Microscopia ii

5/17/2018 Microscopia ii - slidepdf.com

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Universidad Andrés Bello

Facultad de ciencias

Laboratorio de biología celular 133

Profesores: Luciana Oliveira Cruz

Joselin Sofía Jerez Ortega

TRABAJO PRÁCTICO N°4:

Microscopía II

BIO133-2

Autores: Juan Pablo Duarte

Martín Quezada

Fernanda Arredondo

- 05-05-2011 -



INTRODUCCION

La microcopia de campo oscuro se utiliza habitualmente para el análisis de elementos

biológicos transparentes o sin pigmentación alguna, nos permitirá observar detalles en la

superficie de las muestras analizadas.

El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por la estructura de la muestra por

consecuenciaobservaremos detrás de la muestra en análisis un fondo completamente

oscuro sobre el cual segmentos de la muestra emitirán pequeñas partículas brillantes que

reflejan la luz del foco hacia el objetivo.

Es como una habitación completamente oscura en la cual si llegase a entra un pequeño

rayo de luz podremos ver partículas de polvo flotando en el aire. Lo que en un momentoera invisible se volverá visible mediante el haz de luz.

Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión

como el porcentaje de éstas, ocuparemos una cámara de Neubauer, normalmente

utilizada para realizar un conteo celular en microscopia de campo claro o de contraste de

fases,es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de

0.25 mm.



Objetivos

El propósito de este laboratorio es poder analizar una muestra por medio de la

microscopia de campo oscuro, donde apreciaremos en nuestros objetivos la luz que

reflejara la muestra y detalles que solo podremos ver por medio de esta técnica de

microscopia.

Por otro lado realizaremos un recuento de células, de una muestra de sangre humana

diluida 1000 veces. Para esto utilizaremos la cámara de Neubauer (ocupada para el

contaje de células), material que aportara una cifra exacta a lo requerido.

Y por último trataremos de medir el tamaño de las células de la muestra. Para lograr

nuestro propósito ocuparemos una reglilla en el ocular de nuestro microscopio, la cual

después de ser calibrada, nos ayudara a determinar el tamaño de los leucocitos.



Materiales y métodos

El material principal a utilizar es el microscopio óptico el que servirá para la observación

de las muestras. En la primera muestra se visualizara un pelo humano en el que su

objetivo será identificarlo en dos campos diferentes, la primera es analizarlo mediante elmicroscopio de manera normal con el foco de luz despejado, y la segunda habrá un

cambio en el foco de luz ya que se le incorporara en la superficie un cartón oscuro

dejando un pequeño espacio en sus costados para dejar una baja intensidad de luz hacia

el objetivo (en este caso el pelo). Otro material que se ocupo para analizar fue la reglilla

con la función de calibrar la medición de los glóbulos blancos de un frotis de sangre, esta

reglilla presentaba diferentes mediciones (0.05 mm; 0.01 mm) marcadas con las que se

podía obtener un dato aproximado del tamaño de las células, todo esto con la ayuda del

microscopio óptico. La última muestra analizada fue sangre humana en el que se

necesitaba contabilizar las glóbulos rojos, para esto se ocupo la Cámara de Neubauer quese adapta al microscopio con contraste claro, esta cámara está marcada con una pequeña

depresión en el centro formando diminutas cuadriculas. La gota de sangre fue colocada en

esta depresión que estaba cubierta por un portaobjetos donde esta comenzó a deslizarse,

luego se debe esperar un cierto lapsus de tiempo para que sedimenten las células. Así

mediante un microscopio los glóbulos rojos son observados y contabilizados donde se

tendrá que utilizar una fórmula para saber el contenido de glóbulos rojos en 1mL.

Las principales muestras y materiales utilizadas en este laboratorio fueron:

- Microscopio óptico

- Reglilla calibrada

- Cámara de Neubauer

- Pelo humano

- Sangre humana

- Frotis de sangre



Actividad practica

A. Observación de un cabello

La observación del pelo con objetivo 10X en campo claro se puede ver una franja marrón, plana,

sin ningún detalle a distinguir. En cambio, en la observación con objetivo 10X, a la misma muestra

de cabello, con campo oscuro, se aprecia una franja marrón tridimensional destacando los

bordes, se nota la forma cilíndrica del pelo.

Fig. 1 Pelo con objetivo 10X en campo claro Fig. 2 Cabello con objetivo 10X en campo oscuro

B. Reglilla

Fig. 2 Reglilla con objetivo 10X

Utilizamos una reglilla calibrada

para calibrar la reglilla ocular

La medición de un glóbulo blanco,

al ponerlo al microscopio y medirlo

con la reglilla, su radio era de aproximadamente

0,01mm [fig. 3].

