Manual de Procedimientos de Lab Oratorio Clinico Veterinarios

Facultad de Bioanlisis, Veracruz

Manual de Procedimientos de Laboratorio

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO CLINICO VETERINARIO INDICEI. II.III.

La Historia Clnica y su uso en el Diagnstico Clnico Veterinario. Mtodos de sujecin y obtencin de muestras para diagnostico de laboratorio en animales domsticos. El mtodo de flotacin para la identificacin de huevecillos de Nematodos en cnidos y felinos. El mtodo de sedimentacin para la identificacin de huevecillos de Trematodos en heces. El mtodo de Harada Mori para cultivo larvario de Ancylostoma y Uncinaria en perros y gatos. Identificacin de larvas de nematodos pulmonares por el mtodo de Baerman Tcnicas Hematolgicas en medicina veterinaria. Diagnstico de Mastitis mediante las pruebas de Hotis y del Azul de Bromotimol Elaboracin de autovacuna en la teraputica de la Papilomatosis bucal canina. Tincin de esporos de Bacillus anthracis Prueba de intradermo-reaccin para deteccin de Fasciola y Tuberculosis Determinacin de copto antgenos Reacciones de aglutinacin pruebas serolgicas y lcteas para la determinacin de Brucelosis.

IV.

V.

VI.VII. VIII.

IX.

X. XI.

XII.XIII.

Laboratorio Clnico Veterinario

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METODOS DE SUJECION Y OBTENCION DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO EN ANIMALES DOMESTICOS.1. INTRODUCCION Los veterinarios tienen la necesidad de consultar laboratorios para resolver determinados problemas de diagnstico. Sin embargo, este esfuerzo puede verse mermado por una seleccin, preparacin, manejo y envo inadecuado de las muestras. Esta situacin puede ser evitada mediante el seguimiento cuidadoso de algunos principios generales: La muestra seleccionada deber ser representativa del padecimiento. Suele ser preferible el envo de varios especimenes del mismo lugar. Las muestras debern ser perfectamente identificadas. Deber incluirse la Historia Clnica del individuo. Para cada caso se elegir el tipo de recoleccin, manejo, conservacin y envo ms adecuado, a la especie y tipo de padecimiento presentado. Cuidar en lo posible, el manejo estril de la muestra y en una cantidad adecuada. En caso de envo Postal, especificar en la envoltura el tipo de muestra, forma de manejo y verificar que se lleve a cabo en el menor tiempo posible. En esta prctica se llevarn a cabo las tcnicas de Puncin venosa en distintas especies domsticas, as como la toma de Muestra de orina y Recoleccin de heces. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN TECNICA DE PUNCION VENOSA En la prctica veterinaria los exmenes hematolgicos se realizan ms satisfactoriamente con la sangre venosa. La puncin venosa, se realiza con aguja y jeringa de distintas medidas segn el caso, ejecutndola sobre cualquiera de las venas superficiales del individuo: Por ejemplo en el caballo, la vaca y la oveja se emplea la vena yugular; Las venas safena y radial, pueden sugerirse para el perro y gato; El cerdo es sangrado normalmente en la vena cava anterior y en algunas razas en la auricular; Los animales de laboratorio como el cobayo, ratn, rata y conejo son desangrados fcilmente en el corazn, vena caudal o auricular.




3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Alcohol Benzal Xilol Vaselina pura Xilocaina Ketamina CONC. 70 100% 10% 50% CANTIDAD 1L 1L 50 ml 500 gr 100ml 100 ml

3.2 Equipos de Laboratorio 1. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 7 Guantes desechables 7 Jeringas desechables de 3 ml 4 Agujas desechables del No 21 3 Agujas desechables del No 22 2 Agujas desechables del No 25 3 Jeringas de insulina 1 Sonda de alimentacin infantil 1 Cinta adhesiva opaca, tela adhesiva de 2-3 cm. 5 m. Cordn de algodn de 0.5 cm de dimetro 1 Tijeras 5 Gradillas 5 Tubos de ensaye 13 x 100 10 Porta objetos de vidrio 10 Cubreobjetos de vidrio 1 lanceta o bistur 3 Hojas de bistur 1 paquete Algodn 5 Ligas 10 abate lenguas 10 Cucharillas rectales o tubos de vidrio 10 frascos de vidrio 3.4 Material biolgico 1 Perro macho de talla mediana o grande 2 Conejo adulto 3 Gallina o pollo grandeLaboratorio Clnico Veterinario



4 Gato adulto 5 Rata blanca o ratn.4.

TECNICA O PROCEDIMIENTO

4.1 TECNICAS DE SANGRADO EN ANIMALES DE LABORATORIO. PUNCIN INTRACARDIACA. Se coloca al individuo en posicin dorsal, se palpa entre la 2a y 3a costilla del lado izquierdo, se coloca la aguja entre las citadas costillas, se presiona ligeramente sobre la zona y se jala l embolo de la jeringa para obtener la muestra (Es necesario cuidar la introduccin de aire para evitar producir embolia gaseosa). PUNCIN EN LA VENA MARGINAL DE OREJA. Se coloca una torunda dentro del conducto auditivo del conejo, se limpia con alcohol y se recorta el pelo de la oreja con una tijera. Se pasa un algodn con xilol para irritar la zona, con una lanceta o bistur se podr obtener la muestra. PUNCIN DE VENAS CAUDALES. RESERCION DE COLA Y DEDOS. SANGRADO EXHAUSTIVO Y DECAPITACION.

4.2 TECNICAS DE SANGRADO EN PERRO Y GATO. El sangrado en perro y gato se lleva a cabo principalmente en las venas safena y radial. Lo ms importante para una correcta obtencin de muestra ser la adecuada sujecin del individuo. Posteriormente se deber ocluir la vena por presin digital o torniquete. La piel sobre la vena es mvil, por lo cual se deber inmovilizar con los dedos de la mano que sujeta el miembro. La aguja deber insertarse con el bisel hacia arriba (No 21 para perros y 22 al 25 para gatos). Se deber evitar interrumpir la circulacin por tiempos prolongados para evitar hemoconcentracin. La cantidad a obtener ser de 5 a 10 ml. evitando colapsar la vena. Al final se retirar la aguja y se vaciar cuidadosamente en un tubo previamente preparado. 4.3 TOMA DE MUESTRA DE ORINA. El anlisis de orina es uno de los procedimientos de laboratorio ms comunes aplicados a la practica veterinaria, es de gran ayuda para el diagnstico diferencial tanto de padecimientos generalizados como del aparato genitourinario.




Para su recoleccin es necesario emplear recipientes limpios, preferentemente estriles. La muestra se recoger durante la miccin o por sondeo, siendo este ltimo ms adecuado por estar libre de detritus uretral o vaginal. Es difcil cateterizar a un perro ms de una o dos veces al da puesto que la reaccin tisular al traumatismo, causa un estrechamiento del lumen uretral a travs del os penis. 4.4 RECOLECCION DE MUESTRA DE HECES. Es indispensable la aplicacin de medidas higinicas estrictas como medida de proteccin en la toma de muestras de heces, as como seguir las indicaciones especificas para cada tipo de animal, utilizando recipientes limpios o estriles para la recoleccin de la muestra. En las especies de talla grande es ms prctico e higinico obtener muestras directamente del recto del animal, con un guante de plstico. Una vez obtenida una muestra adecuada, el guante es reversado hacia adentro, sirviendo de esta forma como recipiente de recoleccin, una vez colectado se sella, se identifica y se enva refrigerada al laboratorio. En los animales pequeos, las muestras fecales son obtenidas por medio del termmetro o una varilla de vidrio, aunque esta pequea cantidad ser apenas suficiente para un examen directo. En caso de no ser posible la recoleccin directa se proceder a tomar la muestra directamente del recto, se cuidara que la defecacin ocurra sobre un piso previamente lavado. En este caso la muestra se recoger con guante plstico, esptula de madera, tomando solo la capa superior que no entr en contacto con el suelo.

