UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Luis Felipe Morales Curiel

Mónica Gabriela del Callejo Bernal

Andrea Viridiana Mejía Ceja

Tutor: Loren García Uriostegui

18 de marzo de 2015 Guadalajara, Jalisco

1

ÍNDICE

INTROCUCCION…………………………………………………………………………………………………………………3

ANTECEDENTES…………………………………………………………………………………………………………..6

OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………………………………………………….9

HIPÓTESIS…………………………………………………………………………………………………………………10

METODOLOGÍA…………………………………………………………………………………………………………..10

MATERIALES Y EQUIPOS………………………………………………………………………………………………11

MICROALGAS ANALIZADAS …………………………………………………………………………………………11

DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS Y TRIGLICÉRIDOS PRESENTES EN MICROALGAS………………......12

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA………………………………………………………………………………… ….12

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN…………………………………………………………………………………............12

- EXTRACCIÓN CON SOLVENTE HEXANO ……………………………………………………………….…13

- EXTRACCIÓN CON SOLUCIÓN PROPANOL: HEXANO…………………………………………..….14.

- EXTRACCIÓN CON SOLUCIÓN CLOROFORMO: METANOL……………………………………….14.

CONVERSIÓN DE LÍPIDOS Y TRIGLICÉRIDOS A BIODIESEL…………………………………………………. 14

RESULTADOS ESPERADOS……………………………………………………………………………………………. ..16

RESULTADOS CONVERSIÓN DE LÍPIDOS Y TRIGLICÉRIDOS A BIODIESEL ………………………………19

CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………… .20

BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………………………………..20

ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………..21

2

I. INTRODUCCIÓN

En este siglo la humanidad afronta una grave problemática debido al aumento de la demanda

energética mundial, agotamiento de los combustibles fósiles, incremento del precio del petróleo y

las dificultades ambientales causadas por los gases de invernadero. Una alternativa energética

promisoria que ha resultado muy atractiva en años recientes es el biodiesel.

El biodiesel consiste en monoalquilésteres de alcoholes de cadena corta usualmente etanol y

metanol, con ácidos grasos de cadena larga obtenidos a partir de biomasa renovable y que es

técnicamente capaz de sustituir el diesel derivado de petróleo como combustible.

En contraste con el petrodiesel, el biodiesel ofrece varias ventajas ya que es una fuente de energía

renovable y biodegradable (se degrada cuatro veces más rápido que el diesel fósil) y produce

menos emisiones indeseables (CO, hidrocarburos aromáticos policíclicos, óxidos de azufre y

nitrógeno) siendo estas por ende menos nocivas. Además reducen el desgaste del motor y es un

material seguro para su transporte, almacenamiento y manejo debido a su baja volatilidad y

elevado punto de inflamación (100-170 C). El biodiesel puede utilizar la infraestructura actual de

almacenamiento y distribución para el diesel de petróleo. Asimismo, debido a la similitud de las

propiedades físicas y químicas del diesel fósil con las del biocombustible, su uso no requiere de

modificación alguna en los motores diesel convencionales, por lo que puede ser empleado en éste

ya sea directamente o en mezclas biodiesel-petrodiesel.

En las últimas décadas se ha destacado que las microalgas representan una alternativa más

conveniente que cualquier otro tipo de organismo para la producción de Triglicèridos y su

conversión a biodiesel, ya que algunas especies oleaginosas, siendo organismos fotosintéticos, sólo

requieren energía solar, agua, CO2 y algunas sales para producir altos rendimientos de biomasa rica

en lípidos. De hecho son los organismos fotosintéticos más eficientes, absorben más CO2 y liberan

más O2 que cualquier planta, crecen extremadamente rápido y llegan a acumular grandes

cantidades de diversos productos. Algunas microalgas doblan su biomasa en 24 horas y el tiempo

de duplicación de biomasa durante la fase exponencial puede ser tan corto como 3.5 horas.

Los aceites vegetales son la principal materia prima para la producción de biodiesel, razón por la

cual el uso de cultivos de alto contenido oleaginoso ha sido estudiado exhaustivamente. El

mercado creciente de producción de biodiesel a partir de aceites vegetales comestibles, requeriría

3

del uso de enormes extensiones de terreno fértil, situación que podría conllevar a crisis

alimentarias ante la escasez de suelos cultivables. En consecuencia se ha planteado el uso de

aceites no comestibles procedentes de cultivos marginales. El elevado costo de materia prima, que

contribuye del 50 al 90% del precio de producción del biodiesel, ha obstaculizado la

comercialización del biocombustible, motivo por el que se hapropuesto el uso de aceites de

desecho y de grasas animales, alternativa que no ha sido satisfactoria a causa de los gastos

adicionales necesarios para el refinamiento y la transesterificación del material. Se ha reportado

que diversos microorganismos son capaces de sintetizar triglicéridos intracelulares, bajo ciertas

condiciones de cultivo, hasta en un 80% de su peso seco utilizando diversas fuentes de carbono. El

problema al utilizar este tipo de microorganismos, es el costo de producción, dado que requieren

un alto consumo de oxígeno. En contraste, en las últimas décadas se ha destacado que las

microalgas representan una alternativa más conveniente que cualquier otro tipo de organismo

para la producción de Triglicèridos y su conversión a biodiesel, ya que algunas especies

oleaginosas, siendo organismos fotosintéticos, sólo requieren energía solar, agua, CO2 y algunas

sales para producir muy altos rendimientos de biomasa rica en lípidos.

Existen diversas metodologías para la producción de biodiesel, cuatro de ellas han sido estudiadas

exhaustivamente: uso directo de aceites o mezclas de éstos con diesel fósil, microemulsiones,

pirolisis y transesterificación. La aplicación de las tres primeras alternativas en motores diesel es

impráctica e insatisfactoria, ya que ocasiona problemas tales como la obstrucción de los

inyectores, la formación de depósitos de carbono, la combustión incompleta, el golpeteo en el

motor, el desggaste excesivo del mismo, el daño del lubricante y, en el caso específico de la

pirólisis, la eliminación de los beneficios ambientales inherentes al uso de combustibles

oxigenados.

En base a lo anterior en este trabajo se va extraer los triglicéridos de las microalgas mediante los

métodos extracción Soxhlet, extracción con solución propanol: hexano, método Ramos 2010

modificado, extracción con solución cloroformo:metanol y el método Folch et al. modificado para

observar cual método es el que tiene el mejor rendimiento para el objetivo de este trabajo y la

transformación de biodiesel a partir Triglicèridos mediante transesterificación o alcohólisis que es

la reacción química ocurrida entre los aceites (triacilglicéridos) y un alcohol (comúnmente metano,

etanol, propanol o butanol) para producir glicerol y alquil ésteres de ácidos grasos, los cuales son

4

conocidos como biodiesel. Los principales factores que influyen en el proceso son la relación molar

alcohol:glicéridos, el tipo de catalizador, la temperatura, el tiempo de reacción y el contenido de

agua y ácidos grasos libres en la materia prima. Con el uso apropiado de estos factores se llevará a

obtener biodiesel altamente funcional que tenga las mismas características que el diesel fósil con

ventajas tanto ambientales como socioeconómicas.

