MÉTODOS DE ANÁLISIS OPTIMIZACIÓN · Estrategias de optimización Procedimientos seguidos cuando...

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

Dra. Beatriz Hernández Carlos

MÉTODOS DE ANÁLISIS

OPTIMIZACIÓN

Maestría en Ciencias: Productos Naturales y Alimentos

Análisis Químico Cuantitativo

Estrategias de optimizaciónProcedimientos seguidos cuando intentamos optimizar una formulación, proceso, producto o un método analítico

Objetivo: Encontrar las condiciones óptimas para un número dado de factoresFactor: Parámetro que establecemos (a un nivel dado) y que afecta la respuesta o los resultados de un método.“Factores interactúan” ej. la interacción con un segundo factor ocurre cuando la influencia del primer factor, sobre la respuesta es diferente a diferentes niveles del segundo factor

En caso de que solo un factor necesite ser optimizado, un procedimiento univariado simple esdesarrollado.Cuando se tienen dos o más factores para optimizar se usa una estrategia de optimización univariada o multivariada.

Procedimiento clásico univariado: OVAT Una variable a un mismo tiempo Desventaja: las interacciones entre factores no son tomadas en cuentaAproximaciones multivariadas se dividen en secuenciales y simultaneasSecuenciales: conducen a pocos experimentos y los resultados definen los siguientes experimentos, están limitados a la optimización de solo una respuestaSimultáneos: se realizan un número predefinido de experimentos de acuerdo a un diseño experimental bien definido Análisis Químico Cuantitativo

Diseño de superficies de respuestaSon usados para encontrar los niveles óptimos de los factoresmás importantes. Los factores son examinados al menos atres niveles. Las condiciones optimas son derivadas desuperficies de respuesta construidas con los resultados deldiseño.Diseño de mezclas: son diseños de superficies de respuestausados cuando todos los factores examinados estánrelacionados a mezclas, ejemplo, los modificadores orgánicosen una fase móvil o los excipientes en una tableta.Con los resultados de un diseño de superficie de respuesta,un modelo polinomial es construido, éste describe la relaciónentre la respuesta y los factores considerados.

𝑦 = 𝛽0 +

𝑖=1

𝑓

𝛽𝑖 𝑥𝑖 +

1≤𝑖<𝑗

𝑓

𝛽𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 +

𝑖=1

𝑓

𝛽𝑖𝑖 𝑥𝑖2

y = respuesta; 𝛽0 intercepto, 𝛽𝑖 coeficiente principal; 𝛽𝑖𝑖 coeficiente cuadrático, i y j son los factores


Este modelo es usado para encontrar las condiciones adecuadas y no para propósitos predictivos como lo son los modelos de calibración multivariado.

Diseño de experimentos: es un programa experimental para evaluar simultáneamente diversos factores a unnumero definido de niveles en un número predefinido de experimentos. Los diseños experimentales se dividen endiseños examinadores (factorial total, factorial fraccional, Plackett-Burman), diseños de superficie de respuesta ydiseño de mezclas.


Diseño de la matrix, matrix experimentalConcepto clave, consiste en una serie de experimentos desarrollados bajo diferentes condiciones.

Modelo: Describe los datos experimentales mediante una relación matemática entre los factores o variables independientes (ej temperatura) y una respuesta o variables dependientes. Una ecuación típica para tres factores podría tener la siguiente forma:

𝑦 = ( 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎)

𝑏0 + (𝑢𝑛 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜)

𝑏1𝑥1 + 𝑏2𝑥2 + 𝑏3𝑥3 + (𝑇é𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑟𝑒𝑠 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 )

𝑏11𝑥12 + 𝑏22𝑥2

2 + 𝑏33𝑥32 + (𝑇é𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟á𝑡𝑖𝑐𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑟𝑒𝑠 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠)

𝑏12𝑥1𝑥2 + 𝑏13𝑥1𝑥3 + 𝑏23𝑥2𝑥3 (𝑇é𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠)Análisis Químico Cuantitativo

𝑏0 + (𝑢𝑛 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜)

𝑏1𝑥1 + 𝑏2𝑥2 + 𝑏3𝑥3 + (𝑇é𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑟𝑒𝑠 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 )

𝑏11𝑥12 + 𝑏22𝑥2

2 + 𝑏33𝑥32 + (𝑇é𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟á𝑡𝑖𝑐𝑜𝑠 𝑑𝑒𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑡𝑟𝑒𝑠 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠)

𝑏12𝑥1𝑥2 + 𝑏13𝑥1𝑥3 + 𝑏23𝑥2𝑥3 (𝑇é𝑟𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠)

Es un promedio de ciertas circunstancias. Término importante debido a que la respuesta promedio no es normalmente alcanzado cuando los factores se encuentran en su valor promedio.

