metodo folin
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MATERIALES Y MÉTODOS
Materia Prima
La materia prima uti l izada fue uva de mesa de exportación de
las variedades Perlette, Flame, Sugar One y Red Globe, cult ivadas
en la región de Pesqueira, en el municipio de Hermosil lo, Sonora.
Las cuales fueron proporcionadas por Viñedo Alta S.A. de C.V. (las
cuatro variedades mencionadas) Campo "La Cuesta" ubicado en el
Km. 23 de la Carretera Hermosil lo-Nogales, Sonora. La uva de uso
industrial proviene del Campo “La Brea”, calle 4 Sur, Km. 3, Costa
de Hermosil lo.
Preparación de las Muestras de Uva
La uva fue lavada con agua desti lada y la cáscara fue
removida manualmente y secada en una estufa de vacío (Nacional
Appliance Company, Modelo 3640) a 50 ºC hasta obtener una
humedad menor o igual al 12 %. La cáscara se pulverizó
mecánicamente a un tamaño de partícula de 30 mesh en una
l icuadora Oster a la máxima velocidad por 10 s. Los polvos de
cáscara y semil la se almacenaron a una temperatura de – 20 ºC
(Yilmaz y Toledo, 2004).
Extracción de los Compuestos Fenólicos
Preparación de la muestra y extracción de fenoles. Los
compuestos fenólicos fueron extraídos de la cáscara (2 g) con 20
mL de metanol acuoso (60:40) con homogenizaciones intermitentes
de 10 seg por un período de 1 min. Posteriormente se sonicó a
temperatura ambiente por 30 min, y se centrifugó a 10,000 rpm por 44
15 min a 4°C. El sobrenadante se f i l tró con papel Whatman (No. 2) y
el material sólido fue sonicado de nuevo con 20 mL de metanol
acuoso (60:40) para después ser centrifugado. Una vez fi ltrado el
sobrenadante se mezcló con el primero para congelarse a -20°C, en
espera de los análisis de oxidación y HPLC (Prior y col., 2001).
Fenoles Totales
Las determinaciones se realizaron espectrofotométricamente
uti l izando el método de Folin-Ciocalteau (Schlesier y col., 2002).
Este método está basado en la oxidación de los grupos fenólicos
por los ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico; formándose un
complejo verde azulado que se mide a 765 nm.
Para la determinación del contenido de fenoles totales de las
muestras, se mezclaron 50 μL de cada extracto con 3 mL de agua
desionizada, adicionando el reactivo de Folin–Ciocalteu 1 N (250
μL, Merck) para reposar por 5 min, después con 750 μL de Na2CO3
al 20%, y 950 μL de agua desionizada, se homogeniza para
reposar por 30 a 40 minutos de reacción se midió la absorbancia a
765 nm (Fig. 9).
Flavonoides Totales
Se uti l izó al ácido gálico monohidratado (Sigma Aldrich, USA)
para la elaboración de una curva de calibración. El contenido de
fenoles totales se expresó como equivalentes de ácido gálico en
mil igramos por gramo de muestra b.s. (Marinova y col., 2005).
Figura 9. Diagrama de cuantificación de fenoles totales.
Para la determinación de flavonoides totales se siguió la
técnica descrita por Siddhuraju y Becker (2003) modificada. Un
50 μL de extracto + 3 mL de agua desionizada +
250 μL del reactivo de Folin–Ciocalteu 1 N
Reposar 5 min
Adicionar 750 μL de Na2CO3 al 20% + 950 μL de agua desionizada
Vortex
Reposar de 30 a 40 minutos
Leer a 765 nm
volumen de 1 mL de extracto se colocó en un tubo de 10 mL, con 4
mL agua desti lada. A ésto se añadieron 0.3 mL de NaNO2 (5
g/100mL) y 0.3 mili l i tros de una solución de AlCl3 (10:100) después
de agitar vigorosamente, se dejó reposar por 1 min. Después de 6
min, se añadieron 2 mL de solución de NaOH 1 M, y se aforó a 10
mL con agua desti lada.
La solución se mezcló, y se midió la absorbancia contra un
blanco a 510 nm en un espectrofotómetro UV-visible (Cary 100 BIO,
Varian) como se observa en la Figura 10. Para la elaboración de la
curva de calibración se uti l izó a la Rutina (E. Merck) como estándar.
El contenido de flavonoides se calculó en base a la siguiente
ecuación l ineal:
Y = 1.442X – 0.024 r = 0.995
Donde: Y es la absorbancia medida y X es el contenido de
flavonoides en mg quercetina/mL.
Se calcularon los rendimientos de extracción de fenoles y
f lavonoides a partir de los pesos totales de los racimos de uvas, así
como de la cáscara fresca y seca.
Identificación de los Compuestos Fenólicos por HPLC
El procedimiento para la identif icación de los compuestos
fenólicos se realizó de acuerdo al método descrito por Cantos y col.
