Métodos Radioisotópicos
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BIO 368 ANALISIS INSTRUMENTAL Métodos radioisotópicos
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BIO 368
ANALISIS INSTRUMENTAL
Métodos radioisotópicos
USO DE RADIOISOTOPOS EN BIOQUIMICA
Ventajas:- Técnica de alta sensibilidad- Las mediciones se hacen de manera acumulativa (bajos niveles deradioactividad pueden medirse con exactitud usando tiempos máslargos de análisis).- Se complementa con técnicas como cromatografía o electroforesis.- Pueden usarse como marcadores al investigar o monitorear un proceso.
Desventajas:- Su uso implica ciertos riesgos (radiaciones), lo que ha llevado a reemplazarlos en muchos casos por otras técnicas.
CLASIFICACION DE LAS RADIACIONES
Radiaciones ionizantes:Son radiaciones de alta energía que al incidir en una molécula
la ionizan (pérdida de un electrón).Rayos gama, rayos x, partículas alfa y beta, neutrones.Producidas por materiales radioactivos y ciertos aparatos
(ciclotrones, reactores nucleares, etc.)
Radiaciones no ionizantes:Son radiaciones de menor energía, capaces de excitar una
molécula, pero sin la energía suficiente para que pierda un electrón.Ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda.Producidas por lasers, microondas, radios, TV, etc.
ALGUNOS CONCEPTOS BASICOS
Atomos: constituídos por un núcleo (protones y neutrones) y una nube de electrones.
Número atómico: número de protones o electrones de un átomo.
Peso atómico: número de protones + número de neutrones.
Isótopos: átomos con igual carga pero distinta masa (se diferencianen el número de neutrones).
Ej: 12C6 ; 13C6 ; 14C6
LOS ISOTOPOS RADIOACTIVOS
Los isótopos se diferencian en su estabilidad. Algunos sufrenespontáneamente transformaciones nucleares de masa y/o carga paraalcanzar un estado más estable. Estos son los "radioisótopos".
Hay varios mecanismos por los cuales los isótopos inestablesalcanzan estabilidad. Ellos pueden implicar la liberación de partículas específicas:
Ejemplo: 12C6 y 13C6 son estables; 14C6 es un isótopo radioactivo queemite radiaciones beta (electrones).
En la gran mayoría de las aplicaciones bioquímicas de radioactividad se utilizan isótopos que emiten radiaciones beta o gama.
DESINTEGRACION RADIOACTIVA POR EMISION DEPARTICULAS BETA (β-)
Las partículas beta (o negatrones) están cargadas negativamente y tienen masa despreciable (partículas similares a los electrones).
Neutrón protón + negatrón (β-) + antineutrino
La masa atómica permanece constante pero el número atómico sube 1.Ejemplo:
La energía liberada es compartida al azar entre la partícula beta y elantineutrino, por lo que esta partícula es emitida en un rango (o espectro) de energías.
Las partículas beta son fácilmente detectables. Las diferencias de energías son importantes en la detección de radioisótopos (en especialen los experimentos de "doble marca").
Un electron-volt (eV) es la energía cinética que un electrón adquiere cuando es acelerado por una diferencia de potencial de exactamente un volt.Es igual a 1 volt (1 volt = 1 joule por coulomb) multiplicado por la carga(sin signo) de un electrón. 1 eV = 1,602 ×10-19 J
DESINTEGRACION RADIOACTIVA POR EMISION DEPOSITRONES (β+)
Protón neutrón + positrón (β+)
Ejemplo:
Como resultado, disminuye en uno el número atómico y se mantieneel peso atómico.
Los positrones son muy inestables; son aniquilados al chocar conelectrones y como resultado se emiten dos rayos gama.
La emisión de positrones se detecta por el mismo tipo de equiposutilizados en la detección de rayos gama. Muy usados en medicinaen "scanners" de cerebro para detectar tumores (tomografía de emisión de positrones).
DEGRADACION ISOTOPICA POR CAPTURA DE ELECTRONES
Un protón captura un electrón de la capa orbital más interna (K)
Protón + electrón neutrón + rayo X
Ejemplo:
Como resultado, se mantiene el peso atómico pero disminuye en 1 elnúmero atómico.
DEGRADACION ISOTOPICA POR EMISION DE RAYOS GAMA
Implica la emisión de radiación electromagnética, con rayos delongitud de onda menor (y mayor energía) que los rayos X.
Los rayos gama se liberan como resultado de la transformación deun núcleo atómico por degradación en varias etapas y va acompañadode la emisión de partículas alfa o beta.
La emisión de rayos gama por si misma no conlleva cambios en elpeso atómico ni en el número atómico. Estos cambios dependen dela partícula que es liberada en el proceso.