Permite ver una relación directa entre la respuesta y un factor dado

Es importante , porque permite la curvatura, esto es una manera de obtener máximos y mínimos

Son necesarios porque la influencia de dos factores sobre la respuesta es raramente independiente

Justificación de términos:


Renglones se refieren a los experimentosColumnas se refieren a los parámetros en el modelo matemático o ecuación relacionando la respuesta a los valores de los factores individuales

Se tienen 20 experimentos y 10 columnas como los 10 parámetros del modelo

Para una ecuación con 10 parámetros o términos:

𝑦= 𝑏0 + 𝑏1𝑥1 + 𝑏2𝑥2 + 𝑏3𝑥3 + 𝑏11𝑥1

2 + 𝑏22𝑥22 + 𝑏33𝑥3

2 + 𝑏12𝑥1𝑥2

+ 𝑏13𝑥1𝑥3 + 𝑏23𝑥2𝑥3


𝑦 = 𝑏0 + 𝑏1𝑥1 + 𝑏2𝑥2 + 𝑏3𝑥3 + 𝑏11𝑥12 + 𝑏22𝑥2

2 + 𝑏33𝑥32 + 𝑏12𝑥1𝑥2 + 𝑏13𝑥1𝑥3 + 𝑏23𝑥2𝑥3


Validation de la curva de calibración para determinar CCβNormalityIndependencehomoscedasticity means a situation in which the variance of the dependent variable is the same for all the data.


Optimización de las condiciones analíticas y validación de un método fluorescente para la determinación de sulfadiazina en leche

Capacidad de detección CCβConcentración permitida 100 μg/kg músculo, hígado riñón y leche

1. Efecto de los factores experimentales (Diseño factorial)Factores: Temperatura de reacción, cantidad de fluorescamina y tiempo de derivatización.Respuesta: Intensidad de fluorescencia es considerada de tres maneras: a) Como una señal de orden cero, la máxima fluorescencia (univariada)b) Señal de primer orden: El registro del espectro de emisiónc) Señal de primer orden: El registro del espectro de excitación

2. Validación del método analítico


Espectros derivados se usan para mejorar las diferencias entre espectros, para resolver bandas de sobrelapamientos en análisis cualitativo y más importante para reducir los efectos de interferencias de la matrix u otros compuestos que absorban en el análisis cuantitativo.


Determinación de CCβPor una prueba de una cola (para decidir de la existencia del analito en una muestra)Hipótesis nula que la señal del blanco no es analito x=x0

Hipótesis alterna x >x0

α es la probabilidad de un falso positivo (que el analito se observe cuando no está presente)β es la probabilidad de un falso negativo (que el analito no se observe cuando si esta presente)Se estimó CCβ tomando en cuenta la curva de calibración para transformar las señales a concentraciones:

𝐶𝐶𝛽 =∆ 𝛼, 𝛽 𝑤𝑥0

𝜎

𝑏

Donde ∆ 𝛼, 𝛽 es el valor crítico de una distribución t no central relacionadas a las probabilidades α,β; 𝜎 es la desviación estándar residual de la línea de regresión y 𝑏 es la pendiente. 𝑤𝑥0

se define como

en la siguiente ecuación y depende de la posición de los estándares, xi, en la curva de calibración y estaes inversamente proporcional al número de replicados de la muestra, K, y al número de estándares en elmodelo de calibración, I.

𝑤𝑥02 =

1

𝐾+

1

𝐼+

𝑥0 − 𝑥 2

𝑖=1𝐼 𝑥𝑖 − 𝑥 2


Diseño factorial 23 con dos replicados en cada punto; un blanco para las correspondientes condiciones experimentales fue medido en cada punto del diseño. Para evaluar si existe perdida del ajuste se evalúan 3 replicados para cada temperatura con valores intermedios de fluorescamina y tiempo de derivatización.NAS = señal neta del analito. λexcitación 395 nm y λemisión 485 nmAnálisis Químico Cuantitativo

ResultadosLa selección de los niveles extremos de los factores (25 y 35°C, 50 y 100 microlitros fluorescamina, 10 y 20 tiempo de reacción) del diseño fueron efectuados previamente. Diseño factoral usado fue 23 con dos replicados en cada punto del diseño. Para evaluar la falta de ajuste se hicierontres replicados de temperatura y tiempos de reacción en su valor medio.Un blanco para las condiciones experimentales fue medido en cada punto del diseño.El diseño resultante tiene valores de factores de inflación de la varianza d(u) aceptables (entre 1.54-1.8) y la funciónde la varianza entre 0.14 y 0.33.Para una estimación exacta de los efectos e interacciones de los factores, VIF debe estar entre 1 y 4-7 (de acuerdo a los autores) y la función de varianza debe tener el menor valor possible para lograr predicciones exactas.

variance inflation factor (VIF) quantifies the severity of multicollinearity in an ordinary least squares regression analysis. It provides an index that measures how much the variance (the square of the estimate's standard deviation) of an estimated regression coefficient is increased because of collinearity (Collinearity is a linear association between two explanatory variables).

