Manual de Prácticas Microbiologia Industrial_IQ

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Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO ACADMICO DE MICROBIOLOGA Y

PARASITOLOGA

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Prctica I

Bioseguridad

La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y

conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas,

destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biolgicos,

fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o

producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores,

visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicacin adecuada de normas de

bioseguridad as como la importancia de estas normas antes, durante y despus de cada

prctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se est desenvolviendo.

Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de anlisis,

investigacin y dems, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeo seguro y

garantizar resultados exitosos. Las normas generales son:

El acceso al laboratorio estar limitado solo al personal autorizado.

El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de

bioseguridad.

Toda rea debe estar marcada con la respectiva seal de riesgo biolgico y su nivel de

contencin.

Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga,

abotonada y limpia, as mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y

dems objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los

bancos o mesas.

Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesin de laboratorio para

evitar la contaminacin por corrientes de aire.

Al inicio y trmino de una prctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una

solucin desinfectante.

El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el trmino del

mismo.

Se deben lavar las manos al inicio y al trmino de cada sesin de trabajo, secndolas

posteriormente con toallas de papel.

Se debern usar todos los implementos necesarios para la proteccin segn el nivel de

riesgo biolgico.

Durante la prctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.

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Se debe colocar un calzado adecuado para las prcticas en el laboratorio, as como

mantener las uas cortas, limpias y sin esmalte.

Utilizar los equipos segn las instrucciones o los procedimientos operativos

estandarizados.

Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de cadas no

se produzca salpicadura.

Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales

potencialmente infecciosos sin la debida proteccin.

Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de

laboratorio.

Utilizar mscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.

Apagar los instrumentos elctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1. Algunos smbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

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1. Principios bsicos de bioseguridad

El trmino contencin se utiliza para describir mtodos seguros para manejar materiales

infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de

la contencin es reducir o eliminar la exposicin de quienes trabajan en laboratorios, de otras

personas y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contencin

El elemento ms importante de la contencin es el cumplimiento estricto de las

prcticas y tcnicas microbiolgicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando

las prcticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o

un procedimiento de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas

medidas adicionales corresponden a los equipos de seguridad diseados para la proteccin del

personal y las prcticas de manejo (barrera primaria), as como el diseo de instalacin y

caractersticas de ingeniera adecuados (barrera secundaria).

1.2 Barreras primarias

Constituyen la primera lnea de defensa cuando se manipulan materiales biolgicos,

qumicos o fsicos. Se considera que las barreras de proteccin primaria son: equipos de

proteccin personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biolgica (con

barreras de aire, que permiten que ste fluya en una sola direccin y a una velocidad constante

originando el flujo de aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que

atrapan las partculas contenidas en el flujo de aire); normas de higiene personal;

inmunizacin (vacunacin); desinfeccin (alcohol, compuestos fenlicos, hipocloritos) y

esterilizacin (calor hmedo, calor seco) de instrumentos y superficies. Principalmente se busca

la proteccin del personal presente en un ambiente frente a los agentes infecciosos o productos

qumicos de riesgo. Seguridad.

1.3 Barreras secundarias

El diseo y construccin de un laboratorio se conoce como contencin o barrera

secundaria, contribuye a la proteccin del personal del laboratorio as como el que se localiza

fuera del laboratorio y personas de la comunidad en general, frente a posibles escapes

accidentales de agentes infecciosos. Se incluye la localizacin del laboratorio fuera del rea de

trnsito, acceso restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble

puerta ( nivel 3), presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al

calor moderado, cidos y lcalis, reas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin,

tratamiento de residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y

elctrico de fcil acceso.

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2. Clasificacin de los agentes biolgicos por grupo de riesgo

2.1 Agentes biolgicos del grupo 1

Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de

virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo:

Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la

elaboracin de quesos, embutidos, entre otros.


Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la

colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes

pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patologa infecciosa

de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre

otros.


Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los

trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe

generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patologa grave, de difcil y largo

tratamiento, pueden curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y ms

frecuente peligro es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos.

Ejemplo: Mycobacterium. tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros.


Son aqullos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio

peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad

y sin que exista generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son

microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus,

etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratorios

Se consideran cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la

combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biolgica descritos:

tcnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseo arquitectnico de las instalaciones del

laboratorio. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de actividades que se

realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad el

laboratorio. De forma general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contencin

necesaria para proteger al personal y al ambiente.

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3.1 Nivel de bioseguridad 1

Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biolgicos del grupo de

riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros

de enseanza donde se emplean microorganismos no patgenos.


Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal

especializado para el manejo de stos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de

microbiologa clnica y de control de calidad sanitaria (tcnicos de laboratorio, especialistas en

microbiologa).


Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo de riesgo 3. El

material biolgico slo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con

infraestructura apropiada para el nivel de contencin 3, es decir, con aire acondicionado

independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de bioseguridad, entre

otras caractersticas; correspondiendo a algunos laboratorios de microbiologa clnica, de

produccin de biolgicos y de control de calidad sanitaria.


Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biolgico de

riesgo 4, especialmente patgeno infecto contagioso, extico o no, que produce alta

mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel tambin puede

utilizarse para trabajar con animales de experimentacin infectados por microorganismos del

grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliogrficas

- Granados, E. & Villaverde C. (1977). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo.

- Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios.

Serie de Normas Tcnicas N 18 (2 ed.). Per

- Per, Ministerio de Salud. (2001). Buenas Prcticas de Laboratorio. Seminario Taller,

Lambayeque, Per.

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Prctica II

Material y equipo de laboratorio

1. Introduccin

Las tres fuentes del conocimiento son la observacin, la experimentacin y el razonamiento. La

experimentacin exige menos esfuerzo mental pero ms tiempo, es decir ms presencia; por

consiguiente se necesita equilibrar la enseanza con ms horas de laboratorio para un buen

aprendizaje. Una buena enseanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre

observar un fenmeno o una reaccin, y el poder interpretarlo. La correcta observacin le dar

el domino real sobre la materia. La capacidad de interpretacin le proporcionar adems la

preparacin tcnico-cientfica necesaria para ser un buen investigador.

Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de laboratorio,

slo as se lograr obtener buenas lecturas lo que permitir una buena interpretacin de los

resultados.

2. Objetivos

2.1 Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa.

2.2 Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiologa.

2.3 Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiologa.

3. Procedimiento

3.1 Reconocimiento de material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiologa

3.1.1 Tubos de ensayo

Existe una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro, paredes gruesas y

sin rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioqumicos se usan tubos de 13 X

100 mm. y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X 125 mm.

3.1.2 Placas de Petri

Estn compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el ms grande hace de tapa. Se emplean

para el aislamiento y cultivo de microorganismos.

3.1.3 Tubos de Smith

Son utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de fermentacin.

3.1.4 Campanas de Durham

Son tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y permiten detectar la

produccin de gas en los procesos de fermentacin.

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3.1.5 Pipetas serolgicas o de medida

Presentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20C. Las marcas ms

conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para trabajos

de precisin, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en

Norteamrica y tienen las siglas NBS y el ao de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX

serolgica de 1 mL de capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una

pipeta PIREX del mismo volumen tiene un ET de 0.02 (2%).