5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES




CONCLUSIONES

6. BIBLIOGRAFA De la Puente G. Jos. Manual de Exterior y manejo y Tcnicas de sujecin de los animales domsticos. UNAM. Mxico. Oteiza Fernndez, Jos. Manejo de Animales. Editorial Textos Universitarios. Mxico. El Manual Merck de Veterinaria. Merck & CO. INC. USA.




EL METODO DE FLOTACION PARA LA IDENTIFICACION DE HUEVECILLOS DE NEMATODOS EN CANIDEOS Y FELINOS.1. INTRODUCCION La parasitologa estudia los seres que viven momentnea y/o permanentemente, sobre o dentro de otros organismos vivientes, obteniendo de los mismos su subsistencia. Las enfermedades parasitarias son la interrelacin entre el agente etiolgico (parsito), el hospedero y el medio ambiente, en donde al romperse la relacin de equilibrio se produce sintomatologa y se origina la enfermedad. Existen algunos parmetros que nos sirven para destacar la importancia que guardan en Medicina Veterinaria, por ejemplo: la incidencia en animales domsticos, la mortalidad por parasitosis, las erogaciones econmicas producidas a los productores, as como la repercusin social y econmica. Todo ello nos lleva a considerar la importancia de conocer no solo a las enfermedades parasitarias, sus agentes etiolgicos, patologa, sintomatologa, y la forma de combatirla, sin lograr su control mediante el diagnstico e identificacin que permita el control de las infestaciones subsecuentes. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN La presente prctica consiste en la determinacin de parsitos mediante tcnicas de frotis directo y flotacin. Consiste en dispersar una suspensin de material fecal en solucin de mayor densidad que los huevecillos de parsitos, la diferencia en la gravedad especfica hace que los huevos se eleven a la superficie. Cuando los huevos permanecen demasiado tiempo en la solucin de concentracin, pueden deformarse. Esta tcnica es recomendada para la identificacin de quistes de protozoarios y huevos de helmintos, ya que son capaces de flotar en pesos especficos de 1,000 a 1,200. Los huevecillos de tremtodos son mucho ms pesados, por tanto solo flotarn en lquidos con pesos especficos superiores a los 1,300.




3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos (soluciones de enriquecimiento) NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD Solucin saturada de sal 1.190 a 20C 5L Solucin saturada de azcar 1. 120 a 15C 5 L Solucin cloruro de zinc 1.890 a 20C 5 L 3.2 Equipo de Laboratorio 1. Microscopio 2. Centrfuga (opcional) 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 5 Vasos de precipitado 100 ml 10 Tubos de ensaye 10 Portaobjetos 10 Cubreobjetos 5 Gradillas 5 Pinzas 5 Coladeras de malla fina de plstico 6 a 7 cm dimetro 10 Abatelenguas o varillas de vidrio 10 Gasas 10 Guantes desechables 5 Lazos de alambre 5 Esptulas 3.4 Material Biolgico 1. heces de perro 2. heces de gato 3. heces de aves 4. heces de cerdo 5. heces de bovino u ovino 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 FROTIS DIRECTO




Se emulsifica una pequea cantidad de heces en agua y se aplica una pequea capa sobre el portaobjetos. Se coloca el cubreobjetos y se examina el frotis en el objetivo de menor aumento, investigando la presencia de huevos, quistes y larvas. Este mtodo es valioso cuando se sospecha de la presencia de larvas de nemtodos o protozoarios mviles. 4.2 MTODO DE FLOTACION En un vaso de precipitado de 100 ml se mezclan 2 g de heces con algo de solucin de enriquecimiento utilizando para ello una esptula. Luego se agregan 90 ml de solucin de enriquecimiento agitando vigorosamente para obtener una mezcla bien homognea. Si las heces contienen muchas partculas grandes se cuela la mezcla en colador fino. Se debe recordar que algunos huevos quedan en el residuo detenido por la malla del colador. Lugo se deja reposar la mezcla por unos minutos hasta que las burbujas de aire hayan salido y dejar flotar cuidadosamente un cubreobjetos sobre la superficie del lquido. Los huevos de parsitos flotarn hacia la superficie y se adherirn al cubreobjeto. Despus de media hora el cubreobjeto es cuidadosamente tomado con una pinza y colocado sobre el portaobjetos. La preparacin es observada al microscopio. La flotacin de los huevos en la solucin de enriquecimiento se puede acelerar por medio de la centrifugacin. El tubo para centrfuga debe ser lo suficientemente ancho que permita colocar el cubreobjetos sobre la superficie del lquido. La suspensin se centrifuga con el cubreobjeto sobre la superficie del lquido. Si ello no es posible, la capa superficial del lquido puede ser sacada con un lazo de alambre y luego colocada sobre el portaobjetos.





CONCLUSIONES

6. BIBLIOGRAFA THIENPONT, D; ROCHETTE, F; VANPARIJS, O.F.J. Diagnstico de las Helmintiasis por medio del examen coprolgico. Janssen Research Foundation. Beerse Belgica. 1979. QUIROZ, R. H. Parasitologa y Enfermedades parasitarias de los animales domsticos. Ed Limusa. Mxico. LAPAGE, G. Parasitologa Animal. Logia. Ed. Continental. Mxico.




EL METODO DE SEDIMENTACION PARA LA IDENTIFICACION DE HUEVECILLOS DE TREMATODOS EN HECES.1. INTRODUCCION La Fasciolasis, Distomatosis heptica, Palomilla o Mariposa del hgado, es una enfermedad que afecta comnmente a las ovejas, as como a las cabras, bovinos, cerdos, equinos, eventualmente al hombre y a algunos animales silvestres, presentando una amplia distribucin mundial. Es una enfermedad parasitaria debida a la presencia y accin del Tremtodo Fasciola heptica . Presenta un proceso inflamatorio crnico del hgado y conductos biliares, causando trastornos digestivos y nutricionales 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN Los huevecillos de tremtodo son fcilmente identificables en frotis directo o por la tcnica de sedimentacin, debido a la presencia de un oprculo polar, el cual puede ser destruido en soluciones hipertnicas, por lo cual no se recomiendan las tcnicas de flotacin. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solucin Salina Fisiolgica ter cido actico Azul de metileno CONC. 5% 1% CANTIDAD 1L 1L 100 ml 100 ml

3.2 Equipo de Laboratorio 3. Centrfuga 4. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION




10 20 20 20 10 10 10 10 10 10 10 10 3.4 Material Biolgico heces de ovino heces de bovino

Vasos de precipitado 100 ml Tubos para centrfuga (cnicos) Portaobjetos Cubreobjetos Gradillas Pipetas Pasteur Coladeras de malla fina de plstico palillos finos de madera Gasas Guantes desechables Goteros de cristal Esptulas

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 METODO DE SEDIMENTACION SIMPLE Como se mencion anteriormente, esta tcnica se utiliza nicamente cuando se sospecha la presencia de huevecillos de tremtodo u otra clase de huevecillos operculados.1. 2. 3. 4.

Se coloca una suspensin de heces en agua (puede utilizarse solucin salina) en un tubo de ensaye cnico, colada a travs de una malla fina. Se deja el tubo en reposo por un mnimo de 15 minutos o a centrifugacin a baja velocidad. Se extrae el sedimento mediante una pipeta Pasteur o gotero. Se examina al microscopio en un portaobjetos.

