Preparacin de frotis y tincin simple

Objetivos de aprendizaje

1. Preparar un frotis delgado de clulas bacterianas y teirlo con una tincin positiva simple. 2. Entender las razones de usar esta tincin para observar bacterias. Introduccin

Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber.

Las bacterias se caracterizan por ser microorganismos unicelulares que carecen de membrana nuclear, en las cuales el material nuclear est organizado en una tira continua, a veces circular, contenido en el citoplasma, presentan un actividad metablica y se dividen por fisin binaria, son organismos sofisticados y altamente adaptables a cambios del medio ambiente. Debido a su ubicuidad y su alta capacidad de adaptacin su importancia en el campo medico como agentes causales de dao es altamente notable.

En tamao y forma las bacterias de importancia mdica son microorganismos muy pequeos que se presentan en tres formas generales: esfricos designados como cocos, organismos en forma de bastn designados como bacilos, y de formas espirilas, dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros microorganismos que adoptan variantes morfolgicas designadas como formas pleomrficas.

Debido al pequeo tamao de la mayora de los microorganismos, se requiere de un microscopio ptico, ya sea de campo claro, en el que la observacin de clulas vivas es limitada debido a que las clulas son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz. La observacin de frotis teidos es ms recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tien los microorganismos. De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como lo son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los colorantes ms utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromforos. Por ejemplo:

Cloruro de azul de metileno ( azul de metileno + Cl (cromforo)

Si el cromforo es un ion positivo el colorante es de tipo bsico, pero si la carga es negativa ser de tipo cido. La mayora de las bacterias son teidas por colorantes bsicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces inicos dbiles a molculas con cargas negativas de la clula bacterianas.

MaterialesCultivosBacillus cereus

Escherichia coli

Levadura

Staphylococcus aureus

Reactivos

Aceite de inmersinAzul de metilenoSolucin Salina Fisiolgica (SSF)

Equipo

Microscopio de luz compuesto

Otros materiales

Asa de inoculacin redonda

Marcador de cera

Mechero BunsenPortaobjetosPapel seda para limpieza de lentes

Metodologa

ProcedimientoPreparacin de frotis a partir de un medio slido

1. Obtener los cultivos de la bacteria y la solucin salina fisiolgica (SSF). 2. Lavar un portaobjetos con jabn y agua para remover la suciedad y grasa. Limpiarlo con papel para remover el exceso de humedad y tomarlo por los bordes. 3. Escribir las iniciales del microorganismo en el lado superior izquierdo del portaobjetos con un marcador de cera. 4. Flamear un asa de inoculacin redonda y dejarla enfriar. Transferir una gota de SSF mediante una asada en la parte central del lado izquierdo del portaobjetos. Si los cultivos estn suspendidos en caldo, no es necesario adicionar SSF para preparar el frotis. 5. Flamear el asa de inoculacin y dejarla enfriar. Tomar una cantidad pequea del organismo con un asa de picadura a partir de una colonia aislada, y depositarla en el centro de la gota de SSF. Dispersar el organismo sobre el rea del portaobjetos mediante movimientos hacia arriba y hacia abajo para formar una pelcula delgada. Flamear el asa de inoculacin antes de guardar. 6. Dejar secar por evaporacin del agua a temperatura ambiente. Evite aplicar calor. 7. Pasar el frotis por la parte alta de la llama del mechero Bunsen cuatro veces. Evite el calentamiento prolongado del portaobjetos porque se puede romper y el calor excesivo puede ejercer un efecto en la morfologa de las clulas. La parte inferior del portaobjetos debe sentirse clida al tacto con la piel de su mano. Tincin positiva simple

1. Colocar el frotis en la barra de tincin y cubrirlo con azul de metileno o cristal violeta durante 1 min

2. Lavar con agua de grifo, escurrir y dejar secar. 3. Remover cuidadosamente el exceso de agua con papel absorbente. 4. Repetir el procedimiento con el resto de las cepas. 5. Aadir una gota de aceite de inmersin en el centro de la preparacin. Observar el frotis teido con la lente del objetivo de inmersin (100X) del microscopio compuesto. 6. Registrar sus observaciones en la seccin de resultados. 7. Desechar sus preparaciones teidas por inmersin en solucin desinfectante, puede utilizar hipoclorito de sodio al 10% (1:9) por 15 min. Lave sus portaobjetos. 8. Al concluir su estancia en el laboratorio, limpie la lente del objetivo de inmersin con papel seda. El microscopio debe almacenarse con el objetivo seco dbil acomodado en su lugar, coloque su funda y regrselo al sitio de almacn.