Las pipetas serolgicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL. Las de mayor uso son:

Pipetas de 10 mL 0,1 mL

Pipetas de 5 mL. 0,1 mL

Pipetas de 1 ml. 0,1 y 0,01 mL

Pipetas de 0.1 mL. 0,1 y 0,001 mL

Pipetas de Dhan de 0,125 0,0125 mL

Pipetas de Dhan de 0,250 0,0250 mL

Pipetas de Bang de 0,2 0,08 y 0,005 ml

Las pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la

punta de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del lquido se realiza hasta la

ltima lnea de graduacin.

3.1.6 Pipetas Pasteur

Son confeccionadas de varillas de vidrio de dimetro de 4 X 20 mm. y de 30 40 cm. de

longitud. La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la accin directa de la llama

del mechero, para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la toma

de pequeos inculos de siembra.

Modo de emplear la pipeta Pasteur

- La pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio. Se coloca la punta de la pipeta en el

lquido por medir, bastante profundo, para que se pueda aspirar el volumen necesario sin aire.

Con aspiracin suave, se llena el lquido por encima de la marca de calibracin. Se cierra la

pieza de la boca con el dedo ndice.

- Se seca el exceso del lquido en el exterior de la pipeta con un pao o un papel limpio,

y colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del lquido baje hasta

la marca de calibracin moviendo con suavidad el ndice sobre la pieza de boca. El dedo no

debe retirarse.

- Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepcin, colocando su punta contra la pared.

- Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vace durante el tiempo

necesario. No se debe soplar para hacer salir la ltima gota al emplear una pipeta volumtrica o

cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el

vaciamiento sea correcto.

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3.1.7 Buretas

Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con un tubo

corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las ms comunes son de 50 mL y estn

graduadas al dcimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de

lquidos o soluciones y se las usa mayormente en las titulaciones volumtricas.

Modo de usar la bureta

- La bureta limpia y vaca se mantiene en posicin vertical mediante un soporte adecuado.

- Se enjuaga la bureta con el mismo lquido que se va a descargar.

- Se llena la bureta con el lquido hasta un poco ms arriba de la graduacin y se descarga

el lquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduacin

y el pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solucin.

- Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojo debe estar al nivel del menisco para evitar

errores.

- Despus de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de

ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o tambin pueden colocarse en el soporte

con las puntas hacia arriba.

- Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con

cera y resina. La lubricacin adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca.

3.1.8 Matraces

Son recipientes volumtricos muy tiles en la preparacin y almacenamiento de soluciones,

colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamao son muy variables.

- Matraces cnicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que

reducir a un mnimo la evaporacin; son tiles para las titulaciones. En Microbiologa sirven

para la preparacin de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de

alambre cuando se realiza el calentamiento evitando as el contacto directo entre el matraz y la

llama.

- Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el

mechero. Para calentar solventes orgnicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es

preferible emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores

correspondientes y permiten un cierre mucho ms hermtico que los tapones de caucho o de

corcho.

- Matraces aforados o fiolas: Idnticos a los matraces erlenmeyer. Estn calibrados a

medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica

la medida. Se emplean para la preparacin de reactivos y de soluciones buffer.

- Matraces kitasato: Son matraces que adems de la boca tienen una tabulacin corta

lateral para hacer vaco. Se utilizan como complemento del equipo de filtracin (esterilizacin

en fro).

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3.1.9 Esptulas de Drigalsky

Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fraccin recta y horizontal facilita la siembra

y aislamiento de bacterias por diseminacin.

3.1.10 Probetas

Recipientes cilndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener capacidad

de 10 mL hasta 2 000 mL. Las ms utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL.

3.1.11 Beacker o vasos de precipitacin

Recipientes cilndricos y cortos, con una depresin en el margen de la boca. El vidrio debe ser

necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad.

3.1.12 Varillas de vidrio macizo

Fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confeccin de agitadores o baguetas. Las varillas

cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra.

3.1.13 Frascos reactivos

Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color mbar. Son cilndricos, tienen

cuello estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar su

vaciado y su tamao vara de 25 mL a 1000 mL).En los frascos pequeos se pueden almacenar

HCl, H2SO4, CCl4, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos desinfectantes u

otros reactivos.

3.1.14 Frascos goteros

Tienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o mbar, y sus tapones son

ranurados para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para

colorantes o para indicadores.

3.1.15 Picetas

Son botellas plsticas de color blanco con una especie de cao que al presionar el frasco permite

que el lquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar lminas portaobjetos con tinciones.

3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos

Los portaobjetos son lminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mnimo grosor.

Los cubreobjetos son finsimas laminillas de mucho menor tamao que los portaobjetos y

pueden ser de forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para la

observacin microscpica de las bacterias u otros organismos.

3.1.17 Jarra de Brewer

Denominada tambin campana de anaerobiosis, est constituida por una tapa de baquelita en

cuya parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo es un

cilindro de vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es cerrada

hermticamente mediante una abrazadera de metal.

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3.1.18 Asas de siembra

Con mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrn resistente a

elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos.

3.1.19 Mangos de Kolle

Vstagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para

insertar el alambre de platino o micrn en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por

mangos de vidrio.

3.1.20 Alambres de platino en aro y en punta

Pueden ser acoplados a los mangos de Kolle.

3.1.21 Canastillas o cestos de metal

Las mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en medidas

conocidas, sin riesgo de roturas.

3.1.22 Gradillas

Permiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes.

3.1.23 Soportes universales

Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc. Son de

metal de preferencia de fierro y son muy buenos soportes de recipientes sometidos al

calentamiento.

3.1.24 Trpodes

Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al

calentamiento. De variada altura y dimetro.

3.1.25 Rejilla o malla metlica

Malla de alambre galvanizado, resistente a la corrosin a elevadas temperaturas. Se coloca sobre

el trpode.

3.1.26 Mecheros

- Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de

metal por donde se introduce la mecha.

- Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos ms tiles en el

laboratorio. Fue inventado por el alemn Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de

mecheros, algunos tienen regulacin de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son

simples, no regulan el gas, y queman gas propano.

3.1.27 Autoclave

Consta de una caldera de acero o de cobre batido estaado interiormente, protegida por una

camisa metlica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base est instalada la

fuente calrica (gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, est la placa

cribosa para apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa

que es pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno est adaptado un arandel de caucho

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para el cierre hermtico del aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el

cierre, evitndose el escape del vapor. Presenta adems, un manmetro (que marca las libras de

presin), una vlvula de seguridad, un termmetro y una llave o espita (para la salida del aire y

vapor al empezar a hervir el agua).

El vapor de agua se aplica en una cmara cerrada en la que existe un generador de vapor;

cuando ste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el momento en

que ya sale vapor. Posteriormente se consigue la presin deseada, teniendo en cuenta que el

vapor a 1 atm. de presin corresponde a 121C de temperatura. Esta temperatura, aplicada

durante 15 o 20 minutos, una temperatura de 134 C durante 7 minutos destruye todas las

formas vegetativas y esporuladas.

El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente se han

dado las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilizacin ms

usados son productos qumicos (que cambian de color segn los niveles alcanzados) y esporas

de ciertas bacterias.

