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Heidy Pérez, Vicente L. Sánchez

Propuesta de diseño de monitoreo ambiental microbiológico para diagnóstico de niveles de contaminación en

áreas de procesamiento aséptico

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. 44, núm. 3, septiembre-diciembre, 2010, pp. 7-14,

Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar

Cuba

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ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de

Azúcar,

ISSN (Versión impresa): 0138-6204

revista@icidca.edu.cu

Instituto Cubano de Investigaciones de los

Derivados de la Caña de Azúcar

Cuba

www.redalyc.orgProyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

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Heidy Pérez1 y Vicente L. Sánchez2

1. Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de AzúcarVía Blanca 804 y Carretera Central, San Miguel del Padrón, La Habana, Cuba

heidy.perez@icidca.edu.cu

2. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) Ave. 31 entre 158 y 190, Cubanacán, La Habana 10600, Cuba

RESUMEN

El monitoreo ambiental está diseñado para demostrar el control de partículas viables yno viables en un área crítica, en este caso solo se hace referencia a las viables. Dentrode estas áreas se incluyen el flujo laminar, los laboratorios y otras áreas limpias. El ensa-yo de partículas viables se realiza para bacterias, levaduras y hongos. Con el objetivo demantener las áreas seguras y en las condiciones requeridas, es preciso chequear elambiente de las mismas mediante el monitoreo de las superficies, del aire y del perso-nal. El método empleado para ejecutar el muestreo de superficie es mediante el uso deplacas de contacto tipo Rodac. Para el monitoreo del aire se utiliza el método pasivo opor sedimentación y en el personal se utiliza el método de placa de contacto. Las direc-tivas internacionales existentes, avaladas por organismos y entidades reguladoras, esta-blecen los niveles de acción microbiológica para cada condición de muestreo las cualesdependen también del tipo de área aséptica o limpia que se desee monitorear. En estesentido, se propone un diseño para ejecutar los diferentes tipos de muestreo en el depar-tamento de microbiología, específicamente en las cabinas de flujo laminar, cuarto desiembra y cámara fría.

Palabras clave: monitoreo ambiental, control microbiológico, calidad ambiental, áreasasépticas.

ABSTRACT

Environmental monitoring is intended to show the control of viable and non viable par-ticles in critical areas. In this case only viable ones are referred. Among these areas lami-

INTRODUCCIÓN

En el mundo actual donde el interés delos laboratorios de las diferentes áreas de lamicrobiología es mantener controladastodas las variables que intervienen en susprocesos, tiene particular importancia elmonitoreo microbiológico ambiental(MMA) como una herramienta útil para elcontrol de los laboratorios y el monitoreo delas operaciones que se realizan durante unensayo. Adicionalmente, por requerimien-tos de los sistemas de calidad y para lograrel cumplimiento de los requisitos derivadosde las buenas prácticas de laboratorio; elmonitoreo ambiental microbiológico estávinculado al aseguramiento de la calidadmediante el cual se obtienen evidenciasdocumentadas para demostrar que un pro-ceso conduce a resultados de calidad dentrode las especificaciones predeterminadas.

Existe una estrecha relación entre lacalidad y el monitoreo ambiental debido aque la calidad conlleva al control, a la mejo-ra de los resultados de un ensayo, de unproducto o de un proceso y el monitoreoambiental controla el ambiente de las áreasde trabajo para asegurar la calidad.

En tal sentido, el diseño de un monito-reo ambiental microbiológico se lleva a caboprincipalmente para conocer bajo qué con-diciones microbiológicas se realizan deter-minadas operaciones que necesitan ser con-troladas, así como obtener informaciónsobre las condiciones microbiológicas de lasáreas y tomar acciones que permitan mante-ner dichas áreas bajo un estricto control

sobre la calidad ambiental. De esta manera,facilita realizar actividades de procesamien-to aséptico con las máximas garantías deseguridad.

El monitoreo microbiológico es un pro-cedimiento que nos permite determinar elcontenido microbiano de áreas, superficies,personal, equipo y otros. Un aspecto a con-siderar, es que el monitoreo ambiental nosólo se requiere para la elaboración de pro-ductos estériles, sino también para los pro-ductos no estériles.