𝑦 = 𝑏0 + 𝑏1𝑥1 + 𝑏2𝑥2 + 𝑏3𝑥3 + 𝑏12𝑥1𝑥2 + 𝑏13𝑥1𝑥3 + 𝑏23𝑥2𝑥3 + 𝑏123𝑥1𝑥2𝑥3 + 𝜀

x1 temperatura; x2 fluorecamina; x3 tiempo de reacciónLos replicados permitieron evaluar la significancia estadística del modelo y el error


Tres diferentes respuestas que se analizarán con el mismo diseño experimental. En el caso 1 (Máxima intensidad a longitudes fijas de excitación y emisión 395 y 485 nm, respectivamente), la respuesta de la variable es la diferencia entre la intensidad de la fluorescencia de la muestra (buffer, sulfadiazina y flurescamina) y la intensidad del blanco (buffer más flurescamina).


Análisis de la respuesta neta del analitoEsta se calcula a partir de una señal multivariada x (buffer más analito más flourescamina) y de la señal correspondiente al blanco y, como una norma euclediana de un complemento ortogonal de x con respecto a y

NAS la parte del espectro única del analito de interés

La NAS se calcula a partir de la señal multivariada (buffer + fluorescamina + analito) y el blanco (buffer + fluorescamina) como la norma Euclideana del complemento ortogonal de x respecto a y:


𝑦 = 𝑏0 + 𝑏1𝑥1 + 𝑏2𝑥2 + 𝑏3𝑥3 + 𝑏12𝑥1𝑥2 + 𝑏13𝑥1𝑥3 + 𝑏23𝑥2𝑥3 + 𝑏123𝑥1𝑥2𝑥3 + 𝜀

Los valores de probabilidad (valores p) de la prueba de hipótesis para la significancia de cada modelo son 0.0003, 0.001, 0.0003 univariado, emisión y excitación = todos los modelos explican la variabilidad de las respuestas correspondientes

Para la falta de ajuste, los valores p de la prueba de hipótesis correspondiente fueron 0.69, 0.44 y 0.27 para univariado, emisión y excitación. Otra vez, a un nivel de significancia del 5 %, los tres modelos no tienen perdida del ajuste.La variancia explicada por el coeficiente de determinación, R2, es 0.98, 0.96 y 0.98, respectivamente.

Los coeficientes estimados (b1, b2, b3, etc.,) son graficados.


El coeficiente b2 es significante y positivo =la concentración alta de fluorescaminaproduce la mayor respuesta (pero saturaráel detector)El coeficiente b1 negativo para latemperatura = la menor temperaturaproduce la mayor respuesta 22°CEl coeficiente b3 (tiempo) es positivo ysignificativo en a y b, =el mayor tiempo dederivatización 20 min


Validación X0= 0 μg/L

Modelos de calibración1- calibración univariada2. Modelo bilinear PLS con el espectro de emisión y con el espectro de excitación PLS partial least-squares regression (análisis discriminante). CalibraciónEncuentra una variable que maximiza el valor de xc (x = información experimental, c= información de la concentración) o el producto del dato experimental modelado y la concentración modelada, a menudo llamado covariancia. En términos físicos PLS asume que los errores en ambos bloques (c y x) son de igual importancia. Usa combinaciones lineales de las variables predictivas más que de las variables originalesPLS2 bilineal es usado cuando dos variables están correlacionadas una con otra

La mejor CCβ es obtenida con los espectros de emisión y excitación, 4.3μg/l comparada con 6.1 μg/l del modelo univariadoCCα 2.2 μg/l con los espectros de emisión y excitación


Veracidad del métodoSi no hay sesgo, las relaciones entre las concentraciones encontrada y adicionada, es lineal y la pendiente es 1 con intercepto de cero


Precisión se evaluó bajo condiciones de repetibilidad en el rango de concentraciones estudiado


Repetibilidad = la desviación estándar y es igual a la desviación estándar “pooled” (Syx) del

procedimiento en el rango donde el análisis es hecho porque ahí se observa la homoscedasticidad

de varianzas a diferentes niveles de concentración

homoscedasticity means a situation in which the variance of the dependent variable is the same

for all the data.

Bartlett´s and Cochran´s TestAnálisis Químico Cuantitativo

¿El método es adecuado para el análisis en muestras reales?


Ensayos colaborativos y análisis de varianzaEn el siguiente cuadro se muestran los resultados obtenidos por cuatro analistasque determinaron la pureza de un preparado farmacéutico de sulfinilamida.Indique si la diferencia en sus resultados es significativa con α=0.05. Si existediferencia calcule los valores de las varianzas del analista y sistemática delmétodo

Analisis Analista A Analista B Analista C Analista D

1 94.09 99.55 95.14 93.88

2 94.64 98.24 94.62 94.23

3 95.08 101.1 95.28 96.05

4 94.54 100.4 94.59 93.89

5 95.38 100.1 94.24 94.95

6 93.62 95.49


Varianza entre 34.76Varianza dentro 0.631F 55.08Fcrit 3.16Varianza analista 0.631

𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑜2 =

1

𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒2 − 𝑠𝑑𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜

2

𝑛 = 𝑖=1

ℎ 𝑛

ℎnúmero medio de repeticiones por analista

𝑠𝑠𝑖𝑠𝑡2 =

𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑒2 − 𝑠𝑑𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜

2

𝑛


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