“UN DÍA PARA ESTAR AL DÍA EN TUBERCULOSIS”

H O S P I TA L R E B AG L I AT I

ES SA LU D

1

Métodos para determinar la resistencia a los fármacos

anti-tuberculosis

Méd. Alberto Mendoza Ticona

Instituto Nacional de Salud

Unión Nacional Contra la Tuberculosis

Instituto de Biotecnología y Salud

2

Pruebas de diagnóstico

Medicina basada en evidencias

Como evaluar una prueba diagnóstica:

- Para seleccionar una prueba a usar:

Sensibilidad

Especificidad

- Para evaluar la credibilidad de los resultados de la prueba:

Valor predictivo positivo

Valor predictivo negativo

Coeficiente de probabilidades positivo

Coeficiente de probabilidades negativo

Nomograma de Fagan

4

Nomograma de Fagan

5

Pruebas de susceptibilidad anti -TB6

Pruebas Fenotípicas Pruebas genotípicas

Ensayos de nitrato reductasa (Griess)* MTBDRplus y MTBDRsl

MODS* Xpert MTB/RIF

Ensayos de fagos* INNO-LiPA Rif. TB

Ensayos de agar en capa delgada Secuenciamiento de genes de resistencia

Proporciones en medio LJ*

Proporciones en agar 7H10, 7H11*

Reacción de reducción con colorantesbiológicos

Sistema MGIT

Sistema BACTEC 460 y 960

* Pueden ser evaluados de manera directa o indirecta.

7

Métodos de Referencia

Pruebas de susceptibilidad convencionales8

Pruebas fenotípicas

Ausencia de crecimiento de MTB en presencia de drogas.

Tres métodos importantes en medios sólidos:

Método de proporciones

Método de tasa de resistencia

Método de la concentración absoluta

Método de proporciones9

Más ampliamente usado como referencia

Medios sólidos: LJ, Ogawa, agar 7H10, 7H11

Proporción de resistencia > 1% (INH, RIF y PAS)

Proporción de resistencia > 10% (demás drogas)

Concentraciones críticas de los principalesantibióticos para el método de proporciones

10

Antibiótico LJ 7H10 7H11

INH 0,2 0,2 - 1,0 0,2 - 1,0

RIF 40,0 1,0 1,0

EMB 2,0 5,0 7,5

S 4,0 2,0 2,0 – 10,0

PAS 0,5 2,0 8,0

KM 20,0 5,0 6,0

ETH 20,0 5,0 10,0

Ofloxacina 2,0 2,0 2,0

Capremocyna 20,0 10,0 10,0

Cycloserina 40,0 30,0 30,0

Ciprofloxacina - 2,0 2,0

Adaptado de: Kent y Kubica 1985; NCCLS 2000

Método de la razón de resistencia11

Razón entre el MIC de una cepa problema sobre el MIC de una cepa de referencia (H37Rv)

Regla

Si MIC problema/MIC ref ≤ 2, sensible

Si MIC problema/MIC ref ≥ 8, resistente

MIC: La menor concentración de droga con la que se obtiene un número de colonias menor de 20.

Método de la concentración absoluta12

Usa un inóculo estandar

Interpretación más fácil

Usa concentración crítica de cada droga

Compara con medio libre de drogas

Interpretación:

Incubación entre 4 a 6 semanas

Sensible: Número de colonias < 20 con un control 3+ o 4+ en el crecimiento control.

BACTEC 46013

Becton – DickinsonMiddelbrook 7H9Acido palmítico – C14 (12B vial)El consumo del ac. graso produce CO2

SIREPZConsiderado Gold Standar para dorgas de primera líneaSobre todo PZMás rápido que medio sólidoDesventajas:Descontinuación, costo y desechos radiactivos

MGIT14

The Mycobacterial Growth Indicator Tube(BD)

Versión manual y automatizada

Contiene caldo Middlebrook 7H9 modificado unido a una sustancia fluorescente sensible al consumo de oxígeno.

Requiere luz UV para revelar la fluorescencia

Interpretación: la presencia de fluorescencia en el tubo con droga dentro de los dos días de reacción positiva del tubo control.

Indirecto y Directo

BACTEC 960/32015

Basado en el mismo principio, usa tubos MGIT

Tiene una lectura automatizada

Aprobado como Gold Estándar

Buena concordancia con PS en medio sólido y BACTEC 460

Métodos rápidos para TB-MDR

16

Bwanga F, et al. Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: A meta-analysis. BMC Infectious Diseases 2009, 9:67Disponible en: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/9/67

Ensayo de Reducción de Nitratos (NRA)17

Directo e Indirecto

Reactivo de Griess

Capacidad del MTB de reducir

nitrato a nitrito.