REALIZA UN ESQUEMA CON DIBUJOS

Resultados 1. Dibuje las caractersticas de las clulas observadas con la lente del objetivo de inmersin. 2. Describa la morfologa y agrupacin celular.

3. Describa el color de las clulas teidas

Aspecto S. aureus E. coli

Tincin positiva simple

Amplificacin total 100x

Morfologa celulara. Forma b. Agrupacin Cocos agrupados en circulos

Color de la clula Azul

Preguntas para revisin 1. Cul es la importancia de limitar la cantidad de clulas usadas para preparar un frotis? Que sean ms visibles las clulas ya que al ser muchas no se podrn observar bien o incluso solo se ver como si fuera una mancha2. a) Cul es el propsito de fijar un frotis con calor? , b)Qu problemas pueden presentarse si el frotis es calentado directamente en la flama del mechero?

A) conservar la morfologa general, pero no las estructuras internas. El calor desnaturaliza la enzima proteoltica y prevenir la autolisis.B) Quemar o calcinar los microorganismos

3. a) Cules son las causas de que un colorante se adhiera a la clula bacteriana?, b) Cul es la razn de que todos los colorantes no sean tiles para una tincin simple? A) Los colorantes son compuestos orgnicos y cada tipo de colorante suele tener afinidad por determinadas estructuras celulares. Muchos colorantes utilizados en Microbiologa estn cargados positivamente (catinicos) y se combinan fuertemente con compuestos celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidosB) Algunos de los colorantes tienen carga neutra o acida por lo que no tienen afinidadpor la clula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el que estn las bacterias pero la clula queda incolora y transparente4. Puede usarse una tcnica de tincin simple para identificar otras caractersticas adems de la morfologa del microorganismo? Explique.No, ya que solo permite visualizar forma, tamao y disposicin de los grmenes. Se usa un solo colorante y las bacterias toman el color del colorante usado por lo que no es posible ver a travs de los microorganismos y reconocer sus rganos internos

5. Durante la realizacin de un procedimiento de tincin simple positiva, olvidaste fijar tu frotis de Escherichiacoli con calor. En el examen microscpico, Cmo esperara diferenciar esta preparacin de un frotis preparado adecuadamente? El calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las protenas coaguladas unen las clulas al porta objetos por lo que si no se fijan al calor no se podrn ver adecuadamente en el microscopio se podran ver en movimiento o incluso ni poder observarse.6. Durante el receso para el caf, sus amigos derraman caf en su bata de laboratorio y la tela tom el color del caf. Lo anterior es resultado de una tincin biolgica o simplemente es un compuesto capaz de impartir color? Explique su razonamiento. Es una tincin biolgica ya que el caf estdentro de las listas de los colorantes ms comunes a lo largo de la historia, aunque no es posible encuadrar dentro de los niveles de mxima solidez tintrea o saturacin cromtica se ha utilizado como colorantes de telas desde hace mucho tiempo.7. Cul es la razn de que el tamao de una bacteria sea ms cercano a la realidad en una tincin negativa que en una tincin positiva simple? Ya que no es fijada al calor no se deshidratan las clulas8. Cul es la razn por la cual el cristal violeta no es til en la tcnica de tincin negativa? Porque es un colorante con carga positiva y para la tincin negativa se necesitan neutros o cidos.9. Cules son las ventajas de: a) la tcnica de tincin negativa vs. la de tincin simple. b) la tcnica de tincin simple vs. la de tincin negativa?A)Nos permiten visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria y alguna otra estructura como es la presencia de capsula, no necesita ser fijada a calor,permite ver partculas ms pequeas y se usa en el estudio de virus o protenas, cidos nucleicos, macromolculasB) hace ms fcilmente visibles a las bacterias y permite la visualizacin la concentracin, morfologa y el modo de agrupacin bacteriana.10. Suponga que us un portaobjetos limpio para esta actividad prctica, y al observar su frotis teido apreci bacterias diferentes a las que usted deposit para hacer el frotis. Cul podra ser la fuente de lo sucedido? El cultivo estaba contaminado o no se tom el suficiente cuidado al momento de hacer el frotis11. Cul es la razn por la cual no debe fijar a las bacterias cuando prepara un frotis para una tincin negativa? La tincin negativa sirve para observar capsulas y al intentar fijar al calor se destruya