Mantener un control microbiológicoambiental es indispensable para asegurar lacalidad de los productos elaborados y es uníndice del estado higiénico del ambienteque rodea a las instalaciones. Se aplica paralocales cerrados y limpios donde el númeroy variedad de microorganismos desarrolla-dos deben ser bajos y pocos. Es importantetener en cuenta, que las estrategias de moni-toreo se establezcan de acuerdo al área osuperficie a muestrear.

El cumplimiento de directivas tantonacionales como internacionales existentesse encuentra en manos de un grupo deorganismos y entidades regulatorias talescomo: el Centro Nacional de SeguridadBiológica (CSB), el Centro para el ControlEstatal de la Calidad de los Medicamentos(CECMED), la Organización Internacionalde Estandarización (ISO), la OrganizaciónMundial de la Salud (OMS), laAdministración de Alimentos y Drogas(FDA), la Agencia Europea deMedicamentos (EMEA), entre otras. Estasdirectivas establecen los niveles de acción

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nar flows, laboratories and other clean areas. The assay for viable particles is carried outfor bacteria, yeast and fungi. Aiming to keep the areas safe and in proper conditions, it isnecessary to verify the whole environment through the monitoring of surfaces, air andpersonnel. The applied method to carry out surface sampling is through the use of con-tact Rodac-type plates. For air monitoring the passive or sedimentation method is usedand for personnel contact plate methods is applied. International standards are suppor-ted by regulatory organisms and entities that set up the microbiological action levels foreach sampling purpose (air, surface and personnel), which also depend on the kind ofaseptic or clean area that has to be monitored. In such a sense, a design is proposed fordifferent sampling types in microbiology department, especially in laminar flow cabinets,inoculation rooms and cold chamber.

Key words: environmental monitoring, microbiology control, environmental quality,aseptic areas.

microbiológica para cada condición demuestreo del aire, la superficie y el perso-nal. Esto depende del tipo de área a monito-rear sea aséptica o limpia, así como los con-troles necesarios a realizar bajo condicionesde estado en reposo o en operación.

Sobre la base de este conocimiento, el tra-bajo cumple el objetivo de proponer un dise-ño para realizar el monitoreo ambientalmicrobiológico en áreas de procesamientoaséptico del departamento de microbiologíadel Instituto Cubano de Investigaciones de losDerivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA).

Definición de tipos de áreas

Es imprescindible conocer las caracterís-ticas de cada área donde se realicen trabajosde monitoreo, control y evaluación de unensayo, proceso o producto, así como lascondiciones en las que se requieren mani-pular los mismos para lograr una adecuadacalidad. Las áreas que se utilizan para estosfines se relacionan a continuación:

Área limpia: Área que cuenta con un con-trol definido del ambiente respecto a lacontaminación microbiana o por partícu-las, con instalaciones construidas y utili-zadas de tal manera que se reduzca laintroducción, generación y retención decontaminantes dentro del área (1).

Cuarto limpio: Diseñado, mantenido y con-trolado para prevenir contaminaciónmicrobiana o por partículas de los pro-ductos.

Área aséptica (figura 1): Área limpia, dise-ñada y construida para minimizar la con-

taminación por partículas viables y noviables y mantenerla dentro de límitespreestablecidos (2).

Área crítica: Área limpia donde el producto,envases primarios y cierres estériles seexponen a condiciones ambientalesdiseñadas para preservar la esterilidad(2). En dichas áreas de trabajo debe asegu-

rarse que las condiciones ambientales, bajolas cuales se realizan los ensayos microbio-lógicos, no invaliden los resultados delensayo. Otros elementos importantes, son lalimpieza, desinfección e higiene de las áreaspara eliminar la posibilidad de contamina-ciones en todas las etapas del ensayo, pro-ceso o producto.

Es por esto, que uno de los factores aconsiderar durante la elaboración de unproducto es la contaminación provenientedel ambiente donde se está preparando, yasea producción en gran escala, como sehace en los laboratorios e industrias, o enpequeña escala como ocurre en la oficina defarmacia. Esta contaminación se debe a laspartículas presentes en el aire, las cualespueden provenir del suministro del mismo,del personal y las desprendidas por losequipos y demás superficies del área de tra-bajo.

