Manual de Hematologia Basica Actualizado

Laboratorio No 1Tema: NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO CLÍNICO

Objetivo

Conocer y poner en práctica las normas básicas de bioseguridad impartidas en el laboratorio clínico.

Fundamento

El bacteriólogo cada día más tiene más exigencias en su profesión para dar un resultado de óptima calidad, pero de igual manera es un riesgo mayor que corre con la manipulación de las muestras que tiene que procesar. Por ello es de gran interés conocer el conjunto de normas y procedimientos que garantizan el control de los factores de riesgos físicos, químicos, biológicos y ergonómicos que pudieran afectar al personal vinculado al laboratorio clínico o a los miembros de la comunidad.Las Normas básicas de bioseguridad que debe cumplir un trabajador en el laboratorio son:

Lavarse las manos con agua y jabón (o el antiséptico necesario) antes de iniciar cualquier procedimiento, después de terminado el procedimiento (sobre todo si se manipuló material y/o especímenes de carácter infeccioso) e incluso en el momento de abandonar el área de trabajo.

Limpiar y desinfectar previamente el área de trabajo así no se vaya a trabajar con materiales de carácter infeccioso. Una vez limpia debe lavarse nuevamente las manos. En los mesones no se debe colocar material personal que sirva de vehículo infeccioso como bolsos, chaquetas, libros, etc.

Utilizar el equipo de protección para todo tipo de proceso: bata, uniforme, guantes, gorro, tapabocas, zapatos de suela no deslizable. Todo el material a colocarse debe estar estéril en el momento de uso y una vez termina el procedimiento debe descartarse aquel material que es descartable y desinfectar y/o esterilizar las prendas contaminadas mediantes procesos adecuados. No se debe llevar la ropa de laboratorio fuera de este y debe tenerse a la mano otra bata o juego de ropa limpio – estéril para salir del mismo.

El personal no debe introducir ni consumir alimentos en las áreas del laboratorio. No se debe guardar comida ni bebidas en los refrigeradores ni en ninguna de las zonas de trabajo. Tampoco se debe permitir la aplicación de cosméticos ni el uso de anillos dentro del laboratorio. Se recomienda que las damas aseguren por detrás su cabello, de tal

forma que no entren en contacto con superficies contaminadas No pipetear con la boca usar ayudas mecánicas tales como dispensadores, bulbos, y/o

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

CLAUDIA XIMENA LOZANO TRUJILLOCLAUDIA MONTEJO

Fecha 30/11/10 Fecha Fecha

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Unidad de Formación

Versión: 001 Fecha: 30 DE NOV 2010

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Código: UC-BAC-HEM-GL001 Pag 1 de 65

pipetas automáticas. Evitar la exposición a gases, vapores y aerosoles, por medio de la campana de gases y

extracción, especialmente con sustancias volátiles y tóxicas. Utilizar las diferentes cabinas de seguridad para trabajar tanto elementos infecciosos como

tóxicos. Cada laboratorio debe tener un equipo de emergencias para derrames con el fin de

neutralizar reactivos ácidos, bases y solventes cuando estos se derramen e instruir a los empleados sobre su uso.

Cada laboratorio debe tener materiales y reactivos necesarios para realizar los procesos de desinfección y esterilización.

No permitir la entrada de niños y animales a las áreas de trabajo. Autorizar el paso a áreas del laboratorio, solo a las personas que hayan sido informadas

sobre los posibles riesgos y que satisfagan los requisitos que se necesitan para entrar. Terminado el proceso técnico se deben lavar las manos bajo las condiciones de asepsia

que tengan estandarizadas en el laboratorio. Una vez terminada las labores el estudiante debe recoger todo el material de trabajo,

descartar el material en su sitio y condición apropiada, limpiar y desinfectar nuevamente los mesones, dejar las sillas debajo de las mismos, ordenar el sitio de trabajo y asegurarse que las llaves de agua, gas y otros estén perfectamente cerradas y lavarse las manos antes de abandonar el sitio de trabajo.

Cada laboratorio de acuerdo con su perfil ocupacional va agregando normas a sus trabajadores con el fin de garantizar su seguridad en el laboratorio.

Las agujas y las jeringas usadas antes de descartarlas deben pasar por el guardián y nunca vuelva a colocar la aguja en su funda y deben ser incinerados.

Al manipular muestras biológicas utilizar guantes siempre y con mucha precaución, marcar todos los reactivos que se utilicen correctamente.

Materiales y EquiposItem Tipo Descripción

NO APLICA

ReactivosÍtem Descripción

NO APLICA

ProcedimientoPaso Descripción

NO APLICA




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Consulta

1. Defina: Factor de riesgo, Riesgo biológico, Riesgo ergonómico2. Indique que otras normas de bioseguridad se pueden adicionar al Laboratorio Clínico.3. Qué desinfectantes se utilizan en hematología y cuál es su utilidad

Bibliografía

1. OMS, Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Ginebra, Suiza, 1993

2. www.cepis.ops_oms.org/bvsacd/cd49/gc_bioseguridad.pdf

3. www.acercar.org.co/industria/biblioteca/evento/fase6/ips/23032006/08.pdf

ANEXOS No. Anexo Descripción

NO APLICA

Laboratorio No 2Tema: ANTICOAGULANTES

Objetivo

-Identificar cada uno de los anticoagulantes usados en el área de Hematología de un Laboratorio Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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http://www.acercar.org.co/industria/biblioteca/evento/fase6/ips/23032006/08.pdf

http://www.cepis.ops_oms.org/bvsacd/cd49/gc_bioseguridad.pdf

Clínico.-Describir los componentes de los anticoagulantes usados en Hematología-Conocer las ventajas y desventajas de cada uno de los anticoagulantes usados en Hematología.

Fundamento

Existen múltiples factores involucrados en el proceso de coagulación de la sangre. Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formación de coágulos. Existen diferentes tipos de ellos en polvo o líquidos. Debe seleccionarse siempre el anticoagulante apropiado según el estudio que se quiera realizar.

Los tres anticoagulantes habitualmente usados son :

EDTA (ETILEN-DIAMINO-TETRA-ACETATO) : Es el anticoagulante preferido para los recuentos celulares y los estudios morfológicos.

HEPARINA: Se utiliza tanto en estudios de rutina como especializados. Su presentación puede incluir heparina con concentraciones de sodio o litio. En general la heparina con litio es utilizada para estudios de química y la heparina sódica se utiliza para estudios de linfocitos.

CITRATO DE SODIO : Generalmente en concentraciones al 3.8% y se utiliza principalmente en estudios de coagulación..

Existen varias compañías comerciales productores de las diferente presentaciones de tubos colectores de especímenes. Deben ser utilizados de preferencia puesto que le ahorran al laboratorio la preparación de anticoagulantes los cuales deben ser preparados en concentraciones exactas. Si se utilizan tos tubos comerciales debe tenerse encuentra que su llenado sea adecuado, para permitir que la relación entre sangre y anticoagulante sea la ideal.Los tubos deben ser mezclados inmediatamente, una vez que la sangre ha entrado en ellos. Invertir suavemente los tubos 10 - 15 veces. Para así obtener mezclas homogéneas.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MÁS USADOS EN HEMATOLOGÍA

• No alterar el tamaño de los hematíes.• No producir hemólisis.• Evitar al máximo la agregación plaquetaria.• No alterar la morfología de los leucocitos.




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La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso mantenida bajo refrigeración (4 ºC) si no pasan de las 2 horas. El tiempo máximo entre la extracción de la sangre y su procesamiento depende del coagulante de elección y no debe ser más de 4 horas, a excepción del anticoagulante EDTA (etilendiaminotetracético) que puede ser hasta 24 horas (en refrigeración a 4 ºC).

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma sólida o líquida. Los primeros están indicados para la determinación de los parámetros hematológicos, ya que no producen, como los anticoagulantes líquidos, dilución de la sangre.

ANTICOAGULANTES SÓLIDOS

EDTA

Es la sal disódica o tripotásica del ácido etilendiaminotetracético. La sal disódica (Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotásica (K3EDTA). Estos compuestos realizan su acción a través de un efecto quelante sobre el calcio, al fijarlo impiden su activación y, por ende, la coagulación sanguínea.

Ventajas

Respeta la morfología eritrocitaria (especialmente la sal tripotásica) y leucocitaria, de manera que permite una demora de dos horas en la realización del frotis sanguíneo después de la extracción sanguínea.

Asegura la conservación de los elementos formes sanguíneos durante 24 horas si la

sangre se mantiene a 4 ºC. Al inhibir la aglutinación de las plaquetas, facilita su recuento o su expresión

semicuantitativa a partir del frotis. La concentración recomendada de EDTA es de 1,5 mg/mL. de sangre. Una mayor

cantidad de anticoagulante puede producir retracción celular, con disminución del hematocrito, y un aumento de la concentración media de la hemoglobina. Un exceso de sangre con relación al anticoagulante produce formación de microagregados que pueden alterar los resultados. El empleo de tubos al vacío con una gota (50mL) de EDTA

Tripotásica comercial para 5 mL de sangre es de interés práctico dado que es cien veces más soluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante.

Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos, a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma, por ello debe cuidarse de agregar la cantidad




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correcta de sangre al anticoagulante.

