composición y proporción del medio remanente después del lavado. Por tanto, la comparación entre diferentes métodos es difícil. La desventaja fundamental de estos métodos es que los resultados sólo se obtienen después de varias horas, lo que limita la toma de acciones inmediatas. Por otra parte, no es posible distinguir entre células vivas y muertas. El método más popular en la medición del crecimiento es la turbidimetría. Es un método simple, suficientemente preciso para la mayoría de los microorganismos, siempre que la medición se lleve a cabo en la fase exponencial de crecimiento. Su aplicación se ve limitada por dos factores: la coloración del medio y la presencia de partículas sólidas. Su utilización se dificulta en el caso de medios naturales como los de las melazas. Otro método indirecto es la medición de los gases de salida, específicamente, el CO2. Este sistema posee dos ventajas de gran importancia: elimina el muestreo reduciendo así, las posibilidades de contaminación del cultivo y los resultados se obtienen de inmediato, con un retraso de a penas unos pocos minutos. La medición de la concentración másica puede dificultarse si en el medio de crecimiento se encuentran partículas sólidas. Estos medios son frecuentes en las producciones industriales y, en esos casos, la confiabilidad de los métodos citados anteriormente es menor. Recientemente, se han desarrollado métodos que utilizan la medición del ATP intracelular por medio de la enzima luciferasa presente en las colas de las luciéARNgas y que produce energía luminosa a partir del ATP, la que es proporcional a la concentración del mismo.

Cultivo Discontinuo (Batch) El método básico de cultivo es el batch. Un medio estéril de una composición inicial dada se inocula con una cierta cantidad de células de la especie de interés y el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones de operación constantes (temperatura, pH, aireación etc.) hasta que cesa la multiplicación y el crecimiento por agotamiento de los nutrientes o por acumulación de metabolitos tóxicos. Los estudios sobre el desarrollo de poblaciones microbianas en cultivos batch revela cambios marcados en las tasas de crecimiento y multiplicación.

Definición del crecimiento. Curvas de crecimiento El crecimiento de una población se define como:

dX/dt= µX o dN/dt= µN (1) donde X es la concentración másica del microorganismo, N e el número de células y µ la tasa de crecimiento. La igualdad puede expresarse como:



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dX/X=µdt (2) dN/N= µdt (3)

Integrando los dos términos, se obtienen las expresiones logarítmicas del crecimiento y multiplicación, respectivamente:

lnX/X0=µ (t-t0) lnN/N0= µ (t-t0)

Cuando el número de células, su concentración másica o sus ln se grafican contra el tiempo, se obtienen curvas características. Cuando es el número de células lo que está siendo examinado, la curva se conoce como curva de multiplicación, mientras que la graficación de la concentración másica contra el tiempo, da lugar a la curva de crecimiento. La Figura 1 (ver página siguiente) muestra la curva de multiplicación típica de una población microbiana y pueden distinguirse diferentes fases. Cuando los mo son transferidos a un nuevo medio, su concentración se mantiene por un cierto tiempo. Este período puede ser muy corto o puede durar varias horas, dependiendo de si el medio nuevo es más o menos rico en nutrientes que el anterior o si hay diferencias de calidad entre los componentes de ambos medios. En ocasiones, se observa una caída temporal de la concentración. La terminología usada por diferentes autores no siempre coincide. El término lag se usa a veces para la fase 2 y otras veces para la suma de las fases 1 y 2. Las dos fases en su conjunto representan el período de preparación de la población inoculada, para la multiplicación. La longitud de esta etapa se ve afectada por los factores nutricionales ya mencionados, y además por la edad y tipo de las células, características de su aparato genético y factores físico-químicos externos como la temperatura, pH y potencial redox. La longitud de estas dos fases, lag y aceleración, puede definirse como el intervalo de tiempo entre la inoculación y el inicio de la fase de crecimiento exponencial. La fase lag posee gran importancia económica pues en dependencia de la composición del medio y del genotipo del microorganismo podrá ser más o menos larga. Si se está produciendo un antibiótico con tiempos de fermentación entre 100 y 200 horas, unas pocas horas más o menos no significan nada. Si por el contrario, se trata de una producción como la de levadura panadera, de entre 18 y 48 horas de duración, su efecto sobre la economía global es significativo. Figura 1. Curva De Multiplicación N Número de Células Fases: 1) Lag 4) Declinación 2) Aceleración 5) Estado Estacionario 3) Exponencial (Crecimiento Balanceado) 6) Muerte. ln N 4 5 6

3 1 2 Fase lag Tiempo



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La tasa de crecimiento µ puede expresarse en función del sustrato limitante, el único elemento cuya presencia en el medio es limitada y, por tanto, limita el crecimiento de las células, según la ecuación de Monod.

µ = µmax S/Ks + S (4) donde µ es la tasa de crecimiento, µmax es la tasa mayor a la que puede crecer el mo bajo unas condiciones nutricionales y ambientales dadas, Ks es una constante que se expresa en g/l y es inversamente proporcional a la afinidad del mo al sustrato. Nótese la similitud de la expresión con la ecuación cinética de Michaelis-Menten2. Como efectos de esta expresión, se asume que el metabolismo celular está limitado por una reacción enzimática que es la que ocurre a menor velocidad. Como segunda asunción vinculada a la expresión, se considera la célula como catalizador de su propio crecimiento por lo que es a la vez catalizador y producto.

La relación de Monod no reconoce la fase lag, pues si S es mucho mayor que Ks, µ ~ µmax lo que no es cierto según lo antes visto, dado que las células no se multiplican durante esta fase. Por tanto, es preciso modificar la expresión adicionando un término que permita modelar esta fase.

µ = (µmax S/ Ks + S) ( 1- exp -t/T) (5) donde t es el tiempo total de cultivo y T el tiempo de duración de la fase lag. Si se grafica µ vs t a diferentes T, es fácil demostrar que si la fase lag se extiende mucho, es posible que se llegue al agotamiento del sustrato antes de que el cultivo alcance su µmax. Para determinar el tiempo lag, se extrapola la región exponencial de la curva hasta el eje t.

Fase de aceleración En esta fase todas las reacciones enzimáticas importantes alcanzan su velocidad máxima de reacción y luego un estado estacionario. No todas las células lo alcanzan a la misma vez. Pero sólo cuando la población completa ha llegado a este estado, comienza la fase exponencial. El alargamiento de las fases lag y de aceleración trae aparejadas pérdidas económicas en los procesos batch. Fase exponencial En esta fase, ya todos los sistemas metabólicos están preparados para alcanzar la velocidad máxima de crecimiento. De hecho, desde la fase anterior, unas pocas células ya crecían a la máxima velocidad. La totalidad de la población comienza a crecer al máximo posible dentro de las condiciones impuestas en esta etapa. Durante la misma, la composición química no cambia y la replicación de todos los componentes celulares ocurre consecuentemente a la misma velocidad. La tasa máxima de crecimiento (µmax) es el resultado de numerosos factores interdependientes y de reacciones bioquímicas y biofísicas. Se mantendrá esta fase hasta tanto los mo tengan nutrientes suficientes y las funciones vitales de la célula no sean inhibidas por la acumulación de metabolitos tóxicos. En esta etapa, la ecuación de Monod se reduce a: 2 Michaelis y Menten propusieron un modelo para explicar la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas. En este modelo, la enzima se combina reversiblemente con su substrato para formar el complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que regenera a la enzima.



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µ = µmax pues S >> Ks Fase de declinación El consumo gradual de los nutrientes y la acumulación de productos de desecho durante la fase exponencial conduce a una pérdida de habilidad del mo para mantener la tasa máxima de crecimiento. Esta fase puede tomar una multitud de formas. En ocasiones, la fase exponencial es muy corta y es seguida por una fase prolongada de declinación. La longitud estimada de la fase depende del método de medición empleado. Si se mide la concentración celular a partir del conteo de células vivas por unidad de volumen, la longitud es comparable con las de las fases de crecimiento anteriores. Si por el contrario, lo que se mide es la concentración másica, la fase puede alargarse considerablemente. Aquí la tasa de crecimiento puede expresarse como:

µ = µmax/ S S ~Ks Fase estacionaria Esta fase refleja la etapa de crecimiento en que la población alcanza su máximo tamaño y, por un cierto tiempo, el mayor volumen celular. Como en la fase de declinación, la longitud depende del método de medición empleado. En esta fase, las células acumulan reservas de nutrientes (lípidos, carbohidratos, etc.). Si el sustrato limitante es otro que la fuente de carbono y energía, también se preparan para comenzar otra etapa en el ciclo reproductivo: la esporulación. Aquí, dX/dt = 0 y, por tanto, no hay multiplicación (µ = 0). En esta fase, las células comienzan a morir por falta de nutrientes y puede expresarse que:

dX/dt = (µ - α) X donde α es la tasa de muerte por falta de nutrientes. Fase de muerte La muerte de los mo como consecuencia de factores externos ha sido estudiada cuidadosamente. Sin embargo, se ha prestado poca atención a la muerte natural de las células durante las diferentes fases del crecimiento. Tal análisis requiere un estudio separado de las tasas de crecimiento y muerte. Si se comparan los números de células vivas, muertas y totales, los resultados difieren significativamente. No existe regla general para esta fase. La muerte puede ser rápida o lenta, puede estar o no relacionada con la autólisis. No existe una teoría general de la cinética de muerte debido al insuficiente conocimiento de la fisiología celular y a las causas del proceso.

Cambios durante el crecimiento Los cambios en la concentración celular durante un cultivo batch van acompañadas de cambios fisiológicos y bioquímicos. Los estudios de la composición celular en varias fases del crecimiento batch revelan varios cambios fundamentales. Estos cambios fueron resumidos por Monod, en 1961. Cuando el medio freso o nuevo se inocula, la masa celular comienza a aumentar exponencialmente y paralelamente lo hace el contenido específico de ARN. Ambas cantidades crecen hasta un cierto límite. El intervalo de tiempo entre la inoculación y el punto a representa la fase log. Durante la fase exponencial, tanto el contenido específico de ARN, como la masa celular individual permanecen constantes. Cuando algún nutriente se agota en el medio, la masa celular comienza a decrecer (tiempo b) y lo mismo ocurre con el contenido específico de ARN. La división exponencial entonces procederá hasta el tiempo c, mientras que la tasa de síntesis de ARN comenzará a declinar antes. Al tiempo c, la tasa de división celular comienza a decrecer hasta que se alcanza la fase estacionaria (su comienzo está marcado por d). Si el contenido de



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ADN por unidad de masa celular, se calcula durante varias fases, la curva obtenida es opuesta a la del ARN. Aunque los cambios en el ADN son menos marcados. En el curso de un cultivo discontinuo, el valor de µ cambia constantemente entre 0 y µmax. El cultivo es inestable durante todo el proceso lo que se conoce como estado transiente. Tabla 1. Tasa máxima de crecimiento de diferentes microorganismos

Microorganismo Temperatura °C µmax h-1

Bacterias 37 0.6-1.0 Levaduras 30 0.3-0.5 Hongos 28 0.1-0.3

Factores que afectan el crecimiento de los mo

Los factores que afectan el crecimiento celular pueden dividirse en dos tipos: nutricionales y físico-químicos. Factores nutricionales Los mo precisan para crecer de diferentes tipos de nutrientes. Aunque estos son incorporados en el metabolismo en cantidades muy variables, todos juegan un papel importante en las reacciones metabólicas. Analizaremos los de mayor importancia y que son requeridos en cantidades significativas, aunque debe tenerse en cuenta que en ocasiones la ausencia de un componente del medio necesario en concentraciones de trazas, puede crear problemas serios en el crecimiento y hasta impedirlo. Así, el conocimiento de los requerimientos nutricionales de un mo para una producción dada resulta imprescindible. Carbono El componente mayoritario de la materia viva es el carbono. Este compone alrededor del 60% de esta, aportando el esqueleto estructural de proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos. Salvo raras excepciones, la fuente de Carbono (C) es a la vez la de energía. Los mo pueden utilizar diferentes compuestos orgánicos como fuente de C. La variedad de los mismos es tal que se han conducido procesos de crecimiento de mo sobre: metanol, etanol, ácido acético, glicerol, n-alcanos, azúcares de todo tipo y hasta compuestos como el fenol. El sustrato universal es la glucosa y en general es preferido por todas las células frente a cualquier otro. De hecho existe el mecanismo de represión catabólica a través del cual, la asimilación de una fuente carbonada diferente a la glucosa, es silenciada a nivel de genoma. Sólo algunas especies de pseudomonas prefieren el fenol como sustrato y reprimen la utilización de la glucosa. La selección de la fuente de C es de vital importancia puesto que va a incidir en otros factores ambientales como es la transferencia de O2. Por otra parte, al ser el componente mayoritario en el medio, su impacto económico es fundamental. En general, este es el sustrato limitante de cualquier proceso fermentativo. Nitrógeno Es el componente que sigue en importancia al C dentro de la composición celular. Forma parte de las proteínas, nucleótidos como ATP, coenzimas y otros componentes celulares. La proporción de Nitrógeno (N) en la célula fluctúa entre 8 y 12%. En general, se prefieren fuentes de N inorgánicas baratas como el sulfato de amonio o la urea, pero no siempre es posible utilizarlas. En las producciones especializadas como aminoácidos, antibióticos, enzimas y, en general para todos los metabolitos secundarios (no asociados al crecimiento), se precisan otras fuentes de N más complejas. Frecuentemente, se emplean los licores de remojo de maíz (producción de amino ácidos), extracto de levadura, hidrolizados de diferentes fuentes de proteínas, etc.



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Fósforo Este componente resulta fundamental en la composición y estructura de los ácidos nucleicos, moléculas de almacenamiento energético (ATP), coenzimas, fosfolípidos, etc. El fósforo (P) está contenido en la célula en cantidades desde el 1 hasta el 3%. Magnesio El ión Mg2+ juega un papel preponderante en la síntesis de proteínas y en la formación de los ribosomas. Es fundamental en la acción de enzimas de importancia metabólica como la hexoquinasa y fosfofructoquinasa que son los puntos de regulación de la ruta glucolítica. También interviene en la acción de ADN y el ARN, polimerasas responsables de la replicación y transcripción del ADN. Como ejemplo práctico, se conoce que en la producción de etanol (ruta glucolítica en las levaduras) a partir de mieles de remolacha, es precisa con frecuencia su suplementación a los medios de fermentación para obtener buenos rendimientos. Su proporción en la célula es de 0.5%. Otros componentes En el metabolismo celular, se requieren otros elementos como Calcio (Ca), Sodio (Na), Potasio (K), Cromo (Cr), Cobre (Cu), Manganeso (Mn), etc, que muchas veces entran en cantidades de trazas (el Ca es la excepción). El Azufre (S) también es importante, ya que forma parte de amino ácidos esenciales como la metionina y cisteína. Otro compuesto azufrado la S-adenosil-metionina, es importante en los procesos de protección del ADN frente a las enzimas de restricción propias. La S-adenosil-metionina es un donante de grupos metilo para la modificación del ADN. Las vitaminas no siempre son sintetizadas por la célula microbiana y por tanto, debe tenerse en cuenta, cuando se realicen experimentos con medios mínimos sintéticos. En el crecimiento de levaduras, la biotina es imprescindible por su participación en la biosíntesis de ácidos grasos y, por tanto, de la membrana citoplasmática. Si se emplean mieles finales de caña como fuente de C no es necesaria su suplementación. Las mieles de remolacha sí son deficitarias en esta vitamina.

Factores físico-químicos Temperatura Los mo pueden clasificarse en sicrófilos (Topt ≤ 20°C), mesófilos (Topt 28~35°C) y termófilos (Topt ≥ 50°C). Esta temperatura corresponde a las reacciones metabólicas más termolábiles en la célula. Si en un cultivo microbiano, se comienza a aumentar paulatinamente la T en el rango de T subóptimas, se observará que las células crecen más rápidamente (>µ). Esto se debe a que la µ = f(T). La relación de µ con T es la conocida expresión de Arrhenius3 según la cual:

µ = A0 e-Ea/RT

La relación se cumple de forma tal que cuando incrementamos T en 10°C, se experimenta un incremento de µ de aproximadamente el doble de su valor. Supongamos ahora que el aumento de T lo comenzamos a partir de la Topt de crecimiento del mo. En este caso, a diferencia de los catalizadores inorgánicos, las enzimas y otras proteínas estructurales comenzarán a experimentar desnaturalización térmica, lo que conducirá a una pérdida en la eficiencia metabólica de la célula, hasta que esta muere, ya sea por un proceso de coagulación proteica (calor húmedo) u oxidación interna (calor seco, si el O2 está en exceso). Este proceso puede ser interpretado por Arrhenius de igual forma que el crecimiento. Si definimos α como la tasa de muerte térmica, podemos expresar:

α = A0’ e-Ea/RT

3 Svante August Arrhenius. Premio Nobel de Química en 1903. Químico sueco que explicó la conductividad eléctrica de las soluciones iónicas.