Fig. 3 Un leucocito medido por un dibujo

proporcional a la reglilla con objetivo 10X.



C. Determinación del numero de células

Fig. 5 Cámara de Neubauer. Los cinco

cuadrados del centro, es el área donde

se cuentan los eritrocitos. Las áreas de

las esquinas es donde se cuentan los

glóbulos blancos.

Contamos 23 eritrocitos en un cuadrado de 0,2 mm x 0,2 mm. Con esto y sabiendo los

datos de los cuadrados de la cámara y su profundidad se calcula la cantidad de eritrocitos

en 1mm3

de disolución.

Eritrocitos = 23

Volumen del cuadrado = 1/4000 mm3

N° de eritrocitos por cada mm3= Eritrocitos contados

N° de cuadrados pequeños x Volumen del cuadrado x disolución

N° de eritrocitos por cada mm3= 23 x 4000 mm

3x 1000 = 5.750.000 eritrocitos/ mm

3

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Discusión

Es posible convertir un microscopio de campo oscuro a uno de campo claro. La

observación a través del microscopio de campo oscuro hace que las porciones

transparente de la muestra se vean oscuras, mientras que las superficies y partículas

se ven más brillantes. La observación del cabello con campo oscuro a objetivo 10X

resalta los detalles de la superficie del pelo y se aprecia la forma cilíndrica de este, en

cambio, en uno de campo claro solo se aprecia una figura plana.

Los leucocitos son células que se encuentran en la sangre, representes hemáticos de la

serie blanca, y efectores celulares de la respuesta inmunitaria. Estos no tienen

pigmentos por eso su color blanco, tienen núcleo, son capaces de moverse libremente

mediante seudópodos y su tamaño oscila entre 8 y 20μm. Su clasificación: leucocitos

mononucleares y leucocitos. La medición de un glóbulo blanco en el laboratorio, con

un microscopio con objetivo 10X y con una reglilla calibradora fue de 0,01 mm, lo que

corresponde 10μm. Por tamaño puede ser un linfocito, cuyo tamaño es de 8 a 15μm,

un basófilo, el cual mide 10μm o un Eosinófilo que mide de 10 a 12μm.

La cámara de Neubauer es un instrumento, adaptado al microscopio de campo claro o

al de contraste de fases, utilizado para realizar conteo de células en un medio líquido,

en este caso la sangre. Es un portaobjeto con una depresión en el centro de 0,1mm

respecto a la superficie y el volumen es de 0,1μL. Es un cuadrado de 3 x 3mm, con

una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25 mm, donde sus esquinas

corresponden a 1 mm2. Para contar globulos rojos, se agrega una gota de este, entre

la cámara de Neubauer y el cubre objeto, luego observar con el microscopio objetivo

10X, el conteo de eritrocitos se hace en el centro de la cámara de Neubauer de 1mm x



1mm, el cual, consta de 25 cuadrados de 0,2 mm x 0,2 mm. Muy importante es

recordar que los eritrocitos que quedan en la mitad de las líneas inferior y/o de la

derecha no son contabilizados. El conteo de eritrocitos en varones es de 5 a 5.5

millones y en las mujeres de 4.5 a 5 millones por mm3. Los resultados arrojaron 23

células por cuadrado de 0,2 mm, lo que corresponde a 5.750.000 eri/mm3

de sangre

(sin diluir), la muestra no está dentro del rango superior, que es el de varones pero no

se aleja mucho, probablemente se deba al mal conteo de eritrocitos o por error de

disolución de la muestra de sangre. En un principio la muestra fue diluida en 1:10,

pero eran muchas células, así que se diluyo en 1:1.000, pero aún así fue diluida en

1:10.000 mas no funcionó, de tal forma que la disolución usada fue de 1:1.000. Lo

más probable es que todo este proceso de prueba de diluciones haya generado un

error que afectó al resultado de conteo de eritrocitos en la cámara de Neubauer.



Bibliografía

http://es.wikipedia.org/wiki/Linfocitos

http://es.wikipedia.org/wiki/Monocitos

http://es.wikipedia.org/wiki/Neutrofilos

http://es.wikipedia.org/wiki/Basofilos

http://es.wikipedia.org/wiki/Eosin%C3%B3filos http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_campo_oscuro

http://migueldegetaupbl.blogspot.com/2008_02_01_archive.html

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1mara_de_Neubauer

http://bioservice77.obolog.com/camara-neubauer-100991









http://es.wikipedia.org/wiki/Eosin%C3%B3filos


http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_campo_oscuro

















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