HEPARINA

El nombre de heparina proviene del griego hepar, que significa hígado, ya que fue aislado por primera vez de las células de este tejido. Es un mucopolisacárido ácido. Presenta el inconveniente de que si no se agita rápidamente con la sangre después de extraída pueden formarse microcoágulos, aunque no altera el volumen eritrocitario ni la morfología de los leucocitos. No es recomendable para el frotis sanguíneo porque produce un fondo azul en la lámina.

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma sólida o líquida, en proporción de 0,1 - 0,2 mg de heparina por 1 mL de sangre.

ANTICOAGULANTES LÍQUIDOS

Citrato trisódico

Es de elección para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentación. Actúa a través de la precipitación del calcio. La concentración depende de la prueba por realizar.

Para pruebas de hemostasia se emplea en proporción de 1: 9 (0,5 mL de anticoagulante para 4,5 mL de sangre total).

Para la determinación de la VSG (Velocidad de Sedimentación Globular) es 1:4 (0,5 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre).

Oxalato sódico

Recomendado también para las pruebas de hemostasia. Se emplea en proporción de un volumen de anticoagulante para 4 vol. de sangre.


NO APLICA


NO APLICA




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ProcedimientoPaso Descripción

NO APLICA

Consulta1. Investigue sobre otros tipos de anticoagulantes usados en Hematología2. ¿Qué composición tiene el anticoagulante de Wintrobe? ¿Para qué determinaciones se

utiliza?3. ¿Cuáles son los efectos adversos de los anticoagulantes sobre las células sanguíneas?

BibliografíaHenry, R., Clinical Chemistry. Principles and Technics (1964).

Miale, J.; La Fond, D., Am. J. Clin. Path. 52/2:154 (1969).

Mustard, J. F., Am. J. Clin. Path. 30:498 (1958).

Organización Panamericana de la Salud. Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. Washington: OPS, 1983. Publicación Científica Nº 439.

Lewis S. Garantía de calidad en hematología. Organización Panamericana de la Salud. 2ª ed. Lima . Editorial Geneva, 1995


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Laboratorio No 3Tema: OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE

Objetivo

Conocer las indicaciones pre-analíticas necesarias para la correcta toma de muestra. Comprender cada uno de los pasos a desarrollar en una adecuada toma de muestra. Adquirir destreza en el proceso óptimo de la toma de muestra. Diferenciar cada uno de los sitios en los cuales es posible realizar la toma de muestra

y su utilidad en los exámenes de laboratorio.

Fundamento

La flebotomía o venopunción es el proceso de extracción de sangre de una vena para su análisis, constituyendo una de las etapas más importantes en el trabajo del laboratorio clínico. Por una parte representa el primer contacto entre el laboratorio y sus pacientes y desde el punto de vista de la muestra sanguínea, la enorme importancia que conlleva una muestra




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apropiadamente colectada, la seguridad de su origen y el correcto envasado y transporte, constituyen factores fundamentales en la evaluación e informe de los exámenes a realizar.El personal que ha de realizar la colección de la muestra sanguínea, debe tener presente que en el trato correcto del paciente, su orientación y la habilidad para realizar su trabajo, está la cara del laboratorio clínico ante la comunidad que ha de servir.1. Procedimiento de la Flebotomía

La muestra debe tomarse correctamente y bajo las condiciones más favorables para evitar errores. Esto incluye la absoluta identificación del paciente, el sitio a puncionar y el volumen a colectar. El paciente debe estar en posición cómoda, de preferencia en una silla especial para venopunción con descanso para los brazos y si está en cama, preferiblemente acostado.a. Selección del sitio a puncionar

Al proceder a seleccionar el sitio a puncionar, evite áreas con hematoma, fístulas, quemaduras, escoriaciones de la piel o cicatrices. Si se trata de un paciente hospitalizado evite tomar muestra de un brazo que se esté utilizando con venoclisis o del costado en que se ha realizado una mastectomía reciente.

b. La palpación

Antes de proceder a puncionar, se debe escoger la vena. La mejor manera es realizando una palpación de las mismas para esa decisión. Para ello coloque el torniquete 3 a 4 pulgadas por arriba del sitio seleccionado, para visualizarlas mejor. Debe tener presente en no mantener el torniquete por más de 3 minutos, para evitar la hemoconcentración. Las venas más utilizadas para la venopunción, están localizadas en el área antecubital. Entre éstas tenemos:• Vena Media Cubital: Es la más larga y gruesa de todas y es la preferida por bordear la musculatura del brazo.• Vena Cefálica: Tiene iguales características de la anterior, pero es un poco menos gruesa.• Vena Basílica: Es más pequeña que las anteriores. Esta vena está cerca de la arteria braquial, por lo que su punción es riesgosa y su área es más sensible y dolorosa para el paciente.




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Al palpar hágalo con la punta de sus dedos, tratando de seguir el rastro de las venas. Aquí

también son útiles sus conocimientos en la anatomía de las venas de las extremidades superiores. En ocasiones si no visualiza la vena, puede forzar la sangre dentro de la vena través de un suave masaje de abajo hacia arriba.

c. La Descontaminación:

Una vez que se ha decidido por la vena a puncionar, debe proceder a descontaminar el área con alcohol etílico al 70% utilizando algodón y con movimientos circulares del interior al exterior. Debe tener presente que una vez realizada la descontaminación, no debe volver a tocar el área venosa.d. Sitios de extracción de muestra sanguínea

La punción venosa

El brazo debe estar preferiblemente en posición cómoda horizontalmente. Con el torniquete en posición, haga que el paciente cierre y abra el puño de 3 a 5 veces para bombear mejor la sangre, y luego que mantenga el puño cerrado. Si se trata de un niño, es recomendable colocar 2 dedos de la mano, debajo del codo del paciente, para evitar que doble el brazo durante la




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extracción. Extracción con jeringa

Cuando vaya a proceder a realizar la extracción con jeringa, usted debe tener presente el calibre a utilizar y el tamaño de la jeringa según el volumen a extraer.

Coloque la punta de la aguja en un ángulo de 15 a 30 grados sobre la superficie de la vena escogida y atraviese la piel con un movimiento firme y seguro, hasta el lumen de la vena.

Apretando firmemente la jeringa, debe halar el émbolo con movimiento continuo para extraer la sangre hasta el volumen requerido. Evite presionar fuertemente la aguja durante la extracción.

Afloje el torniquete para que la sangre fluya mejor y remueva la aguja del brazo con movimiento suave al terminar de colectar.

Presione el algodón sobre el sitio de la punción aplicando una presión adecuada y no excesiva para evitar la formación de hematoma.

Llenar los tubos en su orden.

Descarte la jeringuilla y aguja en un contenedor apropiado.

Extracción con vacutainer

En ocasiones, especialmente cuando se requiere colectar muchos tubos para diversas pruebas en secciones distintas, es sumamente útil el uso del adaptador vacutainer o similar, el cual nos permite llenar cuantos tubos sean necesarios. En estos casos, una vez hecha la punción,

Sostenga firmemente el vacutainer con una mano y con la otra inserte, llene y retire cuantos tubos requiera.

Punción arterial

Para el muestreo arterial se utilizan habitualmente las arterias radial, humeral, cubital, femoral y la temporal en el recién nacido. La arteria radial es la más utilizada, primero porque no tiene venas próximas y en segundo lugar porque se anastomosa con la cubital en un arco palmar, situación que minimiza los riesgos de irrigación en caso de obstrucción de la arteria punzada.Se requiere jeringa de embolo suave o especial para la toma, Heparina 1:1000 v/v, Lidocaina 2%, torundas estériles con desinfectantes y/o antisépticos, corchos de caucho o tapones especiales para sellar jeringa una vez tomada la muestra, agujas # 21 al 25, hielo por si hay necesidad de realizar transporte de muestra. La muestra teóricamente puede ser extraída de cualquier arteria del cuerpo, pero el sitio más seguro para extraer sangre arterial es la arteria radial y/o como alternativas femoral o braquial.La toma de muestra debe ser realizada por personal entrenado y experimentado




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(Anestesiólogos, Terapeutas respiratorios, Personal Médico, jefes de enfermería) que realizan los siguientes pasos.

La Punción Capilar

La sangre de la llamada punción capilar es una mezcla de sangre de arteriolas y venosa, más que de capilar. La obtención de sangre por punción capilar es particularmente útil en las siguientes circunstancias:

Si la punción venosa es peligrosa para el paciente. No se puede acceder las venas recomendadas. Las venas se están utilizando para administrar medicamentos. El volumen de sangre requerido no justifica una extracción venosa.

Estas circunstancias se aplican a:

• Neonatos.• Lactantes.• Niños.• Adultos con quemaduras severas.• En pacientes muy obesos.• En caso de terapias intravenosas.

Anticoagulante

Una vez extraída la sangre esta sufre un proceso de coagulación que aparece espontáneamente hacia los 3 -7 minutos. Los anticoagulantes se utilizan para mantener la sangre fluida. Es esencial el uso de un tipo y cantidad de anticoagulante adecuado para cada examen.