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El crecimiento en función de T puede ser expresado como:

dX/dt = (µ- α) X Para T ≤ Topt µ crece mucho más rápidamente de lo que lo hace α y el resultado neto es un incremento en la tasa global de crecimiento. Para T> Topt el valor de α comienza a ser más importante y µ - α < 0 por lo que dX/dt < 0 y el cultivo comienza a experimentar la muerte térmica. Se han calculado que las Ea vinculadas a ambos procesos, estimándose que los valores de Ea de crecimiento se encuentran en el rango de 10-30 kcal/mol, mientras que para α estos valores son del orden de 50-100 kcal/mol. No está claro a que mol se refieren puesto que no existe una definición del mol de células pero no obstante, estos valores son indicativos de las tendencias de ambos procesos y su dependencia con T. La representación gráfica de ln µ y ln α vs 1/T rinde rectas con pendientes iguales a-Ea. Figura 2. Relación de las tasas de crecimiento y muerte en función de T, según Arrhenius ln µ ln α µ α aumenta T 1/T pH Los diferentes tipos de mo poseen rangos de pHopt diferenciados. Los hongos filamentosos crecen mejor entre pH de 4 a 6. Las bacterias prefieren el rango de 6-8 y las levaduras crecen entre 3-6. En general, los rangos de pHopt son muy estrechos e, inicialmente, se suponía que los cambios externos de pH inducían cambios proporcionales en el pH citoplasmático. Sin embargo, experimentos conducidos con estos propósitos demostraron que una variación del pH del medio entre 3.5 y 9 inducía variaciones del pH citoplasmático de solo 0.03 unidades de pH. Posteriormente se demostró que el pH afectaba los grados de ionización de los restos de amino ácidos de las proteínas de la membrana y particularmente los amino ácidos básicos y ácidos afectando la permeabilidad de la membrana y por tanto los fenómenos de transporte a través de ella. Oxígeno disuelto El O2 puede considerarse tanto un factor físico-químico como un sustrato. En los procesos aeróbicos, el O2 debe ser transferido al medio antes de que la célula pueda hacer uso de él (la excepción son los procesos de cultivo en estado sólido donde la mayor parte del O2 se toma directamente del aire por las limitaciones de medio líquido). El O2 puede entrar en el metabolismo realizando dos funciones: directamente a través de la acción de las monooxigenasas y dioxigenasas que incorporan uno o dos átomos de O en una serie de reacciones de hidroxilación de ácidos grasos, esteroides, amino ácidos, etc. y como aceptor final de electrones en la cadena de transporte electrónico para formar agua y energía de enlace fosfato. Sin embargo, mientras la mayoría de los sustratos, como la glucosa, por ejemplo,



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poseen una solubilidad elevada del orden de miles de mg/l de agua, el O2 tiene una pobre solubilidad < 10 mg/l y de ahí que requiera consumo de energía para su transferencia al medio líquido. Cinética de Bioprocesos

Análisis y modelación del cultivo discontinuo El crecimiento es uno de los fenómenos fundamentales de los organismos vivos. Para la modelación del crecimiento en microorganismos, multiplicándose en un cultivo discontínuo, consideraremos solamente una población homogénea.

Crecimiento exponencial Comenzaremos con el caso en que las condiciones ambientales y el estado fisiológico de las células son constantes. Así, las condiciones físicas, como la temperatura, y las químicas, como la concentración de sustrato en el medio, han de permanecer constantes. Bajo estos constreñimientos, la ley de crecimiento se reduce a:

dX/dt = f (X) El modelo más simple es la ley Malthusiana: dX/dt = µX, donde µ es constante. Esta ecuación tiene la solución:

X(t) = X(0) e µt (1)

µ es llamada tasa específica de crecimiento. El término “específica” significa que la tasa de crecimiento dX/dt es dividida por la concentración de biomasa. Así, la tasa específica de crecimiento se define como:

1/X(dX/t) = µ (2)

Veamos ahora la interpretación biológica de µ. En un ambiente definido, las células microbianas crecerán y, en su debido tiempo, se dividirán. Las resultantes células hijas lo harán después similarmente. En cada división, cada célula se duplicará. La serie 2, 4, 8, 16....2n describe el incremento de células por lo que podemos escribir:

N =N0 2n (3)

Este será el número de células después de n generaciones. El período de tiempo entre dos generaciones se conoce como tiempo de generación que es igual al tiempo de duplicación (Td), si de la división de una célula, se forman dos. Para números de generación grandes, el Td es igual al tiempo t dividido por el número de generaciones:

N(t) = N(0) 2t/Td

Aplicando logaritmos neperianos:

lnN(t)/N(0) = 0.693t/Td (4)

El crecimiento puede expresarse como:

lnNt/N0 = µt Igualando ambas expresiones,



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0.693t/Td = µt, de donde µ= 0.693/Td (5)

De esta expresión se deduce el significado de µ como el recíproco proporcional del tiempo de generación, es decir el tiempo necesario para que la biomasa se duplique (si X es proporcional a N, lo que ocurre siempre). Tanto el Td como µ pueden variar en un amplio rango de valores incluso para un mismo mo, en dependencia de las condiciones experimentales. Los ejemplos de la Tabla 2 representan bacterias creciendo con Td del orden de 20 minutos hasta las que requieren varias horas para hacerlo. Tabla 2. Tiempos de generación (Td) y tasas de crecimiento (µ) de algunas bacterias

Organismo Medio Td (h) µ (h-1) Streptomyces hygroscopicus

mínimo sintético medio complejo

4.5 5.5

0.15 0.13

Corynebacterium glutamicum mínimo sintético 1.6 0.43 Escherichia coli mínimo sintético

medio complejo 0.83 (50 min) 0.33 (20 min)

0.83 2.0

El valor de µ es la medida más simple para definir el estado fisiológico de los mo creciendo, de ahí la importancia de su determinación. ¿Cómo determinar µ? Primeramente, la definición de µ por el cociente (1/X)(dX/dt) implica que tenemos una curva continua y diferenciable de crecimiento X(t). Sin embargo, generalmente los datos de concentración de biomasa se obtienen de forma discreta a diferentes t. Segundo, si la cinética de crecimiento X(t) se mide continuamente o se obtiene por interpolación de la data discreta, esta debe ser una curva suave para poder interpretar µ(t). Si se cumple esto último, la µ puede ser determinada por la pendiente de la curva de crecimiento (representada como lnX vs t) en la fase exponencial. La ocurrencia de la fase exponencial muestra que existe un amplio rango de concentraciones de sustrato para los que µ es virtualmente constante. Esto es siempre que el sustrato no sea limitado. Para los propósitos que nos interesan, consideremos que todos los sustratos, excepto, uno están en exceso. Este simple sustrato se conoce como sustrato limitante. Así, podemos expresar que:

dX/dt = µ(S) X dS/dt = -q(S) X

Para hallar la representación matemática de las dos funciones µ(S) y q(S) tenemos que seguir las ideas fundamentales de Monod. Recordemos que el crecimiento puede describirse en el más simple de los casos como una reacción bioquímica catalizada:

S Yx/s X donde Yx/s es un factor estequiométrico y X representa tanto el producto de reacción como la enzima. En esta simplificación, hemos ignorado la enorme diversidad de reacciones metabólicas y las hemos sustituido por un solo y sencillo paso, de acuerdo con el principio de que la velocidad de reacción está gobernada por la etapa más lenta. Así, la biomasa se asume como una sustancia homogénea que cataliza su propia formación. Para una reacción catalizada por una enzima aplicamos la ecuación de Michaelis-Menten. De acuerdo con esta teoría, después de sustituir la concentración total de la enzima por la concentración de biomasa y la concentración del producto por la concentración de biomasa multiplicada por el factor estequiométrico Yx/s, llegamos al modelo de Monod publicado en 1942:



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dX/dt = (µmax S/Ks + S) X (6) dS/dt = - (1/Yx/s) (µmax S/Ks + S) X

Así, sobre las bases de analogía, obtenemos la función hiperbólica de saturación para expresar la dependencia de la µ de la concentración de sustrato limitante S. El segundo resultado es que la tasa de consumo de sustrato q tiene que ser proporcional al valor de µ. El factor de proporcionalidad es 1/Yx/s donde Yx/s es llamado coeficiente de rendimiento y expresa los requerimientos cuantitativos de nutrientes de un organismo. Este ofrece información acerca de cuantos g de biomasa se forman a partir de un g de sustrato. Por ejemplo, por 1 g de glucosa el microorganismo E. coli forma 0.45 g de biomasa bajo condiciones de crecimiento aeróbico. Así, Yx/s = 0.45. En la Tabla 3, se muestran otros ejemplos.

Tabla 3. Rendimiento de diferentes microorganismos en dependencia del sustrato limitante Organismo Sustrato limitante Coeficiente de

rendimiento (Yx/s) Saccharomyces cerevisiae glucosa 0.50 Escherichia coli glucosa 0.45 Streptomyces hygroscopicus glucosa 0.47 Kluyveromyces fragilis glucosa (miel de caña) 0.50-0.55 Bacillus subtilis Mg2+ 450 Escherichia coli NH4

+ 6

Cultivo continuo

En la caracterización del cultivo batch, introdujimos una serie de parámetros y explicamos el modelo de Monod. Algunos de ellos como la µmax, el coeficiente de rendimiento Yx/s, el tiempo lag Td pudieron ser determinados en esta modalidad de cultivo. Sin embargo, otros parámetros como la constante de saturación Ks y el coeficiente de mantenimiento m, no pueden determinarse con exactitud debido a que en el cultivo batch se suceden una serie de estados fisiológicos en el organismo en un corto intervalo de tiempo antes de que el sustrato limitante se agote. Desde el punto de vista de la microbiología técnica y de la investigación bioquímica, es preferible cierto estado fisiológico que se pueda mantener por un tiempo lo suficientemente largo que permita mediciones precisas. La modalidad del cultivo continuo hace posible mantener un estado fisiológico de este tipo. Supongamos que en un cultivo batch clásico se alcanza el estado en que el sustrato limitante está casi agotado y, en ese momento, comenzamos a adicionar medio fresco a un flujo F y extraemos medio fermentado con células al mismo flujo. Si la mezcla de reacción es homogénea en todo el volumen, estableceremos el estado estacionario durante el cual las condiciones físico-químicas y nutricionales pueden mantenerse por tiempo indefinido. En el modelo de Monod, el término estado fisiológico está representado por el valor de la tasa específica de crecimiento µ. La expresión de Monod describe la relación entre la célula y su ambiente de una manera simple. El sistema más simple de mantener el estado estacionario es el quimiostato que consiste en un reactor donde el medio está vigorosamente agitado para mantener la máxima homogeneidad. El flujo F dividido por el volumen V del reactor es una medida de la dilución que se impone al cultivo y se denomina tasa de dilución. Así, D =F/V. Las dimensiones de este nuevo parámetro son h-1. El inverso de D (1/D) define el tiempo de retención en el reactor de cualquier componente del medio e.g. biomasa. El balance de este sistema puede plantearse como:

Biomasa acumulada = lo que entra - lo que sale + lo que se forma en el reactor (dX/dt)A V = FX0 - FX + (dX/dt)C V (dX/dt)A = FX0/V - FX/V + (dX/dt)C



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Si el flujo de alimentación sólo contiene medio fresco, el primer término se anula pues X0 = 0. Por otra parte, durante el estado estacionario, (dX/dt)A = 0 y, por tanto, la expresión se reduce a:

0 = -FX/V + µX FX/V = µX

DX= µX D=µ (8) Este es un resultado de importancia capital en la comprensión y control de los procesos continuos. De acuerdo con esto, el cultivo continuo procede bajo condiciones de µ controladas y constantes. Por tanto, el estado fisiológico de la población microbiana que se está multiplicando es prefijado de antemano y puede mantenerse, al menos teóricamente, durante un tiempo indefinido. Para el sustrato, puede plantearse de forma similar que:

-(dS/dt)A = FS0/V - FS/V - (dS/dt)C En el estado estacionario, el primer término se anula y reordenando la ecuación queda:

D(S0 - S) Yx/s = µX (9) La solución de este sistema al que es necesario unir la ecuación de Monod, no es única, sino que posee dos soluciones. El llamado estado de lavado (wash out) está caracterizada por la desaparición de la biomasa y la tendencia de S hacia S0. La segunda solución es aquella en la que X no tiende a cero sino a un determinado valor y S permanece también constante. Ambas soluciones son excluyentes entre sí. Si aumentamos D(=µ) hasta que alcance el valor de µmax las células no podrán crecer a esa tasa, pues el cultivo sólo alcanza µmax a altas concentraciones de sustrato, es decir S = S0 y el cultivo se lava poco a poco (X = 0). El valor de D al que el cultivo se lava, se denomina Dc (tasa de dilución crítica). Si sustituimos µ por Dc en la ecuación de Monod:

Dc = µmaxS/Ks + S Dc(Ks + S) = µmax S Dc/µmax = S/Ks + S

µmax > Dc Como vemos Dc es ligeramente menor que µmax. Por tanto, las dos soluciones “estables” existirán a valores de D < Dc (X permanece) y D> Dc (X desaparece). Hemos dicho que en el cultivo continuo es más exacta la determinación de los parámetros cinéticos. Supongamos que tenemos un cultivo de un microorganismo con una µmax=0.50 h-1 y se establece el cultivo continuo a D = 0.20 h-1 lejano del Dc y, por tanto, con un estado estacionario estable. En esas condiciones, determinamos el valor de S por alguna técnica analítica confiable. A continuación, desplazamos D hasta 0.30 h-1 y dejamos que el sistema se estabilice por unas horas (dos o tres generaciones) y determinamos de nuevo el valor de S en el nuevo estado estacionario. Para mayor seguridad, pueden medirse estos parámetros a varios valores de D < Dc. Con estos datos, se pueden establecer sistemas de ecuaciones a partir de Monod en las que se conocen µ y S quedando como incógnitas Ks y µmax las que pueden ser determinadas ahora con facilidad. Veamos ahora el parámetro restante de los análisis realizados anteriormente: m, coeficiente de mantenimiento celular.



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La utilización de la fuente de energía puede expresarse como la suma de dos funciones de la célula, a saber:

(dS/dt)tot = (dS/dt)crec + (dS/dt)mant dS/dt puede expresarse como el producto de (dS/dX) (dX/dt) = (1/Yx/s)(µX), así, sustituyendo los valores queda:

(1/Yx/s)tot(µX) = (1/Yx/s)crec(µX) + mX de donde:

(1/Yx/s)tot = (1/Yx/s)crec + m/µ Si ahora representamos gráficamente (1/Yx/s)tot vs 1/µ (= 1/D), obtendremos una recta de pendiente m e intercepto (1/Yx/s)crec. El cultivo continuo tiene otras diferencias con respecto al batch. Mientras que en este último las condiciones finales dependen de las iniciales, en el continuo son totalmente independientes. Como se ve en la Figura 2, para el cultivo batch (D = 0) la concentración final de biomasa depende de la concentración inicial. Pero, en el cultivo continuo, se alcanza con el tiempo una única concentración de biomasa independientemente de la de partida. En todos los casos, hay un estado transiente entre la X inicial y la final en la que el cultivo no está en estado estacionario.

Estado estacionario en dependencia de D Ya vimos como, según la ecuación de Monod, existen dos estados estacionarios pero sólo uno de ellos es estable bajo determinadas condiciones. Se discutió la estabilidad de ambos en función del valor de D. Veamos ahora como varían X y S en función de D, pero dentro del estado estacionario estable. Seleccionamos D por ser este un parámetro de fácil manipulación en el cultivo continuo. D puede ser variado por un simple incremento o decremento del flujo de alimentación. Si incrementamos paulatinamente D, la X decrece de igual forma hasta alcanzar el estado de “wash out” al valor de D = Dc.. La concentración de sustrato, S, aumenta poco a poco hasta que en ese valor de D = Dc, S = S0. En el estado estable de “no wash out” la concentración de X es proporcional a la de S. En el estado de wash out, sucede lo contrario. X es independiente de S pues X = 0. Ya vimos anteriormente que el valor de Dc es ligeramente menor que la µmax del mo en unas condiciones de cultivo dadas. El modelo de Monod puede ser expresado como:

D = µmax S/Ks + S De esta ecuación, es evidente que en un amplio rango de concentraciones de S en el estado estacionario, S >> Ks. Sin embargo, pequeños cambios de D en las cercanías de Dc, inducen grandes cambios de S y X, por tanto, en esta región, el control del proceso se hace muy difícil. Desde el punto de vista económico, la tasa de descarga de biomasa, DX, llamada la productividad del sistema es un parámetro en extremo interesante y está dimensionado por gramos de biomasa x unidad de volumen x hora. En dependencia de D, la productividad DX presenta un máximo a D =DM. Nótese que este valor, por fuerza, debe estar cercano al Dc donde todavía la concentración de biomasa no es tan sensible al cambio de d. No obstante, en los procesos industriales no es recomendable trabajar en esas regiones, sacrificándo parcialmente la productividad en aras de un mejor y más seguro control de proceso.