Un equipamiento imprescindible dentrode estás áreas lo constituyen las campanasde flujo laminar, las cuales pueden ser ver-ticales u horizontales y deben ser colocadasen ambientes controlados sin corrientes deaire que pueden perturbar el flujo unidirec-cional. En el ICIDCA, se cuenta con unacampana de flujo laminar vertical cuyo fil-tro HEPA, está colocado en la parte superiorde la campana y el flujo de aire se desplazahacia la parte inferior de la misma dondehay rejillas que permiten su salida. Dichodispositivo tiene el inconveniente de prote-ger al producto, pero no al personal ni almedio ambiente.

Monitoreo microbiológico ambiental

El monitoreo ambiental en un laborato-rio de microbiología debe evaluar tanto lacalidad microbiológica del aire (3) como la ade la superficie (4). Es por esta razón, quelos niveles de microorganismos en aire ysuperficies se establecen en base al riesgo

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Figura 1. Ejemplo de área aséptica.

de contaminación del producto o proceso.Para esto es necesario determinar límites deacción, los cuales son definidos como losniveles que al ser excedidos, indican que elproceso se ha desviado de sus condicionesnormales de operación. El rebasarlo implicatomar una acción correctiva, para que elproceso regrese a sus condiciones normalesde operación.

Existen suficientes indicios de que enáreas de oficinas, laboratorios, almacenaje yservicios generales coexisten sustanciascapaces de alterar sus propiedades físico-químicas y proveer las condiciones necesa-rias para el desarrollo y crecimiento demicroorganismos que alteran las propieda-des biológicas del aire, lo cual puede origi-nar efectos nocivos sobre la salud de las per-sonas y sobre los materiales, dependiendode la concentración y permanencia de estassustancias en el ambiente (5-8).

La cuantificación del riesgo potencial enambientes de trabajo se basa en la determi-nación de la exposición y su comparacióncon los límites establecidos en las normati-vas vigentes. Para llevar a cabo el monitoreoambiental, deben establecerse límites dealerta y de acción apropiados. Estos límitesdeben determinarse teniendo en considera-ción que el objetivo principal es detectar con-diciones que se alejen del comportamientohabitual del ambiente productivo (9).

Basado en lo anterior, es útil determinarlos valores de alerta y de acción a partir delcomportamiento histórico, tanto para áreasdonde se elaboran productos no estériles,donde las normas no establecen límites dereferencia, como para aquellas utilizadas enla elaboración de productos estériles, en lascuales los límites establecidos puedenresultar menores a los recomendados porlas disposiciones vigentes, permitiendo unmayor control microbiológico del ambiente.

Estrategia del monitoreo microbiológicoambiental

Dentro de los parámetros microbiológi-cos monitoreados por excelencia se encuen-tran el aire, las superficies y el personal. Enel caso del aire, se realizan conteos de partí-culas viables (microbiología) mientras quepara la superficie y el personal se determinala contaminación microbiana en el equipa-

miento, las superficies de trabajo, paredes ypisos.

El programa de monitoreo ambiental esmás amplio que el monitoreo microbiológi-co ambiental, que se trata en este trabajo.Dicho programa incluye monitoreo de ruti-na para partículas en el aire tales como via-bles y no viables. En ambientes industrialeslas partículas viables son generalmente lasde más preocupación en el producto estéril,sin embargo, las partículas no viables tam-bién deben supervisarse como un indicadorfiable de los sistemas de control medioambientales (10, 11).

Monitoreo del aireLa evaluación de la calidad microbioló-

gica del aire puede realizarse mediantemétodos activos y pasivos.

Los métodos activos o volumétricos utili-zan dispositivos para tomar un volumen defi-nido de aire y luego determinar las unidadesformadores de colonias (UFC) presentes enél. Un ejemplo de estos dispositivos es el cen-trífugo de Reuter, el cual tiene una turbinaque aspira el aire y hace que las partículasimpacten sobre una tira de agar colocada enla pared interna de la turbina. Es un disposi-tivo portátil y funciona con baterías (12).