(2000).
Figura 10. Diagrama de cuantif icación de flavonoides totales.
El equipo uti l izado fue un Varian 9050 equipado con un
detector de luz ultravioleta (Varian 3400). Se uti l izó una columna
SupelcosilTM LC18 (30 x 0.4 cm x 5 µm tamaño de partícula,
Supelco, Bellefonte, PA). Los solventes fueron agua más 5% de
ácido fórmico (solvente A) y metanol grado HPLC (solvente B) a un
1 mL de extracto + 4 mL de agua desionizada + 300 μL de NaNO2 al 5% + 300 μL de AlCl3
Reposar 1 min
Adicionar 2 mL de NaOH 1M + 2.4 mL agua desionizada
Vortex
Leer a 415 nm
f lujo de 1.5 mL/min. La elusión se realizó con un gradiente
empezando con 2% de B hasta alcanzar 32% de B a los 30 min,
40% de B a los 40 min. Los cromatogramas fueron registrados a
280, 320, y 360 nm.
Los diferentes compuestos fenólicos se identif icaron por
comparación con los t iempos de retención de los estándares
correspondientes. El ácido gálico, catequina y epicatequina fueron
cuantif icados a 280 nm, el resveratrol y el ácido clorogénico a 320
nm y el quercetin-3-rutinosido conocido como rutina (f lavonol) a 360
nm (García-Alonso y col., 2003). Se elaboraron curvas de
calibración para cada estándar identif icado. Los compuestos
fenólicos de los extractos fueron analizados por tr ipl icado.
Actividad Antioxidante por Ensayo ABTS•+
Este método se basa en la reducción de la coloración
verde/azul producida por la reacción del ABTS•+ (3.8 mg/mL) con 88
μL de persulfato potásico (37.5 mg/mL) incubados a temperatura
ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado
el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de
absorbancia comprendido entre 0.70 + 0.1 a 754 nm. Las muestras
f i l tradas (0.1 mL de extracto) se diluyen con 3.9 mL del radical y se
homogeniza por 1 minuto. La absorbancia se mide de forma
continua transcurridos 7 minutos (Figura 11).
Figura 11. Diagrama de determinación de la actividad antioxidante por el radical ABTS•+.
La reducción en absorbancia es relacionada a la del Trolox, un
análogo sintético e hidrofí l ico de la vitamina E, el cual determina el
valor TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacit ity), calculado
como moles de equivalentes Trolox por gramo de sólido (Pellegrini,
2003).
19.5 mg del radical ABTS + 5 mL de agua bidestilada Soln.
37.8 mg de persulfato de potasio + 1 mL de agua bidestilada Soln.
88 μL de Soln. + Soln. dejar reposar en oscuridad Soln. (12 – 16 h) a Tamb.
88 mL de etanol + 1 mL Soln. Soln.
Leer inmediatamente a
λ754 nm
Colocar en celda 3.9 mL Soln. + 0.1 mL muestra
Actividad Antioxidante por Ensayo DPPH•
Los antioxidantes reducen el radical l ibre 2,2-difenil-1-
picri lhidracilo (DPPH•), el cual t iene una absorbancia máxima a 515
nm. La solución del radical se preparó disolviendo 2.5 mg DPPH• en
100 mL etanol.
Para el ensayo fotométrico se mezclaron 3.9 mL de solución
de DPPH• y 0.1 mL de diferentes concentraciones de los extractos,
para la elaboración de una curva de calibración (Figura 12). La
absorbancia de las muestras se midió en función del t iempo hasta
que las diferencias fueron menores que 0,003 (Materska y Perucka,
2005).
A partir de las cinéticas de disminución de DPPH • . Se
uti l izaron los valores asintóticos de absorbancia y se graficaron en
función de las concentraciones para cada extracto. De éstas últ imas
curvas se calculó la concentración media efectiva (EC50), que es el
contenido de antioxidante requerido para reducir la
concentración inicial de DPPH• a la mitad, para poder comparar la
capacidad antioxidante de los diferentes extractos. Los resultados
finales se expresaron como mg de fruto/mg de DPPH• (Molyneux,
2004).
2.5 mg de radical DPPH y aforar a 100 mL con metanol
Figura 12. Diagrama de determinación de la actividad antioxidante por el radical DPPH• .
Análisis Estadístico
Los datos fueron analizados por un análisis de varianza y
comparación de medias por la prueba de Tukey (p<0.05) uti l izando
Sigmastat 3.5 (Point Richmond, CA, USA). Todos los análisis se
realizaron por tr iplicado.
Homogenizar
Elaborar curva de diluciones(para determinar EC50)
Tomar 0.1 mL de la dilución + 3.9 mL de solución. de radical
Reposar por 30 minutos
Leer inmediatamente a
λ515 nm