Palabras clave:

Microalgas, biodiesel, triglicéridos, fotoautótrofos

II. ANTECEDENTES Los aceites vegetales son la principal materia prima para la producción de biodiesel, razón por la cual el uso de cultivos de alto contenido oleaginoso ha sido estudiado exhaustivamente. La idea de utilizar combustibles provenientes de la biomasa en motores diesel fue contemplada desde los mismos los mismos orígenes de la tecnología de fabricación de estos motores Es célebre la referencia histórica sobre la presentación de un motor diesel funcionando con aceite de cacahuate en la feria de París del año 1900. El biodiesel consiste en monoalquilésteres de alcoholes de cadena corta usualmente etanol y metanol, con ácidos grasos de cadena larga obtenidos a partir de biomasa renovable y que es técnicamente capaz de sustituir el diesel derivado de petróleo como combustible. Los principales materiales oleaginosos utilizados derivan de la palma, colza y soya, además del girasol, coco, cacahuate, oliva, mostaza, entre otros (Ma&Hanna, 1999; Al-Zuhair, 2007; Anónimo, 2007; Li et al., 2008; Menget al., 2009; Songet al., 2008). El mercado creciente de producción de biodiesel a partir de aceites vegetales comestibles, requeriría del uso de enormes extensiones de terreno fértil, situación que podría conllevar a crisis alimentarias ante la escasez de suelos cultivables. En el caso particular del sureste asiático y Brasil, el considerable incremento en su tasa de producción de biodiesel a partir de palma y soya, ha ocasionado problemas ambientales inherentes a la deforestación de regiones tropicales (Dismukeset al., 2008; Schenket al., 2008. En consecuencia se ha planteado el uso de aceites no comestibles procedentes de cultivos marginales tales como Jatropha curcas (piñón), Calophylluminophyllum(tamanu), Pongamiapinnata (haya de la India, karanja), Madhuca indica, Swidawilsoniana, Ricinuscommunis(higuerilla) y Verniciafordii(tung). Estos cultivos marginales no requieren de terrenos fértiles, ya que proliferan en suelos áridos, pobres en nutrientes, con altos niveles de radiación y baja precipitación pluvial (Fairless, 2007; Liu&Zhao, 2007; Sharmaet al., 2008; Songet al., 2008). El elevado costo de materia prima, que contribuye del 50 al 90% del precio de producción del biodiesel, ha obstaculizado la comercialización del biocombustible, motivo por el que se ha propuesto el uso de aceites de

5

desecho y de grasas animales, alternativa que no ha sido satisfactoria a causa de los gastos adicionales necesarios para el refinamiento y la transesterificación del material (Al-Zuhair, 2007; Liu&Zhao, 2007; Songet al., 2008; Menget al., 2009). Se ha reportado que diversos microorganismos tales como las levaduras Cryptococcuscurvatus,Cryptococcusalbidus, Lipomyceslipofera, Lipomycesstarkeyi, Rhodotorulaglutinis, Rhodosporidiumtoruloides, Trichosporompullulany Yarrowialipolyticay bacterias del grupo actinomicetos tales como Mycobacteriumspp., Rhodococcusspp. yNocardiaspp., son capaces de sintetizar triglicéridos intracelulares, bajo ciertas condiciones de cultivo, hasta en un 80% de su peso seco utilizando diversas fuentes de carbono (azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes y aceites entre otras) y diferentes subproductos y/o residuos industriales o agrícolas (suero de leche, hidrocarburos, aceites vegetales, melazas de caña de azúcar, salvado de trigo, desechos de frutas y verduras.) (Li et al., 2008a; Adamczaket al., 2009). El problema al utilizar este tipo de microorganismos, es el costo de producción, dado que requieren un alto consumo de oxígeno.Los triglicéridos son el principal tipo de grasa transportado por el organismo. Recibe el nombre de su estructura química. Se forma despues de comer, el organismo digiere las grasas de los alimentos y libera triglicéridos a la sangre. Estos son transportados a todo el organismo para dar energía o para ser almacenados como grasa.El hígado también produce triglicéridos y cambia algunos a colesterol. El hígado puede cambiar cualquier fuente de exceso de calorías en triglicéridos. Los triglicéridos tienen la siguiente estructura:

En el 2007, la producción de biodiesel a partir de aceites vegetales (comestibles y no comestibles, vírgenes y usados) y grasas animales (12 Mtons) correspondió al 0.3% del consumo global de petróleo (3952.8 Mtons), situación que constata la incapacidad de estas fuentes para desplazar la demanda actual y futura de combustible (BP Statistical Review of World Energy 2008; Schenket al., 2008). Asi mismo, la obtención de biodiesel a partir de plantas oleaginosas (comestibles y no comestibles)está limitada por varios inconvenientes tales como los largos periodos de producción(meses o años) inherentes a la tecnología agrícola, el rendimiento lipídico restringido(menor al 5% del peso seco total) y la dependencia a las condiciones climáticas, la ubicación geográfica, la fertilidad de los suelos y la variedad cultivada; no obstante, el principal

6

obstáculo es la extensa superficie de cultivo requerida y el enorme volumen de agua necesario para el riego (Anónimo, 2007;Li et al., 2007; Chisti, 2007; Chisti, 2008;Schenket al., 2008). La sustentabilidad de la industria del biodiesel requiere de materias primas alternas que permitan operar continuamente y superar las limitaciones señaladas (Liu&Zhao, 2007)En contraste, en las últimas décadas se ha destacado que las microalgas representan una alternativa más conveniente que cualquier otro tipo de organismo para la producción de triacilglicéridos y su conversión a biodiesel, ya que algunas especies oleaginosas, siendo organismos fotosintéticos, sólo requieren energía solar, agua, CO2 y algunas sales para producir muy altos rendimientos de biomasa rica en lípidos (Li et al. 2008a).Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticos capaces de transformar la energía luminosa en energía química con una eficiencia cuatro veces superior a la de las plantas. Su importancia radica en su papel como productores primarios de la cadena trófica, que las constituyen en las primeras formadoras de materia orgánica. Por su tamaño reducido y variado (5–50 µm en promedio) son de fácil captura y digestión por multitud de organismos que se alimentan en forma directa del fitoplancton. Las condiciones óptimas de temperatura, intensidad luminosa, salinidad, nutrientes y pH para el cultivo de microalgas, varían ampliamente de una especie a otra, estos parámetros fisicoquímicos, han sido determinados en laboratorio y nos ayudan a comprender las condiciones óptimas para el desarrollo de las diferentes especies en cultivo. Actualmente a nivel comercial, los cultivos masivos de microalgas al exterior y los fotobiorreactores cobran mayor importancia para la producción de compuestos químicos de alta pureza, como: biocombustibles, biofertilizantes, intercambiadores iónicos y carotenos; así mismo, para el tratamiento de aguas residuales, obtención de compuestos terapéuticos y como alimento de consumo humano y animal. En condiciones normales todas las clases de microalgas poseen invariablemente la clorofila-a que confiere el color verde a las algas y al menos un pigmento accesorio, que puede enmascarar en ocasiones a la clorofila-a. La clorofila-b se encuentra en las plantas verdes, la clorofila c en diatomeas, dinoflagelados y algas pardas y la clorofila d en las algas rojas. Cultivadas bajo condiciones adecuadas de iluminación, temperatura, salinidad y concentración de nutrientes, las microalgas representan una excelente fuente de pigmentos carotenoides. Diversos estudios han demostrado que la producción de carotenoides en microalgas, como Dunaliella salina, puede optimizarse mediante variaciones en las condiciones de cultivo tales como: altas salinidades; incremento en la irradiancia y en la temperatura ó estrés por limitación de nutrientes. Las microalgas como organismos autótrofos fotosintetisadores, dependen de la luz para su desarrollo y producción de materia orgánica. La respuesta fotosintética a la energía luminosa se caracteriza por una respuesta lineal baja al incremento en la irradiancia, hasta llegar a su máxima capacidad fotosintética, donde las células son independientes de la irradiación. Bajo condiciones estables (no movimiento) las células se aclimatan a un nivel de irradiancia, obteniendo bajo esas condiciones tasas de crecimiento y fotosintéticas no necesariamente óptimas mediante un ajuste en sus procesos fisiológicos. En células aclimatadas a bajas irradiancias, la concentración de clorofila se incrementa para poder obtener la energía luminosa necesaria para continuar con el