Ejemplo:
En la degradación que libera rayos gama se produce más de un rayo gamay cada uno posee una cantidad discreta de energía. Son en general másfáciles de detectar que las partículas beta o alfa que se liberan en el mismo proceso.
CINETICA DE LA DEGRADACION RADIOACTIVA
Todas las transformaciones nucleares proceden espontáneamentey a velocidades que no son afectadas por los procesos físicos yquímicos ordinarios.
La degradación radioactiva obedece cinética de orden 1, o sea,es proporcional al número de átomos (N) presentes:
λ: constante de desintegración, característica de cada isótopo.
Al t = 0 hay N0 átomos; a otro t cualquiera, habrá N átomos.Integrando la ecuación entre t = 0 y t:
A menudo se expresa la ecuación en términos de la “vida media”, t1/2 :
Tiempo requerido para que decaiga la mitad de los átomos radioactivos.
NATURALEZA EXPONENCIAL DEL DECAIMIENTORADIOACTIVO
La constante de desintegración o “tasa específica de decaimiento” (λ) es igual a la pendiente multiplicada por –1.
UNIDADES DE DESINTEGRACION RADIOACTIVA
La radioactividad se mide “contando” el número de desintegraciones queocurren en un plazo de tiempo, las que son detectadas por instrumentosapropiados. La desintegración radioactiva es un proceso aleatorio; la desintegraciónde una partícula individual en el tiempo es al azar. Para definir estadísticamente la velocidad de conteo radioactivo hay quedetectar un número grande de desintegraciones. En general, las muestras radioactivas deben contarse hasta un valor límitede error de ± 5 % (error límite en manipulaciones bioquímicas, p. ej,pipeteo). Unidad básica de radioactividad: 1 curie (Ci) (cantidad de material radioactivo que emite partículas a la misma velocidad que un gramo de Radium: 3,7 x 1010 desintegraciones por segundo). Se usa mucho el término “radioactividad específica”: curies/mol (o g). Subunidades son el milicurie y el microcurie..
OTRAS UNIDADES PARA MEDIR DESINTEGRACIONRADIOACTIVA
Poco usado es el Becquerel (Bq): 1 desintegración/segundo
Desintegraciones por minuto (dpm): número de átomos que se desintegran por minuto. 1 μCi = 2,2 x 106 dpm
Cuentas por minuto (cpm): número de desintegraciones detectadas por un equipo de detección determinado por minuto.
dpm x efiiciencia = cpm
ESTADISTICA DE MEDICIONES RADIOACTIVAS
- No es posible prever cuando se desintegrará un átomo dado. Sólo sabemos que el 50 % de ellos se desintegrará al cabo de una vida media. - El número de desintegraciones que ocurren en un tiempo finito esrelativamente pequeño en relación al número total de átomos de la muestra radioactiva (a menos que la vida media sea muy corta). - La frecuencia con que ocurren acontecimientos raros es descrita estadísticamente por la llamada “Distribución de Poisson”. - La “desviación standard” nos da una idea del error. - En una distribución de Poisson, la desviación standard es:
N N = número total de desintegraciones
Hay 95 % de probabilidades que el valor verdadero esté en N ± 2 .Si N = 1000, = 32 (3,2 %). Representado por 2 , el error es 6,4 %
TECNICAS COMUNMENTE USADAS PARA DETECTAR Y MEDIR RADIOACTIVIDAD
Los métodos están basados en la capacidad de la radiación para:
- ionizar gases- excitar sólidos o soluciones- exponer emulsiones fotográficas
EL “BACKGROUND” EN UN CONTEO RADIOACTIVO
Es el conjunto de cuentas detectadas por un instrumento y que no provienen de la muestra en estudio.
0.4% fallout
10%cosmic rays
12% internalsuch as food
etc.
12% medical,X rays etc.
14% gamma raysfrom the ground
50% radioactive gases in the home
0.4% air travel
<0.1%nuclear waste
0.2%occupational
(Diagram: resourcefulphysics.org)
Origen del“background”
METODOS BASADOS EN LA IONIZACION DE GASES
Al pasar una partícula cargada por un gas, su campo electrostáticosuelta electrones de los átomos más cercanos del gas provocandoionización. La capacidad de ionizar sigue el siguiente orden:
α>β>γ (10 000 : 100 : 1)por lo que son útiles para detectar partículas alfa y beta.Si la ionización ocurre entre un par de electrodos en una cámara
adecuada, fluye un pulso de corriente que es detectado.Usado en contadores manuales. Poco sensibles.