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Mantenimiento. Lisis celular Con Monod, tenemos un modelo muy simple para el cultivo continuo que puede complicarse, paso a paso, en función de del estudio fisiológico. De acuerdo con el modelo, en la medida que disminuya el valor de d, X debe aumentar en correspondencia. Esto, sin embargo, no es exacto para el caso en que la fuente de energía sea el sustrato limitante. Esta divergencia o desviación del cultivo continuo puede ser explicada en función del mantenimiento celular y la lisis por escasez de nutrientes. Si el sustrato limitante es otro que la fuente de carbono y energía, el valor de X medido como concentración de biomasa lejos de disminuir con el decrecimiento de D, aumenta. Recordemos la fase estacionaria (que no debe confundirse con el estado estacionario) de la curva de crecimiento. En esta fase, la célula acumulaba reservas a partir de la fuente de carbono y energía si el sustrato limitante era otro. Por ejemplo, en la producción de grasa a partir de Rhodotorula gracilis, el cultivo es conducido bajo deficiencia de N2 para acumular lípidos en el citoplasma. Las células no se multiplican por no tener disponible el N2 necesario para hacerlo, sin embargo, aprovechan el exceso de energía para acumular reservas, lo que conduce al incremento de X. Un comportamiento similar se observa en los casos en que el sustrato limitante sea PO4

3-, o Mg2+.

Contaminación en el cultivo continuo Para dos especies compitiendo por el mismo sustrato limitante, puede demostrase que la especie mejor adaptada sobrevive mientras que la otra desaparece del cultivo, es decir la de mayor valor de µmax permanecerá en el reactor. Esto sin embargo, es cierto para dos especies que posean un rango similar de µmax, digamos una bacteria (µmax = 0.7 h-1) y una levadura (µmax = 0.50 h-1), si el resto de los parámetros de cultivo no resultan desfavorables para ninguna de las dos (pH ≈ 5-6, T ≈ 35°C etc.). Veamos el caso en que la contaminación tenga una µmax mucho menor que la especie de interés. Digamos que se tiene un hongo con una µmax = 0.04 h-1. En este caso, a valores de D inferiores a 0.04 h-1 el hongo sobrevivirá en el cultivo por cuanto la levadura (µmax = 0.50 h-1) estará en la región de D en la que el mantenimiento celular es priorizado por la célula en lugar de la multiplicación. La levadura tenderá a la lisis celular para satisfacer los requerimeintos de mantenimiento, si se mantienen estas condiciones por mucho tiempo. De aquí se desprenden dos conclusiones para el control de las contaminaciones en el cultivo continuo de levaduras.

Si la contaminación es por hongos, el incremento de D hasta valores superiores a la µmax del contaminante lo conducirá al wash out, limpiándose nuestro cultivo.

Si por el contrario el contaminante es una bacteria, la estrategia de eliminación se hará a través del pH (recuérdese los valores promedio de pHopt en bacterias entre 6 y 8), reduciéndolo hasta valores inferiores a pH = 3.

Sistema batch incrementado (fed batch)

Los reactores batch y continuo representan casos extremos en la operación de fermentadores pues son o completamente continuos o discontinuos. El sistema batch incrementado es un compromiso entre ambos que permite controlar el proceso de fermentación por el suministro de sustrato. Estos sistemas fueron desarrollados empíricamente para algunos procesos industriales como son la producción de penicilina o de levadura panadera. Esta modalidad tiene como ventajas que se pueden alcanzar grandes concentraciones de biomasa, se puede evitar la inhibición por sustrato, etc., pues su concentración de es siempre mínima dentro del



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fermentador. Pueden minimizarse incluso los procesos de represión catabólica. La modelación matemática de este sistema es más complicada que los sistemas batch o continuo puesto que en este caso tanto la concentración de biomasa X como el volumen de reacción V cambian con el tiempo. El análisis puede realizarse de diferentes formas según se haya conformado el sistema. Es decir, puede haber varios flujos de alimentación de nutrientes al fermentador, el (los) flujo(s) de alimentación puede(n) ser continuo(s) o variable(s). Por motivos de facilidad de comprensión, nos limitaremos al caso más sencillo. Se alimenta el fermentador con un solo flujo, el que porta un solo sustrato limitante del que depende el crecimiento del mo. Durante el proceso se produce un solo producto. Así puede establecerse que:

dXV/dt = µXV dSV/dt = -µXV/Yx/s

dPV/dt = qpX Una característica del sistema incrementado es la alimentación con un medio fresco, por un flujo que puede ser o no continuo, por tanto podemos plantear que:

Fin /V = Din donde Din es la tasa de dilución del cultivo y tiene igual significado que en la modalidad continua. Luego, podemos escribir:

dXV/dt = µXV dSV/dt = FinSin - µXV

dPV/dt = qpX La variación de volumen del fermentador es dV/dt = Fin por cuanto es la única fuente de variación del mismo durante el proceso. Así pues:

dV = Fin dt Integrando la expresión queda:

V-V0 = Fin t (si Fin es constante) y V-V0 = ∫ Fin dt [si Fin = f(t)]

De las expresiones diferenciales iniciales, tenemos que dXV/dt = dX/dtV + dV/dtX lo que puede plantearse para todas ellas, así reordenando y después de sencillas transformaciones tenemos que:

dX/dt = µX - FinX/V dS/dt = FinSin/V -µX/Yx/s

dP/dt =qpX Si Fin = 0, todos los términos que lo contienen se hacen 0 y el sistema se reduce a las ecuaciones del cultivo batch:

dX/dt = µX

-dS/dt = µX/Yx/s dP/dt =qpX

Veamos ahora algunos aspectos teóricos relacionados con este sistema de cultivo a Fin constante. Supongamos que tenemos un cultivo batch clásico donde S es el sustrato limitante y se ha conducido durante un tiempo tal que X = Xmax es decir, S está casi agotado en este punto. En ese momento, comenzamos a suministrar medio fresco a un flujo Fin, Sin >> S y el sustrato



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es consumido casi inmediatamente después de entrar en el reactor y X seguirá siendo casi igual a Xmax. Si X ∼ Xmax, entonces dX/dt ∼ 0, dS/dt ∼ 0 y µ ∼ Din. Bajo estas condiciones, el cultivo alcanza un estado cuasi-estacionario. Si sustituimos Din ∼ µ en la ecuación de Monod, tenemos que:

Din = µmax S/Ks + S, reordenando Din/µmax = S/Ks + S, por tanto

µmax > Din En el cultivo fed batch, la µ se controla por el flujo de nutrientes y esta es siempre menor que la µmax del mo. Si imponemos un flujo Fin determinado, estaremos fijando la µ a la que el microorganismo está creciendo en todo momento. La concentración del sustrato limitante puede obtenerse a partir de la ecuación de Monod.

Din ∼ µmax S/Ks + S Reordenando la expresión,

S ∼ DinKs/µmax - Din En el cultivo continuo µ = D, mientras que en el batch incrementado µ ∼ Din, pero en el continuo D es constante durante todo el proceso mientras no varíe el flujo de alimentación. En nuestro sistema, al ser Fin constante y variar el V de reacción, Din decrece todo el tiempo y de igual manera µ. De este resultado, se desprende una propiedad muy importante que posee el batch incrementado. El cultivo está constantemente bajo condiciones de cultivo transiente pero bajo µ controladas, lo que no es posible en el batch clásico. Consideremos ahora otra situación extrema del incrementado. Si alimentamos el sustrato de forma muy concentrada, tanto que el flujo sea muy pequeño, se puede plantear que Fin ∼ 0 y por tanto dV/dt ∼ 0. Así:

dX/dt ∼ µX -dS/dt ∼ µX/Yx/s

dP/dt ∼ qpX Este estado del sistema se conoce como cuasi-batch.

Características cinéticas de los bioprocesos Es preciso antes de analizar los diferentes tipos de clasificación de los bioprocesos describir algunos términos importantes usados en la caracterización de éstos.

Productividad La productividad se define como la concentración de producto (masa celular o concentración de metabolito) dividida por el tiempo de cultivo. Refleja la tasa media a al que el producto es sintetizado durante el tiempo de cultivo. Por ejemplo, la productividad de la biosíntesis de la penicilina en un proceso que rinde 16,000 unidades/ml en 120 horas es de 133 unidades ml-1 h-

1. La productividad del fermentador puede expresarse de forma similar. Desde el punto de vista económico, hay dos cantidades como son el coeficiente económico y la constante de rendimiento. El primero se refiere a la cantidad de producto o masa celular que se obtiene a partir de la cantidad total de sustrato introducido y la segunda igualmente está referida a la cantidad de producto o masa celular, pero con relación a la cantidad de sustrato consumido.



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Clasificación de los bioprocesos Los bioprocesos pueden dividirse en varios grupos de acuerdo con diferentes criterios: consumo de sustrato y formación de productos (Gaden) y tipo de reacción involucrada (Deindoerfer). Clasificación de Gaden i) La síntesis de producto procede estequiométricamente en relación al consumo de fuente de carbono que proporciona la energía para el crecimiento. Los cambios en las tasas de formación de producto son paralelos a las tasas de cambio de consumo de C. ii) La síntesis de producto está conectada sólo indirectamente con el consumo de la fuente de C que proporciona la energía para el crecimiento. iii) La síntesis de producto no está conectada aparentemente con el consumo de la fuente de C. Un ejemplo de los procesos del tipo i) es la producción de etanol por las levaduras y de ácido láctico. En este caso, el crecimiento depende de la habilidad del microorganismo para obtener energía de la glucólisis. Por tanto, el crecimiento microbiano y la producción del producto proceden en paralelo sólo durante el cultivo anaeróbico. En presencia de O2, el sustrato es metabolizado en una forma diferente. En los procesos del tipo ii), el crecimiento microbiano está separado en el tiempo de la producción del producto, aunque la fuente de energía para el crecimiento es la misma en ambos casos. Ejemplos típicos de estos procesos son la biosíntesis del ácido cítrico y algunos aminoácidos. Los procesos del tipo iii) no exhiben una relación aparente entre la tasa de consumo del sustrato y la tasa de formación aparente de producto. Ejemplos de estos procesos son la producción de algunos antibióticos, vitaminas y enzimas. Estas sustancias son segregadas de las células después de terminado el crecimiento. Si la fuente de C, se añade en exceso no se observan cambios en el nivel de formación de producto. Como en general los productos de este tipo son sustancias complejas, los rendimientos son usualmente incrementados por adición de precursores al medio. Clasificación de Deindoerfer i) Reacciones simples. El sustrato es convertido en producto con estequiometría fija sin acumulación de intermediarios. Ejemplos de estos procesos son el crecimiento de levaduras y bacterias o la conversión de un sustrato por una suspensión de mo. ii) Reacciones simultáneas. Los sustratos se convierten en productos en proporciones estequiométricas variables sin acumulación de intermediarios. Las tasas relativas de formación de estos procesos varían con la concentración de sustrato. Un ejemplo de esto es la acumulación de grasas o polisacáridos en dependencia de la concentración de nitrógeno. iii) Reacciones consecutivas. El sustrato se convierte en producto con acumulación de intermediarios. Estos procesos los vemos en la conversión de glucosa en ácido glucónico en los mo que no poseen gluconolactona o en la síntesis de antibióticos. iv) Reacciones paso a paso. El sustrato es convertido completamente en un intermediario y sólo después en producto.


Aspectos Básicos para la Recuperación de Productos

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3. Aspectos Básicos para la Recuperación de Productos……………. En los primeros tiempos de la Microbiología Industrial, las técnicas utilizadas en la recuperación de productos (extracción, destilación, diálisis, cristalización, precipitación, desecación) se tomaron más o menos directamente de la ingeniería química, sin más que un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biológicos. Sin embargo, gradualmente se comprendió que había que perfeccionar procesos específicos de purificación para materiales biológicos, ya que los bioproductos son frecuentemente compuestos muy lábiles cuyas estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo condiciones definidas y limitadas de pH, temperatura, fuerza iónica, etc. También resultó claro que no existe una operación única, ideal o universal, ni siquiera secuencias de operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma más adecuada para cada problema particular. En muchos casos, la primera etapa, al final de una fermentación, es la separación de los sólidos del líquido que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo puede ser el producto final deseado, sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que está presente intra o extracelularmente. Ejemplos de metabolitos intracelulares incluyen a los ácidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y ciertos antibióticos como la griseofulvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares incluyen a los aminoácidos, el ácido cítrico, alcohol, algunas enzimas (amilasas y proteasas) y la mayor parte de los antibióticos (penicilina, estreptomicina). En unos pocos casos, se encuentran metabolitos tanto en las células como en el filtrado del cultivo (vitamina B12). Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, este debe ser liberado de las células antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las células, la selección de etapas adicionales de purificación dependerá del producto deseado. Las últimas etapas en la recuperación implican precipitación, cristalización y/o desecación. Separación de las partículas La primera etapa en la recuperación del producto es, por consiguiente, la separación de la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante de cultivo. Para este propósito existen varios métodos, que incluyen la floculación, flotación, filtración y centrifugación.

Floculación y flotación Las células aisladas en el rango de tamaño de 1 a 10 µm se sedimentan muy lentamente y son difíciles de precipitar incluso con la centrífuga. En estos casos, se recurre a la floculación para producir grandes agregados que sedimentan mucho más rápidamente, ya que la velocidad de sedimentación de una partícula aumenta con su diámetro (ley de Stokes). En la mayor parte de los casos se añade un agente floculante como una sal inorgánica, polielectrolitos orgánicos o hidrocoloides minerales. La floculación depende tanto del agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las células, de los constituyentes iónicos, así como su concentración. La floculación puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la célula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las células, puentes de moléculas poliméricas cargadas. Si no se forma un flóculo suficientemente denso, puede utilizarse la flotación que es el proceso reverso a la floculación. La flotación se consigue introduciendo gas en el líquido. Las pequeñas burbujas de gas adsorben y atrapan a las células y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.



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Filtración Lo más frecuente es que la primera etapa en el proceso de recuperación se lleve a cabo por algún tipo de proceso de filtración. Los dos principales tipos de filtros son los denominados filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos casos, la fuerza motriz es la presión, sea creada por sobrepresión o por vacío. Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de vidrio o papel de filtro, llevándose a cabo el proceso de filtración debido a que las partículas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partículas que van a ser filtradas son frecuentemente más pequeñas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a través de los intersticios retorcidos del filtro. Los filtros en superficie son membranas en las que el tamaño de los poros es más pequeño que las partículas que van a ser filtradas. Las partículas son, por consiguiente, separadas sobre las superficies de los filtros. Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a través de filtros profundos. Por su parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en superficie. En cualquier caso, la velocidad de filtración, es decir el volumen de filtrado que puede ser recogido en un tiempo determinado, está influenciada por numerosos factores, como el tamaño de los microorganismos, su morfología, la viscosidad del fluido, temperatura, etc. Uno de los inconvenientes de la filtración en superficie es la colmatación. Debido a que este proceso de filtración depende estrictamente del tamaño de los poros y del tamaño de las partículas, a medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma una capa que reduce la velocidad de filtración. Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por filtración en contracorriente, en la cual los sólidos que no pasen a través del filtro son mantenidos en suspensión mediante un flujo turbulento a través de la membrana o ajustando palas móviles o mediante un impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a través de la membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene. Con el método de contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de filtración de 100 veces en comparación con la filtración estática. Dependiendo del tamaño de las partículas que sean filtradas, se reconocen tres tipos principales de procesos de filtración: Osmosis reversa, para partículas de 0,0001 a 0,001 µm Ultrafiltración, para partículas de 0,001 a 0,1 µm Microfiltración, para partículas de 0,1 a 10 µm Las posibilidades de los procesos de ultrafiltración y ósmosis reversa se dan generalmente en términos del peso molecular del tamaño de corte. La ósmosis reversa implica, generalmente, a sustancias de pesos moleculares menores de 1,000 daltons y la ultrafiltración a sustancias de pesos moleculares mayores de 1,000 daltons. El proceso de microfiltración concierne principalmente a la separación de células o de fracciones celulares. Se utilizan membranas fabricadas con ésteres de celulosa, polivinilfluoruros, policarbonatos, polisulfonas y celulosa. En los procesos clásicos de purificación utilizados en la industria de antibióticos (micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se separa del filtrado del cultivo sobre un filtro de tambor rotatorio a vacío que consiste en un tambor rotatorio en cuya parte exterior se enrolla un paño y



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el vacío se produce desde el interior del tambor. Para aumentar la eficiencia del proceso de filtración, se utiliza una ayuda filtrante como tierra de diatomeas. Para mantener la eficiencia de filtración, se utiliza una cuchilla automática para raspar continuamente del filtro la biomasa junto con una fina capa del material de ayuda de filtración. Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser lavada a medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vacío son especialmente buenos para suspensiones que contengan una alta concentración de sólidos (20-60% de volumen de micelio).