01 MATTubos con anticoagulante EDTA..

02 MAT Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre para hemogramas, se recomienda una aguja de un diámetro de 0.8 mm (21G) para evitar daño a las células. Las agujas de 0.9 mm a 1.1 mm de diámetro (20G – 19G) se utilizan normalmente para punción venosa en adultos




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0304 MAT Adaptador para tubos-Vacutainer: Se utilizan para tubos al vacío05 MAT Torniquete: Recomendable de 2 tamaños para adultos y niños

06 MAT Guantes


01 Algodón

ProcedimientoPaso Descripción01 Extracción con jeringa o Vacuntainer (Tubos al vacío)

Preparar el material que se va a utilizar en la toma de muestra, tenga en cuenta todas las normas de bioseguridad.Inspeccionar varios brazosColocar el torniquete unos centímetros por encima del sitio donde se va a realizar la punción venosa.Pida al paciente que empuñe la mano, una vez seleccionada la vena retire el torniqueteCon una torunda de algodón impregnada con alcohol al 70% se limpia la piel del área donde se va a realizar la punción, debe emplearse un movimiento circular desde el centro a la periferia evitando regresar sobre el área que ya se limpió.Coloque nuevamente el torniquete, retire el protector de la aguja y coloque la jeringa en posición paralela a la vena de forma que el bisel quede hacia arriba, inserte con delicadeza la aguja en la piel y en la vena, es importante mantener inmóvil la aguja durante el procedimiento de extracción para no interrumpir el flujo sanguíneo, aspire la jeringa hasta que extraiga el volumen de sangre necesaria para las pruebas. En caso de utilizar tubos al vacío, tome la aguja y enrósquela en el dispositivo diseñado para esto (camisa), quite el protector de la aguja e inserte la aguja con el dispositivo en posición paralela a la vena y con el bisel hacia arriba, una vez realice este procedimiento introduzca el tubo al vacío, este sistema facilita la extracción de la




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sangre ya que este indica que la muestra se obtuvo, además de permitir el cambio de tubos en caso de que se soliciten varias muestras.El torniquete se puede retirar tan pronto la sangre empiece a fluir en la jeringa o justo antes de extraer la cantidad final de sangre.Se pide al paciente que abra la mano, una vez obtenida la muestra se retira la aguja colocando un algodón limpio y seco en el sitio de la punción, la aguja nunca debe insertarse nuevamente en el protector, descártela inmediatamente en el guardián, agregue la muestra con ayuda de la jeringa por las paredes de los tubos con mucho cuidado para evitar hemólisis que alteren los resultados, no olvide agregar una gota de sangre sobre una lámina portaobjeto para realizar el extendido de sangre periférica. NOTA: La sangre nunca debe expulsarse por la agujaMezcle los tubos que contengan anticoagulantes.

02 Extracción de sangre capilar

Una vez escogido el sitio de la punción, puede dar un ligero masaje al área para concentrar la sangre.Limpie el sitio con alcohol etílico al 70%.Con una mano sostenga el dedo o área a puncionar y con la otra sostenga la lanceta.Haga la punción con la lanceta, realizando un movimiento rápido, firme y profundo.Después de puncionar, descartar la primera gota de sangre, que contiene líquidotisular, limpiándolo con el algodón.Presione el dedo para hacer salir la sangre, procurando sea de manera ininterrumpida.Una vez tomada la muestra, sellar los tubos capilares con sellador o los microtuboscon su tapa.Los microtubos y capilares con anticoagulantes deben ser invertidos suavemente por lo menos 10 veces para evitar su coagulación.Coloque el algodón sobre el sitio puncionado haciendo presión para parar el sangrado.

03 Colección en Neonatos:

El pie del neonato es el sitio apropiado para colectar muestra sanguínea por punción capilar.Es recomendable la pre-limpieza del pie con una gasa tibia para incrementar el flujo sanguíneo.El siguiente diagrama ilustra con el color negro los sitios de punción recomendados.Limpie el área seleccionada con alcohol etílico al 70%.Mantenga firmemente el pie del neonato para evitar cualquier movimiento.Usando una lanceta estéril realice la punción con movimiento rápido, firme y profundo.Limpie con el algodón la primera gota obtenida. Utilice una ligera presión para obtener




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las gotas de sangre requeridas. No haga presión excesiva o masajes, que puedan provocar que la sangre se diluya con líquido tisular.Llene los microtubos requeridos.Al terminar mantenga presión sobre el sitio de la punción con gasa o algodón para

parar el sangrado.Descarte la lanceta en un receptáculo apropiado.

04Extracción de sangre arterial

• Explique al paciente el procedimiento a realizarse ya que puede ser doloroso y hasta traumático.

• Coloque el paciente en posición cómodo ya sea en la cama o una silla.• Con el brazo apoyando ya sea sobre la mesa o la cama extendida el

antebrazo y realice una dorsiflexión de la muñeca casi en 30º.• Palpe cuidadosamente la arteria radial (A 2 - 2,5cm del pliegue de la

muñeca). Notará que tiene pulsación propia.• Proceda a desinfectar la zona a puncionar.• Para aliviar el dolor de la punción, si lo desea agregue lidocaína u otro

anestésico a la zona epidérmica.• Prepare la jeringa a utilizarse (aguja 22, heparina 1 unidad por cada 10cms

de sangre.• Palpando la arteria con una mano, tome la jeringa con la otra y coloque la

aguja en medio de los dedos que palpen la arteria y puncione rápidamente la piel en ángulo de 60º con el bisel dirigido hacia abajo y la aguja dirigida hacia el pulso.

Avance suavemente la aguja hasta que aparezca sangre en el cubo de la misma lo cual indica que se ha entrado en la arteria. Notará que la sangre empieza a fluir directamente sin necesidad de succión. Deje que se llene por si sola hasta completar la cantidad indicada (3cms más o menos).

• Obtenida la cantidad, retire la aguja y HAGA PRESIÓN DIRECTA Y FUERTE sobre el sitio de punción por lo menos durante unos 3 minutos o más si es necesario hasta que no salga más sangre.

• Tome la jeringa y elimine velozmente todas las burbujas de aire que pueda tener y tapone las agujas con un corcho o goma.

• Rotule la muestra con los nombres, historia y habitación del paciente.• Baje la muestra inmediatamente al laboratorio para su proceso o colóquela en

hielo si no va a procesar inmediatamente.




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Consulta

1. Averigüe en qué tipo de exámenes se utiliza la punción capilar y la punción arterial.2. Porque en la punción arterial se usa heparina y no otro anticoagulante.3. Investigar sobre diferentes tipos de anticoagulantes, su mecanismo de acción, su uso en

hematología y cómo podemos identificar en el tubo el anticoagulante.4. Porque el anticoagulante EDTA es el ideal para hematología.5. Describa las indicaciones que se deben tener en cuenta para no producir hemólisis,

hemoconcentración, ni hematomas cuando se toma la muestra de sangre.

BibliografíaBERRIO, M. et-al El hemograma, análisis e interpretación con las tres generaciones. Editorial Universidad de Antioquia. Medellín, Antioquia 2003.

BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.

WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.

TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial SalvatANEXOS

No. Anexo DescripciónNO APLICA




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Laboratorio No 4Tema: EXTENDIDO DE SANGRE PERIFERICA

Objetivo Realizar correctamente un frotis de sangre periférica según las indicaciones dadas.

Fundamento

El análisis de los elementos formes de la sangre implica la observación de la características morfológicas y tintoriales de cada uno de ellos. Hay dos procedimientos principales para el examen morfológico de la sangre: Examen de células fijadas y coloreadas, y el examen de células vivas por contraste de fase. La metodología de mayor aceptación a nivel clínico es el análisis de células fijadas y coloreadas, dado que son técnicas sencillas, accesibles a cualquier institución y fáciles de estandarizar. Para fijar y colorear las células se debe realizar un Frotis o extendido sanguíneo. Se define un extendido como el proceso técnico por medio de la cual la sangre bajo un impulso mecánico se expande por capilaridad sobre una capa de vidrio de tal forma que todos sus elementos queden distribuidos uniforme y separadamente.El impulso mecánico puede ser dado por metodología manual como es la expansión condos portaobjetos, dos cubreobjetos etc., o incluso hoy en día existen aparatos automatizados para la realización de extendido. Como aplicación práctica para el semestre se empleará la metodología de los dos portaobjetos. La muestra de sangre a emplearse para el proceso puede ser por punción capilar (recuerde que se usa la segunda gota ya que la primera viene con líquido intersticial), sangre venosa que haya sido depositada en los tubos de muestra. La muestra ideal para trabajar es la sangre capilar o sangre venosa recién extraída (directa de jeringa).

Materiales y EquiposItem

Tipo Descripción

01 MAT Papel absorbente o cualquier otro tipo de papel para colocar sobre los mesones.

02 MAT Toallas desechables o paños absorbentes no algodonosos para limpiar las láminas y el material que se contamine con la sangre

03 MAT Láminas portaobjetos: El estudiante debe tener disponible una caja de




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láminas portaobjetos totalmente limpia y desengrasada (límpielas previamente con alcohol y/o jabones no grasos), séquelas con paños absorbentes que no dejen motas o restos de algodón sobre la lámina.

04 MAT Frascos hermético tapa rosca con hipoclorito de sodio 5000ppm o cualquier otro desinfectante para descartar las láminas sucias.

05 MAT Muestra a trabajarse: sangre del paciente.06 EQU Lámina extensora-De las láminas limpias y desengrasadas

seleccione una lámina portaobjetos que tenga un borde totalmente liso para usarla en la realización del extendido(Marque esta lámina como lámina extensora y consérvela para las siguientes prácticas).