4.2 METODO DE TELEMAN.1. 2. 3. 4.

En 5 ml. de solucin de cido actico al 5% se suspende 1 gr. de heces agitndolo. Se deja reposar por un minuto y se coloca dentro de un tubo de centrifugacin. Se le agrega igual cantidad de ter y se agita vigorosamente. Se centrifuga durante un minuto a 1500 RPM.




El sedimento que se forma contiene los huevecillos de tremtodo, y presenta encima una capa de cido actico y una capa de ter, con una capa de restos de heces entre ambas. 6. Con un palillo fino y largo se afloja el sobrenadante de las paredes del tubo y se decanta, debiendo quedar solo el sedimento. 7. Se agregan unas gotas de agua al sedimento y se mezcla vigorosamente 8. Se toman unas gotas de esta suspensin y se colocan sobre el portaobjetos, examinndolo bajo el pequeo aumento. Con este mtodo es posible evaluar la intensidad de la infestacin.5.


CONCLUSIONES








EL METODO DE HARADA MORI PARA CULTIVO LARVARIO DE ANCYLOSTOMA Y UNCINARIA EN PERROS Y GATOS.1. INTRODUCCION La Anquilostomiasis o Uncinariasis es la Infestacin causada por la presencia ya accin de larvas y adultos de varias especies de Ancylostoma y Uncinaria en intestino delgado y otros tejidos en perros y gatos, Clnicamente se caracteriza por anemia ferropnica, adelgazamiento, diarrea sanguinolenta y en algunos casos edema en patas. Es comn en cachorros posterior al destete, pudindose observar tambin en perros confinados. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN El cuadro clnico por tanto es caracterstico en zonas con problemas enzooticos. Su diagnostico se debe apoyar con la observacin de huevos en heces, en relacin con u cuadro anmico (hematocrito). Para el diagnostico de larvas se recomienda el mtodo de Harada Mori, ya que las larvas son muy sensibles a la sequedad. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3. 1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Agua destilada CONC. CANTIDAD 1L

3.2 Equipos de Laboratorio 1. Estufa de cultivo 2. Lupa 3. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 50 cm Papel filtro. (13 x 120 mm)Laboratorio Clnico Veterinario



10 10 10

tubos de centrfuga cnico de 15 ml Tapones para los tubos de centrfuga de 15 ml Pipetas

3.4 Material Biolgico 1. heces de Perro parasitado o sospechosos 4. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS El cultivo de larvas en heces de perro o gato infectado, se lleva a cabo por el Mtodo de Harada Mori dentro de un tubo de ensaye .1. Se toma una delgada capa de heces de 1 a 2 mm, y se extiende sobre el 2. Se agregan 3 ml de agua destilada en el tubo de ensaya. 3. Se coloca el papel filtro con la muestra dentro del tubo, de tal modo, que

papel filtro, colocndola en el tercio medio.

4. 5. 6. 7. 8.

el extremo inferior haga contacto con el agua (un cm aproximadamente) sin que haga contacto el agua con las heces. En el extremo superior del tubo se coloca un tapn de algodn, sosteniendo el otro extremo del papel. Este cultivo se lleva de 7 a 10 das en la estufa a temperatura promedio de 24 a 28 C. Cada da se deber verificar que el agua contacte con la superficie de papel, en caso necesario se agregar ms agua destilada. Las heces se mantendrn hmedas gracias al papel filtro y tan pronto como las larvas se hallen libres, emigrarn hacia el agua. Las larvas son sacadas con una pipeta y examinadas al microscopio con el menor aumento.





CONCLUSIONES

6. BIBLIOGRAFIA THIENPONT, D; ROCHETTE, F; VANPARIJS, O.F.J. Diagnstico de las Helmintiasis por medio del examen coprolgico. Janssen Research Foundation. Beerse Belgica. 1979. QUIROZ, R. H. Parasitologa y Enfermedades parasitarias de los animales domsticos. Ed Limusa. Mxico. LAPAGE, G. Parasitologa Animal. Logia. Ed. Continental. Mxico.




IDENTIFICACIN DE LARVAS DE NEMATODOS PULMONARES POR EL METODO DE BAERMAN1. INTRODUCCION Los huevos de nemtodos y larvas en heces de bovinos, son casi los mismos que se encuentran en pequeos rumiantes domsticos y salvajes, en medicina veterinaria, el aparato de Baerman ha sido de gran ayuda para la identificacin de parsitos pulmonares de la familia Protostrongylidae principalmente. Cuando se usan heces recin extradas siempre que se encuentren larvas, estas sern identificadas como nemtodos pulmonares, puesto que solo estas son vivparas. Si por ejemplo se utilizan heces de ms tiempo de recolectadas, las larvas de Strongyloides, Trichostrongyldeos y otros nemtodos pueden ser encontradas, tras la eclosin de los huevecillos, lo que obviamente interferir en el diagnstico. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN Cualquier infeccin por pequea que sea, puede ser detectada por medio de este aparato y puede ser utilizado cuantitativamente, siempre que se pese con exactitud la cantidad de heces a utilizar. El aparato de Baerman consiste en un embudo de vidrio sostenido por un soporte y en su parte inferior tiene colocado un tubo de goma de 10 cm de largo que termina en una pequea pipeta (gotero). El tubo de goma es cerrado por un clip. La boca del embudo es cubierta con una malla coladora de gasa o alambre cuya abertura sea de 0.6 a 0.7 mm, la que se empuja un poco en la mitad de manera que se sumerja principalmente en el embudo, sta se cubre por debajo con doble capa de gasas. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Agua destilada CONC. CANTIDAD 2L

3.2 Equipos de Laboratorio




1. Microscopio 2. Centrfuga (opcional) 3.3 Material de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 10 Embudos de vidrio 10 Soporte universal con pinza 5m Tubo de goma 10 goteros 10 Clips 20 Gasas 10 Mallas coladoras de alambre con abertura de 0.6 a 0.7 mm 20 Portaobjetos 20 Cubre objetos 3.4 material Biolgico 1. Heces de bovino u ovino sospechoso a parsitos pulmonares4.

TECNICA O PROCEDIMIENTO

Colocar sobre las gasas 20 g de heces frescas. Llenar el embudo con agua tibia (max. 30C) en la cual deben sumergirse completamente las heces. Si las heces son muy lquidas se deben usar varias capas de gasas. Colocar todo el aparato a temperatura ambiente durante 24 hrs. las larvas saldrn de las heces ya remojadas y pasando a travs del colador, irn a depositarse en el cuello del embudo concentrndose en el fondo. Cuando el clip es abierto se deben recolectar las primeras 3 a 4 gotas (no ms) en un portaobjetos de vidrio y sin cubreobjetos debern ser examinadas al microscopio bajo el aumento menor. Las larvas de nemtodos se vern mover activamente. Tambin se podr recolectar dentro de un tubo para centrfuga de 5 a 10 ml, procediendo al centrifugado, tras la decantacin del sobrenadante, larvas obtenidas debern estar en el sedimento del tubo.

5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS




RESULTADOS Y OBSERVACIONES

CONCLUSIONES





TECNICAS HEMATOLOGICAS EN MEDICINA VETERINARIA.1. INTRODUCCION En la prctica veterinaria los exmenes hematolgicos se realizan mas satisfactoriamente con la sangre venosa prefirindose como se indic en la primera prctica : la vena yugular para caballos, bovinos, ovejas y cabras; el corazn en conejos, cobayos y ratones, y la vena cava para el cerdo. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION Las tcnicas empleadas en medicina veterinaria son similares a las utilizadas en hematologa humana, sin embargo existen algunas consideraciones que sern necesarias indicar. En primer lugar los eritrocitos de perro son especialmente susceptibles a la hemlisis, por lo cual se deber evitar el exceso de presin negativa sobre la jeringa, as como la formacin de espuma que la favorezca (utilizar jeringas de 5 a 10 c.c. con mbolo bien ajustado). Es importante recordar que para las determinaciones de hemoglobina y la cuenta globular, se requiere un anticoagulante y refrigeracin (solucin al 10% con 4 partes de oxalato de potasio y 6 de oxalato de amonio, colocando 0.15 c.c. en tubos de 5 c.c. para perro y gato o 0.3 para tubo de 10 c.c. en especies mayores. Tambin podrn utilizarse de 2 a 4 mg de cristales de oxalato de sodio y citrato de sodio en solucin evaporando a sequedad en tubo de ensaye inclinado). 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Cianometa Standard para cianometa CONC. CANTIDAD

3.2 Equipos de Laboratorio




1. 2. 3. 4.