Reactivo de Griess

Lectura: Indirecto 7 y 14 días

Directo 14, 21 y 28 días

Recientemente recomendado por

la OMS.

Incorporada al MINSA desde 2005

MODS (1)18

Desarrollado en Perú, (Caviedes , 2000)

Simultáneamente detecta TB y susceptibilidad a H, R y MDR

Utiliza caldo 7H9, enriquecimiento OADCmezcla de antibióticos PANTA

Principio: identificación mediante microscopio invertido de la formación de microcolonias características de MTB (cordones)

Tiempo entre 7 a 21 días (para declarar negativo)

19

Decontaminación de la muestra

NaOH-NALC

Vortex y dejelo 15 minutes

Llene tubo hasta 15ml

PBSCentrifuga 15 min 3000g

7H9

PANTA

OADC

Cultivo y prueba de susceptibilidad

directarifampicina

isoniacida

sin droga

1

900μl/pozo

MODS

sin droga

3 42 5Control negativo

MODS (2)20

Avalado por OMS desde 2009 paradetectar TB y TB-MDR directa e indirectamente.

Menor rendimiento con INH.

Descentralizado en 4 regiones de Perú.

Nuevas propuestas de versiones demicroscopía electrónica y telediagnóstico y teledocencia (Zimic 2010)

Prototipo de un nuevo kit comercial (Hardy Diagnostic)

21

Métodos basados en Fagos22

Basado en la capacidad de MTB de permitir el crecimiento de micobacteriofagos (D-29)

Versiones “in house” y comerciales (FastPlaque TB)

Resultados buenos para R, no para H, pero baja especificidad

Evaluaciones en forma directa e indirecta.

No es respaldado por OMS.

Cultivo en agar de capa delgada (TLA)23

Capa delgada de agar 7h11

O método de la microcolonia

Visualización de las características culturales de lasmicrocolonias con microscopio estándar (Welch 1993)

Es muy bueno para detectar TB, pero requiere mayor evidencia para detectar TB-MDR.

Color test24

Desarrollado en Perú (Herrera B) En proceso de validación (Evans C) Detecta TB y resistencia a H, R y Quinolona (Cx) La colonia cambia de color Ahorra el proceso de decontaminación Envase con solución desinfectante Inoculación directa en los 4 campos

25

26

27

Métodos colorimétricos(CRI)28

Son métodos indirectos.Usan indicadores de reducción o sales de tetrazoliumpara detectar el crecimeinto de micobacterias a diversas concentraciones de drogas (MIC)

La resistencia se detecta al producirse cambio en el color del indicador añadido al medio.

Alamar blue cambia a rosadoSal de tetrazolium, amarillo cambia púrpura (MTT)REMA (Resazurin microtiter assay)

Utilizado en drogas de 1 y 2 línea.

Recomendado por OMS, julio 2010

Line Probe Assays29

Extrae ADN de muestra o cultivo.

Amplifica secuencia especifica (PCR)

Hibridación reversa con DNA específico inmovilizado en líneas paralelas en una tira de papel.

La hibridación es inferida porque se colorea la banda respectiva

INNO-LiPA (Complejo MTB y rPOB para RIF)

Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, INH y RIF)

Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, Fq, Km, Ak, Etb)

Regiones genómicas asociadas con resistencia a drogas de 1era y 2da línea

Antibiótico Gen Producto Frecuencia de mutación (%)

Estreptomicina rpsLrrs

Prot. Ribosomal S12RNAr 16S

60< 10

Rifampicina rpoβ Subunidad β RNApol > 95

Isoniacida

katGoxyR-ahpC

inhAkasAndh

Catalasa-peroxidasaAlkilhidroxireductasaEnoyl ACP reductasa

β ketoacil ACP sintetasaNADH deshidrogenasa

60-70 20

< 10< 10NA

Etambutol embCAB Arabinosiltransferasas 70

Pyrazinamida pncA Amidasa 70-100

Etionamida inhAethA

Enoyl ACP reductasaFlavoprot. monooxigenasa

< 10NA

Kanamicina rrs RNAr 16S 65

Fluoroquinolonas gyrAgyrB

Subunidad α DNA girasaSubunidad β DNA girasa

> 90NA

Capreomicina tlyArrs

RNAr metiltransferasaRNAr 16S

NANA

Acido para-aminosalicilico thyA Timidilato sintetasa NA

Genotype MDRTBplus & MTBDRsl

Primers marcadoscon biotina

GT Blot 48

GenoScan

Software BLOTRIX

Flujo de Trabajo

Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniacida usando el Genotype MTBDRplus

Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a Fluoroquinolonas, Aminoglicósidos/Péptidos cíclicos y Etambutol usando

el Genotype MTBDRsl

GeneXpert MTB/RIF35

Test molecular automatizado que detecta MTB y resistencia a RIF

Usa un heminested Real Time PCR para amplificar la secuencia del gen rpoB

Utiliza la plataforma MTB/RIF (GeneXpert, Cepheid) Integra los procesos sonre la muestra y elPCR dentro de

un cartucho de plastico: Lisis de la bacteria (sonicación) Extracción de AND Amplificación y Detección del amplicón

El resultado se obtiene dentro de las 2 horas.