Centrifugación Las bacterias son normalmente demasiado pequeñas como para ser separadas con filtros sencillos. Su separación por centrifugación también es difícil debido a las pequeñas diferencias en densidad entre las partículas y la suspensión. La centrifugación no sólo se utiliza para separar partículas sólidas de la fase líquida sino también para la separación de fluido/fluido. Si bien la separación fluido/partícula es de la mayor importancia, la separación fluido/fluido también es importante como es el caso en la producción de penicilina para la separación del solvente que extrae el antibiótico de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2.5-3.0. La separación eficiente de las células por centrifugación se ve favorecida por un tamaño grande de las partículas, una gran diferencia entre la densidad de las partículas y el líquido, una baja viscosidad del líquido, un radio elevado del rotor de la centrífuga y una alta velocidad angular. Tanto el tamaño de las partículas, su densidad así como la viscosidad del líquido normalmente no se pueden controlar. Además, el radio del rotor de la centrífuga no puede incrementarse indefinidamente ya que el estrés mecánico incrementa con el cuadrado del radio por lo que los límites de seguridad se alcanzan fácilmente. Por todo esto y cuando se trabaja con grandes volúmenes se debe recurrir a centrífugas de flujo continuo. En este tipo de centrífugas la separación de partículas es más eficiente cuanto más lento sea el flujo de la suspensión a clarificar ya que se incrementa el tiempo que cada partícula está expuesta a la fuerza centrífuga. En la transparencia se muestran esquemáticamente algunos tipos de rotores: cámara tubular, recipiente de cámara múltiple y centrífuga de rotor de discos. Todos los diseños tienen desventajas individuales a las que deben ser añadidas las generales del coste (incluyendo el mantenimiento), consumo de energía y (exceptuando las que incorporan refrigeración) elevación de la temperatura. Desintegración de los microorganismos En algunos casos la recuperación de los productos requiere que los microorganismos sean fragmentados por procedimientos químicos, físicos o biológicos. Un resumen de los métodos utilizados en la desintegración de los microorganismos se encuentra en esta transparencia. La selección de un método depende principalmente de la naturaleza de las células. Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredes celulares varían ampliamente en lo rápidamente que pueden ser rotas. Las bacterias Gram + y los hongos son mucho más difíciles de romper que las bacterias G- debido a la composición de la pared celular. Incluso dentro de un mismo microorganismo las células varían significativamente en sensibilidad a la ruptura dependiendo de su estado fisiológico. Al mismo tiempo, la desintegración debe ser llevada a cabo sin destruir el producto que nos interesa. Por ejemplo, pueden utilizarse ácidos para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el producto de interés es lábil a los ácidos.



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Métodos químicos Los métodos químicos utilizados para desintegrar células microbianas incluyen tratamiento con álcalis o ácidos, solventes orgánicos y detergentes. La lisis bacteriana mediante el uso de álcalis puede llevarse a cabo a gran escala y con bajo coste siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por ejemplo, la hormona de crecimiento humano recombinante se libera fácilmente de Escherichia coli por tratamiento con hidróxido sódico a pH: 11. El tratamiento con solventes orgánicos es un tratamiento sencillo y barato que se utiliza en el aislamiento de enzimas en levaduras. No obstante, se corre el riesgo de que el tratamiento desnaturalice las proteínas por lo que se debe chequear con antelación. Los detergentes permeabilizan las células bacterianas al solubilizar las membranas celulares. Como consecuencia de esta actividad se originan agujeros por los que salen al exterior las proteínas y otras moléculas. desgraciadamente los detergentes son caros, desnaturalizan la mayoría de las proteínas y a menudo aparecen como contaminantes en el proceso subsecuente de purificación. Para la extracción de células de levadura se utiliza la plasmólisis que se consigue mediante la adición de una concentración alta de cloruro sódico.

Métodos biológicos Se utiliza la lisis enzimática. Por ejemplo, la pared celular de las bacterias Gram + se hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA. La pared celular de las levaduras se hidroliza con una combinación de una o más de los enzimas α (1,3)-glucanasa, β (1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa. Los tratamientos enzimáticos son muy específicos y las condiciones para la lisis son suaves. En la actualidad, los costes limitan el uso de los enzimas como agentes líticos celulares en la industria. Una variante que se utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los enzimas autolíticos endógenos de las levaduras llevan a cabo la destrucción de su propia pared celular. La adición de cloruro sódico, acetato de etilo o cloroformo y la incubación durante 24h a 45°C aumenta la velocidad del proceso autolítico.

Métodos físicos La desintegración por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Otro método físico incluye repetidos ciclos de congelación y descongelación pero en este caso muchas de las células permanecen intactas. Industrialmente los métodos físicos más empleados de desintegración celular suponen la acción mecánica. Los molinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las células mediante la acción de bolas de vidrio. Las células y las bolas de vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de reacción. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una célula contra las paredes de la vasija. Con este método se consigue una velocidad máxima de ruptura de aproximadamente el 80% de las células. Otro enfoque es el uso de homogeneizadores. En tales artilugios el material biológico se coloca bajo una fuerte presión hidrostática (alrededor de 500 atmósferas) y la presión se libera bruscamente permitiendo que el líquido salga por una válvula, lo que ocasiona la lisis celular. Métodos de aislamiento Una vez que se han lisado las células, los restos celulares se retiran bien por centrifugación de gran capacidad a baja velocidad o por filtración en membrana. Al final obtenemos un líquido libre de células que es el que sufre los tratamientos posteriores para aislar y en su caso purificar el producto de interés.

Cromatografía



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Algunas de las etapas más caras en la recuperación del producto implican el uso de métodos cromatográficos. Tales métodos son de especial valor para la purificación de materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y reactivos para investigación. Los distintos métodos cromatográficos que existen según su mecanismo de separación son: filtración en gel (peso molecular), cromatografía de adsorción (interacciones hidrofóbicas), cromatografía de intercambio iónico (carga), cromatografía de afinidad (actividad biológica) y electroenfoque (punto isoeléctrico).

Extracción La extracción, cuando se aplica a los bioproductos, tiene tanto la función de separación como la de concentración. El caldo acuoso de fermentación que contiene el producto deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se disuelva preferentemente y del que pueda ser más fácil y específicamente recuperado. Una vez se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado. La extracción con solventes ha sido utilizada ampliamente en la industria de antibióticos, como la penicilina, utilizando solventes como el acetato de amilo o de butilo. Para la separación de enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgánicos pero sí pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase múltiple preparados en una solución de sales con polímeros hidrofílicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el agua es el componente principal, pero ambas fases no son miscibles por lo que los enzimas pueden separarse fácilmente sin pérdida de actividad.

Cristalización y precipitación La cristalización a baja temperatura es una forma muy suave de purificación. La cristalización se utiliza principalmente para la purificación de compuestos de bajo peso molecular, como los antibióticos. Por ejemplo, la Penicilina G es generalmente extraída del caldo de fermentación con acetato de butilo y cristalizada por adición de acetato potásico en solución etanólica.

Desecación El secado del material biológico es en muchos casos el método final por el que los productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento. La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biológicos significa que los únicos métodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminación de agua con elevación mínima de la temperatura. En algunos casos, la termoestabilidad de los productos, como enzimas o preparaciones farmacéuticas, es mejorada por la adición de azúcares u otros estabilizantes inertes. La liofilización es el método de desecación más suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos productos farmacéuticos son liofilizados como vacunas, fracciones de plasma, hormonas y preparaciones de enzimas, así como ingredientes muy lábiles y caros para diagnosis. También se utiliza la liofilización cuando el producto final es un cultivo microbiano vivo (cultivos para inoculación en las industrias lácteas). Rendimiento Las pérdidas en la recuperación dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso y del número de etapas de purificación. El promedio de pérdidas atribuidas a la purificación está en torno al 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. En la transparencia se muestran los datos para la purificación de ácido glutámico donde se observa la extensión en la que deben ser combinados y optimizados los métodos de recuperación. El rendimiento final es solamente un factor, ya que el coste de los productos químicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en el cálculo global.


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4. Bioproductos………………………………………………………………….…. El control biológico de plagas y enfermedades tiene como objetivo fundamental mantener las poblaciones de insectos y otros organismos dañinos para los cultivos agrícolas, por debajo de los niveles que causan perjuicios económicos, como alternativa ante el control por vía química, el cual acarrea problemas ecológicos y de contaminación ambiental. Entre los agentes que actúan en el control biológico de plagas, tenemos distintos tipos de virus, bacterias, hongos, nemátodos y protozoos. Podemos citar, por ejemplo: Bacillus thuringiensis, Pseudomonas fluorescences, Beauveria bassiana, Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces fumosoroseus, Metarhizium anisopilae, Trichoderma spp y Verticillium lecanii. El empleo masivo de cualquiera de estos agentes implica una reproducción a escala industrial. Esto determina la necesidad de diseñar la tecnología del proceso, así como el desarrollo del producto, mediante los procesos biotecnológicos correspondientes. A continuación, se presentan diferentes biopreparados producidos para el control de plagas. Biopreparados a partir de Hongos del Género Paecilomyces

Características A partir de estos hongos, se han producido biopreparados a escala de planta piloto mediante fermentación sumergida, obteniéndose un polvo seco y con altas titulaciones de esporas viables. Los productos presentan las siguientes características: Tabla 1. Características de los Productos P. lilacinus P. fumasorosum Humedad (%) 2-5 5-10 Titulación (esporas viables Kg –1) 5x1011-3x1012 5x1011-1x1012 Estabilidad a 25ºC (meses) 3 - Estabilidad a 4ºC (meses) 18 -

Usos

El formulado del hongo P. lilacinus es efectivo para el control de nemátodos del género Meloidogyne, el cual causa considerables pérdidas económicas en cultivos tales como café, viandas, hortalizas y caña de azúcar. En países como Cuba, ha sido evaluado a nivel de campo, en organopónicos naturalmente infectados con nemátodos del género Meloidogyne, y los resultados han mostrado una reducción del nivel de infestación entre 66 y 72 % y una permanencia en el suelo de cuatro meses con efectividad. La dosis de empleo de este formulado representa la cuarta parte o menos de las empleadas con los biopreparados de tipo artesanal. En cuanto a los formulados del hongo P. fumosoroseus, se ha evaluado que es efectivo para el control de la mosca blanca, plaga de importancia en países tropicales y subtropicales por las graves afectaciones que ocasionan en el cultivo de viandas y hortalizas. Por otro lado, los efluentes de la etapa fermentativa de estos hongos en particular P. lilacinus contienen proteasas alcalinas. Mediante un proceso tecnológico de estas aguas residuales, en Cuba se ha obtenido un rendidor enzimático en polvo llamado Flexotex, el cual ha sido empleado satisfactoriamente para el proceso de rendido en la industria del cuero.


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Proceso Tecnológico

La obtención de estos formulados comprende diferentes etapas como son la producción de la biomasa con altas concentraciones de conidios1, filtración, secado y formulación del biopreparado. La fermentación es llevada a cabo en cultivo sumergido empleando la técnica de batch, incrementando y empleando como medio, mieles finales de caña y fosfato de amonio. Con el hongo P. lilacinus al cabo de 32-40 horas de propagación se obtienen titulaciones de 1-60x1012 esporas por l-1, de las cuales el 95% son conidos. Para el hongo P. fumosoroseus se obtienen titulaciones de 1x1012 esporas por l-1 donde 170% de las mismas son conocidos en tiempos que oscilan entre 40-48 h. Una vez concluida la fermentación la separación de la biomasa se realiza por filtro prensa o centrífuga tubular y se procede a su secado en secador por aspersión en presencia de un protector (miel final de caña). El producto es luego formulado con zeolita. Por otro lado, los efluentes son evaporados a 50 °C y posteriormente secados en presencia de sulfato de amonio. El polvo obtenido es mezclado con un relleno inerte de celulosa, para llevarlo a la actividad requerida para su empleo en las tenerías. Figura 1. Producción de Formulados de Paecilomyces y el Rindente Enzimático Flexotex

Aspectos Económicos Un factor económico importante que caracteriza la producción de estos formulados, comparado con los productos artesanales, es el empleo de una tecnología sencilla y reproducible, que permite la obtención de un producto seco en polvo, efectivo para el control de nemátodos, con alta titulación de esporas viables y que puede ser conservado durante 18 meses. Además, el tratamiento de los efluentes para la producción de un rendidor enzimático, proporciona una fuente adicional de ingresos, así como la eliminación de problemas de contaminación ambiental. El nematicida así como el rendidor ha sido producido en Cuba, a escala piloto, para una producción por carga de 4,5 kg de formulado y 50 kg de rindente. El costo de producción a esta escala, ha sido estimado en 9,00 USD kg-1, para el formulado y 0,40 USD kg-1 para el rendidor.

1 Esporas de mayor resistencia y estabilidad

Separación

Secado

Formulación

Evaporación

Secado

Formulación

Fermentador Agua Miel

PO4H(NH4)2

Biomasa

Protector

Zeolita

Efluente

Relleno

Formulado Flexotex

SO4(NH4)2


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Estos valores se comparan favorablemente con productos similares en el mercado internacional, como son el nematicida Nemachek que se vende a $22,00 USD kg-1y el rendidor Basosin BASF, a $1,00 USD kg-1. La estructura de los costos para ambos productos es como sigue: Tabla 2. Formulado de P. Lilacinus % de incidencia Materias primas y materiales 3 Combustible 30 Salarios 60 Depreciación 2 Total 100

Tabla 3. Subproducto FLEXOTEX % de incidencia Materia prima 50 Combustible 23 Salarios 25 Depreciación 2 Total 100

Como se aprecia, para el costo del formulado, el peso fundamental, lo tienen los salarios y en segundo término el combustible, mientras que para el rindente lo son la materia prima (relleno inerte) y los salarios. Debido a que en ambos procesos, un porcentaje de incidencias alto corresponde a los salarios, el costo de producción de los mismos disminuirá con el aumento de escala. Probióticos

Características El desarrollo de productos con características probióticas surge por la necesidad de sustituir el empleo de antibióticos en la dieta animal, debido a que estos provocan resistencia en los microorganismos que componen la flora indígena y efecto residual en los tejidos y productos de origen animal (carne, huevos y leche). Los probióticos sustituyen a los antibióticos restableciendo la flora a su plena capacidad protectora. El término probiótico se vincula a organismos microbianos vivos o muertos de las especies Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus y Saccharomyces, así como a productos de la fermentación de estos microorganismos. PROBLAC es un preparado de bacterias lácticas viables con una concentración celular entre 1011-1012 UCFmL-1 creado en Cuba. Las bacterias empleadas para la obtención del preparado presentan características adecuadas para su empleo como probióticos ya que poseen alta velocidad de crecimiento y tiempo de duplicación de alrededor de una hora. Presentan además, buena resistencia a altas concentraciones de bilis y bajos valores de pH y resistencia frente a las sustancias antimicrobianas más comúnmente utilizadas en la formulación de piensos. Características del producto Concentración Celular 1012 UFC mL-1 Azúcares Reductores Totales g L-1 0.5-1 .0 Ácido Láctico g L-1 14-18 Materia Seca g L- 1 4.0-4.5 pH 6.4-6.6 Densidad a 25 °C gmL-1 1.022-1.030 Viscosidad mPa 1.55-1.15


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Usos Los preparados probióticos son utilizados mundialmente en diferentes categorías animales con el propósito de lograr un mejoramiento en el comportamiento y la salud animal. El preparado probiótico PROBLAC ha sido utilizado en aves y cerdos, aunque por sus características y resultados obtenidos es posible asegurar su utilización con buenos resultados en otras especies animales. Los efectos obtenidos con la aplicación del producto son los siguientes:

Gallinas ponedoras: Mayor producción de huevos Pollos de ceba: Mejora de la conversión alimentaria y aumento de la viabilidad. Cerdos lactantes: Eliminación de enfermedades digestivas (diarreas), disminución de la mortalidad, no empleo de antibióticos, incremento de carne por camada.

