NDICE:1INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS2EFECTO DE LA TEMPERATURA2.1EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO2.2CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS2.2.1MICROORGANISMOS PSICRFILOS2.2.2MICROORGANISMOS MESFILOS2.2.3MICROORGANISMOS TERMFILOS2.3EFECTO LETAL DEL CALOR2.3.1CALOR HMEDO2.3.2CALOR SECO2.4EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS3LIOFILIZACION4EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS5EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS5.1CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULAS5.2EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES5.3EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA5.3.1FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV5.3.2MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS5.3.3APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV5.4EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE6EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS7EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA8EFECTOS DE LA PRESIN OSMTICA9EFECTO DEL pH

1 INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas procariticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que las clulas de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de aos, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida normal, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo cmodamente a pHs muy cidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanos consideramos como extremos reciben el calificativo de extremfilos. En este captulo veremos algunas de estas notables adaptaciones.Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;2) condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales;3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de parmetros para:a) la mutagnesis,b) la esterilizacin y desinfeccin,c) la quimioterapia.No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra.Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la hubiera) o de reproduccin.Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:Agentes fsicos (tema 13)Agentes qumicos (tema 14)

TemperaturaDesinfectantes y antispticos

DesecacinQuimioterpicos de sntesis

RadiacionesAntibiticos

Ondas sonoras

Presin hidrosttica

Presin osmticapH

2 EFECTO DE LA TEMPERATURA2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTOLa temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en funcin de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos caractersticos llamados temperaturas cardinales:

Temperatura mnima: por debajo de ella no hay crecimiento;

Temperatura mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento;

Temperatura ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo).

El margen entre la temperatura mnima y la mxima se suele llamar margen de crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.La temperatura mnima se puede explicar en funcin de un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes y el gradiente de protones.Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, debido a que las reacciones metablicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su ptimo. En dicha temperatura ptima las enzimas y reacciones se dan a su mxima tasa posible.A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura mxima. Dicha temperatura refleja desnaturalizacin e inactivacin de protenas enzimticas esenciales, colapsamiento de la membrana citoplsmica y a veces lisis trmica de la bacteria.Obsrvese en el grfico que la temperatura ptima est ms cerca de la mxima que de la mnima.2.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVASCada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura ptima superior a la temperatura mxima de otra, o inferior a la temperatura mnima de una tercera. Segn el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales:2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOSLas psicrfilas o crifilas: crecen a partir de entre -5 a 5C.a) Las llamadas psicrfilas obligadas tienen temperatura ptima a 15-18C, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antrtida es lo que pudiramos llamar un psicrfilo extremo: tiene su ptimo de crecimiento en 4C, y es incapaz de crecer a 14C (se muere de calor!).b) Las psicrfilas facultativas o psicrotolerantes (tambin llamadas psicrotrofas) presentan temperatura ptima en torno a los 20-30C y mximas a los 35C. Las bacterias y hongos psicrotrofos son los responsables de que los alimentos guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo.Ejemplos de medios permanentemente fros son la mayor parte de las aguas ocenicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan slo 1-2C por encima de cero) y las reas permanentemente heladas del rtico y de la Antrtida. En los medios helados existen pequeas bolsas o microcavidades de agua lquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muy caracterstico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de montaa a mitad de la estacin estival.Las principales adaptaciones bioqumicas a medios fros exhibidas por estos microorganismos psicrfilos son:enzimas ms resistentes al fro;

sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas;

los fosfolpidos de la membrana celular aumentan la proporcin de cidos grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces); ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitndose su congelacin.