7

proceso fotosintético. Por otro lado, células aclimatadas a altas irradiancia, decrece la concentración celular de clorofila-a e incrementan la concentración de pigmentos accesorios fotoprotectores (carotenos) para evitar la oxidación de los fotosistemas. Se reporta que células aclimatadas a alta iluminación no mostraron una tasa de crecimiento mayor que células en baja iluminación, porque a saturación de luz, las concentraciones de clorofilas serán proporcionalmente mucho menores de la masa total de de los pigmentos celulares en alta iluminación. Se ha observado que la salinidad alta tiene influencia en la capacidad de la microalgas para adquirir los nutrientes necesarios para su crecimiento y productividad. Algunos autores han documentado una disminución en las densidades celulares finales cuando se aumenta la salinidad del medio de cultivo. Estas condiciones no favorecen la producción de clorofilas, y si la de pigmentos accesorios, ya que a limitación de nutrientes (nitrógeno) las clorofilas son precursoras de otros pigmentos, razón por la cual puede haber una producción de carotenos celulares bajo estas condiciones. Entre los compuestos de más interés obtenidos de las microalgas, destacan los carotenoides, biodiesel, ficobiliproteínas, lípidos, polisacáridos, y compuestos con actividad biológica provenientes de las especies más utilizadas tales como Dunaliella, Spirullina y Porphyridium. Además de Chlorella, y Hematococcus. Se han identificado más de 600 carotenoides producidos naturalmente en plantas, animales y hongos, de los cuales 400 han sido aislados y caracterizados; de éstos sólo un número reducido se utiliza comercialmente destacando entre ellos el β-caroteno y la astaxantina y solo 50 poseen actividad provitamina A. Los carotenoides hidrocarbonados se denominan colectivamente como carotenos y aquellos que contienen oxígeno se denominan xantofilas. La mayoría de los carotenoides se obtienen mediante síntesis química. Solo dos microalgas unicelulares clorofíceas son fuentes comerciales reconocidas de carotenoides: la microalgas flagelada Dunaliella salina, que acumula β-caroteno y el alga verde de agua dulce Haematococcus pluvialis que produce astaxantina. Existen además otras especies de microalgas y cianobacterias cultivadas comercialmente como son: Chlorella, Spirullina, Dunaliella, Nannochloris, Nitzschia, Crypthecodinium, Schizochytrium, Skeletonema, Isochrysis y ChaetocerosDe hecho, son los organismos fotosintéticos más eficientes, absorben más CO2 y liberan más O2 que cualquier planta, crecen extremadamente rápido y llegan a acumular grandes cantidades de diversos productos. Algunas microalgas doblan su biomasa en 24 h y el tiempo de duplicación de biomasa durante la fase exponencial puede ser tan corto como 3.5 h (Chisti, 2007). La fotosíntesis es la conversión de materia inorgánica en materia orgánica gracias a la energía que aporta la luz. Los organismos que tienen la capacidad de llevar a cabo la fotosíntesis son llamados fotoautótrofos (otra nomenclatura posible es la de autótrofos, pero se debe tener en cuenta que bajo esta denominación también se engloban aquellas bacterias que realizan la quimiosíntesis) y fijan el CO2 atmosférico. En la actualidad se diferencian dos tipos de procesos fotosintéticos, que son la fotosíntesis oxigénica y la fotosíntesis anoxigénica. La primera de las modalidades es la propia de las plantas superiores, las algas y las cianobacterias, donde el dador de electrones es el agua y, como consecuencia, se desprende oxígeno. Mientras que la segunda, también conocida con el nombre de fotosíntesis bacteriana, la realizan las bacterias

8

purpúreas y verdes del azufre, en las que el dador de electrones es el sulfuro de hidrógeno, y consecuentemente, el elemento químico liberado no será oxígeno sino azufre, que puede ser acumulado en el interior de la bacteria, o en su defecto, expulsado al agua.De manera más específica, los beneficios que se obtienen al usar microalgas para la producción de biodiesel son: a) Las microalgas tienen un rendimiento de aceite mucho mayor que cualquier cultivo convencional. Es de 10 a 20 veces mayor que el derivado del aceite de palma y de 200 a 400 veces mayor que el derivado del aceite de soya. b) Sólo este bioenergético tiene una verdadera huella ecológica pequeña, dado que requiere una superficie de 1-2 órdenes de magnitud menores en comparación a los cultivos convencionales o los árboles. Requiere de 1.5 a 3.2 millones de hectáreas (M has) para satisfacer el 50% de las demandas de energéticos de transportación en U.S.A. (Chisti, 2007). En contraste, la soya, principal fuente de biodiesel en U.S.A. requiere de 330 a 450 M has para un propósito similar. En México, se ha estimado que sólo se requiere el 1% de la superficie total del país, para cubrir el 100% de la demanda actual de diesel de petróleo (Garibay et al., 2009). c) Con biodiesel de microalgas cultivadas en lagunas abiertas (LA), sólo se requieren 200,000 has para producir 1 quadrillón de BTU (Sheehanet al., 1998). En contraste, se requieren aproximadamente 40 millones de has si se utiliza etanol derivado de maíz o 20 millones de has si se utiliza biodiesel derivado de frijol de soya. d) Las microalgas oleaginosas pueden ser cultivadas en agua de mar o en agua salobre, disminuyendo así la presión sobre el agua dulce requerida para la producción de alimento. Algunas otras especies aisladas de agua dulce, pueden crecer en aguas residuales, también eliminando la competencia por el uso de agua para la agricultura. e) Las microalgas son excelentes captadoras de CO2. Por cada 100 ton de microalgas producidas, se consumen 183 ton de CO2 (Chisti, 2007). Loera-Quezada y Ollguíín,, 2010.. RevLattiinoamBiiottecnollAmbAllgall 1(1):91-116 98 f) Con relación a la emisión de gases invernadero, es de los pocos bionergéticos con un valor negativo. Es decir, no se produce CO2 durante el ciclo de vida de producción y el valor de este parámetro para microalgas (-183 kgCO2/MJ) es el más negativo respecto a los otros bionergéticos con valores negativos (etanol a partir de pastos o de residuos celulósicos). En contraste, el diesel a partir de fuentes fósiles produce 83 kgCO2/MJ y el etanol a partir de maíz produce 81-85 kgCO2/MJ (Chisti, 2007).

III. OBJETIVO GENERALEscoger e innovar el mejor método de extracción de triglicéridos para su transformación a biodiesel para obtener este en mayor cantidad, menor tiempo, mayor calidad y menor costo, debido a la necesidad de encontrar una fuente renovable más amigable al medio ambiente y con un menor costo al petrodiesel.