Proceso Tecnológico

La tecnología de obtención de productos probióticos incluye diferentes etapas relacionadas con el propósito de utilización con los métodos de administración del mismo. La producción por vía fermentativa constituye una de las más importantes. Una tecnología eficiente y económicamente viable requiere de una buena selección y caracterización del microorganismos a emplear y de la definición de los parámetros fisiológicos y de proceso que influyen en el desarrollo del cultivo microbiano (temperatura, agitación, concentración celular del preparado, pH, composición del medio de cultivo, etc). Es importante también, dentro del proceso, evaluar la estabilidad del producto durante su almacenamiento. La producción del preparado probiótico se realiza mediante un proceso de fermentación discontinuo. El microorganismo empleado es la cepa de Lactobacillus rhamnosus B/103-1-5 perteneciente al cepario del ICIDCA. El medio de cultivo empleado está compuesto por miel final de caña clarificada como fuente de azúcares y por extracto de levadura o hidrolizado básico de levadura forrajera como fuente de compuestos nitrogenados . Se añaden además sales como fuentes de fósforo, potasio y microelementos indispensables para el buen desarrollo del microorganismo. La fermentación comienza con la cuña de cultivo y pasa por las etapas de propagación y prefermentación hasta alcanzar el volumen de producción deseado. Los parámetros del proceso fermentativo para lograr una alta concentración y viabilidad celular en el producto final son los siguientes:

PH: 6.5 ± 2 Ajustado con NaOH Relación de inoculación: 110-1 v v-1 Temperatura: 37 °C Aire: No Agitación: 100 rpm t de fermentación : 12-16 h


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Figura 2. Producción de PROBLAC (1m3/Carga) El producto así obtenido se envasa en frascos de cristal o plásticos de 1.5 y 10 L que pueden ser almacenados a temperatura ambiente 15 días y a 15°C durante 2.5 meses sin sufrir afectaciones en la viabilidad celular y las características del producto.

Equipos fundamentales Fermentadores, autoclave, tanques, centrífugas, bombas, incubadora, estufa, balanza.

Frecuencia de aplicación El probiótico PROBLAC se suministra hasta el momento en forma líquida y su tratamiento y dilución previa, así como la forma de aplicación y dosis, dependerá del tipo de categoría animal al que esté destinado. En aves se puede suministrar en el alimento o en el agua de bebida. En el caso de pollos de cebase aplica en el agua de bebida en las primeras horas de la mañana. En ponedoras se distribuye el PROBLAC en el alimento sobre la primera ración de la mañana. En cerdos se aplica la primera dosis a la hora del nacimiento de forma oral con una jeringuilla o dosificador apropiado, aprovechando para ello el descolmillado de la cría. Las dosis siguientes son suministradas en el alimento.

Dosis En aves En general se suministra 1 mL ave Pollos de ceba y gallinas de reemplazo: 1 mL diario durante los primeros 7 días y a partir de ahí cada 7 días. Gallinas ponedoras: 1 mL cada 7 días durante el ciclo de postura En cerdos En cerdos lactantes: 1 mL (del producto diluido convenientemente para obtener 109 UFC mL-1 por cría al nacer y cada 7 días hasta 2 ó 3 semanas posterior al destete.

Fermentador

Prefermentador

Disolutor de Sales

Miel Clarificada

Envasado (Frascos de 1-10

litros)

Agua Extracto de Levadura

PROBLAC

Sales Disueltas

Extracto de Levadura

Inóculo

Sales Disueltas

Agua

Fosfatos de Potasio Acetato de Sodio Citrato de Amonio Sulfato de Magnesio Sulfato de Manganeso


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Aspectos Económicos Costo de Inversión La instalación para la producción del preparado es sencilla y su costo de inversión no es alto. La inversión de una planta con una capacidad de I t/día, o sea, 300 t a-1, que referida a este preparado líquido equivale a 961 1 d-1 o 288 0001 a-1, se desglosa como sigue: Tabla 4. Costos de Inversión Equipos 15,000 Construcción y montaje 10,000 Otros 5,000 Total 30,000

Capacidad Instalada Y Producción Mundial

En el mundo existen numerosas firmas que producen y comercializan productos probióticos con diferentes formulaciones, destinados tanto a la alimentación animal como humana. Entre las firmas más internacionalmente reconocidas se encuentran la ALLTECH de Estados Unidos y su representación en México, que ofertan formulados probióticos compuestos por diferentes microorganismos y extractos enzimáticos como son: YEA-SACO, LACTO-SAAC, ACID-PAK 4 WAY, ALLLYTE, ALL-SWEET. La Bayer comercializa un producto denominado AVIGUARD recomendado para la crianza de aves. La CENZONE TECH. INC. de Estados Unidos comercializa un producto denominado YEASTURE con amplio espectro de utilización en diferentes categorías animales. La firma LACTIFERNI de Checoslovaquia en cooperación con AB ÍYIEDIPHARNI de Suecia oferta un producto denominado LACTIFERM PREMIX recomendado para animales jóvenes, fundamentalmente para cerdos en edades tempranas de su desarrollo postnatal . El precio de estos productos en el mercado internacional oscila alrededor de 5 USD kg-1 . Por otra parte los laboratorios LACTEOL du BOUCARD de Francia producen varios productos a base de Lactobacillus acidophillus recomendados para el tratamiento de diarreas de origen no orgánico y trastornos gastrointestinales en humanos. Se ofertan en forma de ámpulas, comprimidos, papelillos y polvos. Su precio se encuentra alrededor de 35 USD (caja de 7 ámpulas) -1 , 4 USD (frascos de 45 comprimidos) -1 y 5 USD (caja de 10 papelillos) -1 . Esporas de Trichoderma harzianum

Características En los últimos años se ha venido haciendo hincapié en lo beneficioso, útil y necesario que es el empleo del control biológico o la lucha biológica en el control de plagas y enfermedades que pueden afectar a los distintos cultivos agrícolas y todo parece indicar que existirá una fuerte tendencia hacia la búsqueda y el empleo masivo en el proceso agrícola de especies de microorganismos beneficiosos en cuanto al control de plagas de acuerdo a los cultivos específicos. En este sentido puede señalarse la utilización de distintos tipos de microorganismos utilizados con estos fines entre los que se destaca la Trichoderma harzianum entre otros. Los procesos de fermentación sólida presentan determinadas características que les hacen sumamente atractivos en la producción de esporas o metabolitos para ser empleados en el control de plagas, destacándose entre ellas:

obtener los productos mucho más concentrados producir esporas con características fisiológicas que las hagan más resistentes en el suelo no presentar niveles de contaminación de efluentes altos


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Usos El producto obtenido se emplea en Cuba como fungicida para el control de plagas tales como: Phytophtora nicotiniae, Fusarium oxysporum, Phytophtora parasitica, Sclerotium rolfsil y Alternaria porf. Reportándose además su empleo para el control entre otros de: Botrytis cinerea, Phytophtera cryptogea y Puccinia carthami en el cultivo del tabaco, hortalizas, vegetales y plantas ornamentales.

Proceso Tecnológico El proceso tecnológico está concebido de manera que el microorganismo empleado, Trichoderma harzianum, crezca mediante un proceso de fermentación en estado sólido a partir de mieles finales de caña de azúcar sobre una matriz de bagacillo de caña, previa clasificación del tamaño de la partícula de manera que la partícula tenga un diámetro equivalente ala porción de tamizado entre dos tamices de 1 y 0.7 mm. Para el desarrollo de la fermentación se emplea un inoculante de espora o de micelio al 10 % b.s. El sustrato a fermentar está formulado a partir de mieles finales de caña de azúcar balanceado con urea como fuente de nitrógeno y de manera que se tenga una humedad inicial no mayor del 60 % sin la necesidad de adicionar ningún otro componente, para evitar la eventual formación de enzimas celulolíticas, lo cual provocaría mayores tiempos de esporulación durante la fermentación . Para obtener un medio correctamente balanceado es necesario conocer los siguientes datos (los valores se ofrecen a manera de ejemplo tomando como base de cálculo 100 Kg de sustrato a fermentar). Razón de inóculo (kg de inóculo 100 kg de sustrato húmedo) 10.00 Concentración de biomasa en el inóculo (Kg biomasa kg inóculo) Cantidad de sustrato húmedo a fermentar (kg) 100 Humedad inicial en el sustrato a fermentar (%) 60.0 Humedad del soporte sólido (%) 10.0 Concentración de azúcar deseada en el sustrato a fermentar (% b.s.) 30.0 Concentración de azúcar en el soporte sólido (% b.s.) 0.0 Fuente de nitrógeno a emplear UREA Rendimiento biomasa/sustrato (%) 50.0 Proteína en la biomasa (%) 30.0 Concentración de azúcar en la miel (kg ART kg miel) 0.52 Brix de la miel 80.42 Realizando los balances de masa pertinentes se obtiene la formulación de medio correspondiente: Cantidad de soporte sólido (BAGACILLO) 24.09 kg Cantidad de mieL 20.00 kg Cantidad de inóculo 10.00 kg Cantidad de urea 0.62 kg Cantidad de agua a añadir 45.29 kg El proceso se desarrolla a temperatura ambiente o controlada a 30 °C durante 5-7 días como máximo en fermentador diseñado al efecto, obteniéndose titulaciones del orden de 109-10 10 esporas/g de sustrato en base seca. La demanda de aire en el sistema es del orden de IV Kg M (litros de aire Kg sustrato húmedo inicial-1 m-1). El producto final como se ha aplicado en Cuba solamente requiere del secado del complejo biomasa-espora-sustrato y su formulación a partir


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de inertes con titulaciones del orden de 108-109. Un ejemplo de los parámetros cinéticos correspondientes a una fermentación en estado sólido empleando la cepa Trichoderma harzianum sp. es: Yox 2.7 g biomasa g-1 O2 consumido m 0.001 g O2 consumido g-1 biomasa h-1 u 0.108 h-1 Yox 2.7 g biomasa g-1 O2 consumido m 0.001 g O2 consumido g-1 biomasa h-1 u 0.108 h-1

Aspectos Económicos La producción de esporas a partir de Trichoderma harzianum se considera en una planta multipropósito de fermentaciones con una sección de recobrado que contenga: secado al vacío, formulación y envase, a la cual es necesario añadir un reactor de fermentación en estado sólido (ICIDCA posee el diseño de dos variantes de fermentadores ) en condiciones estériles .

Costo de inversión Tabla 5. Costos de Inversión Costo Total (MP) % del Total Equipos 100 80 Construcción 10 8 Montaje 1 1 Otros 13.3 11 Total 124.4 100

Costo de producción

El costo fundamental de la producción recae en la mano de obra siendo el monto de la misma de 66 % del costo de producción lo cual indica una influencia notable en la escala del reactor a emplear. Tabla 6. Costos de Producción % de Incidencias Materias primas 28 Mano de Obra 66 Mantenimiento 1.4 Otros gastos 2.4 Depreciación 2.6 Total 100

Bacterias Nitrofijadoras, Azospirillum sp

Características Las bacterias del género Azospirillum han sido ampliamente estudiadas en los últimos años, aunque hasta el momento no existe un desarrollo comercial extendido de este microorganismo como biofertilizante . Respuestas variables a los ensayos de aplicación en campo se atribuyen a la falta de formulaciones apropiadas y deficiencias en los métodos de aplicación, ademes de no conocer suficientemente el carácter de la asociación de la bacteria con la planta. En estudios recientes se ha considerado que uno de los mecanismos principales en el crecimiento de las plantas a las que se aplica Azospirillum es la capacidad de este microorganismo de producir sustancias promotoras durante la colonización de las raíces por las bacterias, lo cual estimula la longitud, la densidad de las raíces laterales y el incremento del área superficial de las raíces .


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Estos y otros cambios fisiológicos favorecen la mayor adsorción de agua y nutrientes minerales que ayudan al rápido crecimiento de las plantas . También se plantea la fijación no simbiótica de nitrógeno por parte de esta bacteria asociada a las raíces de las plantas. Ya sea uno u otro el mecanismo que provoca el crecimiento de la planta es indudable que el microorganismo debe infestar las raíces y este debe ser el objetivo que debe cumplir un buen formulado . Esto se consigue cuando se garantiza un elevado número de bacteria por gramo del formulado y una alta viabilidad del microorganismo en el suelo que le permita sobrevivir aun en condiciones adversas y colonizar las raíces.

Formulados Microbianos La forma más simple de emplear la bacteria es, tal cual sale del fermentador, pero es también la menos apropiadas ya que requiere mover grandes volúmenes de líquido con peligro de contaminación en el transporte y almacenamiento, por otro lado y lo más importante es que el microorganismo llega al suelo desprovisto de protección, expuesto a los rigores del medio: calor, humedad, microflora, entre otros lo que disminuye considerablemente las posibilidades de supervivencia de las bacterias. La aplicación del inoculante en forma líquida puede ser, sin embargo, deseable en casos que no es posible tratar la semilla botánica y es necesario aplicar el biofertilizante directamente al suelo.

Métodos de propagación y/o crecimiento de la bacteria La mayoría de las bacterias producidas en la industria agroalimentaria y en la farmacéutica se obtienen por fermentación sumergida en biorreactores de diversas escalas con la aereación - agitación adecuada a los requerimientos del microorganismo cultivado y con los accesorios y la automatización necesaria que garanticen las condiciones de fermentación (pH, temperatura, etc.) que demande. Debido a sus requerimientos nutricionales las bacterias del genero Azospirillum pueden producirse económicamente por el método de fermentación en templas o discontinuo (batch). Para la producción por el método de fermentación batch que es el más convencional, el primer paso es la optimización del medio y condiciones de cultivo, esto es también extensivo a la fermentación incrementada (fed-batch) y continua. Sorpresivamente pocos estudios se han dedicado a la fisiología de Azospirillum propagado en fermentadores para la producción de biomasa. Para la producción de biomasa, el crecimiento no debe estar limitado por nitrógeno, lo que implica que se añadan sales de nitrógeno al medio de cultivo. Se requiere un control estricto de la esterilidad puesto que el pH y la temperatura óptimas de Azospirillum permiten el desarrollo de todo tipo de contaminantes potenciales. Los parámetros claves que deben controlarse son:

La composición del medio de cultivo La temperatura El suministro de oxígeno El contenido intracelular de polihidroxibutirato (material de reserva) El estado fisiológico de la bacteria al detener la fermentación

El desarrollo de estrategias de fermentación optimizadas conllevaran a un mejoramiento de la producción de biomasa. El método de fermentación incrementado (fed-batch), en el que los nutrientes se añaden en el medio durante el transcurso de la fermentación, pueden ayudar a alcanzar el estado fisiológico deseado en el medio incrementándose también la productividad de biomasa por lo que tales estudios requieren más atención.