Microcentrfuga Microscopio Espectofotmetro Disco lector

3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 10 Tubos de vacutainer con EDTA 10 Tubos de ensaye de 13 x 100 50 Portaobjetos 10 Capilares 5 Lmparas de alcohol 5 Pipetas de sahli 5 Boquillas 5 Gradillas 3.4. Material biolgico 1. Muestras de sangre de diferentes especies animales a. Bovino b. Ovino c. Perro d. Gato e. Pollo 4. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS Una vez recibida la muestra se mezcla por inversin, se preparan 4 frotis de sangre y se dejan secar, y se llenan dos pipetas: una para determinacin de hemoglobina y otra para conteo de leucocitos. Se proceder a la verificacin de la cuenta leucocitaria, a la tincin de frotis para el estudio microscpico y la cuenta diferencial (frmula blanca) y la determinacin de hemoglobina. 4.1 PREPARACION DEL FROTIS DE SANGRE.1. Este procedimiento requiere sangre fresca. 2. Para extender la preparacin sern necesarias varias lminas limpias,

sobre las cuales se colocar una gota de sangre en el extremo de la lmina. 3. Con otra lmina se procede a extender la sangre, deslizndola mediante un movimiento rpido, al poner en contacto el borde de la lmina con la gota, en un ngulo agudo.Laboratorio Clnico Veterinario



4. Secar mediante calor o aire, evitando la fragmentacin y crenacin de los

eritrocitos. 5. La laminilla deber ser identificada y teida con los procedimientos usuales (Wright). 6. Una vez seca, se observar al microscopio tanto los eritrocitos como los ncleos de los leucocitos. 4.2 DETERMINACION DE HEMOGLOBINA Existen dos tipos de procedimientos para la determinacin de hemoglobina, ambos son colorimtricos, el directo es el mtodo de Tallqvist en donde el color de la sangre total expuesto en un papel secante se compara con un patrn, este es utilizado en campo, y dentro de los mtodos indirectos se utilizan el hemaglobinmetro de Shali o el de Handen - Hausser, en el cual la hemoglobina es convertida primero en hematina cida y entonces se compara con un patrn (escala graduada). 4.3 CUENTA DE LEUCOCITOS Para esta prueba se requiere sangre venosa oxalatada, extrada en las 24 horas previas al examen.1. La muestra de sangre se vierte sobre un frasco pequeo con cido

2. 3.

4. 5. 6. 7. 8. 9.

clorhdrico 1-10 normal, mezclndola cuidadosamente por inversin repetida. Se procede al llenado de la pipeta de glbulos blancos hasta 0.5 3. La punta de la pipeta deber introducirse en el frasco que contiene diluyente y se aspira cuidadosamente, mezclando el contenido mediante movimientos de rotacin, hasta la marca 11. Una vez lleno deber ser agitado manual o elctricamente hasta asegurar la homogeneizacin de la mezcla. El siguiente paso consiste en el llenado de la cmara contadora, la cual deber estar limpia y libre de grasa. Se procede a colocar el cubreobjetos sobre la cmara. Nuevamente se agita la pipeta, y se desechan dos o tres gotas del capilar graduado de la pipeta. Posteriormente, se procede al llenado por capilaridad, de la cmara sobre las dos hendiduras que separa al borde del cubreobjetos con la misma. Una vez llena, se procede a la observacin al microscopio para el conteo de los leucocitos existentes en cuatro de los cuadros grandes del campo, la suma de su contenido, se multiplica por 50 para dar el total.




10. Cada cuadro grande posee 16 cuadros secundarios y presenta un rea

de 1 milmetro cuadrado y su profundidad es de 0.1 mm (cuatro dcimas de milmetro cubico a una dilucin de 1 a 20).

4.4 CUENTA DE ERITROCITOS. Para el llenado de la pipeta se sigue una tcnica semejante a la anterior, sustituyendo el liquido de dilucin (Hayem), se llena hasta la marca 101 y se procede al llenado de la cmara contadora.1. la cuanta de los eritrocitos se lleva a cabo en el rea central finamente

graduada de la cmara. 2. Se cuentan los cuadros secundarios de las esquinas y el cuadro central (cinco en total). 3. Para el clculo de la cifra total, la suma de los eritrocitos de los 5 cuadros es multiplicada por 10,000 y da la cifra total. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES

CONCLUSIONES




6. BIBLIOGRAFIA BENJAMN M. M. Manual de Patologa Clnica Veterinaria. 4 Edicin. Ed. Limusa. Mxico. 1990 COLES, E. H. Diagnstico y Patologa Veterinaria. 5 Edicin. Ed. Interamericana. Mxico. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum Espaa 1988




DIAGNOSTICO DE MASTITIS MEDIANTE LAS PRUEBAS DE HOTIS Y DEL AZUL DE BROMOTIMOL1. INTRODUCCION La mastitis es una enfermedad aguda o crnica de tipo bacteriano que afecta la glndula mamaria de diversas especies animales siendo de importancia econmica significativa en el caso del ganado bovino, el agente causal puede ser variado entre los que tenemos a los Staphylococcus spp., Corynebacterium pyogenes, E. coli, Pseudomonas spp. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION Para el diagnstico de la mastitis se han aconsejado un sinnmero de procedimientos clasificndose de la siguiente manera:1. Examen fsico del animal (palpacin e inspeccin). 2. Examen fsico de la leche. 3. Examen qumico de la leche (con indicadores como el azul de 4. Examen microscpico de la leche investigando la presencia de leucocitos

bromotimol).

y bacterias (directo o en muestra incubada). 5. Pruebas presuncionales de cultivo encaminadas a identificar al microorganismo, as como la prueba de Hotis. 6. Procedimientos especficos de cultivo para el aislamiento e identificacin del germen.

El xito en el resultado de la prueba depender en gran medida de un estricto procedimiento de recoleccin que evite la contaminacin de la muestra. Estas precauciones no sern tan estrictas en caso de que las pruebas sean de carcter fsico y qumico. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS




3.1 Reactivos NUM. CLAVE

NOMBRE DEL REACTIVO Solucin clorada Alcohol Azul de bromotimol Prpura de bromocresol Tincin de Gram

CONC. 200 ppm 70% 1 - 300

CANTIDAD 10 L 5L 1L 1L

3.2 Equipos de Laboratorio 1. Estufa de cultivo 2. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 20 Lienzos de tela estril (magitel) 5 Paletas para prueba de mastitis 20 Frascos de vidrio estriles 30 Tubos de ensaye 13 x 100 30 Tubos de ensaye 20 cc con tapn de rosca 10 Pipetas pasteur 20 Portaobjetos 3.4 Material biolgico 1. Vacas en etapa de lactacin 2. Muestras de leche directa de la ordea 4. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS 4.1 PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRA Limpieza de la ubre. Lavado con solucin clorada (200 ppm). Secar con lienzo limpio. Secar y esterilizar el pezn con alcohol al 70%. Despuntar para la prueba de pao negro, en su caso. Ordear directamente sobre el recipiente evitando el contacto con el pezn. 7. Las muestras de cada cuarto deber ser tomadas por separado, identificando el cuarto a que corresponden. 8. lavar y desinfectar las manos del ordeador antes y entre la toma de cada cuarto.1. 2. 3. 4. 5. 6.




