8/14/2019 MODIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

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MODIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Marco terico

La tirosinasa del champin

Es la enzima responsable del proceso de melanizacin en los animales y del pardeo enlas plantas; haciendo de esta caracterstica un tema de especial nfasis en procesos detransformacin y almacenamiento de productos vegetales. Su actividad modifica elaspecto y sabor de stos productos, por lo que tiene una favorable importanciaeconmica al evitar o favorecer su actividad en perodos determinados. Posee unaactividad cataltica doble, siendo capaz de hidroxilar los mono fenoles a o-difenoles con

oxgeno molecular (monofenolasa) adems es capaz de oxidar los o-difenoles a o-quinonas con oxgeno molecular tambin (difenolasa).

Procedimiento

Materiales y reactivos

Espectrofotmetro - colormetro. Bao termosttico.

10 g de championes. 1 g de arena de mar lavada. Tampones fosfato 100 mM de pH 6, 7, 7.5 y 8. Tampn acetato 10 mM de pH 3.6, 4 y 5. Catecol 5 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. Catecol 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. Catecol 5 mM en agua destilada.

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cido cinmico 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5.

Mtodos

Aislamiento de la enzima

Fragmentar el material biolgico y centrifugar posteriormente. En un mortero con 1 gaproximadamente de arena de mar lavada triturar 10 g de champin durante 10minutos. A continuacin se aaden 30 ml de tampn de fosfato 100 mM pH 7 y sehomogeniza durante 10 minutos. Centrifugar la mezcla a 10000 x g durante 30 minutos.El sobrenadante es la fuente de enzima, almacenar a 4 C. Si no se dispone decentrifuga filtrar al vaco con embudo Buchner, el filtrado es la fuente de enzima, sealmacena a 4 C.

Medicin de la actividad difenolasa

Mezclar en una cubeta de 1 cm de peso ptico, 1 ml de catecol 5 mM con 1 ml detampn de acetato 10 mM de pH 5. Aadir 0.1 ml de extracto enzimtico y medir lavariacin de absorbancia a 390 nm de longitud de onda en el intervalo de 30 a 90segundos (formacin de o-benzoquinona).Para el clculo de la Actividad enzimtica se utiliza un = 1050 M

-1 x cm-1 para o-benzoquinona a 390 nm.

Clculo de KMy VMAX

Medir la actividad enzimtica variando la concentracin de catecol en la celda demedicin: 50 M, 66 M, 100 M, 200 M, 500 M, 1 mM y 3 mM. Hacer larepresentacin de Lineweaver-Burk correspondiente y evaluar las magnitudes de KMyVMAX.

Inhibicin enzimtica

Se realizan dos series de medidas de la actividad, una con concentracin de catecol de2 mM y otra con 0.5 mM y concentracin variable de cido cinmico desde 0 hasta 0.4mM. Representar con el mtodo de Dixon.

Efecto de la temperatura

Medir la actividad enzimtica en medios de reaccin previamente atemperados en unbao termosttico a temperaturas ente 25 C y 70 C durante 10 minutos, aadiendo laenzima en el momento de medir. Representar la actividad frente a la temperaturautilizada en cada caso y evaluar la temperatura ptima.

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Efecto del pH

Medir la actividad enzimtica utilizando disoluciones tampones 10 mM en acetato depH 3.6, 4, 5 y de tampones 10 mM en fosfato de pH 6, 7 y 8 (utilizar el sustrato disueltoen agua a una concentracin 5 mM). Representar la actividad media frente al pH del

tampn utilizado y evaluar el pH ptimo para esta enzima.

Espectrofotmetro - colormetro. Bao termosttico. Mortero y pistilo. Micropipetas y micropuntas. Centrifuga Tubos falcon

10 g de championes. 1 g de arena de mar lavada.

30 ml tampn fosfato 100 mM de pH 7

Catecol 5 mM en tampn acetato 10 mM pH 5.1 ml catecol 5 mM1 ml tampn acetato 10 mM pH 5

1 ml catecol 50 M1 ml catecol 66 M1 ml catecol 100 M1 ml catecol 200 M1 ml catecol 500 M1 ml catecol 1 mM1 ml catecol 3 mM1 ml catecol 2 mM1 ml catecol 0.5 mM

9 ml tampn acetato 10 mM pH 5

Catecol 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5.

Catecol 5 mM en agua destilada.

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cido cinmico 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5.

1 ml c. cinmico 0 mM

1 ml c. cinmico 0.1 mM1 ml c. cinmico 0.2 mM

1 ml c. cinmico 0.3 mM

1 ml c. cinmico 0.4 mM

5 ml tampn acetato 10 mM pH 5.

Tampn acetato 10 mM de pH 3.6, 4 y 5.

Catecol 5 mM en tampn acetato 10 mM pH 5.3 ml catecol 5 mM3 ml catecol 3 mM3 ml catecol 1 mM3 ml catecol 0.5 mM3 ml catecol 500 M

5 ml tampn acetato 10 mM pH 5 a 25 C5 ml tampn acetato 10 mM pH 5 a 50 C5 ml tampn acetato 10 mM pH 5 a 70 C

datos:

catecol

c6h6o2

110.1g/moln=masa/pm

masa=m*pm

[]=n/v (L)