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Formulados Sólidos Se reporta una gran cantidad de microorganismos cuya aplicación al suelo es beneficiosa; como fijadora de nitrógeno (Rhizobium, Azospirillum, Frankia), promotoras del crecimiento de las plantas (Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter), para el incremento de la asimilación de fósforo en el suelo por las plantas (Bacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens). Sin embargo solamente han alcanzado un amplio desarrollo en cuanto a niveles de producción, comercialización y aplicación los formulados de Rhizobium para la fertilización (fijación de nitrógeno) en leguminosas principalmente en soya (Van Elsas y Heijnen, 1990; Roughley y Vicent, 1967; Paau y Brill, 1991). El soporte sólido mayoritariamente empleado es la turba, aunque se ha ensayado e investigado la aplicación de otros como carbón mineral (Halliday y Graham, 1978), suelo mineral (Chao y Alexander, 1984), cachaza (Philpolts, 1976), arcillas (Marshall, 1975), Bentonita (Heijman, 1992; Heijman y Van Elsas, 1988), vermiculita (Graham-Weiss y Bennet, 1987), soportes sintéticos (Dommerges, 1979), lignito (Dube, Namdeo y otros, 1973), Bagazo (Liederman, 1971), compost de suelos (John, 1966), zeolita, cáscaras de mani, tuzas de maíz, aserrín, cáscaras de arroz y cáscara de café entre otros. La turba se ha impuesto gracias a sus favorables características tales como alta capacidad de adsorción y retención de agua, contenido natural de nutrientes, no formación de grumos, facilidad de molida y la naturaleza biodegradable, no tóxica ni contaminante de este material. La búsqueda de otros materiales como soportes está dada por no contar con yacimientos de turba o no disponer de esta con la calidad requerida. El proceso de obtención de un inoculante sobre base turba incluye las siguientes operaciones: acopio y transportación del material, secado, molinado, clasificación, neutralización, envase, esterilización, inoculación y almacenamiento. Inoculantes de Rhizobium de buena calidad para el tratamiento de semillas se obtienen con los siguientes parámetros: turba con mas de 75% de materia orgánica, tamaño de partículas de 200 mesh, esterilización con rayos ganma, humedad 40-60%, población de bacterias no menor de 108 ufc/g, tiempo de duración 6 meses. Se reportan también producciones con turba no estéril. Se ha estudiado la obtención de inoculantes de Azospirillum (Fages, 1990; Fages, 1992) y su aplicación en el suelo (Okon y Lavandera-Gonzalez, 1994). Según este último los datos acumulados durante los últimos 20 años permiten concluir que la inoculación con Azospirillum puede incrementar los rendimientos de diferentes cultivos en diferentes suelos y condiciones climáticas. Los resulatados de la experimentación muestran un 60-70% de éxitos con incrementos en los rendimientos agrícolas de 5-30%, por lo que la inoculación con Azospirillum puede reducir al uso de fertilizantes químicos a proporciones que dependen de la calidad de los suelos utilizados. Se tienen referencias de un inoculante comercial de Azospirillum que con el nombre de GRAMINOSOIL se produce en Uruguay por la firma Lage y Cía (Biofertilizantes GRAMINOSOIL, 1994). Este producto se exporta a Argentina y a Europa.

Formulados Secos Los formulados secos se preparan por deshidratación de las bacterias, lo cual suprime su actividad metabólica y de esta forma mejoran su resistencia al estrés externo y se hacen menos sensibles a la contaminación. Estos inoculantes pueden ser preparados a partir de un liofilizado de bacterias (Rodriguez, 1994), por separación de los microorganismos del medio de cultivo y posterior secado del inoculante (Paau, 1989), encapsulamiento de las bacterias en alginato y posterior deshidratación (Fages, 1990). Muchos de estos formulados se presentan en forma de polvos humedecibles, que luego de resuspendidos en agua se pueden emplear en el tratamiento de semillas o ser asperjadas en el campo. Para su preparación se emplean además otros ingredientes como dispersantes, adhesivos, protectores celulares e inertes.


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Inoculantes Granulados Se preparan también inoculantes granulados para su uso directamente en el campo. Formulados granulados de Rhizobium se preparan a partir de turba con tamaño de partícula entre 40 y 60 mesh. Las dosis de este tipo de inoculante en dependencia del cultivo y tipo de suelo pueden estar entre 5 y 60 Kg por hectárea. En el caso de la bacteria fijadora de nitrógeno Azospirilum sp. se cuenta en la actualidad con un procedimiento tecnológico que permite alcanzar concentraciones de la misma del orden de 1010

cel/ml de medio de fermentación, lo que significa que se encuentra este proceso al tope de la capacidad biológica de producción de la misma. Adicionalmente centros como el INICA, INCA, IIA y el IIS han validado la actividad biológica de los caldos fermentados por el ICIDCA en cuanto a la variable de interés “La capacidad fijadora de Nitrógeno atmosférico”.

Aplicación Agronómica de Azospirillum y su Evaluación El análisis de los resultados acumulados a escala mundial en los últimos 20 años, de experimentos de inoculación en campo con Azospirillum, demuestran que estas bacterias son capaces de promover el rendimiento de cosechas de importancia agrícola, en diferentes suelos y regiones climáticas. Varias cepas de Azospirillum brasilense y Azospirillum lipoferum se han utilizado para inocular cultivos de diferentes especies de plantas. Los datos indican 60-70% de experimentos exitosos con incrementos de rendimiento estadísticamente significativos en el orden de 5-30% (Okon, y otros, 1994).

Tecnología Para La Producción de Inoculantes de Azospirillum Esquemas tecnológicos propuestos Se evaluó la obtención de los productos en dos variantes tecnológicas: Polvo húmedo para impregnación de semillas Polvo humedecible para aspersión en suelo Las tecnologías se han desarrollado sobre la base de turba y cachaza.

Breve descripción de las etapas Secado: Los materiales se secan a la intemperie hasta alcanzar la humedad de equilibrio con el medio. Granulometría: El material se tamiza en cernidor vibratorio para obtener la granulometría deseada. Empaquetado: Los materiales se envasan en bolsas de polipropileno. Esterilización: El material preempaquetado se esteriliza a 1210C durante dos horas. Dos veces con intervalo de 24 horas. A las bolsas se le hace un pequeño agujero para equilibrar las presiones y evitar su rompimiento. El agujero se sella con posterioridad a la segunda etapa de esterilización. Inoculación: Las bolsas se inoculan con licor de Azospirillum procedente del fermentador mediante una jeringuilla estéril. Título del licor > 3 x 109 ufc/ml. Almacenamiento: Las bolsas se almacenan a la temperatura ambiente. Hongos Comestibles (Setas)

Características Los hongos forman parte de un grupo de organismos independientes de los vegetales y de los animales, a los cuales se les denominaron Reino de los hongos o Reino Fungi. Los hongos comestibles son un grupo especial de los hongos, estos carecen de clorofila y por tanto no usan la energía solar para procesar su propio alimento como lo hacen las plantas verdes, sin embargo


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producen un amplio rango de enzimas que degradan sustancias complejas . Estas sustancias complejas se generan anualmente en grandes cantidades en la agricultura y en desechos industriales. El cultivo de los hongos es atractivo porque no necesita espacio de tierra como otras cosechas agrícolas y lejos de contaminar el medio ambiente con residuos transforma estos en alimentos para el hombre. Tienen un alto valor nutritivo, su proteína posee todos los aminoácidos esenciales y con excepción de la soya poseen por ciento de proteínas mas alta que los vegetales y las frutas . Son fuente de minerales, ricos en fósforo, potasio, hierro, sodio, vitaminas B I riboflavina, B2, niacina, biotina, ácido félico y ascórbico. Adicionalmente son deficitarios en grasas y tiene bajo valor calórico. Desde el punto de vista medicinal tienen efecto anticancerígeno, antihipercolesterolémico y antihipertensivo. En ambiente natural crecen en árboles y otras plantas leñosas degradando su madera y destruyéndola. En esta especie ( Pleurotus ostreatus), la parte superior de los cuerpos fructíferos es redonda, su tamaño depende de la edad, pero oscila entre 5 y 15 cm de diámetro. En su parte inferior posee lomillos parecidos a las varillas de un paragua que van desde el pie ó tallo que lo sostiene hasta el borde y en ellos se producen las esporas que son microscópicas, oblongas, casi cilíndricas y están dedicadas a la reproducción de la especie. El tallo es excéntrico, el color de los cuerpos fructíferos depende de la temperatura. En Cuba varía desde blanco a crema o grisáceo . La carne es blanca de olor algo fuerte, tierna al principio y carnosa después.

Usos El consumo de hongos comestibles en la alimentación humana existe desde tiempos remotos. En la actualidad tanto frescos como procesados tienen una gran demanda en los países que los cultivan. En China yJapón se usa además por sus propiedades medicircales y tónica. China también produce cosmeticos y bebidas saludables. El sustrato remanente se utiliza en la alimentación animal, en la producción de biogás y como fertilizante, entre otros.

Proceso Tecnológico Los residuos cañeros secos son procesados mecánicamente hasta lograr un troceado y desfibrado adecuado. Con posterioridad se tratan mediante un proceso con vapor o agua caliente a 90 °C durante 2 horas. De manera opcional podría emplearse una pasteurización del sustrato. Luego se acondicionan hasta la temperatura ambiente incluyéndose desinfecciones con soluciones fungicidas aplicadas entre 0.02 y 0.05 %, con el objeto de disminuir los riesgos de contaminaciones. En la inoculación del sustrato se emplean inóculos preparados a partir de cepas propagadas en medio malta al 3 % E¡. sembrados en diferentes soportes (semillas de trigo, millo, tusas de maíz molida e inclusive los propios residuos cañeros finamente triturados) dando lugar al inóculo de primera generación. Posteriormente, a partir de éste, se inoculan los frascos comerciales o de segunda generación. Una vez inoculado, el sustrato se coloca en sacos de PVC de dimensiones tales que evite un excesivo aumento de temperatura en su interior; los sacos se colocan en unos soportes de estructura para la etapa de crecimiento o colonización, la que se realiza a oscuras ya una temperatura de 26 a 28 ºC dependencia de la cepa empleada. Durante este período el micelio coloniza paulatinamente el sustrato envasado durante unos 10 ó 12 días apartirde los cuales se practican cortes en los sacos y se cambian de manera radical las condiciones ambientar En esta etapa es necesario iluminación, ventilación adecuada y un alto contenido de humedad en los locales de cultivo. Alrededor de 18 6 19 días de haber sido inoculado el sustrato comienza la fructificación de los hongos y a los 22 ó 23 días se recolectan los primeros frutos . Por lo general se recolectan 2 6 3 cosechas como promedio en cada ciclo de aproximadamente 40 días.


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Tabla 7. Composición promedio de Pleurotus (b.s) Humedad 88.51 Proteína cruda (%) 28.87 Proteína real (%) 18.80 Grasa (%) 4.28 Cenizas (%) 6.99 Fibra (%) 14.4 Fósforo (g/kg) 9.4 Magnesio (g/kg) 1.7 Sodio (g/kg) 0.36 Potasio (g/kg) 42.9 Cobre (mg/kg) 11.3 Hierro (mg/kg) 186.5 Manganeso (mg/kg) 11.2 Zinc (mg/kg) 73.0

Los residuos de la cosecha cañera tienen bajo contenido de nitrógeno por lo cual no se obtienen altos rendimientos productivos . El incremento de los rendimientos ha sido un factor a lograr utilizando diferentes vías que han sido objeto de estudio:

Suplementación de los sustratos con nitrógeno Utilización de fitohormonas en los sustratos Mezclas con sustratos mas rico en nitrógeno Utilización de productos estimuladores del crecimiento

Fogura 3. Producción de Hongos Comestibles Insumos Agua Cruda: 5.72 m3 Electricidad: 20.4 Kw-h Vapor: 24 Kg

Aspectos Económicos Costo de inversión Para una instalación capaz de producir 100 toneladas de hongos al año se requiere una inversión estimada de 125.000 pesos. Para dicho costo la estructura es la siguiente: Tabla 8. Costos de Inversión Costo (MP) % del total Equipos 63.0 50.4 Construcción y montaje 50.0 40.0

Sustrato

Tratamiento Térmico Inoculación

Colonización Fructificación

Cosecha

1.75

6.0

Ajuste de humedad

0.3

Inóculo

Ajuste de Humedad

Agua

Sustrato beneficiado

2.9

Hongos Frescos

1.0t


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Otros 12.0 9.6 Total 125.0 100.0

Costos de Producción

Tabla 9.Costos de Producción de Hongos Comestibles % de incidencia Materias primas y materiales 3 Servicios 1 Salarios 53 Otros gastos 19 Depreciación 24 Total 100

Producción Mundial y Precios

Los hongos se producen en aproximadamente 80 países, existiendo en la naturaleza sobre 2,000 especies de más de tres géneros reconocidos como originalmente comestibles y solo seis se producen a escala industrial: Agarfcus bispores, Lentinos edodes, Volvariella Volvacea, Pleurotus spp. y Auricularia spp. En las últimas 2 décadas todas les especies experimentaron un crecimiento en lo que la producción se refiere. En el porcentaje de la producción de los hongos comestibles, Agaricus bisporus y Lentinos edodes, han decrecido como consecuencia del incremento en la producción de otras especies cultivados, en especial las de Pleurotas spp. debido a la baja complejidad de su cultivo y a la variedad de sustratos utilizados . Los principales productores de Pleurotus son: Corea del Sur, Japón, Taiwan, Tailandia, Alemania, Italia y Eslovaquia en Eurasia y en America los Estados Unidos, México, Panamá, Brasil y Cuba, aunque en estos países las producciones no son tan significativos como en Eurasia. Las capacidades de producción son muy variables. Se considera la mayor instalación la de Waiden en Alemania con 4,500 toneladas anuales. Los precios también varían con el área geográfica, aunque generalmente son altos, oscilan entre 5,000 a 6,000 dólares la tonelada de producto fresco. Ácido Jasmónico

Características El ácido jasmónico (AJ) es un regulador del crecimiento vegetal endógeno del tipo de las absicinas del cual se ha descrito recientemente su intervención en un amplio espectro de respuestas fisiológicas en las plantas. El ácido jasmónico con nombre químico: ácido [±] lα, 2β- [Z]-3-Oxo 2- [2- pentenyl] ciclopentano acético, fue aislado por primera vez de un cultivo con Lasiodiplodia theobromae (hongo tropical) mostrando su efecto regulador en el crecimiento de plantas. Su fórmula empírica es Cl2H18O3 de peso molecular 210, siendo un aceite amarillo viscoso en su estado puro, soluble a temperatura ambiente en cloroformo, acetato de etilo, acetona y éter. Su punto de ebullición es de 125°C a una presión de 0.001 mm. El ácido jasmónico que se produce en las instalaciones del ICIDCA, es un producto biológico obtenido mediante un cultivo estático en presencia del hongo Botryodiplodia theobromae que posee las siguientes características : Concentración de AJ 1,000 mg 1-1 pH 8.0 Color púrpura Densidad 1 .0019 gcm-3 Sólidos 1.05


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Cenizas 0.17

Usos El ácido jasmónico posee una amplia gama de efectos en las plantas tales como: estimulación de la formación de tubérculos, incremento de los rendimientos agrícolas, estimulación de la maduración de los frutos, inhibe la formación de pigmentos, promueve senescencia de las hojas, entre otras. Sin embargo, las funciones mejores documentadas y que han ganado interés en la literatura mundial en los últimos años son las relacionadas con la regulación en la defensa de las plantas que comienza al producirse en éstas una herida por ataque de patógenos. Se ha detectado que al sufrir un daño mecánico por alguna de las causas anteriores se activa la trascripción de un grupo numeroso de genes con funciones de protección por la síntesis de sustancias de defensa como el inhibidor de las proteasas y la tripsina. Se ha podido demostrar que la adición exógena de AJ estimula la formación de estas sustancias en diversos cultivos y constituye un medio de protección efectivo a nivel básico con alfalfa, papa, tomate y tabaco. En Cuba, el ácido jasmónico ha sido evaluado éxitosamente en diversos cultivos, obteniéndose los siguientes resultados:

Incremento del rendimiento en los cultivos de fresa que oscilan entre el 15 y 20 Se logró un incremento del rendimiento en tomate en condiciones de verano, obteniéndose

un aumento del número y masa fresca de los frutos y además de un estado sanitario muysatisfactorio de las plantas del área tratada con respecto al control.

Se realizaron experiencias en condiciones de campo en el cultivo de papa proveniente de la semilla sexual donde se logró incrementos en el rendimiento y mayor altura de las plantas con respecto al testigo.

En el cultivo de toronjas en la Isla de la juventud se adelantó la maduración de estos frutos con vistas a situarlo en el mercado internacional en la época de gran déficit del producto.

Se realizó la aplicación de este producto en papa (variedad Diament) lo cual incrementó el rendimiento por una elevación del peso del fruto en un 35% en las plantas tratadas con respecto al control.

En el cultivo de piña (var. Cayena lisa) en Ciego de Ávila controló de modo significativo el ataque de la Chinche harinosa que representa la plaga más dañina al cultivo por constituir 9,1 agente propagador del virus Will.

Con respecto al cultivo de la caña de azúcar, incrementó la germinación de los embriones por el aumento del %de supervivencia de los mismos en 4.5 veces con relación al control. En las vitroplántulas se obtuvieron incrementos del 2 % en el cierre de estomas y la inducción del aclimatación dulas vitroplántulas. En caña planta incrementó un 36 %de germinación por encima del testigo.