4.2 PRUEBA DE AZUL DE BROMOTIMOL.1. Extraer con cuidado 5cc de leche de cada cuarto y colocar en los tubos 2. Agregar 0.5 a 1.0 cc de solucin de azul de bromotimol en cada tubo. 3. Proceder a la lectura apoyado con iluminacin natural preferentemente.

dispuestos.

Reaccin amarillo verdoso equivale a un pH normal. Reaccin verde a verde oscuro o azul, presencia de exudado inflamatorio. 4. Vaciar las soluciones de las pruebas despus de cada examen, y lavar con agua neutra. Esta prueba no es exacta al comienzo ni en la fecha cercana al final de la lactancia. Los papeles indicadores pueden suplir a la solucin con menor exactitud en los resultados. 4.3 PRUEBA DE HOTIS1. Preparar cada tubo agregando 1cc de solucin estril de prpura de 2. 3. 4. 5. 6.

bromocresol al 1-300. Marcar los tubos a 16 cc. extraer suficiente leche mediante la tcnica estril, para llenar el tubo hasta la marca. Tapar y mezclar el contenido por inversin. Incubar por espacio de 24 Hrs a 37 C y observar los cambios fsicos que experimente. Interpretacin de la prueba : esta prueba esta destinada a revelar la presencia de Streptococcus agalactiae. Cuando el color vire a amarillo, revela la presencia de grmenes que fermentan la lactosa debido a la baja del pH de la solucin. Reaccin negativa. cuando no hay cambios o adquiere una coloracin griscea con o sin sedimento. Reaccin positiva. el color de la solucin varia del gris al amarillo brillante se presentan los flculos amarillentos, observandose desde unos cuantos en el fondo y los lados del tubo hasta un sedimento denso.

La prueba de Hotis puede ser asociada al examen microscpico directo, para lo cual se proceder a incubar los tubos de ensaye invertidos, para que, en caso de muestras positivas, el sedimento adherido al tapn sea observado al microscopio preparando los frotis necesario 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOSLaboratorio Clnico Veterinario




CONCLUSIONES

6. BIBLIOGRAFIA BENJAMN M. M. Manual de Patologa Clnica Veterinaria. 4 Edicin. Ed. Limusa. Mxico. 1990 COLES, E. H. Diagnstico y Patologa Veterinaria. 5 Edicin. Ed. Interamericana. Mxico. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum Espaa 1988




ELABORACION DE AUTOVACUNA EN LA TERAPEUTICA DE LA PAPILOMATOSIS BUCAL CANINA.1. INTRODUCCION La papilomatosis en una enfermedad viral (Papovavirus) en perros jvenes, que se manifiesta con tumefacciones epiteliales benignas (verrugas blanquecinas y rugosas) en hocico, boca, lengua, paladar y garganta. Pudiendo causar muchas molestias y ser altamente contagioso. La prctica seala que los perros se recuperan de manera espontnea despus de 6 o 7 meses adquiriendo inmunidad permanente, sin embargo se recomienda la aplicacin de autovacuna para estimular la velocidad de la respuesta. La presente prctica tiene como objeto provocar la respuesta inmune en un canideo con papilomatosis bucal, utilizando como antgeno el virus de las lesiones neoplsicas, para obtener anticuerpos especficos contra el mismo. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN Los antgenos son sustancias que al ser introducidas en el organismo, inducen una respuesta inmune detectable y que puede reaccionar los mecanismos efectores humorales o celulares de la respuesta. Cualquier sustancia o clula que es reconocida como extraa por el sistema inmune puede ser un antgeno (bacterias, virus, glbulos rojos, clulas de transplante, etc.) Dentro de las caractersticas qumicas que debe poseer un antgeno estn: 1. Composicin qumica. Preferentemente protenas, o bien polisacridos, lpidos complejos, o cidos nucleicos. 2. Carcter extrao. Alejados filogenticamente del sistema inmune receptor. 3. Peso molecular. Superior a 10,000. 4. Rigidez estructural. La complejidad estructural eleva la inmunogenicidad. Para una adecuada respuesta inmune se requiere alto grado de pureza e integridad para facilitar la reaccin. Los antgenos pueden ser moleculares




o celulares, y al encontrarse intracelularmente debern ser liberados para provocar una mejor estimulacin. Los mtodos empleados para la ruptura de tejidos o clulas pueden ser: congelacin y descongelacin simultnea, maceracin en mortero, licuadora, sonicacin, prensas, Bombas y cro impactacin entre otras. 3. LISTA DE REQUERIMINETOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solucin salina fisiolgica Formaldehdo Penicilina sdica Anestesal Estreptomicina CONC. 1% 800 UI CANTIDAD 5L 1L 1 fco 1 fco 1 fco

3.2 Equipos de laboratorio 1. Balanza. 2. Centrfuga 3.3 Material de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 3 Mortero estril 3 pistilo estril 3 Tijeras 3 Pinzas de diseccin 3 Caja de petri 3 Embudo de cristal 3 Soporte universal 3 Gradillas 10 Gasa estril 3 Pipetas de 1ml 3 Pipetas de 10 ml 6 Tubos de centrfuga 9 Jeringas de 3 ml 3 Jeringas de 5 ml 3 Jeringas de insulina 1 Kg Arena estril Tubos de ensaye estriles de 13 x 100 con tapn 3.4 Material biolgico




1. Papilomas bovinos 2. Papilomas bucales caninos 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 1. Para la obtencin de la muestra se proceder a tranquilizar al animal (con Anestesal), se pinza la base del papiloma (pednculo) y se corta con bistur, (colocando la muestra en una caja de petri estril, conservndola con solucin salina fisiolgica en refrigeracin) se procede a cauterizar la base de la lesin. Dependiendo del tamao de la lesin se debern tomar 5 o 6 gramos de muestra. 2. Una vez obtenida la muestra, se trocear con tijeras lo mas pequeo posible colocndola sobre una caja de petri para poder pesarla, obteniendo 4 gr . 3. Se colocan sobre el mortero y se procede a macerar con el pistilo, hasta obtener la destruccin celular, en caso necesario utilizar arena estril (muestras muy grandes y duras) 4. Agregar solucin salina fisiolgica hasta lograr una suspensin al 20% (4ml se SSF por cada gramo de tejido). 5. Filtrar el macerado con gasa estril y centrifugar a 2,000 rpm durante 10 a 15 min. 6. Titular el sobrenadante, por cada ml agregar 500 U.I. de penicilina y 500m g de estreptomicina como conservador 7. Como inactivador del virus se utilizar Formaldehido al 1%. 8. Incubar a 37 C durante 24 hrs. 9. Refrigerar hasta su uso. 10. Aplicar 5 ml subcutneos en tres aplicaciones cada 8 das.