3.1.28 Horno Pasteur

Es un aparato muy utilizado en la esterilizacin por calor seco. Es cilndrico, de metal, de triple

pared; la intermedia ms corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas paralelas

(concntricas) que se comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro hace fondo.

Las paredes son metlicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta. Por los

lados o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero mltiple o

juego de resistencia (fuente calorfica).

3.1.29 Espectrofotmetro

Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza mucho en

anlisis bioqumicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben

ciertas longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene color rojo

porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda ms cortas

del azul y el verde.

3.1.30 Potencimetro

Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biolgicos, medios de

cultivo, etc.

3.1.31 Contador de colonias

Lo ms difcil en la determinacin de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El

contador de colonias soluciona este problema convirtindose en un auxiliar indispensable para

todo laboratorio microbiolgico y adems no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo.

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3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras

Son incubadoras de temperaturas fras. Se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros

y reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento ms prolongado de

sueros, enzimas, etc.

Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberas de agua caliente.

3.1.33 Estufas de cultivo

Sirven para realizar el proceso de incubacin, que brinda una temperatura adecuada para que los

microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos mtodos de incubacin:

Incubacin por calor seco: Se realiza en incubadoras e incluso en hornos. Las

incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre stos radica en

la temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato

que es capaz de soportar temperaturas de 100 C ms. El ms conocido es el horno Pasteur.

Incubacin por calor hmedo (bao Mara): El llamado bao Mara presenta un

dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio

de una corriente de conveccin, lo que permite que el agua se caliente en forma ms uniforme.

3.1.34 Microscopio ptico

La Microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio.

Podemos encontrar un microscopio simple que no es ms que una lente biconvexa, o un

microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello

mayor aumento.

Los microscopios se clasifican bsicamente en dos grupos en funcin del tipo de luz utilizada y

amplificacin: microscopio de luz ptica y microscopio electrnico. El microscopio mediante el

cual la amplificacin de la imagen se obtiene por un sistema de lentes pticas, corresponde a los

microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificacin de la imagen se hace a

travs de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio

electrnico.

Los diversos componentes del microscopio ptico pueden ser agrupados en cuatro sistemas:

a) Sistema de soporte: Pie, bastidor, revlver portaobjetivos, platina.

b) Sistema de aumento : Objetivos, oculares

c) Sistema de iluminacin: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros.

d) Sistema de ajuste: Tornillo macromtrico, tornillo micromtrico, condensador,

elevador del diafragma iris, reguladores de la platina mecnica, tornillos para centrar el

condensador.

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Sistema de aumento

La amplificacin de la imagen en un microscopio ptico se obtiene mediante dos sistemas de

lentes convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del tubo del

microscopio, justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan

objetivos y forman la imagen real del objeto que se est observando. El poder de aumento de

cada uno de ellos es indicado por un nmero grabado ejemplo: 40 indica un aumento del

objetivo de 40 veces.

El segundo sistema de lentes que se sita en el extremo superior del tubo del microscopio, est

ms alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano. Son los oculares y se encargan de

ampliar la imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual que es la que

percibe el ojo humano. La amplificacin del ocular suele venir indicada en la parte superior del

lente ocular o en la lateral.

Poder de aumento del microscopio

Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se emplea

un objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de aumento del

microscopio ser de 450.

Poder de resolucin del microscopio

Es la distancia entre dos estructuras de un espcimen en la cual todava se pueden observar

como estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolucin se define como el espacio

de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar con claridad como

dos entidades independientes y si se les acerca un poco ms, ya no se distinguen, y se les ve

como un solo punto.

El poder de resolucin est sujeto a la longitud de onda () del espectro de luz visible y a la

propiedad de las lentes conocidas como la abertura numrica (AN). El lmite del poder de

resolucin de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 /AN que para un microscopio

ptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes,

ser mejor el poder de resolucin del microscopio

Abertura numrica de un objetivo

Depende del ndice de refraccin (N) del medio que llena el espacio entre el espcimen y la

parte frontal del objetivo, y del ngulo () de los rayos de luz mas oblicuos que pueden entrar al

objetivo. Usando una lente con mayor abertura numrica, se obtiene mayor poder de resolucin.

AN = N x Sen /2

El aire tiene un ndice de refraccin de 1, que limita la resolucin que se puede obtener, pero se

puede incrementar la abertura numrica colocando aceite de inmersin entre el especmen y el

objetivo, aumentando as el poder de resolucin del microscopio.

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Aceite de inmersin

Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego se

desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el punto

objeto es el aceite. Este tiene un ndice de refracccin de 1,5, lo que aumenta considerablemente

la abertura numrica. La observacin de algas, hongos y protozoos se puede hacer con los

objetivos secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espcimen y el objetivo, pero para

observar las bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo de inmersin de

aceite.

Iluminacin

La iluminacin es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolucin de un

microscopio. La luz proceder de la fuente de iluminacin que se situar en la parte ms baja del

microscopio. Dicha luz penetrar en el condensador y ste llegar al objetivo que lo amplificar,

as pues deber llegar un cono de luz muy grande para que su amplificacin sea mayor. Este

tamao de cono de luz que llega al objetivo se podr controlar con el diafragma situado

inmediatamente debajo del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma estuviera

completamente abierto, se perdera contraste y nitidez.

Si se utiliza el objetivo de inmersin, la distancia de trabajo es muy pequea y, en estos casos,

hay que abrir ms el diafragma para facilitar una mayor amplificacin que aumente el mximo

poder de resolucin.

3.2 Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiologa

.3.2.1 Microscopio

- Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriolgica estril.

- Homogenizar la muestra en solucin salina fisiolgica estril (1 gota) sobre una lmina

porta objetos.

- Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo.

- Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X.

3.2.2 Horno Pasteur

- Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado.

- Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica.

- Graduar la temperatura del horno a 180 C y mantener el material por espacio de 2 horas.

Precauciones en el manejo

No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un

cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio.

Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de sta manera se evitar la

carbonizacin del papel y tapones de algodn.

16

No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales,

guantes de goma, etc.

3.2.3 Autoclave

- Depositar agua en la caldera hasta unos centmetros de la parrilla.

- Colocar el material a esterilizar en la canastilla.

- Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en

dos tornillos diagonalmente opuestos.

- Dejar abierta la espita.

- Encender la fuente de calor.

- Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.

- Observar el manmetro y mantener la presin en 15 libras mediante el control de la

temperatura (121 C) durante 15 a 20 minutos.

- Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presin

deseada.

- Apagar el sistema de calefaccin, despus del tiempo de esterilizacin.

- Dejar enfriar hasta que el manmetro marque cero.

- Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua.

- Aflojar los tornillos y levantar la tapa ponindose detrs del aparato para evitar que los

vapores lleguen a la cara del operador.

Precauciones en el manejo:

Para evitar la prdida de material por ebullicin se recomienda no llenar los recipientes.

No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la

circulacin del vapor.

No bajar la presin abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar prdida de material

y ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presin.

3.2.4 Estufa

- Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el

medio de cultivo inoculado.

- Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica.

- Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubacin durante 24, 48

horas o ms tiempo si es requerido.

3.2.5 Bao Mara

- Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo.

- Encender la fuente calorfica.

- Graduar la temperatura deseada.

- Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo

deseado.

17

3.3 Esterilizacin del material de uso en el laboratorio de Microbiologa

3..3.1 Placas de Petri

Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o de descarte y

esterilizar en autoclave a 121 C durante 20 minutos.

Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y

dejar secar.

Envolver con papel y asegurar con pabilo.

Esterilizar en el horno a 180 C durante 2 horas.

3.3.2 Tubos de ensayo

En una canastilla o un depsito que los sostenga depositar los tubos que contengan

material contaminado o de descarte.

Esterilizar en el autoclave a l21 C durante 20 minutos.

Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y

dejar secar.

Taponar los tubos con algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente

y facilite su uso posterior.

Envolver con papel. De preferencia formar grupos de seis tubos, envolver y

asegurar con pabilo.


3.3.3 Matraces

Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recin

preparados o cultivos de descarte.

Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar.

Colocar tapones de algodn no graso, de modo que el tapn ajuste perfectamente y

facilite su uso posterior.


3.3.4 Pipetas

Colocar un tapn de algodn ligeramente ajustado en el orificio superior de las

pipetas.

Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas.


18

4 Anexo

Figura 2.1 Equipos de uso en microbiologa, a. Autoclave, b. Estufa c. Horno,

d. Espectrofotmetro

a b

c d

19

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiologa, a. Potencimetro, b. Refrigeradora, c.

Microscopio binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Bao mara.

a b

c d

f e

20


- Granados, E. & Villaverde C. (1997). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo.

- Mendo, M. (1999).Instrumentacin de Laboratorio. Lima, Per: Editorial Cientfica

Mundi E.I.R.L.

21

Prctica III

Observacin de bacterias

1. Introduccin

Leewenhoek realiz observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta

entonces slo se poda especular de la existencia de agentes infecciosos ms pequeos que lo

que el ojo humano poda distinguir. Desde ese momento el microscopio ptico se ha

transformado en una herramienta muy importante en la determinacin y clasificacin

microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con slo

unas pocas coloraciones y un microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo

individual ms eficiente y econmico para el diagnstico rpido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos

a. Reconocer la morfologa de las bacterias.

b. Adquirir destreza en la obtencin de un frotis.

c. Describir las tcnicas de coloracin simple y compuesta.

d. Adquirir destreza en la tincin de Gram

3. Procedimiento

a. Obtencin de un frotis

El frotis constituye la extensin y fijacin de la muestra sobre una lmina portaobjetos limpia y

desengrasada.

Extensin: Se coloca en el centro de una lmina portaobjetos una gota del cultivo

lquido. Si el cultivo fuera slido, se coloca previamente una gota de solucin salina o agua

destilada sobre la lmina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequea porcin de una

colonia tomada con el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa

delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lmina.

Fijacin: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea

arrastrado durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

22

Figura 3.1 Tecnica para la obtencin de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b) colocar

una gota de solucion salina esteril en una lmina portaobjetos c) tomar una colonia de la placa

de Petri. c), d) realizar una emulsin , luego extender la muestra sobre la lamina y fijar la

muestra al calor .

b. Coloracin simple

Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc.

Procedimiento:

En una lmina portaobjetos realizar el frotis de la muestra.

Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5

minutos.

Lavar el frotis a chorro de agua.

Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.

Observar al microscopio y esquematizar.

c. Coloracin compuesta: Tcnica de Gram

Coloracin compuesta es aquella que utiliza ms de un colorante. La ms comn es la tincin

de Gram, donde las bacterias se tien con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el

lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las

bacterias Gram positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.

A c

b

D

23

Procedimiento:

En una lmina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el

frotis.

Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos.

Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto.

Lavar a chorro de agua y decolorar rpidamente con alcohol acetona.

Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos.

Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.

Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersin.

Comparar y esquematizar.

24

Soluc. A

Soluc. B

4. Anexo

Reactivos para la tincin de Gram

A) Violeta de Genciana de Hucker

Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g

Alcohol etlico ............................................................................... 20,0 mL

Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g

Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B) Solucin de safranina

Safranina ...................................................................................... 0,25 g

Alcohol etlico .............................................................................. 10,0 mL

Agua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C) Solucin de lugol

Yodo .............................................................................................. 1,0 g

Yoduro de potasio ......................................................................... 2,0 g

Agua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D) Alcohol acetona

Alcohol de 95 ............................................................................... 70,0 mL.

Acetona .......................................................................................... 30,0 mL


- Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo.

- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10

ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

25

Prctica IV

Medios de cultivo

1. Introduccin

Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicacin de los

microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de

cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrgeno, debe presentar un equilibrio cido

base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes (esterilizado en autoclave a 121

C, 15 libras de presin, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo segn su naturaleza

1.1.1 Naturales

a. Origen animal: Leche, huevos.

b. Origen vegetal: Papas.

1.1.2 Artificiales: Son aquellos que tienen una composicin qumica conocida y constante

ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo segn su utilidad

1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.

Entre ellos estn el caldo comn, agar comn, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo comn (g/L)

Peptona 10,0

NaCl 5,0

Agua destilada csp 1000 mL

pH 7,0

Agar comn (g/L)

Peptona 10,0

NaCl 5,0

Agar 15,0


pH 7.0

26

Caldo nutritivo (g/L)

Peptona 10,0

NaCl 5 ,0

Extracto de carne 3,0


pH 7,0

Agar nutritivo (g/L)

Peptona 10,0

NaCl 5,0

Agar 15,0



pH 7,0

1.2.2 Medios especiales

a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos orgnicos

como sangre, yema de huevo, suero, etc.

Agar sangre

Agar comn fluidificado y enfriado a 45 C 95 mL

Sangre citratada 5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo de

microorganismos e inhiben a otros acompaantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de sodio.

Agar Chapman (g/L)

Peptona 10,0


NaCl 75,0

Manitol 10,0

Agar 15,0


Rojo de fenol 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo)

pH 7,4

27

c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un

sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de

microorganismos y a la vez los diferencian segn la utilizacin del sustrato. Ejemplo: Agar

Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L)

Peptona 17,0

Peptona proteosa 3,0

Lactosa 10,0

Sales biliares 1,5

Cristal violeta 0,001

NaCl 5,0

Agar 15,0


Rojo neutro 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)

pH 7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioqumica de los

microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI, Agar

LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L)

Peptona 5,0

Extracto de Levadura 3,0

Dextrosa 1,0

Lisina 10,0

Ctrato amnico frrico 0, 5

Tiosulfato de sodio 0, 04

Prpura de bromocresol 0, 02

Agar 15 g

Agua 1 000 mL

pH 6,7

28

1.3 Clases de medios segn su consistencia

1.3.1 Lquidos

1.3.2 Slidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un polisacrido

extrado de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a 80 100 C y de

solidificarse a 40 C. As mismo, el agar no es degradado por las bacterias.

1.3.3 Semislidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos

2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiologa.