Proceso Tecnológico El proceso de obtención del ácido jasmónico no presenta grandes complejidades, el mismo comprende solamente dos etapas, la síntesis del producto y posteriormente la filtración al vacío. El procedimiento diseñado permite obtener en síntesis concentraciones altas de AJ empleando un cultivo batch estático con los consiguientes ahorros de energía y con un medio de cultivo barato y sencillo sin necesidad de un inductor externo. La fermentación es realizada utilizando un cultivo estático , donde inicialmente el microorganismo (B. Theobromae) una vez concluida su etapa de crecimiento es inoculado al medio nutriente en forma de micelio e incubado a 30 °C durante 10-12 días en la oscuridad.


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El medio de cultivo contiene como fuente de carbono la sacarosa, nitrato de potasio o sodio y el fosfato monobásico de potasio como fuentes de nitrógeno y fósforo respectivamente más el complemento de sales. El pH es ajustado entre 5.4-5.6. Concluida la fermentación el medio es separado del micelio mediante filtración al vacío o centrifugación. Figura 4. Esquema tecnológico de la Producción de Ácido Jasmónico Condiciones Medio: Sacarosa KNO2

KH3PO4 Sales

Temp.: 30ºC Cultivo Estático pH: 5.4-5.6 Tiempo: 10-12 días Tabla 10. Costo de Ácido Jasmónico para una producción de 600l a-1 Materiales Cantidad g l-11 Precio g-1 Importe US $ Sacarosa 50 0.01 0.5 Nitrato de Potasio 3 0.04 0.32 Fosfato de Potasio 0.2 0.1 0.02 Sulfato de Magnesio 0.2 0.02 0.01 Cloruro de Potasio 0.1 0.03 0.01 Sulfato de Hierro 0.01 0.14 0.01 Sulfato de Zinc 0.01 0.05 0.01 Sulfato de Manganeso 0.001 0.06 0.01 Molibdato de Sodio 0.001 0.26 0.01 Sulfato de Cobre 0.001 0.38 0.01 Subtotal 0.91

Otros gastos (agua, electricidad, combustible, imprevistos) 20% del subtotal 0.18

Subtotal 1 .09 Otros gastos variables (se asume un 50 % de los fijos) 0.55

Subtotal 1 .64 Purificación 6.56

8.20 US g-1 Precio SIGMA de AJ 400.00 US g-1 Diferencia contra precio SIGMA 391 .80 US Salarios 15,765 pesos por año 23. 87pesos g-1

Conservación cepa

Inóculo micelio Fermentación

Caldo fermentado Filtración al Vacío

Producto FinalÁcido

Jasmónico


Alcohol

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5. Alcohol…………………………………………………………………………….. Características El término alcohol utilizado se refiere al alcohol etílico de fórmula C2H5OH, conocido también como etanol, metil carbinol o alcohol de caña o de granos. Es un líquido incoloro, transparente, volátil, de olor etéreo, sabor picante y miscible en agua y diferentes líquidos orgánicos. Se emplea en la industria destilado con diferentes grados de pureza según su destino. Normalmente, se comercializa en forma hidratada (de 95 a 96 %) o anhidra (mayor de 99 % de volumen). Se obtiene por síntesis química donde existen abundantes recursos fósiles o por vía fermentativa a partir de la caña de azúcar (jugos o melazas), maíz u otros granos o residuos agrícolas . Sus propiedades fundamentales son las siguientes:

Usos Desde el inicio de los años 70, a causa de la crisis energética, el alcohol ha tomado auge. El uso fundamental ha sido como sustituto de la gasolina debido a que sus mezclas aumentan el octanaje de forma adicional y permite reducir el empleo de plomo tetraetilo, que posee acción cancerígena. Adicionalmente la sustitución total de la gasolina por alcohol permite reducir en los gases de escape el monóxido de carbono y óxido de nitrógeno, los cuales son altamente nocivos. Otros usos importantes del alcohol son: antiséptico, solvente, agente preservante y precipitante, disolvente de nitrocelulosa, gomas, resinol, jabón, aceites esenciales, drogas, ceras, en la elaboración de bebidas alcohólicas y muchos otros productos. Últimamente, ha ganado interés el empleo del etanol como materia prima para la fabricación de sustancias químicas. En Brasil, se emplearon con estos fines 454,000 m3 durante 1984. Proceso Tecnológico La producción de alcohol por vía fermentativa se basa en la conversión de hexosas en etanol según: Hexosas + Levadura > Etanol + CO2 + Levadura

(Desprendimiento de calor)

La levadura además de ser el elemento que cataliza la reacción, constituye un producto inevitable de la misma pudiéndose disminuir su reproducción, pero no eliminarla totalmente. El etanol puede ser producido a partir de tres tipos principales de materiales biológicos. a) Materiales portadores de azúcares simples (tales como: caña de azúcar, melazas, sorgo dulce, etc.) el cual contiene carbohidratos simples como fuente de azúcares.

Punto de ebullición (°C) 78.4 Densidad (d4

20) 85.1 Kgm-3 índice de refracción (nd

-20) 1.3633 Viscosidad a 20°C 1.23 gm.s-1 Tensión superficial 0.223 x 10-3Jcm-1 Calor específico (calg 1°C) 2.43 Jg-10 C Calor de evaporación (calg-1) 0.853 JKg-1 Calor de combustión (kcalmol-1) 1372 Kjmol--1 Punto de inflamación (°C) 18.3 °C


Alcohol

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b) Almidones: (tales como yuca, maíz, papa, etc.) los cuales contienen carbohidratos en forma de almidones como fuente de azúcares . Figura 1.Esquema de Producción de Alcohol Etílico

c) Materiales lignocelulósico: tales como la madera, residuos agrícolas, etc,cuyos carbohidratos se encuentran de formas más complejas como celulosas, hemicelulosas y lignina. La producción de alcohol a partir de estos materiales generalmente incluye tres etapas fundamentales: primero la conversión de carbohidratos en azúcares simples o a imilables por los microorganismos productores de alcohol, después la fermentación de estos azúcares a etanol y finalmente la separación de alcohol y finalmente la separación de alcohol y otros productos por destilación. Las materias que contienen sacarosa son convertidas de forma directa en hexosas por la acción de la enzima invertasa producida por la propia levadura en el transcurso del proceso. La miel final de caña se diluye con agua, se ajusta el pH con ácido sulfúrico y se le añade nitrógeno y fósforo en forma de sales solubles. La levadura proveniente de un cultivo puro de laboratorio se propaga mediante pasos sucesivos estériles en condiciones aeróbicas hasta obtener volúmenes de 1 a 2 m3 Se aumenta la biomasa en el prefermentador con un volumen que oscila entre 10 y 20% del fermentador. En esta etapa se añade miel con una concentración de azúcares de unos 100 gl-1 en condiciones no estériles. Cuando la levadura se encuentra a mediados de la fase de crecimiento es inoculada en el fermentador, donde comienza la fermentación alcohólica en condiciones anaeróbicas con una concentración de azúcares de 150 a 160 gl- 1. El esquema representa el caso en que se emplea miel final como fuente de carbohidratos en condiciones no estériles. La levadura crece simultáneamente con la producción de alcohol por espacio de unas 20 horas. La velocidad de fermentación aumenta de forma rápida hasta alcanzar el máximo al término de las 15 horas. La producción de alcohol continúa entonces a una

Preparación del Sustrato

Fermentación

Destilación

Miel

Alcohol

Urea Sulfato de Amonio

Ácido Sulfúrico

CO2

Agua

Pérdidas


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velocidad decreciente, concluyendo el ciclo de 24 a 30 horas de fermentación, para obtener una concentración final de alcohol de 6 a 7 % de volumen. Tanto la producción de levadura como la de etanol son reacciones exotérmicas, por lo que es necesario eliminar el calor desprendido en el transcurso de la fermentación y mantener la temperatura cerca del óptimo (de 33 a 34 °C); de lo contrario la temperatura aumenta hasta 40 ó 42 °C con sensibles pérdidas en el rendimiento. Se considera un índice apropiado de liberación de calor el de 287 Kcal l-1 de etanol formado. Una planta dispone de 8 a 10 fermentadores que operan desfasados, a intervalos de 3 a 4 horas, para garantizar la alimentación continua al sistema de destilación de alcohol. El líquido fermentado es descargado en un tanque de balance capaz de absorber las fluctuaciones del proceso de destilación. La productividad típica de un proceso discontinuo clásico en batch es de 1.8 a 2.5 g de etanol por litro de fermentador en una hora. Esta productividad puede aumentarse de manera sensible si se recircula la levadura producida en el fermentados o se emplea la fermentación continua. En estos casos los valores típicos se encuentran entre 5 y 8 g de etanol por litro de fermentador por hora. El alcohol obtenido es separado de la miel fermentada mediante la destilación. Este proceso tiene lugar normalmente en dos o más columnas de destilación, en las cuales de forma adicional son separados otros compuestos orgánicos tales como ácidos, aldehídos, ésteres, etcétera. La miel fermentada se alimenta a la primera columna, donde es sometida a un agotamiento del alcohol mediante arrastre de vapor. Los vapores alcohólicos del tope (40 a 50 °GL) contienen una cantidad considerable de componentes no alcohol, de los cuales gran parte se elimina con la posterior rectificación. En la columna rectificadora se extraen impurezas volátiles por el tope, alcohol por el cuarto plato, alcoholes superiores por la parte media de la columna y por el fondo, ácidos orgánicos junto a las aguas residuales. Una variante del proceso discontinuo es la recirculación de levadura en el que, al finalizar la fermentación, se procesa el sustrato fermentado a través de una separadora centrífuga. La crema de levadura obtenida se recircula al fermentador para disminuir el consumo de azúcar y reproducirla. Por otra parte, esto permite elevar la concentración inicial de levadura, aumentar la productividad y reducir el número de fermentadores instalados: En una fábrica de Sáo Joáo en Brasil se alcanza una productividad global de 6.41 de alcohol m-3.h en fermentadores de 350 m3 en una fermentación continua en simple etapa con recirculación. Aspectos Económicos

Costo de inversión El valor de inversión de una planta de producción de alcohol-fino de 600 hectolitros diarios (49 t) es el siguiente: Tabla 1. Costos de Inversión Costo Total (MP) % del Total Equipos 3.7 77 Construcción y montaje 0.6 13 Otros 0.5 10 Total 4.8 100

Costo de producción

El costo de producción del alcohol de alta calidad presenta la estructura siguiente: Tabla 2. Costos de Producción % de incidencia Materia prima y materiales 68


Alcohol

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Salarios 2 Otros gastos 23 Depreciación 7 Total 100

El principal componente en el costo de producción es la miel final que representa más del 50 % del costo total. El valor de la materia prima y el uso del bagazo como combustible son factores determinantes en la economía de la producción. La obtención de subproductos de la producción de alcohol puede mejorar la rentabilidad global del proceso. Los principales son el dióxido de carbono que se obtiene con un alto grado de pureza y se emplea en la carbonatación de aguas, refrescos y cervezas; la levadura Saccharomyces de 40 a 45 % de proteína, rica en vitaminas y sales minerales es un excelente producto para la fabricación de piensos y forrajes. Producción de Alcohol con Células Inmovilizadas A partir de 1960 comienza en forma explosiva la utilización dé las células y enzimas inmovilizadas en el desarrollo de tecnologías bioquímicas, con el propósito de incrementar los rendimientos y la productividad de los procesos para obtener beneficios económicos sustanciales. Entre las tecnologías que han marcado el paso en las investigaciones se destaca la producción de alcohol con células inmovilizadas que abarca una gran cantidad de trabajos desde laboratorio hasta planta piloto. Sin embargo, existe un número reducido de publicaciones sobre las tecnologías industriales de este proceso a nivel mundial. En general los procesos desarrollados para la producción de alcohol con células inmovilizadas son continuos o discontinuos, empleando como soportes alginatos, canagenima, avena, bagazo y astillas de madera, entre otros. En el ICIDCA, se desarrolla un proceso de producción de alcohol utilizando astillas de madera como soporte de las levaduras, mediante un sistema continuo de producción caracterizado por constar de dos etapas: la primera de propagación de las levaduras y adsorción de éstas al empaque y la segunda propiamente de producción de alcohol. En la primera etapa, las levaduras se multiplican y se adsorben a las astillas de madera (empaque). Esta parte del proceso se caracteriza por ser muy aireada de 0.5 a 1 V.V.M siendo la composición del medio la siguiente: azúcar reductor (AR), base miel final (MF) 100 gl-1; (NH4)2S04 38 gl-1; (NH4)2HP04 9.6 gl-1. Tiene una duración de 8 a 12 horas y se da por terminada cuando el Brix se hace constante en su valor más/bajo. Esta etapa se realiza una sola vez en el período de producción, el cual puede llegar a varios meses de trabajo interrumpido. La producción de alcohol transcurre a muy bajos niveles de aeración (0.05 a 0.1 VVM con la composición del medio siguiente: AR (base MF) de 120 a 140 gl-1, (NH4)2SO4 1.6 gl-1 y (NH4)2 HP04 0.2 gl-1. Esta etapa se reduce en lo adelante a la carga del medio fresco y la descarga del mismo a las pocas horas, listo para ser destilado. El calor generado durante la reacción es retirado por recirculación del mosto a través de un intercambiador de calor a una velocidad de 0.5 a 1.0 volumen de medio/hora, lo cual permite mantener la fermentación a la temperatura óptima y lograr una agitación suave, lo suficiente para remover las burbujas de C02 ocluidas en el empaque sin que se desprendan las levaduras del soporte. La recirculación se efectúa tomando el medio por la parte inferior y revertiéndolo por la superior del reactor en forma de ducha. La distribución y composición de los materiales en el reactor de células inmovilizadas de 2 m3 de capacidad (piloto) es la siguiente:


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Tabla 3. Distribución y composición de los Materiales Volumen de empaque 0.3 m3 Volumen de Medio 1 m3 Alcohol inicial 15 ml l-1 Alcohol final 23 ml h-1 Productividad total (media) 10-15 ml l-1 Tiempo de fermentación 4-7 horas

Aspectos Económicos

Costo de inversión El costo de inversión de una planta industrial de 2,900 hl día-1 de etanol 95 % sería de: Tabla 4. Costos de Inversión Inmobilizados % del total Batch % del total Capital fijo (MMP) de el 8 100 25.6 100 Área de fermentación 2.1 26 18.8 73 Alcohol final (MMP) 23 ml h-1 Inmovilizado/Batch (%) 31 100

Se destaca la elevada incidencia que tiene el área de fermentación en el costo de la planta con el sistema de batch, así como el ahorro que implica la utilización del sistema de células inmovilizadas.

Costo de producción El análisis del costo de producción para ambos sistemas sería: Tabla 5. Costos de Producción Inmovilizados % Batch % Costo total 100 100 Fermentación 12 56

La mayor incidencia está dada por el área de fermentación con un costo de más de cuatro veces para el sistema batch. Empleo de Antibióticos en la Fermentación Alcohólica En la década del 60 se comenzó el empleo de antibióticos en la fermentación alcohólica en varios países. En Cuba se han hecho pruebas industriales en la destilería J.A Echeverría en 1970 y la destilería Habana en 1985, con resultados satisfactorios en todos los casos. Los antibióticos usados en la destilería Habana fueron penicilina y Ampicilina en concentraciones de 1 ppm y Oxitetraciclina en 2 ppm. Los antibióticos utilizados eran de baja calidad, es decir, su pureza había disminuido durante el almacenaje por lo que no estaban aptos para el consumo humano o animal. Al emplearlos, el nivel de contaminación disminuyó más de 50 veces y el rendimiento alcohólico se incrementó más de 7%. Sin embargo para que su uso sea eficaz se recomienda el uso alterno de estos. En el caso anterior se empleó de la forma siguiente: durante 5 días se añadió Penicilina ó Ampicilina y después se usó Oxitetraticlina el mismo lapso de tiempo, pues a partir del séptimo día las bacterias contaminantes se hacen resistentes a un antibiótico en particular y neutraliza el efecto de éste, con la consecuente pérdida de sus beneficios. El cambio del tipo de antibiótico restablece las condiciones anteriores en la fábrica.