5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

6. BIBLIOGRAFIA BENJAMN M. M. Manual de Patologa Clnica Veterinaria. 4 Edicin. Ed. Limusa. Mxico. 1990 COLES, E. H. Diagnstico y Patologa Veterinaria. 5 Edicin. Ed. Interamericana. Mxico. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum Espaa 1988 CARTER, G. R. Bacteriologa y Microbiologa Veterinaria. Ed. M.M.M. Mxico. 1990




TINCION DE ESPOROS DE Bacillus anthracis1. INTRODUCCION La formacin del esporo es un mecanismo especializado para la supervivencia bacteriana en circunstancias difciles. Su funcin es encerrar un genoma o paquete gentico, en un vehculo aislante que le permita la germinacin subsiguiente en un medio adecuado. Los esporos, que son clulas en el sentido estricto de la palabra, se encuentran en un estado de criptobiosis o vida latente, sin actividad metablica y muestran un aumento marcado en la resistencia a diversos agentes qumicos o fsicos como por ejemplo la desecacin, congelacin y resistencia al calor y a las radiaciones. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION El efecto que las condiciones ambientales tienen sobre la formacin del esporo vara de un tipo de bacteria a otra. Ejemplo; el bacilo de la Fiebre carbonosa (Bacillus anthracis), solamente forma esporos en condiciones de aerobiosis y estas no pueden encontrarse en impresiones de rganos como el bazo de animales muertos de Antrax, en donde la insuficiencia de aerobiosis del tejido impide la formacin del esporo. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Cepa vacunal de Bacillus anthracis. Verde de malaquita Solucin acuosa de safranina CONC. CANTIDAD 1 fco 1 fco 1 fco

3.2 Equipos de laboratorio 1. Microscopio 3.3 Material de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION




5 5 5 5 1

Portaobjetos Lpiz graso Asa bacteriolgica Platina Jeringa desechable de 3 ml

4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 1. Con ayuda de una jeringa, depositar una gota de Cepa vacunal en el centro de un portaobjetos y fijar. 2. Aplicar verde de malaquita y calentar hasta la emisin de vapores, durante 1 minuto. 3. Lavar con agua corriente. 4. Contrastar con solucin acuosa de Safranina, durante 15 segundos. 5. Lavar, secar y observar al microscopio. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS Resultados a observar: formas vegetativas en rojo. Los esporos se tien en verde claro y las





CONCLUSIONES

6. BIBLIOGRAFIA BENJAMN M. M. Manual de Patologa Clnica Veterinaria. 4 Edicin. Ed. Limusa. Mxico. 1990 COLES, E. H. Diagnstico y Patologa Veterinaria. 5 Edicin. Ed. Interamericana. Mxico. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum Espaa 1988 CARTER, G. R. Bacteriologa y Microbiologa Veterinaria. Ed. M.M.M. Mxico. 1990 MERCHAT, I. A. y PARCKER, R. A. Bacteriologa y Virologa Veterinaria. Ed. Acribia. Mxico.




PRUEBA DE INTRADERMO-REACCION PARA DETECCIN DE FASCIOLA Y TUBERCULOSIS1. INTRODUCCION La prctica se basa en la posibilidad de diagnosticar en condiciones de campo a algunas enfermedades crnicas de los animales, mediante la inoculacin de antgenos conocidos y demostrando una respuesta inmune previa, denominada Hipersensibilidad.2.

PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION

Siendo la tuberculosis bovina una zoonosis muy importante en el campo de la Salud Pblica, adems de la campaa nacional de control y erradicacin de este problema, es para nosotros conocer perfectamente la tcnica de deteccin, as como saber dictar las polticas a seguir en el momento de encontrar uno o ms animales afectados (reactores), evitando as mayores problemas debido a su alta transmisibilidad. La observacin de la reaccin de la tuberculina, es una hipersensibilidad de tipo IV (Gell-Coombs), debido a que en ella participan linfocitos T y macrfagos, esto es, se precisa que haya una infeccin primaria de tuberculosis que pudiera ser clnica o subclnica y que se hubiese implementado una respuesta inmune y que ahora estaremos en posibilidad de demostrarlo y que estas clulas al momento del contacto con la tuberculina liberen unas substancias denominadas genricamente como "linfocinas" y otras substancias como las amino-vaso activas; Esto dar por resultado que en el sitio de la inoculacin o de contacto se forme un proceso inflamatorio con infiltracin de linfocitos, monocitos y polimorfonucleres "neutrfilos", as como las aminas vaso activas e interleucinas que promueven la salida de lquidos del torrente sanguneo, provocando el edema. Aunque generalmente existe un elevado grado de resistencia del hospedador, en numerosas ocasiones se han registrado casos de inmuno supresin en enfermedades crnicas, lo que hace que el microorganismo prolifere de manera relativamente incontrolada en los tejidos del individuo y al mismo tiempo se podra observar una reactividad negativa a la prueba de la tuberculina; tambin se han registrado casos de resistencia familiar baja aLaboratorio Clnico Veterinario



la tuberculina, lo cual indica que existe una gran capacidad para producir diversos grados de inmunidad celular a un organismo infectante determinado, esto es bajo control gentico en los antgenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Aparte de la tuberculosis existen otras enfermedades que pueden ser diagnosticadas mediante el mismo tipo de prueba, obviamente cada una requiere de su antgeno especfico, estas son, como: lepra (lepromina), brucelosis (brucelina), paratuberculosis (johnnina), muermo equino (malena), histoplasmosis (histoplasminina), coccidioidomicosis (coccidioidina), hidatidosis (lquido del quiste hidatdico, prueba de Cazzoni), linfogranuloma venreo (macerado de neoplasias, prueba de Frei), y con algunos virus inactivados (rinotraquetis infecciosa bovina, Aujezsky, rabia, etc.). En la prueba diagnstica de la tuberculosis hay dos tipos de antgenos segn la bacteria de donde se originen: aviar o mamfero (bovino), estas substancias se conocen como Derivado Proteico Purificado de la tuberculina. Debindose aplicar por va intradrmica 1/10 de mililitro (0.1 ml 100 ml), en el pliegue caudal o en la tabla del cuello del bovino, registrndose las lecturas a las 72 horas; los resultados deben anotarse como: REACTORES O NO REACTORES (positivos o negativos, respectivamente). Es necesario conocer la Norma Oficial Mexicana para el control y erradicacin de la tuberculosis bovina. Tambin como pruebas intradrmicas podemos manejar algunos diagnsticos de parasitosis, pero estas reacciones no las podemos ubicar como hipersensibilidad tipo IV, sino como del tipo III puesto que en ellas participan complejos inmunes (Ag-Ab-C'), y su reactividad puede ser observada en unos cuantos minutos, permaneciendo hasta 6 u 8 horas. Un problema parasitario comn en nuestra zona y diagnosticable por este mtodo es la fasciolasis; para ello necesitaremos un extracto proteico de Fasciola heptica en una concentracin final de 0.03%. Esta prueba se considera muy til cuando se trata de determinar el estado de salud de un hato muy grande y que para el cual en el laboratorio de parasitologa no habra suficiente tiempo ni lugar; se pueden elaborar antgenos parasitarios de Strongylus sp., Metastrongylus sp., scaris sp., Stephanurus sp., Cisticercus sp., Aunque en muchos de ellos existir el problema de reacciones cruzadas, principalmente entre las familias afines. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOSLaboratorio Clnico Veterinario



3.1 Reactivos NUM. CLAVE

NOMBRE DEL REACTIVO Tuberculina PPD Aviar y mamfero Solucin Salina Fisiolgica Mtodo de Biuret o Kendall

CONC.