2.2 Adquirir destreza en la preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

3. Procedimiento

3.1 Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo

a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y

adicionar la cantidad de agua destilada requerida.

b. Disolver en Bao Mara.

c. Enfriar y ajustar el pH segn convenga.

d. Colocar un tapn de algodn en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y

asegurar con pabilo.

e. Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 libras de presin durante 15 minutos.

3.2 Metodologa para servir medios de cultivo

a. Fluidificar los medios slidos al calor, enfriar a 50 C y frente a la llama del mechero servir

en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso

de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada.

b. Servir los medios lquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos

a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 C.

b. Observar y descartar los medios que presenten desarrollo de algn microorganismo

(contaminante).

29

Figura 4.1 Metodologa para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo slidos y

lquidos


- Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiologa. Espaa: Editorial Paraninfo.

- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10

ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A.

Adicionar los ingredientes

en el matraz.

Agua destilada Llevar el medio a

autoclave

Llevar el medio de

cultivo a control de

esterilidad.

Servir los medios

a placas Llevar a control de

esterilidad

Agua destilada Homogenizar

el medio de

cultivo

Servir el

medio de

cultivo

Los tubos son

colocados en una

gradia y son

taponados con

algodn

Los tubos son

llevados a

autoclave

Los tubos son

inclinados y llevados

a control de

esterilidad.

Adicionar los ingredientes

en el matraz.

30

Prctica V

Siembra y aislamiento de bacterias

1. Introduccin

Sembrar es la accin de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato que

permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y para

trasplante.

La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo comn sta

presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos.

Generalmente se utiliza la tcnica de agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra

simple. Cuando se desea contar el nmero de bacterias se utiliza la tcnica de placa vertida. La

siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie

microbiana (cepa). Tambin se denomina repique. El objetivo es el mantenimiento del

microorganismo conocido cambindolo a un nuevo medio de cultivo.

La siembra por trasplante puede ser:

De un medio slido a otro medio slido

De un medio slido a un medio lquido

De un medio lquido a otro medio lquido

De un medio lquido a un medio slido

2. Objetivos

- Realizar una siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple.

- Realizar una siembra por difusin en placa o placa vertida

- Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento

3.1 Siembra por agotamiento en superficie slida o aislamiento en estra simple

Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biolgica.

Tomar una alcuota de la muestra (inculo) y depositarla en uno de los extremos

superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido

y controlado.

Realizar movimientos en zig zag (estras) muy juntos en el primer tercio de la placa

para agotar el inculo. Posteriormente realizar estras muy separadas de un extremo a otro lado

de la placa no tomando nuevo inculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la

placa.

Incubar a 37 C (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

31

Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusin en placa o placa vertida

Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biolgica.

Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de

Petri estril y vaca.

Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 50 C.

Homogenizar por movimientos de rotacin de la placa de Petri para la dispersin de

microorganismos en forma ms o menos homognea, hasta la solidificacin.

Incubar a 37 C durante 24 horas.

Realizar el recuento de colonias.

3.3 Obtencin de un cultivo puro de bacterias

a. Tratamiento de la muestra

Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio y por lo

tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biolgicas que

pueden ser de varios tipos:

a.1 Muestras que contienen abundante nmero y tipo de microorganismos en las que

previamente se deben realizar diluciones en solucin salina fisiolgica estril. Ejemplo suelo.

a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea investigar,

por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el nmero del microorganismo

requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche.

a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el microorganismo

investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningn pre-tratamiento. Ejemplos

sangre,

32

b. Aislamiento primario

Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento primario a travs

de la siembra en placa de Petri mediante la tcnica de estra en la superficie de medios

enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos diferenciales

(agar Mac Conkey). Despus de un periodo de incubacin de 24 horas (puede variar en funcin

del microorganismo), se observarn las colonias de bacterias (masas constituidas por millones

de bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a partir de una clula). Se

observar el tamao y el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada

gnero y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como caracterstica diferencial. A

continuacin se realizar una tincin de Gram para determinar la morfologa y reaccin tintorial

de las bacterias constituyentes de la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas sobre

el medio de cultivo.

33

c. Aislamiento secundario

En caso que la morfologa y reaccin a la tincin de Gram de las clulas bacterianas coincidan

con el microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a travs de

una siembra para trasplante o transferencia de una pequea porcin de la colonia hacia un tubo

con medio de cultivo inclinado que permitir el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano

(poblacin de bacterias que procede de una clula) y que a su vez puede ser mantenido e

identificado merced a sus propiedades culturales y fisiolgicas.


- Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos.

Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental

- Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos

(10 ed.) Madrid, Espaa: Pearson Educacin, S.A.

34

Prctica VI

IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. Introduccin

Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificacin del

gnero y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificacin comienzan con el

estudio morfolgico de la colonia, estudio morfolgico de las clulas, motilidad, prueba de

catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidacin fermentacin, metabolismo de carbohidratos,

metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas segn la bacteria que va a ser

identificada.

2. Objetivos

2.1 Caracterizar morfolgicamente las colonias bacterianas.

2.2 Caracterizar morfolgicamente las clulas bacterianas.

2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa.

2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidacin-fermentacin

2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y

compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1 Estudio morfolgico de las colonias bacterianas

Determinar el tamao, forma, borde, elevacin, consistencia, aspecto y color de la colonia

bacteriana.

a) Tamao: Pequeo, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo,

invadiendo toda la superficie del medio.

b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme.

c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados.

d) Elevacin: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada.

e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente.

f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

35

Forma Elevacin

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevacin de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasa

La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y

oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios

facultativos excluyendo a los estreptococos.

Tcnica del porta objetos: En una lmina portaobjetos depositar una colonia bacteriana

procedente de un cultivo joven y aadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes.

Interpretacin: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida

con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno en

agua y oxigeno molecular.

2 H202 = 2 H20 + 02

36

Figura 6.1 Reaccin positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas

Morfologa Reaccin

Catalasa Gram

Cocos

Staphylacoccus

Micrococcus

Streptococcus

Enterococcus

+

+

-

-

+

+

+

+

Bacilos

esporulados

Bacillus

Clostridium

+

-

+

+

Bacilos no

esporulados

Listeria

Corynebacterium

Erysipelotrix

+

+

-

+

+

+

3.3 Estudio morfolgico de las clulas bacterianas

Realizar un frotis de una pequea porcin de la colonia y una tincin de Gram para determinar

la morfologa celular y reaccin a la tincin de Gram de las clulas bacterianas.

37

3.4 Prueba de oxidacin fermentacin

Determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al

desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la va oxidativa, el aceptor final de electrones es

el oxgeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la va

fermentativa, el aceptor final de electrones es un compuesto orgnico procedente de la

misma va, por consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez.

La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas

producen cido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias

fermentativas producen mucho cido en todo el tubo.

Tcnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de

los tubos con vaselina o aceite de parafina estril. Incubar a 37 C por 24 horas, aunque a

veces es necesario una incubacin de hasta 14 das.

Interpretacin: Si la va es oxidativa, slo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en

la parte superior al amarillo y ms tarde se extender por todo el tubo, pero nunca con

produccin de gas. Si la va es fermentativa, se observar un viraje intenso al amarillo que

se inicia en la parte inferior de los dos tubos con o sin produccin de gas.