Bibliografa

http://docsetools.com/articulos-para-saber-mas/article_40931.html

http://microbiologiaunvime.wikispaces.com/file/view/Anexo+I+TP+N%C2%BA3.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdfhttps://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/11778/estudio%20del%20caf%C3%A9.pdf?sequence=1PRCTICA #

Tincin de Gram

Objetivos de aprendizaje

1. Entender la base qumica de la tincin de Gram y su importancia en microbiologa. 2. Preparar un frotis delgado de clulas de bacterias Gram positivas y Gram negativas en forma individual y mezcla, teirlas usando el mtodo de tincin de Gram e interpretar el resultado. 3. Usar la tincin de Gram para visualizar clulas de sus dientes y boca Introduccin

La tincin de Gram es un procedimiento diferencial til para identificar y clasificar bacterias, en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Esta tcnica fue descubierta por el mdico dans Hans Christian Gram en 1884, durante la tincin de clulas, l encontr que algunas perdan su color cuando se eliminaba el exceso de colorante por el lavado.

La tcnica de tincin consiste en:

1. Aplicar un colorante primario (cristal violeta). Todas las bacterias son teidas de prpura por este colorante bsico. 2. Aplicar un mordiente (lugol para coloracin de Gram). El yodo se combina con el cristal violeta en la clula para formar un complejo cristal violeta-yodo (CV-I). 3. Aplicar un agente decolorante (etanol o etanol-acetona). El colorante primario ser removido de algunas bacterias, en tanto que otras no sern afectadas. 4. Aplicar un colorante secundario o de contraste (safranina). Este colorante bsico teir a las bacterias decoloradas de rojo. El factor ms importante en el procedimiento es que las bacterias difieren en su velocidad para decolorarse. Aqullas que se decoloran con facilidad se denominan Gram negativas, mientras que las que se decoloran ms lentamente y retienen el colorante primario son Gram positivas.

Las bacterias se tien de manera diferente debido a las diferencias fsicas y qumicas en sus paredes celulares. stas ltimas son redes de estructuras complejas de capas de peptidoglicano y otros compuestos. Las paredes celulares Gram positivas contienen capas mltiples de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram negativas contienen una capa delgada de peptidoglicano rodeada por una capa externa de lipoprotenas, fosfolpidos y lipopolisacridos.

El cristal violeta penetra en la clula. El yodo presente en el lugol reacciona con el colorante en el citoplasma para formar un complejo CV-I ms grande que el cristal violeta. El alcohol como agente decolorante deshidrata la pared celular de la bacteria Gram positiva. El complejo CV-I no puede ser expulsado de las clulas Gram positivas. En las clulas Gram negativas, el agente decolorante disuelve la capa exterior de 12 lipopolisacrido, y el complejo CV-I es expulsado a travs de la capa delgada de peptidoglicano. La safranina tie de rojo a la bacteria decolorada.

La tincin de Gram es ms consistente con cultivos jvenes de bacterias (16-18 h). Cuando las clulas bacterianas mueren, su pared celular se degrada y puede no retener el colorante primario, lo que conduce a resultados inexactos. Los cultivos Gram positivos o negativos de ms de 24 h pueden presentar una reaccin variable a la tincin. Tambin resulta crtico que se preparen frotis delgados para observar las clulas individuales y su agrupacin. El grosor de un frotis afectar la decoloracin; una preparacin gruesa atrapar el colorante primario, que puede no ser removido por el alcohol o acetona. Las clulas presentes en los grandes aglomerados pueden aparecer como Gram positivas, lo cual conducir a resultados errneos. La decoloracin constituye el paso ms crtico en este procedimiento, si el colorante se aplica en exceso, el complejo CV-I puede ser removido de las clulas Gram positivas, hacindolas parecer como Gram Negativas.

