ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 10Recuento e Identificación de

Enterococcus

ASIGNATURA :

Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 13 de marzo de 2008.

1

PRACTICA Nº 10RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE

Enterococcus.

I. Introducción:

Los enterococos son cocos gram positivos, que se encuentran aislados, de a pares, o formando cadenas cortas. Ellos pertenecieron, clásicamente, a los Streptococcus grupo D de Lancefield; sin embargo, a mediados de la década de 1980 fueron oficialmente clasificados en su propio género. Son catalasa negativa, anaerobios facultativos, capaces de crecer en condiciones un tanto extremas. Las características bioquímicas sobresalientes incluyen: la habilidad de crecer en presencia de NaCl al 6,5%, a temperaturas entre 10°C y 45°C, y hasta en un pH de 9,6. Tienen la capacidad de hidrolizar la esculina, crecer en presencia de bilis al 40%, sobrevivir 30 min a 60°C e hidrolizar la L-pirrolidonil ß-naftil-amida (PYR); esta habilidad ha sido usada como parte de un test rápido para detección de enterococos en el laboratorio.

Las especies de enterococos clínicamente importante son: E faecalis, E faecium, E durans, E avium, E gallinarum, E casseliflavus, E raffinosus, E malodoratus, E hirae, E mundtii, E solitarius, E pseudoavium.

E faecalis es el patógeno humano más frecuente representando el 60% al 90% de los aislamientos clínicos de enterococos. E faecium es la segunda especie aislada en frecuencia, representando el 5% al 16% de los aislamientos clínicos.

II. Objetivos:

- Familiarizarse con la técnica de aislamiento de Enterococcus a partir de alimentos.

- Efectuar una numeración e identificar Enterococcus a partir de alimentos.- Conocer la metodología mas adecuada para análisis.

III. Materiales:

- Muestras: Aguas de diferentes tipos, leche deshidratada a granel.

- Medio para detección presuntiva: Caldo Glucosa Azida.

- Medio de detección confirmativa: Caldo EVA.

- Medio para aislamiento: Agar Barnes (a base de Trifeniltetrazolium- TTC).

- Tubos de dilución- Placas de Petri- Pipetas de 10 y 5 mL.- Mechero Bunsen - Asas microbiológicas- Frascos estériles

IV. Procedimiento:

2

- Muestra de agua:

- La positividad de la prueba en el caldo EVA se ve cuando se presenta turbidez y sedimento de color rojo a rojizo.

- De los tubos positivos hay que realizar el aislamiento en agar Barnes.- Luego realizar la identificación de las colonias a través de coloración Gram y

otras como catalasa, crecimiento a 45 ºC, crecimiento en NaCl 6.5%, resistencia bilis 40%, crecimiento a pH 9.6 y otros de ser necesarios.

3

0.1 mL

1 mL

10 mL

Muestra: agua de noria

Caldo Glucosa Azida

PRUEBA PRESUNTIVA

Incubar de 35 a 37 ºC por 18 a 24 h.De los tubos positivos se los pasa a caldo EVA

Caldo EVA

Incubar de 35 a 37 ºC por 18 a 24 h.

PRUEBA CONFIRMATIVA

- Muestra de leche deshidratada:

- Pasado el tiempo de incubación se leen las placas. Si se observan colonias con el centro rojo, es muy posible que corresponda a E. faecalis, colonias blancas es posible que sean E. faecium y si son colonias de color rojo intenso, puede que sea Lactococcus lactis.

- Seleccionamos las colonias características, luego realizamos las pruebas necesarias para su identificación final.

V. Resultados:- De las colonias sospechosas obtenidas de las placas anteriormente observadas se

pasó a sembrarlas en caldo EVA, para ello se escogieron tres colonias (las cuales se aislaron en viales).

4

10-1 10-2 10-3

1 mL 1 mL 1 mL

Pesamos 3 g de la muestra (leche en polvo)

Realizamos tres diluciones

Diluyente: Agua peptonada al 0.1%

Incubar a 35-37 ºC por 24-48 h.

Agar Barnes

- Se sembró a 37 ºC por 24 horas. Después de lo cual nos dio la coloración característica de la positividad en el caldo (sedimento rojo-violáceo).

- Luego de la confirmación de que las colonias aisladas pertenecen al género Enterococcus se pasó a desarrolar las pruebas bioquímicas respectivas (para esto sólo se escogió una cepa):

Catalasa Negativo Crecim. pH 9.6 PositivoCrecim. NaCl 6.5% Positivo Superv. 60 ºC x 30’ Positivo

- Como las pruebas realizadas no pueden diferenciarnos la especie de Enterococcus aislado y además, la colonia escogida para las pruebas bioquímicas era una colonia con centro color rojo en el agar Agar TTC, es muy probable que sea E. faecalis.

VI. Preguntas:- Describir la composición de los medios utilizados.

Agar Barnes (TTC) Caldo EVA Caldo glucosa azidaTriptosa 1 g Triptosa 20 g Tripteína 15 gGlucosa 0,1 g Dextrosa 5 g Extracto de carne 4.8 gNaCl 0,5 g Dipotasio fosfato 2,7 g Glucosa 7.5 gTTC 0,01 g Monopotasio fosfato 2,7 g NaCl 7,5 gAgar 0.4 g NaCl 5 g Azida sódica 0,2 gAgua destilada 1 000 mL Azida de sodio 0.4 g Agua destilada 1 000 mL

Agua destilada 1 000 mL

VII. Referencias:

- ACOSTA G., S. I. (2005). Enterococcus. Obtenido el 29 de febrero de 2008 en www.codeinep.org/control/ Enterococcus .doc

- L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiología de Alimentos: Investigación de streptococos fecales. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm

- FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.

5