ReactivosÍtem

Descripción

NO APLICA

ProcedimientoPaso

Descripción

Técnica del Extendido por el Método de los dos Portaobjetos.

1 Aliste y ordene previamente su mesón de trabajo. Desinféctelo, ordénelo y deje únicamente el material de trabajo. Debido a que es la primera vez que usted va a estar manejando muestras de sangre se recomienda colocar sobre el mesón una hoja de papel absorbente extendida con el fin de evitar manchar los mesones con sangre y estar limpiando los mesones de manera muy seguida. Una vez usted adquiere la habilidad de manipular las muestras puede dejar de usar hoja.

2 Colóquese el equipo mínimo de protección de Bioseguridad que necesita para manipular muestras de sangre.

3 Proceda a realizar el extendido de la siguiente forma:

o Mezcle suavemente la muestra y coloque una gota de aproximadamente 5ul de volumen y no más de 3mm de diámetro, sobre la superficie de un portaobjeto de 2cms de uno de los extremos.




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Tome la lámina que ha seleccionado como extensora y coloque el canto liso de la lámina por la parte anterior a la gota de sangre, haciendo un ángulo de 45º entre las dos láminas.

Desplace suavemente la lámina portaobjetos hacia atrás hasta que toque la gota desangre.

4 Espere a que la gota se expanda homogéneamente por capilaridad de la lámina extensora, evitando que llegue a los extremos del portaobjetos.

Sin hacer presión ni fuerza a velocidad uniforme y moderada, deslice suavemente la

lámina extensora sobre la lámina que recibió la gota. El deslizamiento debe ser en forma longitudinal, hasta que la gota quede extendida sobre las ¾ partes de la superficie del primer portaobjetos.

Cuando esté llegando al final del extendido sencillamente levante la lámina portaobjetos sin parar y/o frenar la extendida. De esta forma obtiene su extendido de sangre.

5 Realizado el extendido, déjelo secar de forma HORIZONTAL, a temperatura AMBIENTE, y evitando que le caiga agua, o elementos del medio ambiente. A este proceso se le llama SECADO del extendido. Una vez seco proceda a rotularlo con nombres legibles.

6 Un buen extendido debe reunir varias características a saber:

1. El extendido no debe tomar ninguno de los extremos de la lámina (lateral, posterior, anterior).

2. Debe presentar tres zonas definidas a saber:

- Cabeza o zona excesivamente gruesa: se halla en la región inmediata al punto de Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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partida (donde coloca los 5ul de la gota de sangre). En esta zona se presenta un predominio de las células leucocitarias de bajo peso como Linfocitos y los eritrocitos están superpuestos o demasiado pegados haciendo que esta zona no sea apta para los análisis.- Cola o zona excesivamente delgada, corresponde a la zona final del extendido presenta un predominio de células leucocitarias de gran tamaño y peso como Monocitos-granulocitos, y allí los eritrocitos adoptan una forma acordonada (barbas) y su morfología se distorsiona.- Zona homogénea: que corresponde a la parte central o cuerpo del extendido. Es la zona ideal para los análisis ya que hay un reparto equilibrado de los elementos celulares.

3. El extendido no debe presentar artefactos (algodón, restos de lápiz, etc.,), manchas (agua, aceite, etc.), ni presencias de zonas huecas ya sea por defecto o por haber usado láminas sucias.

4. El extendido debe marcarse en el borde superior de la lámina (sitio donde colocó la gota) con lápices o marcadores que no desprenda materiales que afecten el proceso técnico y/o analítico.

Consulta

1. Cuál es la importancia de realizar un buen extendido de sangre periférica.Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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2. Porque es recomendable realizar el frotis sanguíneo con sangre sin anticoagulante.3. Describa como el proceso de limpieza de las láminas para realizar el extendido de

sangre periférica.4. Investigue la técnica de cubreobjetos y automatizada para la realización del extendido de

sangre periférica.

BibliografíaVIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006


NO APLICA

Laboratorio No 5Tema: PREPARACIÓN COLORANTE DE WRIGHT Y TINCIÓN DE FROTIS

SANGUÍNEO

Objetivo Comprender el mecanismo de actuación del colorante de wright como herramienta para

la caracterización de las células sanguíneas. Preparar adecuadamente el colorante de wright y realizar el control de calidad. Realizar correctamente la tinción del extendido de sangre periférica, utilizando la

coloración de Wright. Identificar y describir los diferentes elementos celulares (tamaño, forma, color) del frotis

de sangre, observados al microscopio.

Fundamento

Las coloraciones de Romanowsky entre ellas la de wright utilizadas rutinariamente en hematología, permiten diferenciar las células sanguíneas dependiendo de sus características tanto físicas como químicas. Por lo tanto, contar con un buen extiendo y coloración propiciaran esta caracterización.




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En esta dirección, las coloraciones utilizadas debe permitir el contraste de los componentes nucleares y citoplasmáticos, y diferenciar su afinidad por los colorantes ácidos (eosina) o básicos (azul de metileno). De esta manera un colorante ácido (aniónico) tiene capacidad para formar un enlace electrostático (ionógeno) con un grupo tisular con carga positiva, como las proteínas citoplasmáticas. En contraste, el colorante básico (catiónico) puede formar un enlace electroestático con un grupo tisular con carga negativa como el DNA y el RNA.Estos explica que ciertas estructuras basófilas (que atraen los colorantes básicos) presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos (que atraen los colorantes ácidos) como la hemoglobina adquieran un color rosado. De igual modo, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permiten clasificar los leucocitos polimorfonucleares en tres grandes grupos:Granulocitos neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente. El color resultante es pardo y las granulaciones se denominan “neutrófilas”.

Granulocitos eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias de intenso carácter básico (espermita y derivados), que fijan fundamentalmente los colorantes ácidos

(compuestos acidófilos). El color resultante es rojo-naranja. Granulocitos basófilos, en los que la granulación específica posee sustancias de fuerte carácter ácido (heparina, principalmente), que fijan los colores básicos como el azul de metileno (compuestos basófilos). El color restante es azul oscuro. Como podemos inferir, en esta reacción química es necesario tener control sobre aspecto como la temperatura, el pH, la humedad entre otros. Adicionalmente es muy importante que la superficie de reacción sea lo más homogénea posible, estamos hablando del espesor de la lámina.

De todas formas, a pesar de tratar de modificar el espesor de una lámina especialmente cuando proviene de una sangre poco densa, algunas veces no es posible darle el “punto”. En estos casos es importante jugar con otro factor como es el tiempo de coloración primario y el tiempo del contraste. Si el extendido es muy delgado tiene que dar ácido, si es grueso va a quedar básico. El correctivo que puede aplicar en esto caso es el siguiente:

Ácido: aumentar el tiempo de contacto del colorante con la sangre y/o disminuir el tiempo de contraste.

Básico: disminuir el tiempo de contacto del colorante con la sangre y/o aumentar el tiempo del contraste.Este mismo correctivo lo puede aplicar cuando sus coloraciones, a pesar de tener un buen espesor, le quedan básicas o ácidas.




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TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamaño de los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de coloración. La información obtenida de un frotis de sangre periférica depende en gran parte de la calidad del extendido y la coloración.

PREPARACIÓN DEL COLORANTE DE WRIGHT

Colorante de wright 3,0grMetanol 1000,0mlGlicerina 15,0mlColorante de wright se trata de una solución de eosina y una mezcla compleja de tiaminas, que incluyen azul de metileno (normalmente 50 al 70 %), azul B (10ª25%) y otros derivados en metanol. En un mortero colocar el polvo de wright y la glicerina, macerándola hasta destruir completamente los grumos formados durante mínimo una hora invirtiéndolo en un botellón ámbar y poco a poco ir lavando el mortero con el metanol. Debe quedar el mortero completamente limpio. Una vez terminado de preparar se debe dejar madurar a 37º C por lo mínimo 8 días y en el momento de utilizarse se debe filtrarse.

PREPARACIÓN DEL BUFFER

Fosfato monopotasio (KH2P04) 6.63grFosfato Disodiaco (Na2HPO4) 2.56grAgua destilada 1000.00ml


01 MAT Sangre con EDTA02 MAT Láminas03 MAT Pipetas de Pasteur06 EQU Microscopio


01 Colorante de Wright02 Agua destilada

03 Solución limpiadora




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04

ProcedimientoPaso Descripción1 Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20

minutos. Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante de

Wright, dejándolo por espacio de 5 minutos. Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada en partes iguales

hasta obtener un brillo metálico, dejando 6 minutos adicionales.Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

2 Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad de la coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge el sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se enfoca a un aumento de 100x. La forma de los glóbulos rojos se examinará detenidamente observando además del color (cantidad de hemoglobina), presencia de plaquetas, su agrupación y distribución.

3 Posteriormente, se hace el recuento diferencial de glóbulos blancos en 100 células, para lo cual se deberá conocer las diferencias entre neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos.

Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena diferenciación de las estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloración rosada de los hematíes y la ausencia de precipitados.

4 Los defectos más frecuentes observados en la tinción del frotis sanguíneo son:

Coloración excesivamente azul, debido a: Frotis excesivamente grueso. Lavado insuficiente Tinción muy prolongada. Empleo de colorante excesivamente alcalino.