Los psicrotrofos (psicrfilos facultativos) son ms abundantes, ya que estn adaptados a soportar grandes oscilaciones trmicas, y en verano pueden crecer a unos 30C-40C. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y hortalizas) que se guardan en frigorficos, alterando las cualidades organolpticas e incluso, echndolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido).2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOSLos mesfilos presentan temperaturas ptimas a los 25-40C y mximas entre 35 y 47C. La mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patgenas) pertenecen a esta categora. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y tropicales, incluyendo los simbiontes y parsitos, pertenecen a esta categora.2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOSLas nicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65C son todas procariotas. Los termfilos presentan ptimos a 50-75C y mximos entre 80 y 113C. Dentro de esta categora se suele distinguir las termfilas extremas (=hipertermfilas), que pueden llegar a presentar ptimos cercanos a los 100C, y que taxonmicamente pertenecen al dominio de las Archaea.Los hbitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima de 45-50C) estn restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente relacionadas con fenmenos volcnicos:fuentes termales volcnicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japn, Nueva Zelanda e Islandia);

fuentes termales submarinas: los llamados humeros (fumarolas hidrotermales) asociados a las grandes dorsales ocenicas);

fumarolas

Los materiales en fermentacin como acmulos de abono (compost) y ensilados pueden alcanzar 65C.

Como ejemplo clsico, muy conocido por documentales de divulgacin, recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentracin mundial de fuentes volcnicas, con giseres que emiten a ms de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones de +/- 1 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullicin. El riachuelo que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. All fue donde T.D. Brock descubri la eubacteria termfila Thermus aquaticus, de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente (Taq) empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) automatizada. Recientemente se est recurriendo a usar la polimerasa de una arquea hipertermfila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100C.Los hipertermfilos, con ptimos por encima de los 80C son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su ptimo nada menos que a 105C y puede llegar a aguantar 113C, y parece que detiene su metabolismo (por fro) a la agradable temperatura de 90C (!).

Las termfilas facultativas pueden crecer a menos de 37C, como p. ej. la eubacteria Thermus aquaticus.

Se han aislado bacterias termfilas en medios artificiales, como calentadores de agua domsticos e industriales.Las principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas en clulas vegetativas bacterianas son:enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrfobo;

ribosomas termorresistentes;

membranas ricas en cidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofbicos ms fuertes.

En Arqueas hipertermfilas los lpidos son muy especiales: en vez de basarse en steres de cidos grasos con el glicerol, se trata de teres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace ter es ms resistente). Algunas, adems, en vez de la tpica bicapa lpdica, exhiben una monocapa bioqumica de C40-bifitanil-tetrateres (resultado de unirse cola con cola dos C20-fitanil-diteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes ambientales. (repasar tema 6).

2.3 EFECTO LETAL DEL CALORAl subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idneo. La muerte por calor es una funcin exponencial de primer orden:dN/dt = -KTNO sea, y como se puede constatar en el grfico adjunto, la accin del calor supone la muerte de una fraccin constante (KT) de la poblacin sobreviviente en cada momento.La cintica de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana).Cmo podemos caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de una suspensin bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados:tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura;

tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D);

punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

Ejemplospunto trmico mortalEspecies

55oCEscherichia coli

60oCMycobacterium tuberculosis

120oCendosporas de especies muy resistentes de Bacillus.

Estos tres parmetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en las de fabricacin de conservas, centrales lecheras, etc.Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento trmico, lograremos inactivacin parcial de la poblacin microbiana (es decir, queda una fraccin de clulas viables) o bien esterilizacin (=inactivacin total).En general, entendemos por esterilizacin todo tratamiento de un material con un agente fsico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o qumico (como veremos en el captulo 14) que acarrea la eliminacin de toda forma de vida en l. Una vez estril, el material sigue estril indefinidamente con tal de que est encerrado en un compartimento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior.Centrndonos de nuevo en el calor, la inactivacin parcial o la esterilizacin se pueden lograr por calor hmedo o por calor seco.La inactivacin (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalizacin de protenas y a la fusin de lpidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces dbiles, sobre todo los puentes de hidrgeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlaces se rompen ms fcilmente por calor hmedo (en atmsfera saturada de vapor de agua), debido a que las molculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrgeno.2.3.1 CALOR HMEDOPor lo tanto, la inactivacin por calor hmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones de inactivacin total por calor hmedo:Microorganismocondiciones

La mayora de clulas vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos80oC , 5-10 min

Bacilo tuberculoso58oC , 30 min

Bacilo tuberculoso59oC , 20 min

Bacilo tuberculoso65oC , 2 min

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis60oC , 60 min

La mayora de esporas de bacterias patgenas100oC , pocos min

esporas del patgeno Clostridium botulinum100oC , 5,5 horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos100oC , muchas horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos120oC , 15 minutos

