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Metodologías básicas delprocesamiento de Proteinas
Alejandra KunDepartamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos-IIBCE
Unidad Asociada Sección BioquímicaFacultad de Ciencias13 de octubre 2014
Curso Introducción a la Biología II
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ProteínasProteínas
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libreslibres
RERRER
GolgiGolgi
Cada compartimiento celular estáCada compartimiento celular estácaracterizado por uncaracterizado por un
grupo de proteínas específicogrupo de proteínas específico
cuya síntesis ocurre localmentecuya síntesis ocurre localmente
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NH3+ H
R
COOH
C
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HayHay 2020 aminácidosaminácidosdistintos y se unendistintos y se unenformando cadenasformando cadenas
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basicosbasicos
polarespolares
ácidosácidos
hidrófoboshidrófobos
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Aminoácido Código de tresletras
Código de unaletra
Alanina Ala AArginina Arg RAsparagina Asn NÁcido aspártico Asp DCisteína Cys CGlutamina Gln Q
Ácido glutámico Glu E
Glicina Gly GHistidina His HIsoleucina Ile ILeucina Leu LLisina Lys KMetionina Met MFenilalanina Phe FProlina Pro PSerina Ser STreonina Thr TTriptófano Trp WTirosina Tyr YValina Val V
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Niveles de organizaciónNiveles de organizaciónen la proteínaen la proteína
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Puentes de hidrógenoPuentes de hidrógeno
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Puentes de hidrógenoPuentes de hidrógenoALFA HELICEALFA HELICE
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Puentes de hidrógenoPuentes de hidrógeno
LAMINA BETA PLEGADALAMINA BETA PLEGADA
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libres
RER
Golgi
Cada compartimiento celular estácaracterizado por un
grupo de proteínas específico
cuya síntesis ocurre localmente
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Las proteínas celulares seránextraídas desde los
compartimientos celulares a losque pertenecen
para ser estudiadas pordiferentes métodos basados en laidentificación de algunos de sus
parámetros específicos
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Se aprovechan las propiedades de lasproteínas en solución para separarmezclas de éstas basándose en su:Tamaño (peso) molecular;Solubilidad;Carga eléctrica;Afinidad biológica por otras moléculas.
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1. purificación
* Homogenización: rotura de membranascelulares
* Liberación del contenido celular almedio
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2. Separación
- Cromatografía
- Electoforesis
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Tipos de cromatografía
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- Electroforesis
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-SDS detergente iónicocarga elétrica
- Mercaptoetanolgrupos SH
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Isoelectroenfoque (electroforesis 2D)
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3- Inmuno-detección de proteinas
Inmunoblotting
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Inmunolocalización de proteínas in situ
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Es una herramientas de reconocimiento, basada enla interacción antígeno-anticuerpointeracción antígeno-anticuerpointeracción antígeno-anticuerpo.
Las técnicas de inmunomarcado ( e.g.Inmunocitoquímicas), han surgido en respuesta a lanecesidad de caracterización y de localizacióncaracterización y de localizacióncaracterización y de localizaciónespecíficaespecíficaespecífica de diferentes componentes tisulares ycelulares.
La formación del complejo antígeno-anticuerpopuede ser reconocida y visualizada con diferentesreconocida y visualizada con diferentesreconocida y visualizada con diferentesmarcadoresmarcadoresmarcadores o sistemas de marcadores.
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El objeto a ser reconocido debe tener lacapacidad de unirse a un anticuerpo o a unsistema cuyo efector final sea un anticuerpounido a un marcador.
Métodos de marcaje:
1- directo: anticuerpo específico marcado
2- indirecto: anti-anticuerpo marcado
3- puente
4- antigeno marcado
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Caracteristicas:
1- disponer de cantidades de anticuerposespecífico del orden de 1 mg.
2- se pueden reconocer todos los antígenosdeseados.
3- limitados por:
a. el sistema de marcajeb. el sistema de detección.
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Características: 1- El anti-anticuerpo se aplica en exceso,
2- reconoce la región Fc del anticuerpo específico
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Marcadores:
-Enzimas, que precipitarán sustratos específicos, de manera
irreversible (MO y ME).
-Fluorócromos, captan luz a una longitud de onda (exitándose) y
emiten luz a una longitud de onda mayor (al desexitarse, MO).
- Ferritina, en ME (12nm ø), unido a Ig.
- Oro coloidalPartículas de tamaños variables (2nm a 150nm).Complejos proteicos estables, conservan actividadbiológica.Para ME y MO con amplificación por precipitación de Ag(el oro cataliza la reducción del ión plata a plata metálica enpresencia de un agente reductor).Unido a Ig o Proteína A.
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- Marcadores fluorescentes, alta sensibilidad ypoder de resolución, en Microscopía Confocal.
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Neurofilamentos
Tubulina
Lípidos polares de lasmembranas(OsO4)
Actina
Fibras aisladas, Sistema Nervioso Periférico.
Incisuras vistas por Cajal, 1928
axcSch
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Parvalbúmina en cerebrode ratón. Inmunotincióncon oro 25 nm previa ala inclusión. D, dendritainmunoreactiva.
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Filamentos de desmina marcadausando “Ultra small gold”conjugado y amplificación conplata (R-GENT SE-EM, Aurion).
RE marcado con COPII encriosecciones de célulasHepg2 y revelado conanticonejo unido a Ultra-Small gold y amlificaciónde plata
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Resumen• Las proteínas pueden ser estudiadas extrayéndolas de los
compartimientos celulares que integran o ser estudiadas insitu, en el mismo compartimiento.
• Se pueden analizar diferentes parámetros: Tamaño (peso)molecular, solubilidad, carga eléctrica, afinidad biológica porotras moléculas.
• Extracción:a) fraccionamiento subcelular (homogenización, centrifugación,ultracentrifugación, separación en gradientes por velocidad desedimentación o de densidad).b) separación (cromatografía: intercambio iónico, gel filtración,afinidad, electroforesis: PM, Punto isoeléctrico).
* Estudios in situ: Inmunolocalización celular o ultraestructural.La formación del complejo antígeno-anticuerpo puede serreconocida y visualizada con diferentes marcadores o sistemasde marcadores (MO y ME).
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Bibliografía consultada:
• Biología molecular de la Célula. Alberts,Bray, Lewis, Raf, Roberts, Watson.Editorial Omega, 2002.
• Lehninger Principios de Bioquímica.Nelson, Cox. Editorial Omega, 2000
• Nature Methods, Vol. 2, Nº 12, Diciembre2005.