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Aspectos Económicos Las ventajas económicas del empleo de antibióticos en la fermentación alcohólica están dadas por: a) El ahorro de miel final al tener un incremento de eficiencia en el rendimiento alcohólico de 7 %. b) El incremento en la producción de alcohol. Para una producción de alcohol de 440 hl día-1 y 275 días de operación anual, el beneficio económico sería: a) Ahorro de miel 52 % ART = 34.8 kg hl-1 de alcohol Valor de la miel ahorrada = $ 1,566 hl-1 de alcohol Consumo de antibióticos Como se consume penicilina y tetraciclina en la mitad de la producción, el consumo final sería: Penicilina = I , 1365 g hl-1 de alcohol Tetraciclina = 2,2725 Costo de antibióticos = $ 0,1023 hl-1 de alcohol Beneficio económico = miel ahorrada - consumo de antibióticos

=$ 1,4637 hl-1 de alcohol = $ 177 108 año4

b) Incremento de producción = 30.8 hl día-1 Valor de la producción adicional de alcohol Beneficio económico = Incremento de alcohol

= $ 63949 año- Beneficio económico total = a + b = $ 241,057


Levadura

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6. Levaduras………………………………………………………………………… Introducción Bajo la denominación de levaduras se estudian las que se propagan, especialmente, para ser usadas en alimentación, ya sea humana o animal, con vistas a aprovechar los componentes nutricionales que la constituyen, sobre todo proteínas y vitaminas. Los géneros preferidos de levadura para su producción industrial son: Candida y Saccharomyces, mencionándoselas especies Candida utilis, C. pulcherrima, C. reukauffi, Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y S. fragilis. La elección de una cepa para que pueda ser desarrollada industrialmente debe considerar los siguientes factores: 1. Capacidad de asimilación de diferentes sustratos 2. Elevados rendimientos, 3. Alta velocidad de desarrollo, 4. Estabilidad bioquímica y de cultivo 5. Fácil recuperación, 6. Valor nutricional elevado, sabor agradable y buena apariencia. La experiencia mundial ha probado la posibilidad de utilización de: 1. los licores sulfíticos, 2. melazas, 3. hidrolizados de madera y de residuos celulósicos, 4. hidrocarburos, 5. residuos de almidón, 6. suero de leche, 7. mieles cítricas, etc., como fuente de carbono para esta producción. De los microorganismos que se deben utilizar se ha mostrado favorecido el uso de la especie Candida utilis, ya no solamente por su capacidad en asimilar hexosas y pentosas, sino también otros compuestos orgánicos no azúcares, tales como ácidos, alcoholes y aldehídos. Sin embargo, no es exclusivamente levadura forrajera y de la industria del pan las que se producen para nutricionales, sino también se destina aquellas que se obtiene como subproducto de otros procesos fermentativos, tales como la producción de alcohol etílico (levadura de destilería) y de la fabricación de cerveza levadura de cerveza). La levadura, en estos procesos, se le llama, en general, "levadura secundaria' y tiene un valor nutricional un poco más bajo que la que se propaga; específicamente para uso alimenticio. En los países tropicales, poseedores de una amplia industria azucarera de caña, la producción de levadura forrajera, a partir de mieles finales, y/o otros subproductos o efluentes de la industria, resulta particularmente atractiva, sobre todo si se logra producir a niveles que sean competitivos con sus productos sombra, fundamentalmente proteínas vegetales de bajo costo, tales como la soja. Es, además, una forma de amortiguar las variaciones del mercado exterior, en cuanto a la importación de materiales proteínicos adecuados. Estos factores, así como el de ser una producción localizada, de complejidad tecnológica media, que diversifica la industrialización de la caña de azúcar y, además, de generar fuentes de empleo.


Levadura

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La producción de levadura forrajera, se caracteriza por ser un proceso continuo en el cual la miel aporta carbohidratos como fuente de energía y factores de crecimiento en forma de vitaminas y minerales. Esta producción se efectúa mediante 5 unidades de proceso, básicas:

1. Preparación de materias primas y auxiliares. 2. Propagación de la levadura. 3. Separación o recuperación de la levadura. 4. Concentración y secado de la levadura. 5. Envase, almacenamiento y manipulación.

Esquemas Tecnológicos Figura 1. Producción de levadura prensada y levadura seca. Levadura Seca activa

Fermentación

Separación

Filtrado y prensado

Miel

Levadura prensada

Efluente

Efluente

Secado en lecho fluidizado

Levadura activa

Vapor


Levadura

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Figura 2. Producción de Levadura Torula Levadura torula a partir de otros sustratos

Fermentación

Separación y lavado

Termólisis y concentración

Miel

Secado y ensacado

Fosfato diamónico Urea

Sulfato de amonio Agua

Vapor

Levadura

Agua

Vapor Antiespumante

Nitrógeno P2O4

Levadura

Azúcares

Efluentes

Agua

Recepción

Filtración

Enfriamiento

Fermentación

Agua

Levadura


Levadura

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Materias Primas y Auxiliares En esta producción se consideran como materias primas fundamentales las fuentes de carbono y energía y las sales nutrientes, aunque se utilizan otras en el proceso, que pudieran denominarse auxiliares, tales como agentes antiespumantes, ácidos o álcalis, productos de limpieza, de tratamiento de agua, combustible, lubricantes, etc. Miel Final de Caña La melaza es un substrato que por su naturaleza -ya que contiene gran número de impurezas en forma coloidal y de suspensión, así como ácidos orgánicos volátiles y una flora microbiana elevada-, puede afectar el proceso de propagación de la levadura en aspectos fundamentales, como son el rendimiento y la calidad de la misma, así como a otros parámetros no menos importantes, en los fermentadores. Por las razones expuestas anteriormente esta materia prima debe ser sometida a un tratamiento previo antes de su utilización en los fermentadores como veremos con posterioridad Otras Corrientes del Proceso de Fabricación de Azúcar Los jugos acompañantes a los lodos del proceso de clarificación de los jugos de caña, denominados por esta industria como, “JUGO DE LOS FILTROS”, con un contenido adecuado de azucares y que representan entre un 16 al 18 % del jugo del proceso de producción de azúcar, así como el jugo de los últimos molinos de los esquemas tradicionales de extracción de azúcar (tandem), cuya concentración en azucares es baja, constituyen una materia prima ideal para la producción de levadura, constituyendo corrientes indeseables en la producción de azúcar, por su incidencia en la calidad de azúcar producida, y en el esquema energético de esta industria. Efluentes de la Producción de Alcohol Las sales nutrientes aportan al medio, para propagar las levaduras en los fermentadores, la mayor parte del nitrógeno y fósforo requeridos para el desarrollo del microorganismo. Las empleadas en nuestra industria de levadura forrajera son el sulfato de amonio y la Características principales requeridas en las sales nutrientes Sulfato de amonio 19 % (min) Urea 46 % (mín.) Fósforo (P,O5) 19 % (min.) Fosfato diamónico 49% (min.) Humedad 10% (mix.) Levadura Torula

Características La levadura Torula es un forraje valioso por su alto contenido proteico y su relación proteína/carbohidrato que es mayor que en otros forrajes vegetales. La proteína unicelular de levadura se puede considerar intermedia entre la mejor proteína vegetal y la del huevo. Es altamente valorada por su calidad y contenido proteico. Dado el alto por ciento de lisina, la levadura resulta ideal como suplemento de vegetales pobres en este aminoácido esencial, sin embargo, a causa de su deficiencia en aminoácidos sulfurados -cistina y metionina- no debe ser usada como única fuente de nitrógeno. Tabla 1. Características físicas y composición química de la levadura Torula de mieles. Densidad de bulto (Kg m-3) 0.0045 Ángulo de reposo 45º Humedad (%) 6-8


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Proteína bruta b.s. (%) 45-50 Ceniza (%) 7-10 Fósforo (%) 3-4.4 Grasa y lípidos (%) 1-1.5 Carbnohidratos totales (%) 20-30

Usos

La levadura Torula se utiliza como fuente proteica en todas las especies animales, aún cuando los mejores resultados son con proteína de origen animal, cada vez es más amplio el uso de la levadura como suplemento proteico. En Cuba constituye un renglón exportable y de consumo interno, fundamentalmente, para la formulación de piensos en la alimentación avícola. Con la línea de desarrollo y diversificación de esta industria y la introducción de nuevas cepas de levadura en determinados casos, el uso perspectivo se extenderá a otros productos, algunos de ellos más valiosos que el actual y que contribuirán a una gran rentabilidad de esta industria, entre ellos: levadura desnucleizada para consumo humano, ácido nucleico (RNA), autolizado de levadura para medios de cultivo y como saborizante, levadura invertasa y miel proteica.

Proceso Tecnológico La producción de levadura Torula, a partir de mieles, se caracteriza por ser un proceso del tipo convencional, en el cual la miel aporta carbohidratos como fuente de carbono y energía, factores de crecimiento en forma de vitaminas y minerales, pero que es necesario complementarla con nitrógeno y fósforo con forma de soluciones de sales inorgánicas y orgánicas. La preparación de la miel que se alimenta a los fermentadores, consiste en una dilución hasta 43 ó 45 Bx, esterilización de 110 a 120 °C, y clarificación por centrífugas desenfanguizadoras . La posterior dilución a la entrada de los fermentadores, sobre la base de un rendimiento biomasa-sustrato de 50 %, es a una concentración de 20 a 50 g l-1 de azúcares reductores totales (ART), en dependencia de si el fermentador es de baja o alta eficiencia. Las sales nutrientes se preparan diluyéndolas con agua, las cuales regulan además el pH de fermentación . Las cantidades suministradas de nitrógeno y fósforo son para lograr 50% de proteína y 3% de P2O, en la levadura. El proceso de crecimiento de la levadura es continuo, aeróbico y exergónico, por lo tanto, se hace necesario el suministro de grandes volúmenes de aire, así como disponer de algún sistema para disipar el calor biológico. La aerobiosis se logra con sopladores de lóbulo del tipo roots. La capacidad de estos equipos se encuentra entre 8,000 y 16,000 m3h-1 de aire a una presión de 0.3 a 0.45 kgcm -2. La temperatura adecuada para la fermentación es de 33 a 35 °C, se puede obtener con las superficies de intercambio calórico de los fermentadores y agua fría suministrada por los sistemas externos de enfriamiento. La concentración de levadura en el fermentador es como promedio de 10 a 25 g l-1 1, en dependencia del tipo de tecnología empleada. el nivel de emulsión formada en los fermentadores se controla mediante el tanque de desemulsión, por sistemas mecánicos y agentes químicos (antiespumante), que se adicionan en este tanque y en los fermentadores de forma automática o manual . El mosto agotado y desemulsionado es bombeado a las separadoras centrífugas, donde se obtienen cremas de levadura entre 50 y 100 g FI(primera etapa de separación). Estas se lavan por dilución con agua hasta unos 30 g l-1 de levadura y se bombea a la segunda etapa de separación en la cual se obtiene crema de 150 g l-1. Los fluentes o claros de separación se pueden enviar al sistema de residuales. La crema de la segunda etapa de separación se bombea a los termolizadores donde se realiza el proceso de termólisis a una temperatura de 80 a 85 °C. Posteriormente se concentra en evaporadores de película descendente y doble etapa al vacío. La crema termolizada y concentrada hasta unos 240 gFl de levadura es bombeada a un secador por atomización. El polvo seco de levadura (5 a 8 % de humedad) es recolectado por un sistema de ciclones y transportado a la tolva de


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almacenamiento. Un sistema de tornillo sinfín transporta la levadura hasta los embudos alimentadores de las ensacadoras pesadoras. La levadura se envasa en sacos de papel valvulados, multicapas.

Aspectos Económicos Costo de inversión Tabla 2.El costo de inversión de una planta de levadura Torula de 12,000 t/d es el siguiente: Costo total (MMP) % del total Equipos 8.4 50 HumedaConstrucción y montaje 5.8 35 Otros 2.5 15 Total 16.7 100

Los precios de la levadura Torula se determinan de acuerdo con productos similares comercializados internacionalmente . Se establecen relaciones con la harina de pescado y de soya sobre la base de sus contenidos de proteína.

Capacidad Instalada y Producción La levadura Torula se obtiene a partir de diversas materias primas. Actualmente, se produce levadura Torula en Sudáfrica, Filipinas, Tailandia y Taiwán. En Cuba, la producción de levadura Torula se inició en 1965 con una planta de 30 t/d de producto seco. Con posterioridad, en 1973 fueron adquiridas 10 plantas que ampliaron las posibilidades de producción en 120,000 t adicionales.


Glosario

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7. Glosario………………………………………………………………….………… Autólisis: Es el proceso de enzimatizar la auto-digestión o la ruptura del tejido fino de la célula de la planta o del animal privada de nutrientes. Muerte celular.

ADN (DNA): Ácido desoxiribonucleico. La molécula de ADN está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.

Aminoácido: molécula orgánica que contiene los grupos amino y carboxilo. Son los monómeros de las proteínas. De su diversidad como del enorme número de combinaciones y longitudes resulta la enorme variedad de proteínas existentes.

Aminoácido esencial: aminoácido que no puede ser sintetizado por el propio organismo. De los 20 aminoácidos necesarios en las proteínas humanas, solamente son esenciales los 8 siguientes: leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina.

AN: Hay dos tipos de ácidos nucleicos (AN): el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), y están presentes en todas las células. Su función biológica no quedó plenamente demostrada hasta que Avery y sus colaboradores demostraron en 1944 que el ADN era la molécula portadora de la información genética.

ARN (RNA): Ácido ribonucleico.

ATP: Aunque son muy diversas las biomoléculas que contienen energía almacenada en sus enlaces, es el ATP (adenosín trifosfato) la molécula que interviene en todas las transacciones de energía que se llevan a cabo en las células; por ella se la califica como "moneda universal de energía". Catalizar: Causar o provocar un proceso o una reacción de cualquier tipo. Célula: Unidad mínima de un organismo capaz de actuar de manera autónoma. Todos los organismos vivos están formados por células, y en general se acepta


Glosario

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que ningún organismo es un ser vivo si no consta al menos de una célula. Esporulación: Una división asimétrica, durante la cual el futuro protoplasto de la espora recibe el material nuclear correspondiente. A diferencia de una división común, el estrangulamiento del protoplasto de la célula materna no es seguido por el de la pared celular entre los dos protoplastos hijos. Represión catabólica: Cantidades adecuadas de glucosa, previenen la expresión de genes que expresan proteínas necesarias para la fermentación de otros numerosos catabolitos como la lactosa, arabinosa y galactosa, aún cuando están en concentraciones elevadas. Previene el gasto de energía en sistemas enzimáticos que no se utilizan.

Enzima: Catalizador biológico, normalmente una proteína, que mediatiza y promueve un proceso químico sin ser ella misma alterada o destruida. Son catalizadores extremadamente eficientes y muy específicamente vinculados a reacciones particulares.

Fermentación: Conversión biológica anaeróbica (sin oxígeno) de las moléculas orgánicas, generalmente hidratos de carbono, en alcohol, ácido láctico y gases, mediante la acción de ciertos enzimas que actúan bien directamente o como componentes de ciertas bacterias y levaduras. En su uso más coloquial, el término hace referencia a menudo a bioprocesos que no están estrictamente relacionados con la fermentación.

Metabolismo: Es el conjunto de transformaciones químicas y físicas necesarias para la transformación de los alimentos en parte integrante de la materia viva. Para estas transformaciones es necesaria la presencia de energía.

Microorganismo: Organismos microscópicos pertenecientes por regla general a virus, bacterias, algas, hongos o protozoos.

Nucleótido: Monómero de los ácidos nucleicos, integrado por la combinación de una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azúcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. Se obtiene como producto de la hidrólisis de ácidos nucleicos por acción de nucleasas.

Potencial redox: Son las relaciones de oxígeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energía y sintetizar nuevas células sin recurrir al oxígeno molecular.

Proteína: Biomoléculas formadas por macropolímeros de aminoácidos, o macropolipéptidos. Actúan como enzimas, hormonas y estructuras contráctiles que atribuyen a los organismos sus propias características de tamaño, potencial metabólico, color y capacidades físicas.


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Pseudomonas: Las bacterias del grupo al que pertenecen Pseudomonas está constituido por microorganismos Gram-negativos, siempre móviles con flagelación polar. Se encuentran normalmente en el suelo, aunque pueden ser patógenos oportunistas en animales (Ps. aeruginosa) y patógenos de plantas (Ps. syringae).

Torula: Proteína Unicelular obtenida a partir del procesamiento de la Candida utilis.Tiene un alto calor nutricional y puede utilizarse como tratamiento ambiental par alas aguas residuales de agroindustrial como la de la producción de azúcar, alcohol, madera, etc.

Bioproducto: Se define como un producto comercial o industrial, diferente a la comida, y fármacos, que se obtiene a partir de un proceso biológico o renovable ya sea este a partir de plantas animales o materiales forestales o marinos. Son un subsector de los productos biotecnológicos que incluyen además todos aquellos elementos desarrollados para su aplicación en alimento o a nivel farmacéutico.

Organoponia: Técnica para la instalación de huertos orgánicos en la ciudad.

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