Veamos los mtodos principales de lograr esterilizacin de materiales por calor hmedo:Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentar muestras por calor hmedo a temperaturas superiores a las de ebullicin del agua (sin que sta hierva), debido a que el tratamiento se efecta en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosfrica. (El funcionamiento del autoclave ser oportunamente explicado en clases prcticas). Los parmetros de esterilizacin suelen ser: temperatura 121C y 10-15 min. Como se puede deducir, estos parmetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especies saprofitas (ver ltima lnea de la tabla anterior), que son las formas de vida que ms aguantan el calor sin perder viabilidad.(Hay que tener en cuenta que, en la prctica, a veces hay que emplear condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volmenes de lquido, habr que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min, ya que el centro del recipiente donde va el lquido tarda ms en alcanzar la temperatura de esterilizacin. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a 115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en estas ocasiones, el tiempo tambin es mayor: 30 min).La accin rpida del calor hmedo depende en buena parte del alto valor de calor latente del agua (540 calg-1); ello hace que los objetos ms fros (como las muestras a esterilizar) se calienten rpidamente por condensacin de agua en su superficie.Tindalizacin (nombre en honor de John Tyndall): Es un mtodo de esterilizacin fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a ms de 100C. Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 4) de dos fases sucesivas cada uno:a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100C, durante 1 2 horas;b) en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37C durante 24 horas.Durante las fases de tipo a) mueren todas las clulas vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se produce la germinacin de las esporas activadas en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirn las clulas vegetativas procedentes de la germinacin en la fase anterior; y as sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningun microrganismo en la muestra.Como se puede ver, este mtodo es bastante engorroso y consumidor de tiempo, por lo que en los ltimos aos ha sido reemplazado por otro mtodo de esterilizacin, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilizacin por filtracin. Consiste de hacer pasar una solucin a travs de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamao inferior al de cualquier clula bacteriana (dimetro de poro =0,22 m).Aplicaciones principales del calor hmedo:1. En la prctica cotidiana del laboratorio de microbiologa, en la esterilizacin de medios de cultivo y soluciones.2. En la esterilizacin de material quirrgico.3. En la esterilizacin o inactivacin parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados).a) En la industria lctea se emplean como mtodos de esterilizacin la llamada uperizacin. La uperizacin o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de calor hmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. ej.: 135-150C durante 1-2 seg).b) Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los posibles microorganismos patgenos que pueden contaminarla, y que son ms sensibles al calor que los saprfitos inofensivos. Con esta inactivacin parcial de la poblacin microbiana de la leche logramos que sta se conserve durante unos das, sin alterar apenas sus cualidades organolpticas y nutricionales. He aqu los procedimientos ms habituales para conseguir esto:i. La pasteurizacin (en honor a Pasteur, que la introdujo en los aos 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfra y envasa rpidamente.ii. La pasteurizacin instantnea (tambin conocida por sus siglas en ingls HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72C durante slo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfra rpidamente. Esta tcnica es la ms usada actualmente, ya que:mata ms rpidamente;

mata mejor organismos ms resistentes;

altera menos el sabor;

acta en flujos continuos (y permite procesar grandes volmenes de leche).

Tras la pasteurizacin, el nmero de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patgenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc) son eliminados fcilmente. La pasteurizacin tambin se emplea para la preparacin de vacunas a base de microorganismos inactivados por el calor.2.3.2 CALOR SECOComo ya dijimos, la esterilizacin por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor hmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrgeno y la desnaturalizacin de protenas, as como la fusin de membranas, se efectan a mayores energas. Otros efectos del calor seco son los daos por oxidacin y el provocar un aumento de la concentracin de electrolitos.Aplicaciones del calor seco:1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170C durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metlico, aceites y jaleas, etc.2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metlicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias.3. Incineracin de materiales de desecho.2.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIASLas bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mnima) no son tiles para la esterilizacin, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelacin (p. ej., especies patgenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo, bacteriosttico, sin contar aquellos organismos psicrfilos o psicrotrofos.Los efectos de someter una suspensin bacteriana a temperaturas menores de 0C dependen de:el medio donde estn suspendidas las bacterias;

el modo en que se realice la congelacin y una ulterior descongelacin.

Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelacin del medio, el citoplasma queda en sobrefusin (sin congelar) entre -1 y -10C. Pero como la tensin de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser:por prdida de agua de la clula (cuando la congelacin se efecta lentamente), o bien

por cristalizacin de agua en el interior (cuando la congelacin se realiza rpidamente).

En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que supone que la solucin del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitacin de sales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentracin de electrolitos provocan la desnaturalizacin de protenas y daos a la membrana; otro efecto de menor importancia es el dao mecnico a la pared celular y a la membrana provocado por los cristales de hielo.En general, el enfriamiento rpido es ms lesivo que el lento, existiendo una velocidad ptima. Cuando una bacteria se enfra rpidamente a -35C se producen cristales de hielo que provocan daos cuando la muestra se descongela.Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la descongelacin, y el nmero de ciclos de congelacin-descongelacin. La descongelacin lenta es ms letal que la rpida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo.Aplicaciones de la congelacin:La congelacin se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cmo se efecta tanto la congelacin como la descongelacin. Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutctico:en nieve carbnica (CO2 slido), a -78C;

en nitrgeno lquido, a -180C.

Por ello, este mtodo es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbnica o nitrgeno lquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay mtodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largos periodos de tiempo.Para preservar an mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a aadir a la suspensin ciertas sustancias, como por ejemplo:Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificacin amorfa y vtrea, en lugar de la cristalizacin, evitando as la formacin de zonas intracelulares con alta concentracin de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfxido (DMSO).

Materiales ricos en protena: leche, suero, extracto de carne.

Protenas purificadas (p. ej., la albmina).

Determinadas macromolculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.

La suspensin bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas sustancia entre -25 a -30C, en congelador. Si se hace con nitrgeno lquido, la conservacin puede ser de varios aos.3 LIOFILIZACIONLa liofilizacin es la desecacin al vaco de una muestra previamente congelada. Aplicada a bacterias, es uno de los mtodos que mantiene por ms tiempo la viabilidad bacteriana (varios aos). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (vase epgrafe anterior), se congela sobre nieve carbnica (-78C), y se conecta a una bomba de vaco, que provoca la desecacin. La eliminacin de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la viabilidad de sta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente, hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos aos despus.4 EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIASLa desecacin al aire (sin vaco) mata a las clulas vegetativas bacterianas, pero no a las endosporas. La sensibilidad a la desecacin vara de una especie a otra. Ejemplos:Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia de luz), de ah que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos.

En cambio, el vibrin colrico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de slo dos horas.

Las causas de la muerte son, principalmente:el aumento de concentracin intracelular de sales, lo que conlleva efectos txicos y desnaturalizantes de protenas;

daos por oxidacin.

La mayor eficacia de la desecacin al aire se logra con 50% de humedad relativa.5 EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS5.1 CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLCULASSe puede definir la radiacin como la propagacin de energa por el espacio. Los principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:radiacin electromagntica (longitudes de onda, en nm)

radiacin infrarroja (IR)800-106

radiacin visible380-800

ultravioleta (UV)13,6-380

rayos X0.14-13.6

rayos 0.001-0.14

rayos csmicos< 0.001

Los efectos derivados de la absorcin de radiacin dependen de:la energa de la radiacin absorbida;

la naturaleza del material.

1) Si la energa es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los rayos (estos ltimos se emiten como resultado de la desintegracin de radioistopos). Un fotn de gran energa incide sobre un tomo, provocando la expulsin de un electrn de gran energa (fotoelectrn), y quedando el tomo en forma ionizada (cargado positivamente). El electrn expulsado suele tener energa suficiente para originar una nueva ionizacin, de la cual surge otro electrn de alta energa, etc... producindose una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energa, hasta que sta se disipa en el material: el ltimo electrn de la cadena es captado por otro tomo o molcula, que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones (uno positivo y otro negativo). A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrnicas ulteriores, que dan pie a cambios qumicos en el sistema que se haba sometido a la irradiacin.2) Si la energa es E