9

III.I Objetivos específicosInvestigar métodos para la extracción de Triglicèridos de las microalgas.Experimentar ventajas y desventajas de cada uno de los métodos.Seleccionar el mejor método para la extracción de lípidos y Triglicèridos.Entender y usar el mecanismo para la transformación de Triglicèridos a biodieselObtener rendimientos de cada uno.Observar ventajas y desventajas sobre otro tipo de cultivo para la transformación de biodiesel.

IV. HIPÓTESISSe producirá biocombustible a partir de microalgas debido a las ventajas que esta proporciona y se usaran diferentes métodos para su extracción de triglicéridos y su conversión a biodiesel.El uso del método de transesterificación para la conversión de triglicéridos a biodiesel es una de las mejores opciones que se tiene hoy en día debido a sus rendimientos, su facilidad de ejecución y a las ventajas mecánicas y ambientales que este proporciona. Para la obtención de los triglicéridos a partir de la microalga se pretende ejecutar una serie de métodos para obtener el mejor rendimiento y menor costo posible para el uso de estos. La extracción por el método Folch et al. modificado se cree que es el mejor por los rendimientos que puede proporcionar y el bajo costo que este presenta.

V. METODOLOGÍA

V.I Materiales y EquiposPara la reproducción sistemática de los distintos métodos de extracción de aceite, ensayados en el presente proyecto se utilizaron los siguientes materiales:Materia prima Biomasa seca y pulverizada de microalgas, de las especies Dunaliella tertiolecta, Chaetoceros calcitrans y Nannochloropsis sp.

Cloroformo (CHCl3) Hexano (C6H14) Metanol (CH3OH) Propanol (C3H7OH)

- Equipos Balanza analítica (marca: Ohaus, modelo: Discovery) Extractor Soxhlet Agitador Vortex (marca: Thermolyne-Barnstead, modelo: 63210-26) Centrífuga (marca: Hettich, modelo: Universal 16) Sonicador (marca: Bicasa, modelo: Ultrasonic) Agitador magnético (marca: J. SELECTA. S.A, modelo: 6003284)

10

Estufa (marca: Memmert, modelo: Universal 500) Refrigerador Plancha de calentamiento (marca: HW Kessel S.A) Desecador

V.II Microalgas analizadas Los ensayos se realizaron con tres especies de microalgas: Dunaliella tertiolecta y Chaetoceros calcitrans. La otra especie utilizada es Nannochloropsis sp; se utilizó esta cepa debido a su alto contenido de lípidos, además de contar con gran cantidad de biomasa seca. La decisión de realizar ensayos con diferentes especies de microalgas obedece a la importancia de evaluar la respuesta de distintas cepas frente a un mismo método de extracción de lípidos; es decir si estas ofrecen un rendimiento proporcional a los demás métodos o si, para una determinada cepa, se obtiene un mayor rendimiento asociado a un determinado método de extracción, dado que cada especie presenta características biológicas y fisicoquímicas particulares lo que podría producir una mejor respuesta frente a determinados solventes. A continuación se expondrá brevemente las principales características de las microalgas seleccionadas:

V.II.I Dunaliella tertiolecta Dunaliella tertiolecta es un alga verde unicelular, móvil y en forma de varilla que es común en las aguas saladas. Esta alga puede ser fácilmente cultivada en laboratorios. Su morfología la hace ideal para su recuento, pues no se agrupan ni forman cadenas. Su crecimiento es lo suficientemente rápido para medir con precisión el número de células después de 72 horas, lo que también significa que su consumo de CO2 es elevado. La especie es moderadamente sensible a las sustancias tóxicas y se reporta que esta cepa tiene un rendimiento de aceite de 37%.

V.II.II. Chaetoceros calcitrans Chaetoceros calcitrans es una diatomea marina ampliamente utilizada en la industria de la acuicultura, ya que se compone de valor nutricional adecuado para la mayoría de animales filtradores marinos. Pertenece a la familia Chaetocerotaceae, clase Bacillariophyceae del filo Heterokontophyta. Generalmente, el crecimiento celular y la reproducción se llevan a cabo mediante la división en dos células. Estas algas unicelulares microscópicas están rodeadas por una pared celular que está altamente impregnada de sílice (SiO2 nH2O). El tamaño de la célula es de 3-7 ∙ μm de longitud y de 3-5 μm de ancho. La Chaetoceros contiene lípidos con ácidos grasos altamente insaturados y un buen balance de vitaminas. Se reporta que esta especie presenta un rendimiento de aceite de 27%.

V.II.III. Nannochloropsis sp. Nannochloropsis sp., es una microalga generalmente marina, aunque se le ha encontrado también en agua dulce. Se considera un alga prometedora para aplicaciones industriales debido a su

11

capacidad de acumular altos niveles de ácidos grasos poli-insaturados. Su valor nutricional estriba en ser fuente de vitamina B12 y ácidos grasos no saturados EPA. Se utiliza principalmente como fuente de alimento energético para larvas de peces y rotíferos. Se reporta que esta cepa tiene un rendimiento de aceite de 32%.

V.III Determinación de lípidos y triglicéridos presentes en microalgas A continuación se describe cada uno de los métodos de extracción de lípidos aplicados a las muestras de microalgas para su posterior evaluación, lo que constituye uno de los objetivos de este trabajo. De los distintos métodos de extracción recogidos en la literatura científica, se escogieron aquellos que fueron probados en biomasa de microalgas y que, aplicados en distintas investigaciones relacionadas con la producción de biodiesel, presentaron el mayor rendimiento de aceite extraído, por lo que se les asume como los métodos más eficientes y compatibles con las características de las microalgas.

V.III.I Preparación de la muestraLa preparación de las muestras consiste en un tratamiento previo que se aplica a la biomasa seca de microalgas con la finalidad, principalmente, de permitir al solvente penetrar las células y lograr una extracción completa.La especie de microalga con la que se trabajó fue sometida a un pretratamiento de molienda en mortero de porcelana, de modo que la muestra quede completamente pulverizada y homogeneizada.

V.III.II Métodos de extracción La realización repetitiva de ensayos de métodos de extracción de aceite de microalgas se desarrolló de modo que se pueda comparar los resultados obtenidos en cada uno de ellos, con las distintas especies utilizadas, de manera objetiva, sistemática y estadísticamente significativa. Para asegurar la consistencia estadística de los resultados y minimizar la posibilidad de cometer error sistemático y/o aleatorio en la experimentación se realizaron cuatro pruebas por especie analizada y por método empleado, asegurando que las condiciones experimentales fueran las mismas para cada uno de los casos. Los solventes a utilizar para la extracción son los siguientes:

El hexano, solvente orgánico de fácil recuperación, ampliamente utilizado en la extracción de lípidos y comúnmente asociado a la extracción Soxhlet.

La solución cloroformo:metanol, de alta selectividad hacia lípidos totales al combinar un solvente polar y otro apolar además de utilizarse extensamente en la extracción de lípidos de tejidos marinos bajo los métodos Folch et al. y Bligh & Dyer; y

La solución hexano:isopropanol, también ampliamente utilizada, y que para el presente proyecto se toma en su versión modificada por Ramos et al. (2010).