Coloración con una tonalidad rosada: El colorante, el tampón o el agua de lavado tienen un pH demasiado ácido.

Presencia de precipitados: Obedecen a una acción excesiva del colorante. Esto se puede evitar con la

filtración.

La preparación debe parecer color rosa a simple vista, al microscopio los eritrocitos serán los núcleos de los leucocitos púrpura, los gránulos neutrófilos violeta rosa o lila, los gránulos eosinófilos rojos y los basófilos púrpura tirando a azul oscuro.




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5 “CADA LABORATORIO DEBE ESTANDARIZAR LOS TIEMPOSUTILIZADOS EN LA COLORACIÓN DE ACUERDO A LAS CONDICIONES DE LOS

REACTIVOS”.

Consulta

1. Que es el colorante de ROMANOWSKY, cual es su composición y su utilidad en hematología?

2. Cuáles son los colorantes más utilizados en hematológica?3. Describa las causas de error en la tinción del frotis sanguíneo.4. Describa y dibuje las características de cada una de las células normales en el frotis

sanguíneo.5. A que se denomina estandarización del colorante y como se realiza.

BibliografíaWILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006





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Laboratorio No 6Tema: MEDICION DEL HEMATOCRITO

Objetivo

Reconocer y aplicar la técnica para valoración del Hematocrito. Obtener la relación existente entre el volumen de masa eritroide y el volumen total de

sangre. Analizar los diferentes resultados obtenidos con esta prueba e interpretar los diferentes

valores obtenidos como conducentes para un posible diagnóstico clínico

Fundamento

El valor hematocrito (Hto) corresponde a la relación entre el volumen ocupado por los hematíes y el volumen correspondiente a la sangre total. La relación entre Hto y la concentración de la Hb hace que su determinación sea el método más accequible en la práctica clínica para el diagnóstico de la anemia. Así el Hto disminuye siempre que disminuye la Hb y aumenta cuando la masa eritrocitaria es superior al valor normal.Al valorar el Hto en ciertas condiciones patológicas debe tenerse siempre en cuenta no obstante que independientemente de la concentración de Hb, su valor puede variar también y a veces de manera importante con el valor del volumen plasmático (VP). Así el descenso del VP dará lugar a un falso aumento del Hto por Hemoconcentración, mientras que el aumento del VP o hemodilución, dará lugar a una falsa anemia. Por consiguiente sólo puede ser interpretado adecuadamente cuando exista certeza que el VP es normal. El hematocrito de sangre capilar siempre dará más alto que el realizado en sangre venosa.El Hto, la Hb y el recuento de glóbulos rojos se relacionan entre sí mediante los llamados índices eritrocitarios secundarios, los cuales son de gran utilidad en la orientación diagnóstica de una anemia. Estos índices son:

VCM: Volumen corpuscular medio

HCM: Hemoglobina corpuscular media CHCM: Concentración corpuscular media de hemoglobina

El tamaño de los glóbulos rojos será otra variable que influya en la valoración del Hto. Si los GR son muy pequeños (microcitos) ocupan menor volumen y viceversa, si son muy grandes




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(macrocitos) ocuparán mayor volumen. Ambas situaciones son patológicas y cursarán con estados anémicos.

El Hto se expresa en tanto por ciento, se determina usando sangre con un anticoagulante que no altere el volumen de los hematíes, como la heparina y el EDTA.

Este índice puede ser medido en una escala "macro" centrifugando a relativamente pocas revoluciones, o en una escala "micro", mediante tubos capilares y a una velocidad alta de centrifugación. Los errores que surgen de esta determinación del Hto se deben a: los cambios provocados en el volumen celular durante las preparaciones previas, a una mezcla incorrecta, a una centrifugación inadecuada. El coeficiente de variación del índice hematocrito determinado por centrifugación es del 1 al 2%. Algunos sistemas automatizados calculan el Hto a base del recuento eritrocitario y el volumen corpuscular medio o lo estiman por mediciones de conductividad.Valores normales

Los valores normales para el hematocrito, al igual que la hemoglobina varía con la edad y el sexo.

♦ Recién nacidos 45 - 60%♦ Hombres 41 - 52 %♦ Mujeres 36 - 47 %

Después de los 50 años de edad hay una ligera disminu8ción de los valores de hematocrito en ambos sexos.


01 MAT Sangre total con EDTA o sangre capital 02 MAT Microhematocritos (capilares desechables de vidrio, tienen 2

presentaciones: con heparina para ser utilizados en muestras obtenidas por punción capilar, se identifican por poseer una franja roja en uno de sus

extremos y sin heparina, que se identifican por una franja azul y deben llenarse con sangre anticoagulada.

03 MAT Tabla de lectura o reglilla,

04 MAT Plastilina

05 EQU Microcentrífuga,




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01 NO APLICA

Procedimiento

1 Microhematocrito

Llenar el capilar con sangre bien mezclada hasta las 2/3 partes aproximadamente, sellar bien la parte inferior con plastilina, colóquelo debidamente calibrado en la Microcentrífuga y al número correspondiente en esta. Cierre bien y coloque a funcionarla de 5 a 10 minutos entre 10.000 y 5.000 rpm respectivamente. Cuando la Microcentrífuga pare, leer el Microhematocrito en la tabla y obtenga el valor directamente y reporte en porcentaje.

2 Uso de la escala: Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de

eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismo nivel de la línea horizontal correspondiente al cero.

Desplace el tubo a través de la escala hasta que la línea marcada con el número 1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigile que el fondo de la columna de eritrocitos continúe sobre la línea cero. El tubo debe encontrarse completamente en posición vertical.

La línea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicará la fracción de volumen de éstos.

Consulta

1. Resalte la importancia de la medición Hto y Hb.2. Qué otros métodos conoce para medir Hto? Descríbalos.3. Qué es hipocromía y qué relación tiene con los valores de Hto y Hb?4. Cuáles son las variaciones fisiológicas que se pueden encontrar en este valor?

Bibliografía

BERRIO, M. et-al El hemograma, análisis e interpretación con las tres generaciones. Editorial Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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Universidad de Antioquia. Medellín, Antioquia 2003.

BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993.MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985.LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006


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Laboratorio No 7Tema: MEDICION DE LA HEMOGLOBINA

Objetivo

Aplicar la técnica de la Cianometahemoglobina para cuantificar la Hemoglobina en gramos por decilitro de sangre.

Analizar los diferentes resultados obtenidos con esta prueba e interpretar los diferentes valores obtenidos como conducentes para un posible diagnóstico clínico.




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Fundamento

La Hemoglobina (Hb) es un pigmento respiratorio de naturaleza proteica que constituye el 95& del peso seco eritrocitario, siendo el componente más importante del hematíe. A través de la Hb el hematíe realiza su función transportadora de oxígeno desde los pulmones a los tejidos. A nivel de los pulmones el oxígeno se fija a ala Hb, dando lugar a la formación de Oxihemoglobina (Hb-O2) y de esa forma es transportada hacia los tejidos, donde el oxígeno es liberado y la Hb se transforma en Hb reducida, conocida como desoxigenada o desoxihemoglobina.Cada molécula de Hb puede fijar un máximo de 4 moléculas de oxígeno (átomos) y en este caso se dice que está saturada. La unión entre el oxígeno y la Hb es de tipo coordinado y por lo tanto fácilmente disociable. En condiciones patológicas la Hb puede fijar otros gases, tales como el ácido sulfhídrico (H2S) o de monóxido de carbono (CO) dando lugar a la sulfahemoglobina y carboxihemoglobina respectivamente, son tóxicos para el organismo ya que impiden el transporte normal del oxígeno.La determinación de la concentración de hemoglobina es de criterio fundamental, para el diagnóstico de una anemia. Debido a ello la metodología empleada debe ser precisa y fiable. Los métodos empleados en la actualidad se han basado siempre en determinadas propiedades físico-químicas de la Hb destacando entre los colorimétricos basados en la medida de la absorbancia lumínica (A) de la propia hemoglobina o de algunos de sus derivados en solución mediante un fotocolorímetro o espectrofotómetro.Método de la Cianometahemoglobina

Este método colorimétrico fue recomendado por el Comité Internacional para Estandarización en Hematología (ICSH) en 1966 y modificado en 1977. Actualmente continúa siendo el método de

elección, debido a la estabilidad de la reacción, facilidad del método, exactitud y precisión, además tiene la ventaja de que puede ser verificado mediante el empleo de un patrón de referencia internacional, el cual permite además, preparar soluciones control para la calibración de instrumentos y elaboración de gráfica patrón.Fundamento

Al mezclar la sangre con el reactivo de Drabkin, se transforma la Hemoglobina en Cianometahemoglobina, la intensidad de color de esta reacción se mide en un fotocolorímetro o espectrofotómetro. La densidad óptica de la solución es proporcional a la concentración de Hemoglobina. Todas las formas de Hemoglobina se miden por este método, excepto la sulfahemoglobina.7

Los pasos de la reacción son los siguientes:

1. Hemoglobina + ferricianuro potásico Metahemoglobina2. Metahemoglobina + cianuro potásico Cianometahemoglobina




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Métodos electrónicosEn todos los instrumentos semi o automatizados se determina la Hemoglobina fotocolorimétricamente por el método de la cianometahemoglobina. La diferencia con el método manual es que la lectura es digital e instantánea en d/dl.

