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Aplicaciones biomédicas de la microscopia electrónica y el análisis elemental conespectrómetro de Rayos X

 Resumen 

La microscopio electrónica ha avanzado mucho desde su invención hace 60 años y su aplicaciónen las ciencias biomédicas ha sido muy grande. Paralelo al desarrollo de nueva tecnología en estecampo y que ha permitido alcanzar una resolución de !". # para el microscopio de transmisión yde $0 a %0 # para el microscopio de rastreo! se le han adaptado a estos microscopios otrosaparatos que permiten realizar un an&lisis elemental de la muestra que est& siendo e'aminada enel microscopio. La venta(a de este procedimiento es que la muestra que est& siendo observada entiempo real puede ser analizada en su composición química sin ser destruida. #dicionalmente esposible realizar un an&lisis de la distribución de sus elementos en toda la muestra. La aplicación deeste nuevo método en las ciencias biológicas es muy amplia. Podemos detectar materialesinorg&nicos como el plomo! arsénico! calcio! mercurio! aluminio! etc! en di)erentes te(idosde* cuerpo! obtenidos de biopsia o autopsia. +na aplicación pr&ctica es el an&lisis de lacomposición de c&lculos vesiculares o urinarios determinando de esta manera la )isiopatogenia delproceso. 

Palabras clave

,icroscopia electrónica de rastreo! -spectrómetro de rayos ! ne)rolitiasis! c&lculos urinarios.

 Introducción 

+n haz de electrones puede considerarse como constituido por partículas u ondas. -n este /ltimocaso! la longitud de onda 1 asociada depende del volta(e con que )ue acelerado dicho haz2 así! a0034 es apro'imadamente de 0! 5! o sea unas 0 000 veces menor que de la luz visible.

7ecordemos que la resolución del microscopio de luz tiene como limitante la longitud onda de la luzvisible  1.

-n 8$" -rnest 7us9a desarrolló un sistema de electroimanes para concentrar y en)ocar un haz deelectrones de manera an&loga a la acción que e(erce un lente de vidrio sobre un haz de luz. -stedispositivo! que luego se denominaría :lente electromagnético: le permitió construir el primermicroscopio electrónico! cuyo aumento m&'imo era de 6 . ;in embargo! este )ue el inicio de laera de la microscopio electrónica! que se bi)urcaría en os grandes corrientes! la microscopioelectrónica de transmisión y la microscopio electrónica de rastreo. -n paralelo se desarrolló otrametodología! que permite el an&lisis elemental de la muestra mediante el patrón de dispersión derayos generados por la interacción del haz de electrones con la muestra  1! al igual que ocurre en el microscopio de luz!)orma una imagen con el haz de energía que atraviesa la muestra2 que en el caso de ,-> se tratade electrones acelerados a muy alto volta(e y en el microscopio de luz se trata de luz visible. Poreso! a este microscopio electrónico se le denominó de transmisión y siguiendo tal razonamiento! almicroscopio de luz? microscopio de luz transmitida  $ 1.

http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#1http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#1http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#2http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#2http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#3http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#3http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#2http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#3http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#1

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Para que los electrones atraviesen la muestra sin destruirla por calentamiento debe seguirse unprocesamiento! que resulta un tanto similar al que se sigue para obtener los cortes histológicospara microscopio de luz. -n resumen! los te(idos deben )i(arse químicamente! deshidratarse eincluirse en un medio de soporte para hacer los cortes. -n el caso de microscopia electrónica! la)i(ación se realiza con aldehídos usualmente glutaraldehído y para)ormaldehído1 y el medio deinclusión m&s corriente son resinas epó'icas de gran dureza. Los cortes deben tener un grosorm&'imo de unos 00 nm2 recordemos que para luz se usa para)ina como medio de inclusión y loscortes usualmente son de alrededor de @m de espesor! o sea unas 0 veces m&s gruesos que lorequerido en ,->. Luego los cortes deben contrastarse! lo que usualmente se denomina :tinción:!aunque en microscopio electrónica no se mane(a el concepto de color! pues este corresponde a

una pequeña porción del espectro electromagnético de 0!" a 0! % @m1. -l contraste en realidadconsiste en una impregnación del te(ido con sales de metales pesados! como acetato de uranilo ocitrato de plomo! que aumentan la electrondensidad en el sitio de deposición! esto hace quealgunas zonas aparezcan oscuras o negras en la pantalla! lo que contrasta con lo claro de laszonas no impregnadas con esos metales  " 1.La gran di)erencia en los aumentos logrados en el,-> estriba en el límite de resolución d1. >anto en et microscopio de luz como el ,-> la

resolución obedece ala ecuación de #bbe? d A 0!6< B < #C. Donde E se re)iere a la longitud deonda empleada para generar la imagen y #C es la abertura numérica del lente. -n el caso del

microscopio de luz! corresponde a 0! @m promedio del espectro visible humano1 y la #C oscila

alrededor de !$. -l valor < se re)iere a que suma la #C del ob(etivo y la del condensador quedeben ser iguales seg/n la ley de 7ayleigh. -sto produce un límite de resolución deapro'imadamente 0!

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contaminante de la otra señal! que corresponde a los rayos característicos cuya longitud de ondaes de 0!0 a 0 nm 6 1.