12

V.III.II.I Extracción con solvente hexanoA. Extracción Soxhlet El proceso utilizado se basa en la metodología seguida en el proyecto FINCyT en la Universidad de Piura. Se trabajó con 5 g de muestra en aparato Soxhlet con balones de 500 mL. El tiempo de extracción sugerido en la bibliografía es de 4 horas, sin embargo, a fin de asegurar una extracción completa, se duplicó el tiempo de extracción en las pruebas realizadas (8 horas). Al ser este un sistema extracción en el que existe una baja probabilidad de cometer error sistemático/aleatorio, sólo se realizaron pruebas por duplicado.

V.III.II.II. Extracción con solución propanol: hexano A) Método Ramos 2010El método de extracción en base a una solución propanol:hexano que se evaluó en el presente trabajo fue planteado por Ramos et al. (2010) como parte de su tesis en la que se busca la maximización del rendimiento de aceite en microalgas.Por cada gramos de biomasa algal seañade 18 mL del solvente y se mezcla. Posteriomente se realiza una filtración con papel filtro Whatman, se evapora la solución filtrada y, finalmente se determina el contenido de lípidos gravimétricamente.

B) Método Ramos 2010 modificadoEn la Universidad Agraria de Molina, se propuso realizar una leve variación al método de Ramos et al. 2010; es así que, a fin de lograr una extracción más limpia y completa. De esta forma se cambió el proceso de filtrado con papel filtro Whatman 42 por la extracción directa de la solución conteniendo los lípidos previa sedimentación de la muestra, además se dejó reposar la solución extractora con la muestra por 24 horas a 4 °C y protegida de la luz

V.III.II.III. Extracción con solución cloroformo:metanol A) Método Folch Esta es la solución extractora planteada en el método de extracción Folch et al. (1957. Este método consiste en la homogeneización de tejido con solución extractora y el posterior lavado del extracto con una apropiada solución salina para, finalmente, obtener un sistema bifásico bien definido, en el que la fase inferior -fase clorofórmica- contiene los lípidos extraídos del tejido y la fase superior -fase metanol-agua- contiene las sustancias no lipídicas. La función de las sales en el agua es la de alterar la distribución de los lípidos y prácticamente eliminarlos de la fase superior; en la ausencia de sales, permanecen cantidades significativas de ácidos lipídicos en la fase acuosa y se pierden en el lavado.

B. Método Folch et al. modificado I Frente a las modificaciones observadas en el protocolo de extracción de lípidos del IMARPE (Instituto del Mar de Perú), se propuso aplicar ciertos criterios de éste en el método Folch et al.

13

1957 descrito anteriormente. Al igual que las modificaciones realizadas al método Ramos 2010, se adoptó la extracción directa de la solución clorofórmica conteniendo los lípidos, previa sedimentación de la muestra por centrifugación, y se dejó reposar la solución extractora con la biomasa por 24 horas a 4 °C y protegida de la luz. Esperando de este modo obtener una extracción más limpia y completa.

V.IV Conversión de lípidos y triglicéridos a biodieselDesde un punto de vista técnico no es viable la utilización directa de aceites vegetales en motores diesel debido entre otras razones a su elevada viscosidad, baja estabilidad frente a la oxidación (y las posteriores reacciones de polimerización), y a su baja volatilidad, lo que provoca la formación de una cantidad relativamente alta de cenizas como consecuencia de la combustión incompletal. Existen diversas metodologías para la producción de biodiesel, cuatro de ellas han sido estudiadas exhaustivamente: uso directo de aceites o mezclas de éstos con diesel fósil, microemulsiones, pirólisis y transesterificación (Balat y Balat., 2010; Garibay-Hernández et al., 2009. V.IV.I Pirólisis o cracking Consiste en la aplicación de energía térmica en presencia de aire u oxígeno para producir una modificación química. La descomposición térmica de los triglicéridos da lugar a compuestos de varias clases entre los que se incluyen alcanos, alquenos, alcanodienos, compuestos aromáticos y ácidos carboxílicos. Los diferentes tipos de aceites vegetales presentan grandes diferencias en la composición del aceite descompuesto térmicamente.

V.IV.II Microemulsión La microemulsión con alcoholes tales como metanol, etanol o 1- butanol tiene por objeto disminuir la viscosidad del biodiesel. Las microemulsiones son dispersiones (de aceite, agua, tensioactivos y a menudo, una pequeña molécula, llamada co-tensioactivo) isotrópicas, transparentes y termodinámicamente estables. Mediante este proceso se puede obtener un combustible de baja viscosidad pero la inyección de este combustible en un motor no resulta eficiente y da lugar a una combustión incompleta.

V.IV.III Trasnesterificación

La Figura 1 esquematiza de manera general la transesterificación de un triglicérido con un alcohol en un medio catalizado; ésta es la reacción comúnmente empleada para la obtención de biodiesel. Los productos correspondientes son una mezcla de alquilésteres de los ácidos grases constituyentes de los triglicéridos, y glicerina

14

Figura 1. Transesterificación de un triglicérido con un alcohol en un medio catalizado para la obtención de alquilésteres de ácidos grases y glicerina.

V.IV.III.I Procedimiento de Transesterificación

El aceite obtenido se debe deshidratar en un horno, para posteriormente agregar alcóxido mientras se lleva a cabo una agitación. Finalizada la reacción, la mezcla se deja reposar en un embudo de decantación. La fase superior que se forma, rica en ésteres, se somete a evaporación, recuperándose la mayor parte del exceso de alcohol utilizado.

V.IV.III.II. Procedimiento de purificación del biodiesel

Concluida la evaporación, los ésteres se lavan con agua acidificada 5% y se agita vigorosamente. Los jabones reaccionan con el ácido formando sales solubles en agua y ácidos grasos, las cuales se remueven durante el lavado mientras que los ácidos permanecen en el biodiesel. La mezcla se deja reposar en un embudo de decantación a temperatura ambiente. El biodiesel se deshidrata agregando Na2SO4 en una cantidad de 25% en masa; posteriormente, se separa mediante filtración, y sometiéndolo a evaporación

IV. RESULTADOS ESPERADOS

Se presentan los resultados de los análisis realizados siguiendo los métodos descritos anteriormente, así mismo, al final se realiza una evaluación comparativa y estadística de los distintos métodos de extracción

Una muestra es la cantidad determinada de biomasa seca de una especie de microalga que la cual fue sometida a análisis; una prueba hace referencia a cada uno de los cuatro experimentos realizados por muestra de especie de micro alga analizada y método de extracción aplicado; el ensayo engloba los resultados de las cuatro pruebas realizadas.

VI.I Extracción con Soxhlet

Los resultados obtenidos bajo este método se presentan en la siguiente tabla. Se considerarán como punto de partida para comparar el desempeño obtenido con los demás métodos.

Tabla 1.- Determinación de lípidos en Ccal, Dun y Nanno: extracción con hexano – método Soxhlet

Masa de cada muestra: 2,5 g en Ccal y Dun; 5 g en Nanno Cepa Muestra Lípidos (g) Porcentaje

de lípidos PROMEDIO CV

Chaetoceros C1 0,25890 10,356% 10,31% 0,66%

15

calcitrans C2 0,25650 10,260% Dunnaliella tertiolecta

D1 0,31530 12,612% 12,67% 0,60%

D2 0,31800 12,720% Nannochloropsis sp.

N1 0,31920 6,384% 6,35% 0,87%

N2 0,31530 6,306%

VI.II .-Extracción con solución hexano: propanol

Los resultados obtenidos con este método son similares a los de la extracción Soxhlet. Lo interesante, y que realza la importancia del método, es que la extracción se realiza en un tiempo mucho más corto (más de 7 horas de diferencia) produciendo un gran ahorro de energía y ejecución.