Utilizacin: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratos

Investigar la fermentacin de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formacin de acidez

(medio RMVP), utilizacin del citrato como fuente de carbono y energa (medio citrato de

Simmons) e hidrlisis del almidn (agar almidn).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenados

Investigar la descarboxilacin de la lisina (agar LIA) y formacin de indol (caldo peptonado)

38

AGAR TSI

(Agar triple azcar de hierro) (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composicin

Extracto de carne 3,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Peptona 15 g

Peptona proteasa 5,0 g

Lactosa 10 g

Sacarosa 10 g

Glucosa 1,0 g

Sulfato ferroso (FeSO4) 0.2 g

Cloruro de sodio 5,0 g

Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) 0,3 g

Agar 15 g

Rojo de fenol 0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo)

Agua csp 1 litro

pH 7,4

2. Fundamento

Este medio se utiliza para la identificacin de enterobacterias segn su capacidad para

metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formacin de sulfuro de hidrgeno (H2S) y gas.

Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el

indicador rojo de fenol a un color amarillo. La fermentacin de la glucosa se lee al fondo del

tubo (amarillo), la fermentacin de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la

fermentacin de la lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo).

Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las protenas que

alcalinizan el medio por la formacin de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo

acentuado, debido a que la pequea cantidad de glucosa (0.1%) se consume rpidamente en la

superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo).

En la produccin de sulfuro de hidrgeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio

hasta hidrgeno sulfurado (o sulfuro de hidrgeno) y ste se une al fierro (del FeSO4) formando

un compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier

parte del tubo, especialmente en el fondo.

En la formacin de CO2 e H2 durante la fermentacin de los carbohidratos: el agar se

rompe o se forman cavidades con aire en el medio de cultivo.

39

A/A amarillo todo el tubo

Gas (+)

H2S (-)

glucosa (+)

lactosa (+)

sacarosa (+)

3. Tcnica

Sembrar por puntura y estra en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI.


Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

A B C

K/A amarillo en el fondo del tubo

y rojo en la parte superior

Gas (-)

H2S (-)

glucosa (+)

lactosa (-)

sacarosa (-)

negro

amarillo amarillo

amarillo rojo

amarillo

rojo

K/A amarillo en el fondo del tubo

y rojo en la parte superior

Gas (-)

H2S (+)

glucosa (+)

lactosa (-)

sacarosa (-)

40

Medio MRVP

(Rojo de Metilo Voges Proskauer)

1. Composicin (g/L)

Polipeptona 7,0

Glucosa 5,0

Fosfato dipotsico 5,0

Agua csp 1000 mL

Indicador rojo de metilo pH 4,5 = Rojo

pH 6,3 = Amarillo

pH 6,9

2. Fundamento

Este medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba

de rojo de metilo detecta la formacin de cidos (lctico, actico, frmico) por fermentacin

cido mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden

producir cantidades suficientes de cidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las

fases iniciales de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos

que pueden mantener el pH bajo despus de una incubacin prolongada de 48 horas.

3. Tcnica

Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP.


Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.

4. Lectura

El desarrollo de un color rojo estable indica que la produccin de cido es suficiente como

para bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden

producir cantidades menores de cido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio

entre el amarillo y el rojo. sta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna

amarillo.

MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composicin (g/L)

Fosfato amnico 1,0

Citrato sdico 2,0

Cloruro sdico 5,0

Fosfato bipotsico 1,0

Indicador azul de bromotimol 0,08

pH 6 = amarillo, pH 7.6 = azul

Sulfato magnsico 0.20

Agar 15

Agua csp 1000 mL

pH 6.9

2. Fundamento

Este medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como

fuente de carbono y energa. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y

bicarbonatos (C02 se junta con el sodio). Simultneamente los microorganismos utilizan el

fosfato amnico como fuente de nitrgeno y liberan amonaco. La presencia de carbonatos,

bicarbonatos y amonaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira al azul.

3. Tcnica

Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar citrato inclinado.


Observar el cambio de coloracin del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.

4. Lectura

En caso positivo se observar el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria

utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador,

observndose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se

recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observar crecimiento de la

bacteria y el medio permanecer de color verde.

MEDIO AGAR ALMIDN

1. Composicin (g/L)

Agar nutritivo 100 mL

Almidn 1.0

2. Fundamento

El almidn es un polmero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un

complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidn a molculas ms simples

como la maltosa y glucosa, stas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloracin

azul.

3. Tcnica

Sembrar por el mtodo de estra un tubo conteniendo agar almidn inclinado.


Adicionar dos gotas de lugol.

Observar la presencia o no de una coloracin azul.

4. Lectura

En una hidrlisis positiva del almidn, despus de adicionar el lugol no se observar coloracin

alguna. Por el contrario, en una hidrlisis negativa despus de adicionar el lugol se observar

una coloracin azul.

AGAR LIA

(Agar Lisina Hierro)

1. Composicin (g/L)

Peptona 5,0

Extracto de levadura 3,0

Dextrosa 1,0

Lisina 10,0

Ctrato amnico frrico 0, 5

Tiosulfato de sodio 0,04

Prpura de bromocresol 0,02

Agar 15,0

Agua 1 litro

pH 6.7

2. Fundamento

Este medio permite evidenciar la descarboxilacin de la lisina y la formacin de cido

sulfhidrico (H2S).

Para que se lleve a cabo la descarboxilacin tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0)

por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo debe

utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es

descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color

violeta (K / K).

La produccin de H2S se evidencia por la coloracin negra debido al sulfuro de fierro

formado.

Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un

cetocido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales frricas y un color rojizo bajo

la influencia del oxgeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A).

Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa

producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Tcnica

Sembrar por puntura y estra en superficie en un tubo conteniendo medio LIA


Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

K / K R / A K / A A / A

LIA (+)

Rojo

LIA (-)

Violeta

Amarillo

Negro Violeta

Amarillo

Amarillo

MEDIO CALDO PEPTONADO

1. Composicin (g/L)

Peptona 10,0

Na Cl 3,0

H2O csp 1000

pH 7,0

Reactivo de Kovac : Alcohol amlico o isoamlico puro 150

p dimetilaminobenzaldehido 10

HCl concentrado 50

2. Fundamento

Este medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrlisis del

aminoacido triptfano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima

triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y

amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido

del p dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac)

3. Tcnica

Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio.


Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac.

4. Lectura

Observar la formacin de un anillo coloreado en la zona de reaccin (color rojo) = Indol (+)

Tabla 6.2. Reaccin a ciertas pruebas bioqumicas claves para la diferenciacin de bacterias

entricas

Gneros

H2S

Indol

Rojo de

metilo

Lisina

descarb.

Citrato

Gas (glucosa)

Lactosa

Escherichia - + + d - + +

Enterobacter - - + + + + +

Shigella - +/- + - - - -

Salmonella + - + + +/- + -

Klebsiella - - - + + + +

Citrobacter +/- - + - + + d

Proteus +/- +/- + - D +/- -


- Carreo, C. (2010). Manual de Prcticas de Microbiologa Industrial. Lambayeque,

Per.

