Histología: Microscopia

Profesora Zulamita Medina de Aguilar

Ciencia que estudia el funcionamiento y composición de cada uno de los microscopios.

Instrumento de óptica que permite hacer observación de mínimos detalles de un tejido determinado, que a simple vista no puede ser observado.

HISTORIA DE LA MICROSCOPIA


Resumen de los acontecimientos más sobresalientes en la historia de la microscopía:

• El naturalista holandés Jan Swammerdam observó insectos con el microscopio haciendo hincapié en su conformación, descubrió también que la sangre no es un líquido uniforme rojo sino que existen corpúsculos que le dan ese color.

• El botánico inglés Nehemiah Grew estudió los órganos de reproducción de las plantas y descubrió los granos de polen.

• El anatomista holandés Reigner de Graaf realizó estudios similares en animales describiendo ciertos elementos del ovario que desde entonces se conocen con el nombre de folículos de Graaf.


• Marcello Malpighi fue uno de los microscopistas más grandes de la historia de acuerdo a su espectacular descubrimiento. Sus primeros estudios los realizó con pulmones de rana, pudiendo observar en ellos una compleja red de vasos

sanguíneos, demasiado pequeños para ser vistos por separado y muy anastomosados. Cuando siguió el recorrido de los vasos hasta que se unían con otros mayores, comprobó que estos últimos eran venas en una dirección y arterias en dirección opuesta. Por consiguiente, las arterias y las venas se hallaban unidos mediante una red de vasos llamados capilares.

De acuerdo al número de lentes.

• Simples o lupas: Constituidos por un solo sistema de lentes convergente produciendo una imagen: aumentada,derecha y virtual.

• Compuesto: Aquellos cuya parte óptica consta de dos sistemas de lentes llamados, ocular y objetivo. Producen una imagen aumentada, invertida y virtual.

DE ACUERDO AL NUMERO DE OCULARES QUE TIENE:

– Monoculares– Binoculares– Tetraoculares– Multioculares– Con pantalla visora incorporada

A.- Luz visible- Natural. - Artificial

Microscopio simple, microscopio óptico compuesto, microscopio de contraste de fase,

microscopio de interferencia, microscopio de polarización, microscopio de campo oscuro.

B.- Luz invisible: Microscopio de rayos x, microscopio de luz

ultravioleta, microscopio electrónico.

DE ACUERDO A LA FUENTE LUMINOSA

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE

• Necesita un condensador especial de Zernike y una placa de fase colocada detrás de los lentes objetivos.

• El M.C.F. convierte las diferencias de fases no detectables a diferencias de amplitud visibles a la retina humana.

• Utilidad: muestras vivas o sin teñir.

MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA

• Usa los mismos principios del M.C.F. es preciso y útil en las determinaciones de densidad.

• Con el se determina la masa seca y los índices de refracción de células y tejidos.

• El M.I. de Fase de Nomarski, da imágenes tridimensionales de células y tejidos.

MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN

• Sust. Intracelulares Org. Mol PerfectaRayo de Luz Polarizada Rayo Ordinario y Rayo Extraordinario=Birrefrigencia.

• Es de campo claro, utiliza un polarizador y un analizador con la muestra entre ellos.

• Útil para estudiar bandas isotrópicas(I) y anisotrópicas(A) del músculo y organización estructural ósea.

MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA

• Fuente de radiación ultravioleta.• Resolución entre 500 y 1500 Aº.• Lentes de cuarzo.• La L.U. no es visible al ojo humano y daña la

retina y los especimenes vivosTécnicas Fotográficas.

• Utilidad: microespectrometria como complemento de estudios histoquímicos.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

• Luz visible.• Utiliza filtros.• Utilidad: técnicas de anticuerpos

fluorescentes.

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

• Es una modificación del microscopio de campo claro.

• Reemplazo del condensador común por uno que alcance la imagen en ángulo oblicuo.

• Las células y otros elementos tisulares se ven brillantes en un campo oscuro.

• Permite estudiar especimenes vivos no teñidos.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION

• Se efectúa un registro permanente de la imagen resultante, mediante sustitución de una película sensible a los electrones en lugar de la placa fluorescente y producción de un negativo= fotomicrografía en blanco y negro.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO

• Brinda una imagen tridimensional del objeto que se está viendo.

• La imagen se puede volver permanente mediante fotografía o por digitalización para guardar en un disco de computadora.

Contribucion de Humberto Fernández-Morán a la Microscopía Electrónica

1.- Introduce el concepto de Crio-ultramicrotomia.2.-Introduce la Cuchilla de Diamante.3.-Introduce la aplicacion de la cuchilla de diamante para el seccionamiento ultrafino de

materiales biologicos y de metales.4.-introduce su ultramicrotomo disenado especialmente para su cuchilla de diamante.5.-Introduce la crio-fijacion ultrarapida con helio II.6.-Introduce el metodo de substitucion bajo congelamiento en microscopia electronica.7.-Desarrolla filamentos de punta y de cristal unico para proveer microhaz coherente

para la obtencion de micrografias de baja dosis electronica disminuyendo el dano por irradiacion electronica.

8.-Introduce el concepto de crio-microscopia electronica: la necesidad de observar las muestras congeladas-hidratadas.

9.- Introduce el crio-microscopio electronico.10.- Introduce el uso de lentes superconductoras a temperatura de helio liquido en

microscopios electronicos11.-Introduce el portaespecimen de nitrogeno y el de helio liquido.12.-Introduce el crio-ultramicrotomo a temperatura de helio liquido.