Tabla 2.- Determinación de lípidos en Ccal, Dun y Nanno: extracción con propanol: hexano

Masa de cada muestra de biomasa micro alga: 0,5 g Cepa Muestra Lípidos (g) Porcentaje

de lípidos PROMEDIO CV

Chaetoceros calcitrans

C1 0,04720 9,440% 9,59% 1,39%

C2 0,04840 9,680% C3 0,04830 9,660% C4* 0,04399 8,798% Dunnaliella tertiolecta

D1 0,07320 14,640% 14,66% 1,44%

D2 0,07440 14,880% D3* 0,07540 15,080% D4 0,07230 14,460% Nannochloropsis sp.

N1 0,02190 4,380% 4,39% 3,01%

N2 0,02260 4,520% N3 0,02128 4,256% N4* 0,02376 4,752%

VI.III Extracción con cloroformo: metanol16

Es necesario conocer la densidad de las muestras a fin de obtener las proporciones correctas de solventes a utilizar en los procedimientos.

MUESTRA DENSIDAD (g/mL)calcitrans (Ccal) 0,63801 Dunaliella tertiolecta (Dun) 0,618535 Nannochloropsis sp. (Nanno) 0,63801

Teniendo en cuenta estos datos se presenta a continuación los resultados obtenidos por cada método evaluado que aplica esta solución extractora.

Tabla.- Determinación de lípidos en Ccal, Dun y Nanno: extracción con propanol: hexano

Masa de cada muestra de biomasa microalgas: 0,25 g Cepa Muestra Lípidos (g) Porcentaje

de lípidos PROMEDIO CV

Chaetoceros calcitrans

C1 0,04583 18,332% 17,60% 5,17%

C2* 0,03805 15,220% C3 0,04469 17,876% C4 0,04145 16,580% Dunnaliella tertiolecta

D1 0,05270 21,080% 22,02% 6,25%

D2 0,05900 23,600% D3 0,05345 21,380% D4* 0,06483 25,932% Nannochloropsis sp.

N1 0,01134 4,536% 4,33% 4,47%

N2* 0,01210 4,840% N3 0,01075 4,300% N4 0,01038 4,152%

VI.IV Método Folch et al. Modificado I

Se decidió entonces probar los lineamientos del protocolo excluyendo la sonicación, sobre el método que, hasta el momento, había dado los mejores resultados: Folch et al. Lo cual, posteriormente, permitiría evaluar de forma apropiada la influencia de este método de pretratamiento. Se debe mencionar también que a partir de este punto la proporción muestra:

17

solución extractora se hizo en función de un volumen de 0,25 mL de muestra pulverizada, en contraste a los anteriores ensayos que se basaban en una masa de 0,25 g.

Tabla.- Determinación de lípidos en Ccal, Dun y Nanno: extracción con cloroformo: metanol por método Folch et al. Modificado I.

Volumen de la muestra de biomasa micro alga: 0,25 mL Cepa Masa (g) Muestra Lípidos

(g) Porcentaje de lípidos

PROMEDIO

CV

Chaetoceros calcitrans

0,15950 C1 0,08776 55,021% 42,04% 34,33%

C2 0,03556 22,294% C3 0,07989 50,087% C4 0,06502 40,764%

Dunaliella tertiolecta

0,15463 D1 0,06664 43,095% 52,26% 21,55%

D2 0,10577 68,400% D3 0,07914 51,179% D4 0,07168 46,355%

Nannochloropsis sp.

0,13905 N1 0,05373 38,642% 46,44% 16,92%

N2 0,07750 55,737% N3 0,05755 41,389% N4 0,06949 49,977%

Como se puede observar en las tablas anteriores el Método Folch et al. Modificado I nos da un mejor rendimiento de lípidos por lo que nos lleva a elegirlo en primera instancia.

VI.V Resultados Conversión de lípidos y triglicéridos a biodiesel

Existen diversas metodologías para la producción de biodiesel, cuatro de ellas han sido estudiadas exhaustivamente: uso directo de aceites o mezclas de éstos con diesel fósil, microemulsiones, pirólisis y transesterificación. Nosotros nos enfocamos solo en transesterificación ya que es el mejor en cuanto a tiempo y rendimientos.Ya que con los resultados anteriormente observados de la extracción de lípidos con el Método Folch et al. Modificado I se puede concluir que para tener un mayor obtención de biodisel a través de los lípidos o triglicéridos.

18

Estos resultados no se pueden expresar cuantitativamente ya que no se tiene una firme idea de la cantidad exacta o porcentual que se obtenga a través de esta experimentación ya que no fue realizada.

VII CONCLUSIONES

El gran resultado a esperar es que por medio de estas experimentaciones se pueda extraer el deseado biodiesel para así poder tener otra alternativa de extraer este tipo de combustible de manera ecológica y sustentable.

Y como se pudo apreciar en los resultados anteriormente expresados se puede concluir que el Método Folch et al. Modificado I es el que nos da un mayor porcentaje de rendimiento de los lípidos de la cepa de microalga. A pesar de que ya se sabe método nos da un mejor resultado no hay que descartar el uso de los otros métodos ya que nos necesarios de realizar para obtener una mayor certeza y por lo tanto un mejor resultado (BIODISEL).

Como se pudo observar en los resultados esperados la microalgas Dunaliella tertiolecta y Chaetoceros calcitrans las mejor selección si lo que se desea es tener mayor rendimiento y mejor adaptación. Y la Nannochloropsis sp. Esta cepa debido a su alto contenido de lípidos, además de contar con gran cantidad de biomasa seca. Con estas tres microalgas el biodiesel es seguro de producir.

Y como se pudo apreciar en los resultados anteriormente expresados se puede concluir que el Método Folch et al. Modificado I es el que nos da un mayor porcentaje de rendimiento de los lípidos de la cepa de micro alga. A pesar de que ya se sabe método nos da un mejor resultado no hay que descartar el uso de los otros métodos ya que nos necesarios de realizar para obtener una mayor certeza y por lo tanto un mejor resultado (BIODISEL).

Para la obtención de biodisel atreves de los lípidos e el método de transesterificación ya que nos da un mayor rendimiento y en menor tiempo.

Bibliografía:

1.Donohue, T.; Cogdell, R. Microorganisms and clean energy. Nat Rev.Microbiol. 4: 800, 20062. Zhenk, P.M.; Thomas-Hall, S.R.; Stephens, E.; Marx, U.C.; Mussgnug, J.H.; Posten, C.; et al. Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production. Bioenerg. Res. 1: 20-42. 20083. Meng, X.; Yang, X.; Xu, X.; Zhang, L.; Nie, Q.; Xian, M. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. RenewableEnergy 34, 1-5, 2009