- MERCK (2005). Curso Taller de Actualizacin terico-prcrtico. Tcnicas Microbiolgicas de

Anlisis de Aguas y Alimentos. Piura, Per.

- Per, Ministerio de Salud (2001). Manual de anlisis Microbiolgico de alimentos.

Lima, Per: Direccin General de Salud Ambiental

- Doyle, M., Beuchat, L. & Montville T. (1997). Microbiologa de los alimentos.

Fundamentos y Fronteras. Espaa: Editorial Acribia, S.A.

- Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos

(10 ed.) Madrid, Espaa: Pearson Educacin, S.A.

PRCTICA VII

RECONOCIMIENTO DE LAS ETAPAS DE UN PROCESO

DE FERMENTACIN INDUSTRIAL

Un proceso de fermentacin tpico es aquel que se lleva a cabo en un recipiente llamado

fermentador o biorreactor, en el que determinados sustratos que componen el medio de cultivo

son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa (producto). En el esquema

general de un proceso de fermentacin existen cuatro etapas diferenciadas: propagacin de

cultivos, fermentacin, operaciones y procesos de separacin y purificacin de los productos

(recuperacin de producto) y tratamiento de los residuos.

1. Propagacin de cultivos

La propagacin de cultivos se realiza en laboratorio y comienza con un tubo de ensayo que

contiene un cultivo reciente de un microorganismo o un tubo liofilizado o congelado, donde se

conserva el microorganismo de inters obtenido comercialmente. En ambos casos el proceso,

comprende aislamiento, seleccin, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos de

inters industrial.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a

partir de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos .La fuente de todos los

microorganismos industriales es el ambiente natural (suelo, agua), animales y plantas enfermas,

alimentos de fermentaciones naturales (vino, pan, queso) y materiales en descomposicin. A

nivel industrial, en general, cada firma posee su propia coleccin de organismos, muchos de los

cuales han sido mejorados a travs de tcnicas clsicas de mutacin o de ingeniera gentica En

el mundo existe un gran nmero de colecciones depositarias de cultivos como American Type

Culture Collection (ATCC), USA y la Coleccin Espaola de cultivos tipo (CECT) las cuales

mantienen bacterias, levaduras, algas, actinomycetos, mohos, protozoos, virus y lneas celulares.

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica utilizada,

siendo las alternativas: a) aislamiento directo b) enriquecimiento de la muestra con o sin

pretratamiento. Una vez efectuado el aislamiento de los microorganismos se procede al

screening primario que es una seleccin cualitativa para detectar si el microorganismo

produce o no un compuesto. Por ejemplo, seleccionar microorganismos productores de cidos

orgnicos, enzimas, antibiticos por la presencia de halos transparentes o de zonas de

inhibicin de crecimiento, respetivamente. Se prosigue con el screening" secundario, que es

una seleccin cuantitativa para valorar la produccin y productividad industrial. Por ejemplo,

determinar el espectro antimicrobiano, la concentracin de cidos orgnicos o de enzimas

producidas.

Despus de la seleccin de microorganismos industriales es preciso mantenerlos y

conservarlos. El mantenimiento es por cortos perodos de tiempo (das) y la conservacin por

largos perodos de tiempo (aos), a travs de diferentes tcnicas que corresponden a la

desecacin, congelacin y liofilizacin.

En general los organismos aislados de la naturaleza producen metabolitos de inters

industrial en concentraciones muy bajas, por lo tanto se hace necesario incrementar estos

rendimientos, para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Una forma de mejorar el

rendimiento es mediante la optimizacin del medio de cultivo y de las condiciones de

operacin, pero est limitado por la capacidad de sntesis mxima del producto deseado que

tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa por seleccin

natural de variantes, mutacin inducida y recombinacin gentica. La productividad potencial

de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo ser modificado para incrementar los

rendimientos. Con el organismo modificado se reexaminan las condiciones de cultivo para

lograr nuevamente la mxima productividad.

Finalmente, se procede a la propagacin de los cultivos o inculos, teniendo como material

de partida los microorganismos seleccionados y en el mejor de los casos mejorados, debiendo

aumentar la cantidad de los mismos mediante sucesivos pasajes en frascos de volmenes

crecientes, que son generalmente operados en agitadores (5 a 100 mL y entre 100 a 10 000 mL

respectivamente)

2. Fermentacin

Un proceso tpico de fermentacin comienza con la formulacin y esterilizacin del medio

de cultivo as como la esterilizacin del equipo (tanque de inculo o prefermentador y

fermentador de produccin). El inculo propagado sucesivamente en matraces se siembra en el

tanque de inculo o prefermentador que puede tener un volumen de 10 L a 1 000 L, segn la

escala industrial posterior. Del tanque de inculo se siembra al fermentador industrial o de

produccin cuyo volumen vara de acuerdo al producto a obtener y a su concentracin y est

comprendido entre 1000 a 100 000 L. En algunos casos especiales, como la produccin de

protena microbiana, los tanques de fermentacin pueden llegar hasta 1 000 000 L.

El tamao de inculo generalmente es de 1 a 10 % del volumen total del medio. Si es

inferior a esta proporcin se puede prolongar el periodo de latencia, lo que incrementar el

periodo de fermentacin. Se considera 5 a 10 % para hongos y actinomicetos y 0,1 a 3,0 % para

bacterias, a excepcin de los actinomicetos.

3. Operaciones y procesos de separacin y purificacin de los productos

Estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente: a) separacin de insolubles

por filtracin, centrifugacin o decantacin; b) separaciones primarias por extraccin,

absorcin, adsorcin, ultrafiltracin; c) purificacin por extraccin lquido lquido o

extraccin a dos fases acuosas, o cromatografa de afinidad, y finalmente d) aislamiento

del producto.

4. Tratamiento de residuos

Si bien no tiene una relacin directa con el producto, que es la razn de ser la industria de

fermentacin, representa una etapa imprescindible, porque es fundamental controlar la calidad y

cantidad de residuos que salen de la fbrica y que son enviados generalmente a un curso de

agua, sea un canal, arroyo, un ro o al mar.

Propagacin

de los cultivos Fermentacin

Procesos y

operaciones de

separacin y

purificacin

Tratamiento

de residuos

Aislamiento

Seleccin

Mantenimiento

Mejoramiento

Propagacin o

multiplicacin de

cultivos

Figura 1. Esquema general de un proceso de fermentacin o bioproceso.

Residuos

Tratamiento

Separacin

Purificacin

Producto

Esterilizacin

Preparacin de

medios

Materias

primas


Dorn, P. (1995). Principios de Ingeniera de los Bioprocesos. Espaa: Editorial Acribia.

Ertola, R., Yantorn, O. & Mignon, C. (1994). Microbiologa Industrial. Argentina.

Madigan M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos.

10 a ed. Madrid: Pearson Educacin, S.A.

PRCTICA VIII

AISLAMIENTO, SELECCIN Y MANTENIMIENTO DE

CULTIVOS LCTICOS TERMFILOS:

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus

1. Introduccin

Los cultivos lcticos iniciadores, fermentos o starters son microorganismos seleccionados

que se emplean en la industria de alimentos fermentados. Segn la temperatura ptima de

crecimiento, los cultivos lcticos comerciales pueden ser termfilos y mesfilos y segn su

composicin pueden ser fermentos de cepa nica, mltiples y mixtos.