CANTIDAD 1 fco 5L

3.2 Equipos de laboratorio 1. Bscula 2. Centrfuga 3. Espectrofotmetro 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 20 Jeringas de tuberculina c/agujas cal. 25-27 5 Jeringas de 5 ml con aguja del 21 5 Vernier (pie de Rey, nonio, cutmetro) 6 Mortero estril 6 Vasos de precipitado de 500 ml 6 Pistilo estril 6 Cajas de petri 6 Pinzas de diseccin 15 Gasas 6 Embudo de cristal 12 Tubos para centrfuga 6 Tubos de ensaye de 13 x 100 3.4 Material Biolgico 1. Fasciolas vivas 2. Bovinos 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 ELABORACION DE ANTIGENO PARA DIAGNSTICO DE FASCIOLA Para la elaboracin de un antgeno para el diagnstico de una parasitosis, los parsitos frescos son lavados repetidas veces en SSF, hasta que se liberen de toda la materia orgnica que les rodea, se secan y taran,




luego son macerados y se suspende la papilla al 10% son SSF, centrifugar y titular la protena del sobrenadante (SN) son un mtodo apropiado ( Biuret y/o Kjelldal), ajustar a 0.3 % de protena. Para conservarlo se congela a -20 C, liofiliza o refrigera a 4-6C. 4.2 METODOLOGA DE LA PRUEBA DE INTRADERMOREACCION Se realiza antisepsia en el pliegue caudal del bovino sospechoso (base de la cola) y se aplica INTRADERMICAMENTE 0.1 ml de la tuberculina (PPD). Ser positivo (reactor) cualquier manifestacin inflamatoria que se observe en las prximas 72 horas. Si un animal resulta reactor se le deber realizar una prueba doble comparativa en la tabla del cuello, en donde se le rasurar y medir el grosor de la piel previo a la aplicacin y se le aplicarn sendas dosis de PPD aviar y mamfero, (siendo el PPD aviar en la parte anterior del sitio afeitado), leyndose a las 72 horas. Para realizar la interpretacin final se deber restar la medida de los pliegues cutneos de las 72 horas a la medida inicial de ellos. 5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS 5.1 REGISTRO DE RESULTADOS Prueba caudal Bovino No. Sexo Edad Raza RESULTADO Observaciones

Prueba doble comparativa Bovino No. Sexo Edad

Raza

Lectura Inicial final Mam Av Mam Av

RESULTADO




Parasitosis Bovino No. Sexo Edad Raza RESULTADO Observaciones


CONCLUSIONES




6. BIBLIOGRAFIA BENJAMN M. M. Manual de Patologa Clnica Veterinaria. 4 Edicin. Ed. Limusa. Mxico. 1990 COLES, E. H. Diagnstico y Patologa Veterinaria. 5 Edicin. Ed. Interamericana. Mxico. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum Espaa 1988 CARTER, G. R. Bacteriologa y Microbiologa Veterinaria. Ed. M.M.M. Mxico. 1990 MERCHAT, I. A. y PARCKER, R. A. Bacteriologa y Virologa Veterinaria. Ed. Acribia. Mxico.




DETERMINACION DE COPTOANTIGENOS1. INTRODUCCION El objetivo de la prctica es determinar mediante reacciones de precipitacin la identidad de productos crnicos en los cuales se haya podido sospechar algn fraude. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION En el rea de la chacinera es frecuente encontrar que los embutidos no correspondan sus contenidos a lo especificado en la etiqueta, o que en la carnicera nos entreguen una carne de una especie animal diferente a la solicitada. Los copto anticuerpos se emplean para la identificacin de estos productos, para ello se pueden preparar los antisueros como lo realizado en la prctica 1, y obtener antisueros especficos y muy potentes que sean capaces de dar resultados positivos an en diluciones a 1: 10,000. 3. LISTA DE REQUERIMINETOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solucin salina fisiolgica Merthiolate Azida sdica Melox Cloroformo Ketamina Xilacina CONC. 1:100 000 0.02 % 50% 5% CANTIDAD 5 L 1 fco 1 Fco 1 Fco 1 fco 1 fco 1 fco

3.2 Equipos de laboratorio 1. Bscula 2. Centrfuga 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDADLaboratorio Clnico Veterinario

DESCRIPCION



6 6 6 6 25 12 30 6 6 20 6 3.4 Material biolgico 1. 2. 3. 4.

Morteros estriles Pistilos estriles Tijeras Pinzas de diseccin Gasas estriles Tubos para centrfuga Tubos de ensaye de 13 x 100 Pipetas pasteur de 1 ml 250 gr. carne de Jeringas de 3ml Jeringas de 5 ml

Muestras crnicas:250 gr. carne de bovino 250 gr. carne de pollo 250 gr. carne de caballo 250 gr. carne de cerdo 5. 250 gr. de Embutido (salchicha, jamn, etc) 6. 6 Conejos adultos 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO Se pesan unos cuantos gramos de la muestra crnica y se maceran en el mortero, luego se diluyen hasta quedar en una concentracin del 20% con SSF; enseguida se filtran por gasa y se centrifuga a 2000 rpm por diez minutos. Posteriormente el sobrenadante se debe enfrentar a los diferentes antisueros para as poder identificar al producto. Para hacerlo se colocar un ml del antgeno en el fondo de un tubo de ensayo y el suero de conejo diluido (10, 100, 1000, 10000, 100000 veces) se resbalar suavemente por la pared del tubo con una pipeta, intentando formar dos fases y una interfase (no deben mezclarse), en dicha interfase se deber formar un anillo de precipitacin en unos minutos a horas. Tambin puede hacerse utilizando gel. 5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS ANTISUERO MUESTRA NMERO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 EQUINO______________________________________________________




CERDO ______________________________________________________ PERRO ______________________________________________________ BOVINO______________________________________________________ ______________________________________________________ MUESTRA 1. _________________ 2. _________________ 3._________________ 4. _________________ 5. _________________ 6._________________ 7. _________________ 8. _________________ 9._________________ 10. ________________ 11. _________________ 12.________________


CONCLUSIONES




6. BIBLIOGRAFIA CARPENTER, P.H. Inmunologa y Serologa. Prensa Mdica. Mxico HERNANDEZ-BELTRAN, A. y LOPEZ-YNEZ, B. Reacciones serolgicas en la inspeccin de carnes y embutidos. 1977. Tesis recepcional. FMVZ-UV. NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-023-ZOO-1995 identificacin de especie animal en msculo de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y aves, por la prueba de inmuno difusin en gel. Diario Oficial de la Federacin el 14 de septiembre de 1995. edicin a cargo de la "Comisin Nacional de Sanidad Agropecuaria". Mxico, DF.




REACCIONES DE AGLUTINACIN PRUEBAS SEROLOGICAS Y LACTEAS PARA LA DETERMINACION DE BRUCELOSIS.1. INTRODUCCION Las pruebas de aglutinacin son la base del conocimiento sero epidemiolgico de las campaas de control y erradicacin de diversos problemas sanitarios de los animales, como: brucelosis y salmonelosis aviar. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIN Las reacciones de aglutinacin, al igual que las de precipitacin, tienen como componentes: antgeno, anticuerpo y electrolitos; pero en la aglutinacin el antgeno es forme, esto quiere decir que son clulas o partculas de stas. El fenmeno de aglutinacin se lleva a cabo en dos etapas, siendo la primera la formacin de complejos inmunes, o sea la unin de antgenos y anticuerpos, conformando lo que se conoce como complejos primarios, esta parte es inmediata, especfica e invisible; luego pasa a conformar los denominados complejos secundarios, o sean las uniones de los complejos primarios entre s, esta fase es mediata, especfica y visible. La brucelosis es una zoonosis que incapacita al humano y causa mermas econmicas considerables en la ganadera nacional mediante abortos, esterilidad, decomisos y muerte. Existe cierta dificultad para diferenciarla clnicamente de otras afecciones del aparato reproductor de los bovinos como son: vibriosis (campylobacteriosis), tricomoniasis, desnutricin, disfunciones hormonales, etc. Esto ha originado la creacin de diversos mtodos de laboratorio para diagnosticarla en los animales sospechosos. Estos mtodos utilizan suero sanguneo, leche, lquido seminal, desde el punto de vista sero epidemiolgico, adems de que dichas pruebas difieren en sensibilidad y especificidad. Desde el punto de vista bacteriolgico se intentar el aislamiento a partir del moco vaginal, cotiledones, contenido gstrico del producto abortado, etc.