Un sinnúmero de investigaciones se handesarrollado en el campo del muestreomicrobiológico del aire desde el punto devista volumétrico, han permitido llegar aimportantes conclusiones (13) y a continua-ción se resumen las siguientes:1. La muestra mínima en superficies es de

100-125 cm2, a causa de la distribuciónno homogénea de los microorganismos.En el aire el número de muestreos debeser la raíz cuadrada del volumen de lasala y el muestreo mínimo y máximo porplaca debe ser 200 L.

2. No existe correlación entre los recuentosde superficies y los del aire que las rodeapor la aparición de un factor que distor-siona contundentemente los resultados:la carga microbiana de las personas. Porello, deben realizarse muestreos de aire ytambién de superficies.

3. A menor caudal de muestreo, menorvelocidad de impacto, menor efecto rebo-te y mayor recuperación de microorga-nismos.Tradicionalmente, los muestreos del

aeroplancton se venían realizando median-

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te el método llamado de sedimentaciónpasiva, el cual es cualitativo, a lo sumosemicuantitativo y sus resultados se dan enUFC por placa (14).

El otro método más empleado en elmonitoreo del aire es el pasivo o por sedi-mentación en placas de Petri. En este méto-do los microorganismos viables presentesen el aire, son llevados a la superficie delmedio sólido por las corrientes de aire pre-sentes en el área. Es un método fácil de rea-lizar y económico que nos permite obtenerinformación sobre los microorganismoscapaces de sedimentar en el aire (15).

El aire es monitoreado mediante unmétodo microbiológico pasivo aplicando latécnica de placa expuesta donde ocurre lasedimentación de partículas del aire. Dichatécnica consiste en exponer al ambiente laplaca de Petri que contiene el medio AgarTriptona Soya (ATS) en un período de 1 a 4horas. Pasado este tiempo, se incuba laplaca de 3 a 5 días a las temperaturas entre30 y 35 ºC, cuyo resultado indica el conteode colonias expresado como unidades for-madoras de colonias (UFC) por placa portiempo de exposición. La figura 2 muestra elprocedimiento para el método de placa

expuesta para el monitoreo de contamina-ción aérea.

Las técnicas actuales para el monitoreode partículas viables en el aire están limita-das (16) por:a)- El equipamiento disponible.b)- El tiempo necesario para demostrar la

presencia de microorganismos en lamuestra del aire tomada.

c)- La incapacidad para re-probar el ambien-te de un modo oportuno para la garantíade los resultados.

d)- Las dificultades en el monitoreo conti-nuo del ambiente debido a las considera-ciones tales como secar fuera de losmedios de cultivos.

Monitoreo de superficiesEn la evaluación de la calidad microbio-

lógica de las superficies se emplean el méto-do de hisopado y el de placa de contacto(Rodac) (15).

El método de hisopado utiliza un hisopohumedecido, el cual se frota en tres direc-ciones sobre un área predeterminada, luegose coloca en un diluente para liberar losmicroorganismos presentes y de allí se tomauna alícuota y se siembra en un medio sóli-do. Este método se utiliza para superficiesirregulares o de difícil acceso.

Por otra parte, el método de la placa decontacto (Rodac) cuenta con placas llena deun medio nutritivo sólido con una superficieconvexa que se presionan sobre la superficieplana a evaluar. Es utilizado para superficiesplanas. Algunas de las desventajas de estemétodo es que no se utilizan para superficiesirregulares, si el medio es humedecidopuede ocurrir la concurrencia de microorga-nismos y el residuo del medio puede ser eli-minado del sitio de la muestra (16).

Las superficies son monitoreadas pormétodos microbiológicos a través de la téc-nica por placa de contacto tipo Rodac. Eldesarrollo de esta técnica comienza a partirde placas Rodac con medio Agar ATS y sehace contactar la superficie con el agar paraluego incubar en las condiciones indicadasen la figura 3 y los resultados se expresancomo UFC por placa.

Supervisión del personalEl personal es el principal componente

en las actividades de un área y la principalfuente de contaminación. Por lo tanto, el

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Figura 2. Técnica de placa expuesta empleadaen el monitoreo del aire.

monitoreo del personal constituye un buenindicador de la disciplina tecnológica delmismo y es recomendable realizarlo al finalde las operaciones críticas y del proceso.