MaterialesCultivosBacillus cereus Escherichia coli Staphylococcus aureus

Reactivos

Aceite de inmersinCristal violetaEtanol al 95% etanol-acetona Lugol para coloracin de Gram SafraninaSolucin salina fisiolgica

Equipo

Microscopio de luz compuesto

Otros materiales

Asa de inoculacin circular Mechero BunsenPapel seda para limpieza de lentes Portaobjetos

Procedimiento

1. Preparar frotis individuales de una bacteria Gram positiva y una Gram negativa en un portaobjetos limpio y seco, dejarlos secar a temperatura ambiente con base en las instrucciones de la actividad prctica 1. Fijar las preparaciones con calor. 2. Cubrir cada rea de los frotis con cristal violeta y dejar en contacto por 1 min. Lavar con agua de la red municipal, de manera que la presin no favorezca el arrastre de la preparacin. Drenar el exceso de agua. No es necesario secar el frotis. 3. Cubrir cada rea de los frotis con lugol, el cual es una solucin de yodo-yodurada y dejar en contacto por 1 min. Lavar con agua de la red municipal. Drenar el exceso de agua. No es necesario secar el frotis. 4. Decolorar los frotis con alcohol etlico al 95% o etanol-acetona: depositar gotas del alcohol sobre el frotis y mantener en contacto por 15 s, escurrir el alcohol. Repetir este procedimiento por otro periodo de 15 s (Regla general, la decoloracin debera continuar hasta que el alcohol etlico remueva la totalidad del colorante, un indicador es cuando la solucin de alcohol tiende a ser incolora. Sin embargo esto puede ser difcil de discernir cuando realizamos el procedimiento por primera vez). Lavar el frotis con agua de la red municipal, pero no seque. El grado de decoloracin del frotis depende del grosor del frotis. Una decoloracin excesiva puede causar que una bacteria Gram positiva pierda su color (aparecer como Gram negativa), y una decoloracin insuficiente puede permitir que una bacteria Gram negativa retenga el color prpura (aparezca como Gram positiva).

5. Cubrir cada rea de los frotis con solucin de safranina y dejar en contacto por 30 s. Lavar con agua de la red municipal. Drenar el exceso de agua. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. 6. Observar los frotis con las lentes del objetivo seco dbil (10X) para localizar el campo microscpico, despus mueva la lente del objetivo seco fuerte (40X) y finalmente realice las observaciones con la lente del objetivo de aceite de inmersin (100X). Revise la preparacin para localizar un campo en donde las clulas estn separadas. Las clulas de las bacterias Gram positivas tendrn un color de azul a prpura y las clulas de las bacterias Gram negativas se observarn naranja a rojo. Revise varios campos para familiarizarse con el color predominante en las clulas. Asegrese de preparar frotis con capas delgadas de clulas, debido a que un frotis con reas gruesas de clulas puede resistir la decoloracin debido a esta concentracin. 7. Desechar sus preparaciones teidas por inmersin en solucin desinfectante. Lave sus portaobjetos. 8. Preparacin de un frotis mixto de bacterias Gram positivas y Gram negativas: Colocar una gota de solucin salina fisiolgica en un portaobjetos limpio y seco. Depositar una asada de una colonia de una bacteria Gram positiva con un asa estril en el centro de la gota de la solucin y distribyala en la superficie con movimientos hacia arriba y hacia abajo. Esterilice el asa con el calor seco del mechero, deje enfriar y repita el procedimiento para la bacteria Gram negativa. Tia su frotis con el procedimiento de Gram referido anteriormente. Registre sus resultados en la seccin correspondiente. 9. Desechar sus preparaciones teidas por inmersin en una solucin desinfectante. Lave sus portaobjetos. 10. Al concluir su estancia en el laboratorio, limpie la lente del objetivo de inmersin. El microscopio debe almacenarse con el objetivo seco dbil acomodado en su lugar, coloque su funda y regrselo al sitio de almacn.

Resultados Clulas individuales 1. Dibuje las caractersticas de las clulas observadas con la lente del objetivo de inmersin.

Aspecto Clulas individuales Clulas individuales Clulas individuales

Nombre del microorganismo S. AurusE. ColiE. coli con S. aurus

Dibujo de un campo representativo

Amplificacin total 40x y 100x40x y 100x40x y 100x

Morfologa celular a. Forma b. Agrupacin Cocos formaciones hexagonales y en lineaBacilos formaciones en circulosBacilos formaciones en crculos