Las pruebas sero epidemiolgicas son:

Especie 1.- Huddleson (placa) Bovino, cerdo y hombre 2.- Lenta en tubo (SAT) Bovino 3.- Tarjeta (Ag tamponado y con rosa de bengala)Bovino y hombre 4.- Anillo en leche (Bang). Bovino 5.- Fijacin del complemento. Bovino 6.- 2--Mercapto-etanol * Bovino 7.- Rivanol * Bovino 8.- Inactivacin por calor (56 C por 30 minutos) Bovino, cerdo 9.- Coombs. Bovino, cerdo * Estas dos pruebas son capaces de detectar anticuerpos no vacunales (IgG), destruyendo o precipitando a los anticuerpos de origen vacunal (IgM). Para funciones de campaa para el control y erradicin de la brucelosis se estn empleando las pruebas de tarjeta, rivanol y fijacin del complemento, como rutina y para el control permanente de los hatos lecheros libres de la enfermedad se est empleando la prueba de anillo en leche (Bang); as como el aislamiento bacteriolgico para la confirmacin de los casos. 3. LISTA DE REQUERIMINETOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Antgeno Brucella abortus aba-test-tarjeta coloreado con rosa de bengala Antgeno Brucella abortus aba-test-rivanol Antgeno Brucella abortus aba-test-leche CONC. pH 3.65 1% CANTIDAD 1 fco 1 fco 1 fco

3.2 Equipos de Laboratorio 1. Caja de iluminacin o Negatoscopio 2. Estufa de cultivo 3.3 Materiales de Laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 15 Agujas para puncin calibre 18 o 20 15 Tubos vacutainers 1 Marcador




5 5 1 caja 5 5 5 1 5 1 10

Placas de vidrio con cuadrcula 2.5 x 2.5 cm Gradilla Palillos de dientes Pipetas de Bang .02 ml Pipetas serolgicas de 0.2 mL Pipetas automticas graduables Caja aislante con refrigerantes frascos de vidrio con tapa Lmpara de alcohol Tubos de ensaye de 13 x 100

3.4 Material Biolgico 1. Bovinos hembras sin vacunaciones contra Brucella 2. Leche de vaca de reciente ordeo 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO Para la obtencin de la sangre se deber hacer una puncin en la vena caudal colectndose esta en el tubo al vaco (vacutainer), rotularlo (identificacin definitiva del animal) y dejarlo en posicin HORIZONTAL hasta que alcance la perfecta coagulacin, posteriormente colocarlo en forma vertical en la gradilla, as cuando el cogulo se retraiga soltar mayor cantidad de suero. es importante que la coleccin de las muestras se hagan con DIFERENTE aguja (siempre estril). La muestra de leche puede ser individual o colectiva, esta se utilizar para la prueba de Bang, aunque es preferible como muestra de hato pues es capaz de detectar a una vaca reactor entre la leche de 60 animales. 4.1 PRUEBA DEL ANTIGENO TAMPONADO (tarjeta).- (Pietz 1968). La prueba es cualitativa, se utilizan 30 L (microlitros, 0.03 ml) de suero sanguneo y la misma cantidad del Abatest-tarjeta, coloreado con rosa de bengala y un pH de 3.65. Se colocan los reactivos sobre una placa de vidrio , de plstico o cartn satinado y mezclar con palillos de dientes, rotar la mezcla y esperar hasta 4 cuatro minutos a la aparicin de la reaccin. Debido al pH bajo, las IgM muchas veces no establecen perfectamente la aglutinacin, mientras que en presencia de IgG, esta s se realiza mejor. 4.2 PRUEBA DE ANILLO EN LECHE (prueba de Bang).- (Fleishaver 1937). Esta prueba detecta aglutininas en la leche, se utiliza para inspeccionar hatos que han sido declarados libres de la infeccin. Se debe homogeneizar




la leche (perol, tanque de enfriamiento, bote, etc.), se toman unos mililitros y se lleva al laboratorio en donde se deber refrigerar de 12-72 horas. Luego calentar al ambiente por 30-60 minutos los reactivos (antgeno y muestras), colocar en tubos de ensaye un ml de la muestra y agregarle 30 L de antgeno, mezclarlo e incubar en estufa de laboratorio a 37 C durante 30-60 minutos, la lectura se har segn el cuadro anexo en resultados: 4.3 RIVANOL.- (Anderson, 1964). El rivanol (lactato 2-etoxi-6,9 diaminoacridina) es un colorante derivado de la acridina y tiene la particularidad de precipitar a protenas del suero de los bovinos. Mediante el uso de cantidades iguales de suero y una solucin de rivanol al 1%, queda un precipitado y un sobrenadante despus de 30 minutos de incubacin y centrifugacin a 2000 rpm por 10 minutos en este sobrenadante se detectan exclusivamente las IgG. Adems debe emplearse un antgeno especialmente elaborado para esta prueba con un pH de 5.8-6.2, pues debe compensarse el efecto de la dilucin de los anticuerpos. Se requiere una placa de vidrio cuadriculada, pipetas de Bang o de 0.02 ml, en donde se colocarn formando una columna, diversas cantidades de la muestra (0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml que significarn ttulos de 1.25, 1:50, 1:100, 1.200 y 1.400 respectivamente), luego se les aadirn 30 L de antgeno a cada cuadro y se agitarn con un palillo de dientes, desde la mayor hasta la menor dilucin del suero sanguneo, aglutinacin igual o mayor que el ttulo de 1:50 se considera positivo. Para la elaboracin de cada uno de los reactivos se utiliza la misma semilla de B. abortus cepa 1119-3 que Cepanzoo proporciona al laboratorio productor. estas bacterias se cultivan en cubas de fermentacin en PBS, peptona y dextrosa, adicionado un perfecto aireado para obtener un adecuado incremento celular; manteniendo el control de calidad en cuanto se refiere a la: Disociacin: mantenimiento de la cepa en su fase lisa Pureza: contener solamente B. abortus Esterilidad: que no haya contaminacin con hongos, virus y otras bacterias. Las diferencias entre los reactivos adems de la coloracin, estriba en la concentracin celular bacteriana: Placa 10-12% Tubo 4.5% Leche 4.0% Tarjeta 8.0%




Rivanol

4.0%

RELACIONES ANTIGENICAS ENTRE BRUCELAS BACTERIA SUERO MONOESPECIFICO AGLUTINACION Br. abortus anti-abortus si Br. abortus anti-melitensis no Br. melitensis anti-melitensis si Br. melitensis anti- abortus no Br. suis anti-abortus si Br. suis anti.suis si Br. suis anti-melitensis no Tambin se detectado reactividad cruzada entre bacterias del gnero Brucella y Pasteurella, Campylobacter y Yersinia.

5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS


CONCLUSIONES




6. BIBLIOGRAFIA AGUIRRE, M. R. A. Brucelosis bovina, diagnstico comparativo por medio de las pruebas serolgicas de fijacin de superficie, aglutinacin en placa y en tubo. Tesis recepcional. FMVZ-UV. 1969. GONZALEZ, P.V. Porciente de reactores serolgicos positivos a brucelosis. Tesis recepcional. FMVZ-UV. 1971. LOPEZ, A. C. Investigacin serolgica de brucelosis canina por los mtodos de Huddleson y Brewer diagnostic kits (card test) en la ciudad de Veracruz. Tesis recepcional. FMVZ-UV. 1971. MORILLA, G.A. y cols. Manual de inmunologa. 1a. Ed. Mxico. TIZARD. Inmunologa Veterinaria. 1998 Ed. Diana-tcnico. 1986.




MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO CLINICO VETERINARIO

Elaborado por: MVZ Elsa Ariadna Villanueva Jimnez


Manual de Procedimientos de Lab Oratorio Clinico Veterinarios

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