Los cultivos lcticos termfilos contienen bacterias cuya temperatura ptima de

crecimiento est entre 40 a 45 C. Son utilizados para la elaboracin de yogurt y quesos duros y

estn constituidos por Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus helveticus y L. lactis. El yogurt es un producto lcteo fermentado que resulta del

crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en leche

concentrada (por evaporacin o por adicin de slidos).

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus es un bacilo Gram positivo, largo, no mvil, que

produce cido D (-) lctico. Fermenta fructosa, galactosa, glucosa y lactosa, pero no maltosa y

sacarosa. Requiere 11 a 15 aminocidos, segn las cepas y acidifica la leche ms lentamente

que los estreptococos, pero generalmente ms intensamente gracias a una mayor resistencia al

pH cido (hasta pH 3,5) y a una concentracin ms elevada de cido lctico (mximo 27 g/L).

Streptococcus thermophilus es un coco Gram positivo, esfrico, agrupado en pares o en

cadenas, homofermentativo y produce cido L (+) lctico a partir de glucosa, fructosa, lactosa y

sacarosa. Se distingue bsicamente por su crecimiento termfilo con un ptimo de 42 a 43 C y

termorresistencia a 60 C durante 30 minutos.

Los estreptococos y lactobacilos transforman 20 a 30 % de la lactosa de la leche en cido

lctico. La lactosa es hidrolizada a travs de una B D galactosidasa en D glucosa y B D

galactosa. A continuacin, la D glucosa es trasformada en cido pirvico y despus en cido

lctico, mientras que la galactosa es excretada y se acumula progresivamente en la leche, porque

no es utilizada por los microorganismos del yogurt.

Durante la fermentacin del yogurt (42 a 45 C) se mantiene un equilibrio entre la

poblacin de estreptococos y lactobacilos y un favorable efecto sinrgico entre los dos

grmenes, ya que su crecimiento conjunto es ms rpido que el crecimiento en un cultivo puro

de cada uno de ellos. El estreptococo utiliza pptidos y aminocidos (valina) liberados a partir

de las protenas de la leche por los lactobacilos y a su vez, el crecimiento de stos es estimulado

por compuestos producidos por los estreptococos como cido frmico, anhdrido carbnico y

cido pirvico.

Los criterios de caracterizacin y seleccin de las bacterias lcticas termfilas utilizadas en

la elaboracin del yogurt se basan en cuatro propiedades que se determinan despus de su

cultivo en leche: acidificacin a temperatura elevada, acidificacin a baja temperatura,

produccin de acetaldehdo y viscosidad del medio de cultivo. La medida de la produccin de

cido lctico a 44 C, durante la fase de crecimiento exponencial, caracteriza la actividad

acidificante en la fermentacin del yogurt. El control de la produccin de cido lctico a

temperaturas entre 4 a 12 C despus del crecimiento exponencial, durante 24 das, permite

predecir los fenmenos de post acidificacin, durante la comercializacin del producto. La

cantidad de acetaldehdo producido representa una buena forma de apreciar el efecto de una

bacteria sobre el aroma del yogurt, ya que el acetaldehdo es el componente mayoritario en este

aroma. Finalmente, la medida de la viscosidad de la leche por determinacin de las fuerzas de

cizallamiento, permite conocer directamente la contribucin de una bacteria a la viscosidad del

producto final.

La elaboracin de yogurt a pequea escala permite comprobar las propiedades tecnolgicas

de las mezclas de bacterias previamente seleccionadas en laboratorio. El anlisis organolptico

de los productos obtenidos a escala industrial aporta informacin suplementaria sobre las

aptitudes de las mezclas de cepas, en lo que respecta a su contribucin al aroma y viscosidad del

producto final. Una vez seleccionadas las bacterias lcticas, stas son conservadas y

comercializadas en diversas formas, cada una de las cuales presenta ventajas y desventajas.

a) Cultivos lquidos frescos o estrter lquidos

Para su obtencin se requiere de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 a 12 %

extracto seco magro, E.S.M.), esterilizada en autoclave a 15 libras de presin durante 10 a 15

minutos e incubada a 30 C durante 1 semana para comprobar su esterilidad. Tras la inoculacin

(1 a 2 %) la leche es incubada a 30 C durante 16 a 18 horas o a 42 C durante 3 horas a 4

horas. Despus, el cultivo coagulado es refrigerado y cuando la acidez del cultivo refrigerado es

de aproximadamente 0,85 % de cido lctico se tiene la garanta que durante 1 semana se

mantendr su actividad y la relacin cocos: bacilos (1:1), recomendndose realizar como

mximo 15 a 20 resiembras. Este tipo de estrter se conoce en la industria lctica como cultivos

de reserva de trabajo. Su principal desventaja consiste en su corto periodo de conservacin,

debido al posterior desarrollo de acidez y contacto de las clulas con el medio cido, lo que resta

actividad al cultivo.

Se puede conseguir una conservacin ms prolongada de cultivos lquidos utilizando

leche Litmus esterilizada en autoclave e incubada durante 1 semana para comprobar su

esterilidad. Despus de la siembra se incuba a 42 C durante 12 horas y se almacena en

refrigeracin. Estos cultivos solo tienen que ser reactivados una vez cada 3 semanas y son

conocidos como cultivos de reserva.

b) Cultivos liofilizados (no concentrados)

El estrter se cultiva en leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en

autoclave con un porcentaje de inoculacin de 2 % y se incuba a 42 C durante 4 horas.

Despus, se mantiene a 5 C durante 18 horas y posteriormente se distribuye en alcuotas de 2 a

3 mL en viales de vidrio estriles. Los viales se congelan a 40 C durante 2 a 3 horas,

despus son liofilizados durante 36 horas, cerrados al vaco, sellados y se mantienen a 5 C

hasta su utilizacin.

Para la activacin de los cultivos liofilizados se vierte el contenido del vial en 250

mL de leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en autoclave y se incuba a 42 C

durante 12 a 15 horas. Para lograr una actividad total se realizan una a dos siembras en el

mismo medio con una tasa de inoculacin de 2 % y una incubacin a 42 C durante 4 horas.

Como desventaja, los cultivos liofilizados presentan largas fases de latencia, siendo preciso la

resiembra como mnimo dos veces para lograr cultivos lquidos activos, de all que para la

produccin de los cultivos finales se utilice el sistema de Siembra a gran escala (sistema 1), ya

que de otro modo se precisa una gran cantidad de cultivo deshidratado y largos periodos de

incubacin.

c) Cultivos congelados (no concentrados)

El estrter es congelado en forma rpida a temperaturas de 40 a 45 C, pudiendo

mantenerse as por 3 a 8 meses. Las unidades deben ser descongeladas y propagadas una vez

previa a su utilizacin a nivel industrial. Como desventaja se puede sealar que las posibilidades

de transporte a bajas temperaturas se ven limitadas desde el punto de vista econmico.

d) Cultivos congelados o liofilizados concentrado

Manual de Prácticas Microbiologia Industrial_IQ

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