Curva de Hemoglobina

Servir 3 tubos con 5 ml de Drabkin, marcados con los números 1, 2 y 3

En el número 1 llevamos en la pipeta de Hemoglobina, sangre de una concentración conocida que sea baja (5-8 g aproximadamente)

En el número 2 llevamos en la pipeta de Hemoglobina, sangre de una concentración conocida que sea normal (12-14 g aproximadamente)

En el número 3 llevamos en la pipeta de Hemoglobina, sangre de una concentración conocida que sea alta (20-22 g aproximadamente)

Se mezcla cada uno de los tres tubos por separado, se dejan en reposo de 5 -10 minutos, y se lee en Espectrofotómetro a 540 nm, anotando el valor de absorbancia de cada muestra (usando blanco de reactivo), luego en una hoja de papel milimetrado, colocamos en las abscisas los valores en gramos y en las ordenadas los valores de las absorbancias o densidades ópticas. Colocamos los 3 puntos y se traza una recta, pudiendo de esta manera

leer cualquier muestra, llevando su densidad óptica, para ver a qué concentración corresponde en gramos por ciento de hemoglobina.

Lectura

1. Comparar el valor con la curva realizada anteriormente para determinar la concentración de su muestra al hacer incidir, en la curva la absorbancia de su muestra con la concentración que marca la curva.

2. Si de otra manera cuenta con algún estándar de hemoglobina, entonces deberá leer también el estándar y obtener la concentración de la hemoglobina de acuerdo al siguiente cálculo:

Abs muestra x Concentración patrón ____________

Abs patrón




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3. El resultado que se obtiene es en gramos por cada 100 ml.

Valores normales

Varían con la edad, sexo y la altura sobre el nivel del mar.

♦ Recién nacidos: 17 - 23 g/dl♦ Hombres: 14 - 18 g/dl♦ Mujeres: 12 - 16 g/dl

Después de los 50 años se presenta una ligera disminución


01 MAT Tubos de 13 x 100 mm02 MAT Gradilla, pipeta de 5 ml , pipeteadores03 MAT Pipeta automática (20 ul)04 MAT Cubetas de cristal para el fotocolorímetro05 MAT Tapones de caucho para los tubos06 EQU Fotocolorímetro o espectrofotómetro calibrado


01 Reactivo de drabkin02 Patrón de hemoglobina

ProcedimientoPaso Descripción1 Prenda el fotocolorímetro o el espectrofotómetro y espere a que alcance la

temperatura adecuada para su funcionamiento.2 Servir en un tubo de ensayo de 13 x 100, 5ml de Drabkin, con ayuda de un pipeteador3 Mezcle cuidadosamente la sangre por inversión unas 30 veces para obtener una

buena homogenización de la muestra4 Tomar 20 ul utilizando la pipeta automática, teniendo la precaución de limpiar bien

con una gasa las paredes externas de la pipeta cuando finalice el llenado.5 Introduzca la muestra dentro del tubo con drabkin. Tape y mezcle muy bien el

tubo por inversión6 Dejar en reposo por10 minutos para que se produzca la hemólisis total de las células

rojas y se complete bien la reacción7 Transfiera la solución a las cubetas del fotocolorímetro y lea a 540 nm, usando como




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blanco el reactivo de Drabkin.8 Tome nota de la absorbancia de la muestra y del estándar.

Consulta

1. Qué importancia tiene el determinar la hemoglobina a un paciente?2. Qué es la anemia, y cómo es que ésta puede producirse?3. Qué pasa con la relación Hb-O2, cuando una persona está sometida a una gran

cantidad de CO2 (por ejemplo en el caso de un incendio)?4. Qué condiciones debe tener la muestra de sangre para realizar la Hb?5. Cuál es la importancia de correr curvas de Hemoglobina?

Bibliografía

BERRIO, M. et-al El hemograma, análisis e interpretación con las tres generaciones. Editorial Universidad de Antioquia. Medellín, Antioquia 2003.

BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993.MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985.LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006


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Laboratorio No 8Tema:

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULARV.S.G.

Objetivo Determinar, en unidades de longitud y tiempo, la propiedad que tienen los glóbulos rojos

de formar pilas de monedas

Fundamento

Los eritrocitos poseen una carga electrostática negativa en su membrana, lo cual genera fenómenos de repulsión que llevan a mantener los glóbulos rojos suspendidos, conservando su individualidad. Esta fuerza de repulsión se denomina potencial zeta.




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En condiciones normales si se coloca la sangre en un tubo vertical, las células, debido a la fuerza de la gravedad caen por que son más densas que el plasma. Si la carga electrostática disminuye, por alguna causa, los eritrocitos producen mayor cantidad de pilas de mondas que aumentarán la masa de la partícula y en consecuencia, la velocidad de sedimentación. La velocidad de sedimentación se expresa como la distancia en milímetros, que recorren los eritrocitos al caer por unidad de tiempo, generalmente una hora.La sedimentación se puede determinar por métodos manuales o automatizados. El método manual recomendado por el comité Internacional de Estandarización en Hematología, es el de Westergreen y entre los métodos automatizados está el Coulter Zetafuge y el Ves-matic.

LA SEDIMENTACIÓN GLOBULAR

Se realiza en tres etapas:

1. Agregación o Hemoaglutinación: período inicial, en el cual se constituyen las pilas de monedas. La sedimentación es lenta, dura más o menos 10 minutos.2. Sedimentación rápida, o desplazamiento de los hematíes hacia el fondo del recipiente, a velocidad constante, dura aproximadamente 40 minutos,

3. Periodo final: Acumulo de hematíes en el fondo del recipiente.

Factores que influyen en la eritrosedimentación

- Una variación en el tamaño (Anisocitosis) como la macrocitosis (glóbulos rojos grandes) hace caer con mayor rapidez, la microcitosis (glóbulos rojos pequeños) las hace caer con menor velocidad que los glóbulos rojos normales, el efecto sólo es significativo en casos extremos.

- Una variación en la forma de los glóbulos rojos (poiquilocitosis), como la esferocitosis y la




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drepanocitosis pierden la propiedad de formar pilas de monedas por lo cual aquellas entidades que cursan con presencia de estas estructuras, presentan una sedimentación disminuida o nula.

- El número de glóbulos rojos por unidad de volumen de sangre modifica la sedimentación, esta es inversamente proporcional al número de eritrocitos. En la anemia se encuentra aumentada la sedimentación debido a que un número pequeño de partículas tienen más facilidad para formar pilas de monedas en un volumen mayor de plasma, por el contrario en las policitemias la sedimentación es escasa o nula.

Factores plasmáticos

Las variaciones en la composición del plasma afectan la sedimentación; el aumento de las moléculas proteicas del plasma, especialmente el fibrinógeno y las globulinas aceleran la eritrosedimentación. Estas proteínas actúan disminuyendo el potencial zeta y favoreciendo la formación de pilas de monedas. Por eso la VSG se encuentra aumentada en aquellas entidades caracterizadas por hiperfibrinogenemia (infección, necrosis tisular), por aumento en la cantidad de inmunoglobulinas (mieloma múltiple) y también de manera fisiológica o normal durante el embarazo y el ejercicio. Cualquier incumplimiento en cuanto al tipo de muestra, materiales y procedimiento puede ocasionar fallas en dicha medición.

Métodos automatizados

Los sistemas de eritrosedimentación automatizados proporcionan resultados equiparables a los obtenidos por el método manual de Westergreen. Un sistema es el llamado Diese que utiliza unos tubos especiales compatibles con los vacutainer estándar; estos tubos poseen el anticoagulante incorporado, Se colocan verticalmente en el analizado donde se mezclan

automáticamente para luego proceder a las lecturas (0, 30 y 60 minutos) mediante sensores de luz infrarroja que miden el nivel de opacidad de la columna de la sangre. La segunda y la tercera lectura miden el descenso del nivel de opacidad con respecto a la primera. Las diferencias de tamaño y de diámetro entre las columnas de sangre del método de Westergreen y el Diesse, provocan que los resultados obtenidos mediante el sistema Diesse a los 30 y 60 minutos correspondan a la primera y segunda hora del método de Westergreen.

VALORES DE REFERENCIA

Hombres: 0 – 10 mm/ h Mujeres: 0 – 20 mm/ h Niño: 0 – 15 mm/H

Estos valores son constantes entre los 10 y 50 años.




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SITUACIONES QUE SE ALTERA LA VSG

Aumento de la VSG1. Fisiológica - Embarazo- Vejez- Crecimiento- Menstruación

2. Patológicas - Anemias intensas - Procesos inflamatorios crónicos (sífilis, artritis reumatoide, tuberculosis, lupos)- Infarto de Miocardio- Insuficiencia renal- Neoplasia o Neopatía malignas

- Presencia de crioaglutininas- Gamapatía monoclonal- Meloma, enfermedad de Waldemtrom- Infección inflamatorias

Disminución de la VSG1. Policitemia vera 2. Alteración congénita eritrocitaria 3. Hipofibrinogenemia 4. Insuficiencia cardiaca congénita 5. Mecanismo desconocido

CAUSAS DE ERROR

- El valor de la VSG puede disminuir si la concentración del anticoagulante es mayor de lo recomendado.