La generación de los rayos característicos depende de los electrones del &tomo que los generan.7ecordemos que un &tomo es neutro! pues tiene un n/mero de electrones igual al n/mero deprotones del n/cleo designado como I1 y que esos electrones est&n dispuestos en orbitales con

di)erentes niveles energéticos! que ordenados del n/cleo hacia )uera! son denominados 3! L! ,etc! y que esos orbitales deben irse llenando ordenadamente. -l orbital 3 acepta dos electrones! elL J! el , J! el C $< y así sucesivamente. -sto signi)ica que un elemento con doce electrones!debe llenar primero las dos plazas en el orbital 3 que serían ocupadas por los electrones cuyaenergía de en lance es mayor y luego se alo(arían los otros ocho electrones del orbital L y)inalmente los dos electrones con menos energía de enlace ocuparían su lugar en el orbital ,.Huando un electrón es removido de un orbital! su lugar ser& ocupado por otro electrón de un orbitalm&s e'terno! o sea que su energía de enlace aumentar&. -sa di)erencia energética es eliminadacomo un )otón de rayos cuya energía es equivalente a la di)erencia e'istente entre ambosorbitales 6 1. Por e(emplo! si la vacante quedó en el orbital 3 y )ue llenada por un electrón queprovenía de L se estaría generando una emisión de rayos denominada 3&2 pero si )ue llenadopor un electrón de dos orbitales m&s atr&s! o sea de ,! la radiación ser& 3& otra posibilidad seríauna emisión 3K si proviene de tres orbitales atr&s. ;i la vacante hubiese quedado en L! lose(emplos anteriores corresponderían a L& ! LK L y así sucesivamente. -sas di)erenciasenergéticas son características de cada elemento2 por lo tanto! si la cuanti)icamos sabremos dequé elemento proviene. Por e(emplo para el hierro tenemos los siguientes valores en 9iloelectronesvoltio 3e41 Ge 3& 6 "0$! Ge 3K 6 $80! Ge 3 % 0%! etc   1.

Los equipos analizadores de rayos en microscopio electrónica cuentan con programas decomputación cuya base de datos tiene esta in)ormación! de manera que el programa identi)icaautom&ticamente el elemento responsable de la emisión. -sto signi)ica! que empleando un detector de rayos en un microscopio electrónico es posible hacer un an&lisis químico de la muestra enescala puntual! indicando qué elementos est&n presentes en determinada &rea de la muestra.

Los detectores de rayos m&s utilizados en microscopio son el :-nergy Dispersive ;pectroscopy:-D;1 y el :Mavelength Dispersive ;pectroscopy: MD;1 éste permite un an&lisis r&pido ysimult&neamente puede detectar varios elementos! gracias a que segrega o dispersa las di)erentesseñales de. #cuerdo a su energía empleando un detector de cristal semiconductor. La )igura6 muestra un equipo -D; acoplado a un ,-7 y la )igura % muestra unos cristales obtenidos deorina de un paciente.

Huando los )otones de rayos golpean el cristal semiconductor! este absorbe una cantidad deenergía determinada! que es convertida en una señal eléctrica! la cual es emitida! ampli)icada ydigitalizada para alimentar un analizador multicanal! que identi)ica los elementos que originaron esaseñal y la despliega gr&)icamente! como se muestra en la )igura J que corresponde a un c&lculorenal. 

Aplicaciones biomédicas

-ntre las aplicaciones del an&lisis elemental con rayos en la biomedicina est& la identi)icación dedepósitos de metales pesados en te(idos! como el cobre en te(ido hep&tico de pacientes conen)ermedad de Milson % 1! el plomo en eritrocitos de pacientes con saturnismo! el mercurio en pielJ 1! el arsénico en las into'icaciones y carcinomas de piel! el tetraó'ido de osmio en traumatismosde piel 8 1! etc. >ambién! es posible analizar la composición de cristales urinarios y litiasis renal yvesicular 0 1. -l an&lisis de la etiología de la microlitiasis renal representa un e(emplo deaplicación de esta técnica. -sta patología puede ser multicausal y representa uno de los problemasde salud cuya importancia se reconoce cada día m&s. -ntre las posibles causas se mencionaronlas in)ecciones bacterianas debidas a agentes ureasa positivos!principalmente Klebsiella  penuemoniae, Proteus spp yUreaplasma urealyticum. La ureasa de estas

http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#6http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#6http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#6http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#5http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#5http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#7http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#9http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#9http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#10http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#10http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#6http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#6http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#5http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#fig6-8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#7http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#8http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#9http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-29482002000200005#10

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bacterias hidroliza la urea e'cretada por la orina! produciendo amonio que eleva el pN! lo que)avorece la precipitación de cristales de )os)ato de calcio. -sto unido a otros problemassubyacentes como alteraciones anatómicas o reducción del )lu(o urinario induce la )ormación demicrolitiasis y c&lculos renales   !

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Referencias 

. 7ubbi HP. Light microscopy. Oohn Miley ;ons! Hhichester. 88". Pp 08.  [ Links ]

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J. Uoyd #;! ;eger R! 4annucci ;! Langley ,! #braham OL y L- 3ing. -'posición al mercurio yen)ermedad. cut&nea. J Am Acadermatol.