Dicho personal debe estar adecuada-mente entrenado, capacitado y documenta-do acerca de todos los conocimientos nece-sarios para trabajar en áreas asépticas dondese aplican técnicas microbiológicas, de bue-nas prácticas de laboratorio, el uso de losmedios de protección, así como la higiene yhábitos personales.

El método microbiológico empleado parael personal es de acuerdo a la técnica deplaca de contacto (Rodac) por impresión demanos enguantadas. Dicha técnica tienecomo principio los pasos que se muestran enla figura 4, y consiste en la impresión de loscinco dedos de cada mano enguantada. Losresultados se expresan en UFC por guantes.

Propuesta de diseño de un monito-reo ambiental microbiológico enáreas de procesamiento asépticodel departamento de microbiologíadel ICIDCA

Método pasivo o por sedimentaciónMuestreo del aire por la técnica

de placa expuesta.Toma de muestra: Se exponen pla-cas de Petri (o sea se abren las pla-cas) en el área de trabajo y duranteel proceso de siembra.Áreas a monitorear o zonas de tomade la muestra: Cabinas de flujo lami-nar, cuarto de siembra y cámara fría.Medio de cultivo: Agar TriptonaSoya (ATS).Tiempo de exposición: Durante 2horas.Tiempo y temperatura de incuba-ción: Luego de la exposición al aire,las placas se cierran e incubandurante 5 días a 30 ºC.Frecuencia de realización de loscontroles: Estado de reposo semanaly en estado de operación, el tiempoque dure la misma. Criterio de conformidad: Bajo flujolaminar se establece que para estatécnica sea < 3 UFC/placa/4h, segúnlo establecido en el anexo 4 de laregulación No. 16-2000 (2).

Muestreo de superficiesMuestreo de superficies por placa de

contacto tipo Rodac.Toma de muestra: Destapar las placas yponer en contacto el agar con el área dela superficie a muestrear en el estado dereposo y al finalizar la operación. Superficies a monitorear: Superficiesinteriores de las cabinas de flujo laminar,piso y paredes del cuarto de siembra y dela cámara fría.Medio de cultivo: Agar Triptona Soya.Tiempo y temperatura de incubación:Luego del muestreo de las superficies, lasplacas se cierran e incuban durante 5días a 30 ºC.Frecuencia de realización de los contro-les: Estado de reposo semanal y en esta-do de operación, al finalizar la misma.Criterio de conformidad: Bajo flujo lami-nar se establece que para esta técnica sea

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Figura 3. Técnica por placa de contacto tipo Rodacpara el monitoreo de superficies.

Figura 4. Técnica por placa de contacto tipo Rodac parael monitoreo del personal.

< 3 UFC/placa, según lo establecido en elanexo 4 de la regulación No. 16-2000 (2).Las superficies del cuarto de siembra y lacámara fría no son áreas clasificadas.

Muestreo del personalMuestreo de manos enguantadas por

placa de contacto tipo Rodac.

Toma de muestra: Destapar las placas eimprimir los cinco dedos de cada mano enel agar al finalizar la operación.

Parte a monitorear: Los cinco dedos de cadamano.

Medio de cultivo usado: Agar TriptonaSoya.

Tiempo y temperatura de incubación: Luegodel muestreo de las manos enguantadas,las placas se cierran e incuban durante 5días a 30 ºC.

Frecuencia de realización de los controles:Al finalizar una operación semanalmente.

Criterio de conformidad: Bajo flujo laminarse establece que para esta técnica sea < 3UFC/guantes, según lo establecido en elanexo 4 de la regulación No. 16-2000 (2).

CONCLUSIONES

La puesta en práctica del monitoreomicrobiológico ambiental es una herra-mienta que permite caracterizar desde elpunto de vista microbiológico en qué condi-ciones realizamos las diferentes operacio-nes bajo flujo laminar. La prescripción tantodel grado de contaminación del aire comode la higiene de los equipos y del personalson necesarias para establecer un control deinspección higiénico sanitario y llevar acabo un programa de limpieza y desinfec-ción. En este sentido, la aplicación del dise-ño propuesto y sus resultados servirán paracontrolar y tomar las acciones preventivas ycorrectivas necesarias para mantener la cali-dad ambiental.

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