19

4. Rodolfi, L.; Zitteli, G.C.; Bassi, N.; Padovani, G.; Biondi, N.; Bonini, G.; et al.Microalgae for oil: strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor.Biotechnol. Bioeng. 102:100-102, 20095. Ma, F.; Hanna, M.A. Biodiesel production: a review. Bioresour Technol. 82: 775-780, 19996. Al-Zuhair, S. Production of biodiesel: possibilities and challenges. Biofuels Bioprod. Bioref. 1: 57-66, 20077. Liu, B.; Zhao, Z.K. Biodiesel production by direct methanolysis of oleaginous microbial biomass. J ChemTechnolBiotechnol, 82. 775-780, 20078. Sharma, Y.C.; Singh, B.; Upadhyay, S.N. Advancements in development and characterizationof biodiesel: a review. Fuel. 87: 2355-2373, 2008 9. Vasudevan, P.T.; Briggs, M. Biodiesel production-current state of the art and challenges. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35: 421-430, 200810. Fairless, D. The little shrub that could - maybe. Nature, 449: 652-655, 200711. Song, D.; Fu, J.; Shi, D. Exploitation of oil-bearing microalgae for biodiesel. Chin. J. Biotech. 24: 341-348, 200812. British Petroleum Statistical Review of World Energy, 200813. BP Statistical Review of World Energy 2010 www.bp.com/statisticalreview (consultadoJunio 2010)14. Li, Y.H.; Liu, B.; Zhao, Z.B.; Bai, F.W. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidiumtoruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microb. Technol 41: 312-317. 2007

15. Chisti, Y. 2007. Biodiesel from microalgae. BiotechnolAdv25(3):294-306. 16. Chisti, Y. 2008. Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends Biotechnol26:126-131. 17. Chiu, S.-Y., Kao, C.-Y., Tsai. M.-T., Ong, S.-C., Chen, C.-H., Lin, C.-S. 2009. Lipid accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsisoculatain response to CO2 aeration. BioresourceTechnol100(2):833-83818.Li, Y., Horsman, M., Wu, N., Lan, C.Q., Dobois-Calero, N. 2008b. Biofuels from microalgae. BiotechnolProg24(4):815-820. 19.Li, Y., Horsman, M., Wang, B., Wu, N., Lan, C.Q. 2008c. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green algae Neochlorisoleabundans. ApplMicrobiolBiotechnol81(4):629-636. 20.Li, X., Hu, H-Y., Yang, J. 2010. Lipid accumulation and nutrient removal properties of a newly isolated freshwater microalga, Scenedesmussp. LX1, growing in secondary effluent. New Biotechnol27(1)59-63. 21.Liang, Y., Sarkany, N., Cui, Y. 2009. Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions. Biotechnol Lett 31:1043-1049. 22.Liu, Z.Y., Wang, G.C., Zhou, B.C. 2008. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris. BioresourceTechnol99(11):4717-4722

20

23. Predojevic, Z. J. (2008). “The production of biodieselfrom waste frying oils: A comparison of different purification steps”. Fuel, 87: 3522-3528.24. ] Knothe, G. (2006). Analyzing Biodiesel: Standards and Other Methods”. Journal of American Oil Chemists’ Society, 83(10): 823-833.25. Vicente, G., Coteron,A., Martinez, M. & Aracil, J.(1998). “Application of the factorial design of experiments and response surface methodology to optimize biodiesel production” Industrial Crops and Products, 8: 29-35.

ANEXOSI. Metodología

I.I Materiales y Equipos

Para la reproducción sistemática de los distintos métodos de extracción de aceite, ensayados en el presente proyecto se utilizaron los siguientes materiales:

Materia prima Biomasa seca y pulverizada de microalgas, de las especies Dunaliella tertiolecta, Chaetoceros calcitrans y Nannochloropsis sp.

Cloroformo (CHCl3) Hexano (C6H14) Metanol (CH3OH) Propanol (C3H7OH)

- Equipos

Balanza analítica (marca: Ohaus, modelo: Discovery) Extractor Soxhlet Agitador Vortex (marca: Thermolyne-Barnstead, modelo: 63210-26) Centrífuga (marca: Hettich, modelo: Universal 16) Sonicador (marca: Bicasa, modelo: Ultrasonic) Agitador magnético (marca: J. SELECTA. S.A, modelo: 6003284) Estufa (marca: Memmert, modelo: Universal 500) Refrigerador Plancha de calentamiento (marca: HW Kessel S.A) Desecador

I.II Microalgas analizadas

21

Los ensayos se realizaron con tres especies de microalgas: Dunaliella tertiolecta y Chaetoceros calcitrans. La otra especie utilizada es Nannochloropsis sp; se utilizó esta cepa debido a su alto contenido de lípidos, además de contar con gran cantidad de biomasa seca.

La decisión de realizar ensayos con diferentes especies de microalgas obedece a la importancia de evaluar la respuesta de distintas cepas frente a un mismo método de extracción de lípidos; es decir si estas ofrecen un rendimiento proporcional a los demás métodos o si, para una determinada cepa, se obtiene un mayor rendimiento asociado a un determinado método de extracción, dado que cada especie presenta características biológicas y fisicoquímicas particulares lo que podría producir una mejor respuesta frente a determinados solventes. A continuación se expondrá brevemente las principales características de las microalgas seleccionadas:

I.II.I. Dunaliella tertiolecta Dunaliella tertiolecta es un alga verde unicelular, móvil y en forma de varilla que es común en las aguas saladas. Esta alga puede ser fácilmente cultivada en laboratorios. Su morfología la hace ideal para su recuento, pues no se agrupan ni forman cadenas. Su crecimiento es lo suficientemente rápido para medir con precisión el número de células después de 72 horas, lo que también significa que su consumo de CO2 es elevado. La especie es moderadamente sensible a las sustancias tóxicas y se reporta que esta cepa tiene un rendimiento de aceite de 37%. I.II.II. Chaetoceros calcitrans Chaetoceros calcitrans es una diatomea marina ampliamente utilizada en la industria de la acuicultura, ya que se compone de valor nutricional adecuado para la mayoría de animales filtradores marinos. Pertenece a la familia Chaetocerotaceae, clase Bacillariophyceae del filo Heterokontophyta. Generalmente, el crecimiento celular y la reproducción se llevan a cabo mediante la división en dos células. Estas algas unicelulares microscópicas están rodeadas por una pared celular que está altamente impregnada de sílice (SiO2 nH2O). El tamaño de la célula es de 3-7 ∙ μm de longitud y de 3-5 μm de ancho. La Chaetoceros contiene lípidos con ácidos grasos altamente insaturados y un buen balance de vitaminas. Se reporta que esta especie presenta un rendimiento de aceite de 27%.

I.II.III. Nannochloropsis sp. Nannochloropsis sp., es una microalga generalmente marina, aunque se le ha encontrado también en agua dulce. Se considera un alga prometedora para aplicaciones industriales debido a su capacidad de acumular altos niveles de ácidos grasos poli-insaturados. Su valor nutricional estriba en ser fuente de vitamina B12 y ácidos grasos no saturados EPA. Se utiliza principalmente como fuente de alimento energético para larvas de peces y rotíferos. Se reporta que esta cepa tiene un rendimiento de aceite de 32%.

I.III Determinación de lípidos y triglicéridos presentes en microalgas A continuación se describe cada uno de los métodos de extracción de lípidos aplicados a las muestras de microalgas para su posterior evaluación, lo que constituye uno de los objetivos de este trabajo. De los distintos métodos de extracción recogidos en la literatura científica, se escogieron aquellos que fueron probados en biomasa de microalgas y que, aplicados en distintas

22

investigaciones relacionadas con la producción de biodiesel, presentaron el mayor rendimiento de aceite extraído, por lo que se les asume como los métodos más eficientes y compatibles con las características de las microalgas.

I.III.I Preparación de la muestraLa preparación de las muestras consiste en un tratamiento previo que se aplica a la biomasa seca de microalgas con la finalidad, principalmente, de permitir al solvente penetrar las células y lograr una extracción completa.La especie de microalga con la que se trabajó fue sometida a un pretratamiento de molienda en mortero de porcelana, de modo que la muestra quede completamente pulverizada y homogeneizada.