- La hemólisis puede modificar la sedimentación.- La limpieza del tubo es importante - La inclinación del tubo acelera la VSG por todo ello, una desviación de solo grados mínimo a

partir de la vertical puede acelerar el valor de la VSG hasta un 30%- Todas las burbujas que quedan en el tubo cuando este se llena influirá sobre la VSG. - La temperatura debe mantenerse entre 20 y 25 grados centígrados ya que las temperaturas

inferiores o superiores pueden disminuirla o aumentaría. Si la sangre se ha guardado Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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refrigerada se debe llevar a temperatura ambiente antes de realizar la prueba.- La prueba debe realizarse antes de las 2 horas de haberse tomado la muestra.- La anisocitosis puede interferir en la formación de apilamientos. - La poiquilositosis pronunciada, por ejemplo, formación de células falciformes pueden inhibir

la sedimentación.

Los cuerpos densos contienen ADP y ATP no metabólico así como calcio y seratonina. Los lisosomas contienen numerosas hidrolasas ácidas y son semejantes a los de otras células. Tienen la función de liberación o secreción.

La región anatómica dentro de las organelas está formada por el sistema tubular denso y el sistema de conexión de superficie. Estas estructuras se asocian con la producción de prostaglandinas y el flujo iónico de calcio dentro del citoplasma plaquetario.

¿Para qué sirve y cuándo se realiza?

La prueba puede aplicarse para detectar enfermedades no sospechadas. Muchos clínicos emplean la VSG con esa idea en la evaluación rutinaria de sus pacientes. Otros la consideran inespecífica y poco útil como estudio rutinario. La VSG puede ser útil en ocasiones para diferenciar entre entidades patológicas. Por ejemplo, en el paciente con dolor torácico, la VSG estará aumentada en caso de infarto de miocardio, mientras que será normal en caso de angina.

La VSG es un indicador bastante fiable de la evolución de la enfermedad, por lo que puede emplearse para controlar el resultado del tratamiento, sobre todo en enfermedades inflamatorias (por ejemplo, enfermedades reumáticas o autoinmunes). Es habitual que la VSG aumente cuando la enfermedad empeora y viceversa. Si los resultados de la prueba son equívocos o inconsistentes con la impresión clínica, es habitual realizar otras pruebas (PCR o determinación de proteína C reactiva).


01 MAT Sangre venosa anticoagulada con EDTA02 MAT Tubo de Wintrobe

03 MAT Aguja de Pasteur

04 MAT Soporte para velocidad

05 MAT Jeringas de 2 ml




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ReactivosÍtem

01 NO APLICA

Procedimiento

1 Mezclar suavemente la sangre, por inversión, durante un minuto para homogeneizar la muestra.

2 Llenar el tubo de Wintrobe con la ayuda de aguja de Pasteur y una jeringa teniendo en cuenta que no queden burbujas, que la sangre no esté hemolizada y que quede exactamente hasta la marca cero (0).

3 Colocar en el soporte especial y dejar 1 hora, al cabo de la cual, se lee en escala descendente, la cantidad de mm cúbicos que descendió. Se da lectura en mm/hora.

Consulta

1. Cuál es la etapa más importante de la V.S.G?2. Por qué en un individuo normal la V.S.G. se mantiene constante?3. Qué condiciones debe tener la muestra para realizar Hb, Hto y V.S.G?4. Cómo realiza usted una V.S.G por punción capilar?5. Cuándo se utiliza la corrección de la V.S.G?6. En qué casos se encuentra disminución de la V.S.G?7. Enumere patologías que produzcan aumento de la V.S.G.8. Mencione las utilidades de la V.S.G.9. Analice los siguientes pacientes según sus valores de Hto, Hb y V.S.G

- Paciente A: Mujer adulta que presenta Hto: 53%, Hb: 17 g/dL y VSG: 8 mm/h- Paciente B: Recién nacido (masculino) con Hto: 50%, Hb: 16 g/dL y VSG 17 mm/ h- Paciente C: Adulto masculino con Hto: 7%, Hb: 16 g/dL y VSG: 10 mm/ h




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Bibliografía


BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993.MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985.LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.

TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006


NO APLICA




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Laboratorio No 9Tema: RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS

Objetivo

Contar el número de glóbulos rojos por mm³ o por litro de sangre total

Fundamento

Una muestra de sangre diluida en un medio isotónico, se deposita en la cámara de Neubauer, para visualizar y contar los eritrocitos. Un conteo de glóbulos rojos o RBC alto es común en personas que viven en altitudes elevadas. Es la manera en que el cuerpo se adapta a la falta de oxígeno.


Tipo Descripción

01 MAT Pipeta para dilución de glóbulos rojos

02 MAT Microaspirador o boquilla03 MAT Cámara de Neubauer04 MAT Laminilla de cuarzo05 EQU Microscopio

06 MAT Sangre venosa anticoagulada con EDTA. La sangre capilar también puede ser utilizada




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ReactivosÍtem

Descripción

01 Solución salina 0,85 % como diluyente

Procedimiento

1 Con la Cámara se emplea una laminilla de cuarzo que presenta una superficie plana

muy bien lograda. La distancia entre la cámara inferior de la laminilla o cubreobjetos y la superficie de la cámara es de 0,1 mm.

2 El cuadrado central de la cámara de Neubauer está dividido en 25 cuadrados mas pequeños cada uno, por ejemplo el cuadrante A, mide 0,2 x 0,2 x 0,1, es decir que tiene 0.04 mm² y 0.004 mm³ de área y volumen respectivamente.

Nótese que 1/ 25 esta subdividido en 16 cuadrados pequeños para facilitar su recuento los cuadrados A-B-C-D-E, son los utilizados para el recuento de eritrocitos.




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3A. Dilución Con Pipeta de Rojos1. Mezcle cuidadosamente la sangre anticoagulada, durante un minuto aproximadamente, con el fin de obtener una mezcla homogénea y evitando la formación de espuma.2. Llene la pipeta de Glóbulos Rojos con la muestra de sangre hasta la marca 0,5 exactamente, utilizando el microaspirador3. elimine el exceso de sangre de las paredes externas de la pipeta para no contaminar el líquido diluente.4. Aspire el liquido diluente (solución salina 0,85%) hasta la marca 101 exactamente.5. Coloque la pipeta en posición horizontal y con el dedo índice tape firmemente la punta de la pipeta, suelte el aspirador del otro lado de la pipeta6. Sujete la pipeta entre los dedos pulgar e índice y sométala a una agitación horizontal e inclinada durante 3 minutos aproximadamente. Este proceso debe hacerse preferiblemente en agitadores mecánicos. La perla de vidrio debe moverse libremente. 7. Descarte las cuatro primeras gotas para eliminar el contenido del capilar que no contiene hematíes.8. coloque la laminilla de cuarzo sobre las áreas de hemocitomentro y verifique su limpieza mediante observación microscópica.9. Llene la cámara, sujetando la pipeta como si fuera un lápiz, controlando el flujo de líquido con el dedo índice, la punta de la pipeta se sitúa en el borde del cubreobjetos, en cada uno de los extremos del hemocitometro y por capilaridad se llena la plataforma




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correspondiente. No debe haber burbujas y los surcos adyacentes no deben contener líquido.10. Coloque la cámara en la platina del microscopio y deje reposar por tres minutos para que las celular se distribuyan.11. Utilice el objetivo de bajo poder (10X) para localizar el cuadrado central y comprobar que las células estén uniformemente distribuidas. Si no es así, repita el procedimiento.12. Pase luego al objetivo de 40 X y con la luz reducida (bajando ligeramente el condensador) proceda a contar células en cinco (A, B, C, D, E) de los 25 cuadrados pequeños situados en el gran cuadrado central.13. Realice el recuento en el siguiente orden: Cuadrado superior izquierdo(A), superior derecho (B), inferior derecho (C) inferior izquierdo (D) y central (E).14. El conteo al interior de cada uno de los cuadrados se hace como se indica en el siguiente esquema.

4

15. Observe en el esquema anterior la distribución sistemática de los eritrocitos. Cuente las células tocantes a la parte izquierda y superior de la línea externa y prescinda de las que toquen las líneas derecha e inferior. Tenga cuidado de no contar doblemente las células, anote el número de células contadas en cada cuadro y el total del retículo. Proceda de igual forma a contar el retículo opuesto.

La diferencia entre el número más elevado y el más bajo entre los 10 cuadrados no debe ser superior a 25.




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5 B. Dilución en tubo.

1. Teniendo la muestra recolectada en EDTA, mezclarla suavemente por inversión evitando la formación de espuma.2. Realicé la dilución así: Marque dos tubos y en el primero deposite 0,1 ml de sangre + 0,9 de diluente, solución salina 0.85% y en el segundo tubo coloque 0,1 de la dilución que hizo en el tubo 1 y agregarle 1,9 ml de solución salina.3. Deje la mezcla diluida en reposo durante unos 5 minutos,4. Monte la cámara teniendo en cuenta los procedimientos para ello, antes mencionados. Numeral 7 – 15

6 CALCULO

El recuento de los eritrocitos por mm³, se calcula teniendo en cuenta:

• Área contada• Profundidad de la cámara• Dilución empleada

El cuadro central de la cámara mide 1 mm² y contiene 25 cuadrados menores, de los cuales solo utilizamos cinco para el recuento. Cada cuadrado menor (A, por ejemplo) tiene un área de 0,04 mm² y un volumen de 0,004 mm³.El volumen total utilizado en el conteo será de 0,02 mm³, además para obtener el resultado final por mm³ (R) multiplicamos el número de células contadas por el factor de dilución.