Esquema de uncontador Geiger
CONTADORES BASADOS EN EXCITACION
Se los denomina “cintiladores”. Se utilizan para detectar radiacionesbeta y gama. Muy sensibles y automáticos de manejo. Los isótopos radioactivos interactúan excitando un compuesto (elfluoróforo). Cuando sus electrones vuelven al estado basal seemiten fotones de luz (flurescencia), la que es detectada por un fotomultiplicador y cuantificada. En el fotomultiplicador la energía luminosa es convertida en un pulsoeléctrico amplificado que es directamente proporcional a la energía del evento radioactivo original. Esto permite detectar dos o más isótopos diferentes en una misma muestra. Se usan fluoróforos líquidos o sólidos. Los sólidos son utilizadospara radiaciones gama y los líquidos para beta. Nos permiten obtener dos tipos de información:
Cuantitativa: cantidad de radiación (número de cuentas)Cualitativa: tipo de radiación (intensidad de la señal).
CONTADORES DE CENTELLEO LIQUIDOS Y SOLIDOS
Sólido Líquido
Cristales de yoduro de sodio Fluoróforos líquidos
EL FOTOMULTIPLICADOR
Fotomultiplicadorasociado a un contador de centelleo
El fotomultiplicador recibe luz del proceso fluorescente. La luz liberaelectrones del cátodo fotosensible, y cada electrón choca con un electrodo secundario que emite múltiples electrones. Estos pasan a suvez a otro electrodo que también emite múltiples electrones. El proceso continúa por hasta 9 electrodos, magnificándose la señal 1 millón de veces.
Dínodo: electrodo usado para emisiónsecundaria de electrones.
CONTEO DE PARTICULAS BETA EN UN CINTILADORLIQUIDO
Se coloca la muestra en un “cocktail” de cintilación que contiene unsolvente excitable y uno o más fluoróforos. Las partículas ß al chocarcon el solvente le transfieren parte de su energía:
La energía residual (ß- - E) puede excitar muchas más moléculas desolvente hasta agotarse. El número de moléculas de solvente excitadodepende de la energía inicial de la partícula ß.Las moléculas excitadas de solvente transfieren su E a otras moléculasde solvente y a un fluoróforo primario (F*
1) que emite fotones:
Un fluoróforo muy usado es el PPO (2,5 difenil oxasol). Algunos “cocktails” utilizan fluróforos secundarios.Todos los eventos provocados por la emisión de un ß- son registradoscomo un pulso único, cuya energía es proporcional a los fotones generados por la partícula ß-. Cada pulso es registrado como una cuenta.
ESTRUCTURA DE UN EQUIPO DE CINTILACION
La energía total de los fotones por cada emisión ß- es muy pequeña, porlo que el fotomultiplicador debe ser muy sensible. Esta sensibilidad lolleva a captar “ruido” (cuentas no relacionadas a emisiónes ß-). Esto sereduce utilizando un “circuito de coincidencia”: dos fotomultiplicadores, que deben detectar simultáneamente la cuenta.
Se emplean también “discriminadores”, útiles en experimentos con doso más emisores ß-. Ellos tienen “compuertas” que limitan el perfil deenergía de cada canal.
Utilizando muestras “standard” (p. ej. de 14C de radioactividad conocida)se puede determinar el porcentaje que es detectado por cada canal.
El voltaje de “ganancia” aplicado a los fotomultiplicadores esimportante en la discriminación de los canales. Define el grado deamplificación de los pulsos de voltaje de los fototubos.
Ganancia óptima
Ganancia muy alta
APAGAMIENTO (QUENCHING)
La medición de radioactividad puede ser también afectada por diversos componenetes del “cocktail” de cintilación. Estos componentespueden causar apagamiento, o sea, disminuir la la eficiencia del procesode cintilación: el número de “cuentas por minuto” (cpm) es menor que el “número de desintegraciones por minuto” (dpm). En la práctica, todas las muestras de conteo están sujetas a cierto gradode apagamiento. Para determinar la eficiencia de conteo, se cuenta una muestra estándar que contiene un número conocido de dpm.
Hay 3 tipos de apagamiento:- Apagamiento por color: el color de la muestra absorbe los fotones
emitidos por el fluoróforo antes que lleguen al detector.- Apagamiento puntual: la muestra no se disuelve bien y las
partículas beta se absorben antes de excitar al solvente.- Apagamiento químico: componentes de la mezcla de conteo
interactúan con el solvente o el fluoróforo, disipando la energía. Difícil deeliminar. Menor en los emisores ß- de alta energía.
CONTEO DE EMISIONES ß- POR CINTILADORES SOLIDOS
Permite evitar algunos de los problemas de la cintilación líquida.
Las muestras líquidas con el material radioactivo se colocan enpequeños frascos cubiertos en el fondo con una matriz sólida quecontiene itrio, que actúa como fluoróforo. Se seca la muestra yse cuenta en los mismos instrumentos para centelleo líquido.
El volumen de muestra utilizable es limitado (~ 200 μl) para evitarapagamiento puntual.
CONTEO DE RADIACIONES GAMA POR UN CINTILADORSOLIDO
Los cintiladores son los métodos más eficientes para la detección deradiaciones gama.