Cocos formaciones hexagonales y en linea

Color de la clula Azul/moradoRosaRosa y Azul morado

Reaccin al Gram Gram negativoGram positivoRosa = Gram +Azul = Gram -

Preguntas para revisin

1. Escriba el propsito para el uso de cada uno de los siguientes reactivos en un procedimiento de tincin diferencial

a. Colorante primario: adherir a la pared celular bacteriana y permitir la identificacin de bacterias cuya estructura y composicin de pared celular se encuentre mayor proporcin y distribucin de cido teicoicob. Colorante de contraste: dar a las clulas decoloradas un color que contrasta con el del colorante primarioc. Agente decolorante:deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.d. Mordiente:sustancias qumicas que unidas a los colorantes forman una laca que se adhiere fuertemente a la estructura difcil de teir2. Cul es la razn de que sea esencial elegir colorantes primario y de contraste que presenten colores diferentes? Para que al momento de observar en el microscopio se fcil distinguir al microorganismo y no se confunda o camuflaje con el entorno

3. Cul es el paso ms importante en la tincin de Gram? Explique.La decoloracin es el paso ms importante. El tiempo debe ser suficiente para que deje de desprenderse cristal violeta de la preparacin sin decolorarla completamente4. a) Enliste razones por la que la tincin de Gram es de mayor utilidad que la tincin simple en un laboratorio de diagnstico. b) Bajo qu circunstancias podra ser ms til una tincin simple que una tincin de Gram?A)1.- pone en evidencia diferencias en la composicin qumica de la pared celular de las bacterias2.- permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas

3.- permite visualizar partes internas de la clula

4.-mtodo rpido para la identificacin inicial de bacterias implicadas en las infecciones

B) cuando solo se requiera visualizar forma, tamao5. Suponga que un estudiante est realizando el procedimiento de tincin de Gram y en la etapa de decoloracin de clulas en lugar de cubrir su frotis con alcohol etlico al 95%, us agua destilada. de qu color observara las clulas de una bacteria Gram positiva y Gram negativa al observarlas al microscopio con la lente del objetivo de inmersin?- Explique su respuesta.Ambas las vera de color rojo/rojizo. El colorante violeta y el yodo (lugol) se combinan con las bacterias tindolas de violeta oscuro. Las que retienen este color despus del intento de decoloracin con el alcohol son las gram (+) mientras que las gram (-) quedan incoloras, entonces al agregar la safranina, las gram (+) no se tieran porque stas ya estn de violeta mientras que las gran (-) tomaran el color rojizo pero si no se agrega el lugol que es mordiente no se fijara el color violeta por lo que al final solo podr verse como si todas las clulas fueran gram (-)6. Cul sera el valor de la tcnica de tincin de Gram en el estudio de la pureza del cultivo de una bacteria? ExpliqueEl valor sera muy alto ya que gracias a ella se podra conocer si ese cultivo de verdad es puro y no est contaminado con bacterias de otro tipo ya que la tincin te permite diferenciar entre gran-positivas y gran-negativas y no solo eso sino tambin saber o diferenciar de cual microorganismo se trata7. Al realizar la tincin de Gram en el frotis con la mezcla de clulas usted us rojo Congo en lugar de safranina. Dibuje cmo espera que se observarn las clulas en el microscopio.

8. Debido a que existe un huracn en su localidad se suspendi la actividad prctica en los alumnos en el laboratorio de microbiologa general, en la cual estaba contemplado realizar la tincin de Gram de dos cultivos de bacterias. Por consiguiente, el profesor no pudo sacar de la incubadora los cultivos y los dej 24 h ms de incubacin. Al da siguiente, usted fue a realizar su actividad prctica y al observar los frotis de la bacteria Bacilluscereus aprecia una gran variabilidad en el color de las clulas (de violeta intenso hasta sombras rosa). Proporcione una explicacin para estos resultados.

Bibliografa

http://docsetools.com/articulos-para-saber-mas/article_40931.html

http://microbiologiaunvime.wikispaces.com/file/view/Anexo+I+TP+N%C2%BA3.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdf

Eddie Echandi. 1967. fitopatologa general. Lima, Per

Tincin Simple

Realizar la fijacin del frotis

Poner una gota de ssf en el porta

Tomar una muestra y diluir en la ssf

Pasar por la prte alta del mechero para fijar

Realizar Tincin simple

Cologar azul de metileno en la muestra fijada

Esperar de 30-60seg

Lavar con agua

Retirar el exedente de agua.

Observacin al microscopio

Observar al microscopio en seco dbil

Observar al microscopio en seco fuerte

Colocar una gota de aceite de inmersin y observar con objetivo de inmersin.

Las bacterias aparecen incoloras en un fondo azul

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