36

Boehme et al. N Engl J Med 2010;363:1005-15.

Pruebas rápidas en Perú37

Prueba País n Sensi-bilidad

Especifi-cidad

Valor predicti

vo +

Valor predictiv

o -

Concordancia

H R H R H R H R H R

GRIESS1(Asencios)

Perú 192 99,1 93,5

100 100 100 100 98,7 92 99,5

96,4

MODS(Moore)

Perú 338 88,9

100 99,6 100 98,2 100 96,4 100 nr nr

MTBDR plus (Asencios)

Peru 208 97 99.1 98.7 95 nr nr nr nr 97.6 97.1

GeneXpert(Boheme)

Peruy otros

741 na 97.6 na 98,1 na nr na nr na nr

H: Isoniacida R: Rifampicina

Comparación de pruebas rápidas38

Características GRIESS MODS MTBDR plus

GeneXpert

Esputo BK + + + + +

Esputo BK - - + -? +

Muestras extrapulmonares - +* - -

Cultivo de micobacterias(indirecta)

+ - + +

Pacientes antes de inicio de tratamiento

+ + + +

Pacientes en tratamiento o fracaso

- - + +/-

Tiempo de proceso (días) 14 – 21 5 – 21 1 – 2 <1

Identifica MTB - + + +

Costo por prueba, solo reactivos

S/.8 S/.12 S/.30 S/.140

Costo de equipamiento USD

48 000 53 000 100 000 25000* Datos solo para diagnostico en LCR, líquido pleural, heces, no para susceptibilidad.

Nuevas declaraciones de políticas de OMS39

Respaldado por OMS No respaldado por OMS

GeneXpert (2010) Fagos

MODS (2010) Cultivo en agar de capa fina

NRA (2010)

Pruebas colorimétricas (2010)

MTDRplus (2008)

Inno Lipa (2008)

WHO. Non-commercial culture and drug-susceptibility testing method forscreening of patients at rosk of MDR-TB. Policy Statement. (pre publication), Julio de 2010.

40

41

42

Interpretación de una prueba43

Caso 1.

Niño de 10 años con BK ++, tío que vive en su casa tiene TB-MDR confirmada

Caso 2

Mujer de 30 años, vive en zona residencial de Arequipa, tieneBK de esputo +, sin factores de riesgo para TB-MDR, primer episodio de TB

Probabilidad pre-test de que tengan TB-MDR:

Caso 1: 50%

Caso 2: 5%

En Arequipa existe MODS44

Identificacion

de TB-MDR

Método de

proporciones en LJ

MODS Resistente Sensible Total

Resistente 40 1 41

Sensible 4 462 466

Total 44 463 507

Sensibilidad (%) 90.91 81.28 100.00Especificidad (%) 99.78 99.25 100.00

Índice de validez (%) 99.01 98.06 99.97Valor predictivo + (%) 97.56 91.62 100.00Valor predictivo - (%) 99.14 98.20 100.00

Razón de verosimilitud + 420.91 59.28 2988.39Razón de verosimilitud - 0.09 0.04 0.23

45

Nomograma de Fagan

Caso 1 Caso2

Rojo Azul

Pre: 50% Pre: 5%

Post +: 100% Post +: 83%

Post - : 5% Post -: 0,3%

46

Simultáneo con el cultivo Menos demora

Menor capacidad del laboratorio

No se manipulan cultivos

No se necesita aislamientoprimario, entonces bajo costo

menor carga de trabajo

Método Griess

medio solido (LJ)

MODS

medio liquido (7H9)

Programa de diagnóstico rápido de TB-MDR del INS

http://uwclh.conference2web.com/content/all

47

41 Conferencia Mundial de la IUATLD

Berlín 2010

LIBRE ACCESO A CONFERENCIAS

48

Méd. Alberto MendozaInstituto Nacional de Salud

Instituto de Biotecnología y Salud

Contacto:

mendozalberto@hotmail.commdrxdr@gmail.com

Web site: www.tbperu.org

Teléfonos:9807-59549 / 617 6200 - 2143