I.III.II Métodos de extracción La realización repetitiva de ensayos de métodos de extracción de aceite de microalgas se desarrolló de modo que se pueda comparar los resultados obtenidos en cada uno de ellos, con las distintas especies utilizadas, de manera objetiva, sistemática y estadísticamente significativa. Para asegurar la consistencia estadística de los resultados y minimizar la posibilidad de cometer error sistemático y/o aleatorio en la experimentación se realizaron cuatro pruebas por especie analizada y por método empleado, asegurando que las condiciones experimentales fueran las mismas para cada uno de los casos. Los solventes a utilizar para la extracción son los siguientes:

El hexano, solvente orgánico de fácil recuperación, ampliamente utilizado en la extracción de lípidos y comúnmente asociado a la extracción Soxhlet.

La solución cloroformo:metanol, de alta selectividad hacia lípidos totales al combinar un solvente polar y otro apolar además de utilizarse extensamente en la extracción de lípidos de tejidos marinos bajo los métodos Folch et al. y Bligh & Dyer; y

La solución hexano:isopropanol, también ampliamente utilizada, y que para el presente proyecto se toma en su versión modificada por Ramos et al. (2010).

I.III.II.I Extracción con solvente hexano

A. Extracción Soxhlet El proceso utilizado se basa en la metodología seguida en el proyecto FINCyT en la Universidad de Piura. Se trabajó con 5 g de muestra en aparato Soxhlet con balones de 500 mL. El tiempo de extracción sugerido en la bibliografía es de 4 horas, sin embargo, a fin de asegurar una extracción completa, se duplicó el tiempo de extracción en las pruebas realizadas (8 horas). Al ser este un sistema extracción en el que existe una baja probabilidad de cometer error sistemático/aleatorio, sólo se realizaron pruebas por duplicado.

I.III.II.II. Extracción con solución propanol: hexano

A) Método Ramos 2010

23

El método de extracción en base a una solución propanol:hexano que se evaluó en el presente trabajo fue planteado por Ramos et al. (2010) como parte de su tesis en la que se busca la maximización del rendimiento de aceite en microalgas.Por cada gramos de biomasa algal seañade 18 mL del solvente y se mezcla. Posteriomente se realiza una filtración con papel filtro Whatman, se evapora la solución filtrada y, finalmente se determina el contenido de lípidos gravimétricamente.

B) Método Ramos 2010 modificadoEn la Universidad Agraria de Molina, se propuso realizar una leve variación al método de Ramos et al. 2010; es así que, a fin de lograr una extracción más limpia y completa. De esta forma se cambió el proceso de filtrado con papel filtro Whatman 42 por la extracción directa de la solución conteniendo los lípidos previa sedimentación de la muestra, además se dejó reposar la solución extractora con la muestra por 24 horas a 4 °C y protegida de la luz

I.III.II.III. Extracción con solución cloroformo:metanol

A) Método Folch Esta es la solución extractora planteada en el método de extracción Folch et al. (1957. Este método consiste en la homogeneización de tejido con solución extractora y el posterior lavado del extracto con una apropiada solución salina para, finalmente, obtener un sistema bifásico bien definido, en el que la fase inferior -fase clorofórmica- contiene los lípidos extraídos del tejido y la fase superior -fase metanol-agua- contiene las sustancias no lipídicas. La función de las sales en el agua es la de alterar la distribución de los lípidos y prácticamente eliminarlos de la fase superior; en la ausencia de sales, permanecen cantidades significativas de ácidos lipídicos en la fase acuosa y se pierden en el lavado.

B. Método Folch et al. modificado I Frente a las modificaciones observadas en el protocolo de extracción de lípidos del IMARPE (Instituto del Mar de Perú), se propuso aplicar ciertos criterios de éste en el método Folch et al. 1957 descrito anteriormente. Al igual que las modificaciones realizadas al método Ramos 2010, se adoptó la extracción directa de la solución clorofórmica conteniendo los lípidos, previa sedimentación de la muestra por centrifugación, y se dejó reposar la solución extractora con la biomasa por 24 horas a 4 °C y protegida de la luz. Esperando de este modo obtener una extracción más limpia y completa.

I.IV Conversión de lípidos y triglicéridos a biodieselDesde un punto de vista técnico no es viable la utilización directa de aceites vegetales en motores diesel debido entre otras razones a su elevada viscosidad, baja estabilidad frente a la oxidación (y las posteriores reacciones de polimerización), y a su baja volatilidad, lo que provoca la formación de una cantidad relativamente alta de cenizas como consecuencia de la combustión incompletal. Existen diversas metodologías para la producción de biodiesel, cuatro de ellas han sido estudiadas exhaustivamente: uso directo de aceites o mezclas de éstos con diesel fósil, microemulsiones, pirólisis y transesterificación (Balat y Balat., 2010; Garibay-Hernández et al., 2009.

24

I.IV.I Pirólisis o cracking Consiste en la aplicación de energía térmica en presencia de aire u oxígeno para producir una modificación química. La descomposición térmica de los triglicéridos da lugar a compuestos de varias clases entre los que se incluyen alcanos, alquenos, alcanodienos, compuestos aromáticos y ácidos carboxílicos. Los diferentes tipos de aceites vegetales presentan grandes diferencias en la composición del aceite descompuesto térmicamente.

I.IV.II Microemulsión La microemulsión con alcoholes tales como metanol, etanol o 1- butanol tiene por objeto disminuir la viscosidad del biodiesel. Las microemulsiones son dispersiones (de aceite, agua, tensioactivos y a menudo, una pequeña molécula, llamada co-tensioactivo) isotrópicas, transparentes y termodinámicamente estables. Mediante este proceso se puede obtener un combustible de baja viscosidad pero la inyección de este combustible en un motor no resulta eficiente y da lugar a una combustión incompleta.

I.IV..II Trasnesterificación

La Figura 1 esquematiza de manera general la transesterificación de un triglicérido con un alcohol

en un medio catalizado; ésta es la reacción comúnmente empleada para la obtención de biodiesel. Los productos correspondientes son una mezcla de alquilésteres de los ácidos grases constituyentes de los triglicéridos, y glicerina

Figura 1. Transesterificación de un triglicérido con un alcohol en un medio catalizado para la obtención de alquilésteres de ácidos grases y glicerina.

I.IV.III.I Procedimiento de Transesterificación

El aceite obtenido se debe deshidratar en un horno, para posteriormente agregar alcóxido mientras se lleva a cabo una agitación. Finalizada la reacción, la mezcla se deja reposar en un embudo de decantación. La fase superior que se forma, rica en ésteres, se somete a evaporación, recuperándose la mayor parte del exceso de alcohol utilizado.

I.IV.III.II. Procedimiento de purificación del biodiesel

Concluida la evaporación, los ésteres se lavan con agua acidificada 5% y se agita vigorosamente. Los jabones reaccionan con el ácido formando sales solubles en agua y ácidos grasos, las cuales se remueven durante el lavado mientras que los ácidos permanecen en el biodiesel. La mezcla se deja reposar en un embudo de decantación a temperatura ambiente. El biodiesel se deshidrata

25

agregando Na2SO4 en una cantidad de 25% en masa; posteriormente, se separa mediante filtración, y sometiéndolo a evaporación

26