MICROSCOPIO DE BARRIDO CONFOCAL

Utiliza métodos electrónicos de imagen que permiten enfocar un plano escogido de una muestra fina, eliminando la luz que proviene de las zonas fuera de foco, superiores e inferiores a este plano obteniéndose imagen nítida de una fina sección óptica series de secciones ópticas de este tipo obtenidas a diferentes profundidades(archivadas en un ordenador) Imagen tridimensional detallada de secciones del interior de una estructura intacta.

Parte Mecánica:• Pie.• Columna - pilar.• Tubo.• Revolver.• Platina.• Sub-Platina.• Tornillo macrometrico.• Tornillo micrometrico.• Escala graduada.

Parte Optica• Objetivos• Oculares• Aparato de Iluminación

Un rayo luminoso choca contra una superficie pulimentada, y es rechazado

fuera de ella, siendo el ángulo de reflexión igual al ángulo de incidencia.

N

RI RR

i rSuperficie

R

S

Prol

onga

ción Rayo Reflejado

Espejo Plano

PQ

Reflexión de la Luz

A.- De acuerdo al sistema de lentes que los constituyen:•Acromáticos•Apocromáticos•Semi apocromáticos•Mono-Cromáticos•Aplanáticos,

B.- De acuerdo al uso:•Secos.•De inmersión.(agua n=1.33, Aceite n=1.515, monobromuro de naftaleno n=1.66).•De corrección

NRI

RR

Menos Denso

Mas Denso

i

r

N

RI

RR

Mas Denso

Menos Denso

i

rElementos de la Refracción

1.- Rayo Incidente (RI)

2.- Rayo Refractado (RR)

3.- Angulo de Incidencia (i)

4.- Angulo de Refracción (r)

5.- Normal (N)

• ABERTURA NUMERICA

Capacidad del objetivo de utilizar un mayor o menor número de rayos

luminosos en la formación de la imagen del microscopio.

• ANGULO DE ABERTURA.Angulo limitado por los rayos más

periféricos que penetran en el sistema óptico y contribuyen a formar la imagen

de un punto cualquiera del objeto.

• PODER DE DEFINICION .Es la capacidad del objetivo de formar imágenes

claras, de contornos nítidos.

• PODER DE RESOLUCION.Es la facultad del objetivo de distinguir los más

finos detalles de estructura y ligeros contrastes de índice de refracción.

• PODER DE PENETRACION.Propiedad del objetivo de permitir observar varios planos del preparado con una misma

posición de enfoque.

• DISTANCIA FOCAL.Distancia entre el foco y el centro de la lente del

objetivo.

• DISTANCIA FRONTAL.Distancia existente entre la lente frontal del

objetivo y el preparado enfocado.

• AUMENTO PROPIORelación existente entre el tamaño real del

objeto y el de la imagen que produce el objetivo.

Descripción:- Lente Inferior.- Lente Superior.

Clasificación de los oculares:- De Huyghens o negativos.- De Ramsden o positivos.- De Compensación.- Aplanáticos, ortoscópicos y periscopicos

Espejo

Condensador- De ABBE.- Acromático.

Diafragma o Iris.

• Central.• Oblicua.• De campo oscuro:

- Diafragma para campo oscuro.- Condensadores para campo

oscuro.

• Imagen del ocular: Aumentada, virtual y derecha.

•Imagen del objetivo: Aumentada, real e invertida.

•Definitiva del microscopio óptico compuesto: Aumentada , virtual e invertida.

• Microscopio simple: Aumentada, virtual y derecha.

•Pupila de emergencia.Circulo luminoso formado por la

concurrencia en ese plano de todos los rayos procedentes de la imagen del

microscopio.

• Distancia normal de proyección.

Distancia entre la pupila de emergencia y el plano donde se forma la imagen

microscópica definitiva.

•Campo real.Superficie del preparado que se abarca

en la observación microscópica, sin desplazar el portaobjeto.

Optico Compuesto Electrónico

Luz Visible Invisible

Lentes + ConvergentesElectromagnético

Se Observa Ocular Pantalla Fluorescente

Fuente de Luz Natural o Artificial Haz de Electrones

Tubo No está al vacío Está al vacío

Fuente de Poder No Tiene Si Tiene

MICROSCOPIAMicroscopio Óptico

MICROSCOPIA

• Microscopio Electrónico de Transmisión.

MICROSCOPIA

• Microscopio Electrónico de Barrido

F F

Clasificación de los Lentes

Tipos de Lentes

De acuerdo al comportamiento de los Rayos de luz que la atraviesan:

• Lentes Convergentes ( Más o de Aumento)

• Lentes Divergentes (Menos o de Reducción)

DivergenteConvergente

De Acuerdo a su Forma :

Biconvexa Plano Convexa Cóncavo -Convexa

Bicóncava Plano-Cóncava Convexa-Cóncava

Convergentes

Divergentes

Aberración Cromática

Luz Blanca

Luz Blancaa

a` b`

bVioleta

Rojo

Violeta

Rojo

A B

Corrección de la Aberración CromáticaSe utilizan lentes compuestas de 2 cristales de diferente clase:

Crown I.R.: Semejante

Flint Poder Dispersivo: Diferente

Una lente poco Divergente de Flint-Glass ( Silicato de K y Pb de alto poder Dispersivo, acoplada a una Convergente de Crown-Glass (Silicato de K y Ca), recompone la luz descompuesta por ésta, sin anular su efecto Convergente

Objetivos Acromáticos

Aberraciones:

Aberración de Esfericidad

a

n

mb

de

c

a`

b`

c`

d`

e`

Corrección de la Aberración de Esfericidada Lentes acopladas de

distinto Indice de Refracción

Funciona: Lente Simple convergente Aplanática sin AE

F

b

de

c

a`

b`

c`

d`

e`

Histología: Microscopia

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