Los rayos gama son fotones de alta energía que carecen de carga y masa.Son altamente penetrantes pero requieren materiales densos para serabsorbidos eficientemente lo que no ocurre con los cintiladores líquidos.Se usan por lo tanto celdas de cintilación con cristales de NaI.
Los rayos gama son emitidos con valores energéticos únicos, lo quefacilita el análisis de experimentos con doble o triple marca usandoisótopos que emitan rayos gama.
CONTEO CERENKOV
Las partículas beta de alta energía (> 0,5 MeV) atraviesan mediosacuosos a una velocidad superior a la de la luz en agua, lo que las lleva a emitir luz (efecto Cerenkov). La luz emitida puede ser detectada por los instrumentos de cintilación líquida. Muy utilizadopara medir degradación de P32 (eficiencia del 40 %; ¿por qué?).
El conteo Cerenkov no requiere solventes o fluoróforos especialespor lo que no está sujeto a apagamiento químico, y por eso resulta unmétodo muy conveniente para detectar radioactividad.
AUTORRADIOGRAFIA
En investigación bioquímica a menudo es de interés determinar laubicación de uno o más compuestos radioactivos después de unaseparación cromatográfica o electroforética. Por ejemplo, separaciónde sustratos de productos radioactivos después de una reacciónenzimática; separación de oligonucleótidos radioactivos en la secuenciación de DNA, etc
La forma más usada de autorradiografía es exponer la cromatografíao electroforesis a una placa fotográfica, como la utilizada para detectarrayos X. Después de un tiempo de exposición, se revela la placa comoen una fotografía tradicional.
El uso más común es para análisis cualitativo, pero también cuantitativoutilizando densitómetro. ¿Limitaciones?
La eficiencia depende de la energía de los rayos emitidos.
Uso de tres tipos de isótopos en secuenciación de DNA
PROBLEMAS DE SEGURIDAD EN EL MANEJO DE RADIOISOTOPOS
El uso de radioisótopos implica riesgos para los investigadores y parael medio ambiente (uso y descarte de los residuos). Pero estos riesgosno son mayores que el manejo p. ej. de acrilamida o bromuro de etidio.
Los riesgos están asociados a la capacidd de la radiación de ionizarmoléculas y formar radicales libres. Esto puede llevar a hidrólisis de proteínas, quemaduras, mutaciones y cáncer.
La toxicidad depende de la masa y energía absorbida y los órganos queabsorben la radiación. La DOSIS recibida es importante para determinarla toxicidad de la radiación.
La radiación puede ser absorbida por la piel y membranas, inhalación eingestión.
COMO EXPRESAR LA DOSIS DE RADIACION
La unidad usada más comunmente es el Rad (dosis de radiaciónabsorbida).Un Rad es igual a 0,01 Joules de radiación absorbida por Kg de peso.Otra unidad es el Gray (Gy). 1 Gray = 100 Rad.Como los distintos tipos de radiación difieren en su capacidad de dañarlos tejidos, es necesario aplicar un factor de corrección W.La unidad corregida es el Sievert (Sv) o “dosis equivalente”:
Sv = Gy x WW para rayos X y ß- es 1. Para rayos alfa es 20.Velocidad de dosis (dose rate): Sv/hora
La dosis absorbida está relacionada inversamente al cuadrado de la distancia entre la fuente radioactiva y el sujeto. Para reducir al máximola radiación recibida se recurre a distintos tipos de protección.
¿CUALES SON LOS LIMITES ACEPTABLES DE RADIACION?
Actualmente se acepta como límite recibir 15 mSv por año para el cuerpo entero, valor raramente alcanzado por un biólogo.
Para órganos individuales: Manos 500 mSv/año Cristalino del ojo: 150 mSv/ año
Recomendaciones básicas para el manejo de isótopos son:- Maximizar la distancia entre el sujeto y la fuente- Minimizar el tiempo de exposición- Utilizar protectores siempre mientras dure la exposición
El principio ALARA (As Low As Reasonably Achievable): debe ser elguía en todo trabajo que utilice radioactividad.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Método analítico muy sensible, utilizado en especial para la cuantificación de hormonas.
Requiere de anticuerpos contra la molécula (hormona que se deseadetectar) y de la hormona marcada radioactivamente.
Se incuban cantidades fijas de anticuerpo con cantidades conocidasde la hormona radioactiva, que se une al anticuerpo.
Se agrega hormona no radioactiva (que se desea cuantificar), la que compite con la hormona radioactiva por su unión al anticuerpo. Se cuentala radioactividad remanente en el complejo.
Se construye una curva standard con cantidades conocidas de hormona no radioactiva y se cuenta la radioactidad unida. Se interpola elvalor de radioactiviad de la muestra con hormona a cuantificar.
RADIOINMUNOENSAYO