R= No de Células obtenidas en el recuento x Factor de dilución _________________________________

0,02 mm

R= No células contadas x 10.000

7VALORES DE REFERENCIA

Recién nacidos 4 a 5 millones / mLA los 3 meses 3.2 a 4.8 millones / mLAl año de edad 3.6 a 5 millones / mLEntre los 3 y 5 años 4 a 5.3 millones / mL




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De los 5 a los 15 años 4.2 a 5.2 millones / mLHombre adulto 4.5 a 5 millones / mLMujer adulta 4.2 a 5.2 millones / mL

8OBSERVACIONES:

• Cuando el paciente tiene anemia severa, lleve la sangre hasta la marca 1 y diluya hasta la marca 101 el factor de dilución es de 100• En caso de policitemias, en donde el conteo de células es alto, la dilución debe ser mayor. Lleve la sangre hasta la marca 0,3 y diluya hasta la marca 101. El factor de

dilución es 333

• Asegúrese de que el diluente esté libre de sangre u otros contaminantes,• Limpie la lámina y la laminilla de cuarzo con un trapo libre de hilas. El uso de etanol al95% facilita el proceso de limpieza

• El conteo de células rojas demora más tiempo que el conteo de las células blancas, puesto que su número es mayor. El proceso debe hacerse tan rápido como sea posible, evitando que se seque la dilución lo que causaría inexactitud en el recuento final • La homogenización de la muestra para el recuento eritrocitario y demás mediciones del hemograma, constituye un aspecto fundamental y es fuente de error constante en sesgo positivo o negativo.

9EL RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS EN LA ACTUALIDAD SOLO SE REALIZA POR METODOS AUTOMATIZADOS, YA QUE EL RECUENTO MANUAL POSEE UN COEFICIENTE DE VARIACIÓN DEL 11 AL 22%, EN COMPARACIÓN CON EL 1% DEL AUTOMATIZADO, LO QUE NOS INDICA LA BAJA PRECISIÓN DE LA TECNICA MANUAL. SIN EMBARGO EL MONTAJE EN CAMARA SIGUE SIENDO DE GRAN UTILIDAD PARA OTRO TIPO DE RECUENTOS.

Consulta




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1. Nombre algunas causas fisiológicas que puedan presentar variación en el recuento de glóbulos rojos y porqué?.

2. Averigüe las condiciones pre-analíticas del paciente para la toma de muestra.3. Qué errores deben evitarse para la realización del recuento de glóbulos rojos.4. Qué dilución es la realizada en el recuento de glóbulos rojos?

Bibliografía


BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993.

MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985.LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

ANEXOS No. Anexo

NO APLICA




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RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOSObjetivo

Realizar a nivel práctico técnicas que valoren parámetros leucocitarios; por medio del uso de cámaras cuenta glóbulos (Cámara de Neubauer) como herramienta de rutina para la cuantificación de dichas células.

Fundamento

Los leucocitos o glóbulos blancos son células que están principalmente en la sangre y circulan por ella con la función de combatir las infecciones o cuerpos extraños; pero en ocasiones pueden atacar los tejidos normales del propio cuerpo. Es una parte de las defensas inmunitarias del cuerpo humano. Se llaman glóbulos blancos ya que éste color es el de su aspecto al microscopio. El fundamento de la prueba consiste en contar el número de células leucocitarias en Cámara de Neubauer mediante el uso de un líquido diluyente


01 MAT Sangre venosa con EDTA o sangre Capilar

02 MAT Pipeteador03 MAT Pipeta para dilución 0.1 ml o pipeta para recuento de glóbulos blancos04 MAT Cámara de Neubauer05 MAT Laminilla de cuarzo




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0607 MAT Caja de petri

08 EQU Microscopio



02 Reactivo: Liquido de Turk (Acido Acético 3 ml, agua destilada 97 ml, azul de

metileno 1 ml)

Procedimiento

1 A. Dilución en Tubo

1. Tome la muestra de sangre con EDTA y mézclela suavemente por inversión unas tres veces.2. Tomar 20 ul de sangre y deposítela en un tubo que debe contener 380 ul de líquido de Turk (dilución 1/20). Mezcle por inversión, (use papel parafim)3. Deje el tubo en reposo al menos por cinco minutos.4. Prepare la cámara de Neubauer con su laminilla, completamente limpios.5. Tome el tubo con la sangre diluida, mézclelo nuevamente y con la pipeta de 0.1 ml deposite 1 -2 gotas entre cámara y laminilla.6. Deje en reposo por 8 minutos la cámara para que sedimente la preparación. Para evitar que se seque coloque sobre el mesón papel filtro húmedo, encima de la cámara y tápela con una caja de petri.7. Seque por debajo la cámara, móntela con mucho cuidado en el carro del microscopio (tenga cuidado porque puede salir impulsada y quebrarse) y observe primero en 10X y luego en 40X8. Realice el recuento en los 4 cuadrantes grandes de los extremos señalados como 1, 2, 3, 4.

2 Recuerde que no debe incluir las células que queden por fuera de las líneas extremas de la cámara, que se debe contar en los 16 cuadritos de cada uno de los cuatro cuadrantes grandes y se recomienda hacerlo en un sentido en el cual no se repita ningún cuadro




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3

4B. Dilución en pipeta de Blancos

1. Mezcle suavemente la sangre por inversión, para lograr la homogenización de la muestra.2. Llene la pipeta con la muestra de sangre hasta la marca 0,5 exactamente; haga uso del pipeteador o microaspirador.3. limpie las paredes externas de la pipeta para que no contamine el líquido diluente 4. Aspire el líquido de Turk hasta la marca 11 exactamente5. Sujete la pipeta entre los dedos pulgar e índice, desprenda el microaspirador y agite la pipeta en forma horizontal, durante tres minutos para obtener la hemólisis total de las células rojas o llévela al agitador eléctrico.6. Para llenar la cámara de Neubauer realice los siguientes pasos:7. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara y verifique su limpieza mediante la observación microscópica8. Con el dedo índice tape el extremo superior de la pipeta y colóquela en forma vertical9. Descarte las cuatro primeras gotas de la dilución, para eliminar el contenido del capilar que no contiene leucocitos10. Use el dedo índice para controlar la gota que sale de la pipeta con la cual va a llenar los retículos de la cámara.




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11. Coloque la cámara sobre la platina del microscopio y espere aproximadamente un minuto para iniciar el conteo12. Use el objetivo de bajo poder (10X) para observar la distribución de las células en la cámara y cuadrar la intensidad de la luz de manera que visualice mejor las células blancas13. Realice el recuento en los 4 cuadrantes grandes de los extremos señalados como 1, 2, 3, 4, recuerde que no debe incluir las células que queden por fuera de las líneas extremas de la cámara, que se debe contar en los 16 cuadritos de cada uno de los cuatro cuadrantes grandes y se recomienda hacerlo en un sentido en el cual no se repita ningún cuadro.

5 CALCULO

El recuento de glóbulos blancos por mm3, se calcula teniendo en cuenta:

• Volumen del área contada: 0.4 mm3 (1 x 1 x 0.1 x 4)• Número de células contadas• Dilución empleada (1/20)

Leucocitos/ mm³ = Nº cel contadas x dilución _______________________

Volumen de área contada

Leucocitos/ mm³ = Nº cel contadas x 20 ___________________

0,4

Leucocitos/ mm³ = Nº cel contadas x 50

6 OBSERVACIONES

• Cuando el paciente presenta leucopenia con una cifra igual o inferior a 2.500/mm³, la muestra de sangre debe aspirarse hasta la marca 1 para obtener una dilución de 1:10 (el factor de multiplicación es de 25)• En ciertas situaciones, como la leucemia, el recuento de leucocitos puede ser

extremadamente alto, para ello empleamos la pipeta de glóbulos rojos hasta la marca 1 (1:100) o hasta la marca 0,5 (1:200). Los factores de multiplicación serán 250 y 500 respectivamente.




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• El anciano presenta un recuento de leucocitos entre 3.100 y 8.500 / mm³ y en el embarazo, sobre todo durante el último trimestre, la leucocitosis puede llegar a 15.000/ mm³ Con aumento de Polimorfonucleares neutrófilos y bandas neutrófilas • La presencia de eritroblastos circulantes, en algunas entidades hematológicas, aumenta el recuento de leucocitos debido a que son células nucleadas y no son destruidas por el líquido diluente, por esto se hace necesario corregir el recuento inicial con la siguiente fórmula:

7 Recuento corregido= Conteo inicial de leucocitos x 100______________________________

100+número de células nucleadas rojas por 100 células blancas

8 VALORES DE REFERENCIA

Recién nacido 10.000 a 26.000/mm3A los 3 meses 6.000 a 18.000/mm3Al año de edad 8.000 a 16.000/mm3Entre los 3 y 5 años 10.000 a 14.000/mm3De los 5 a los 15 años 5,500 a 12.000/mm3Hombre adulto 5.000 a 10.000/mm3Mujer adulta 5.000 a 10.000/mm3

Consulta

1. Qué condiciones debe tener el paciente para realizar la toma de muestra?2. Porque otro diluyente remplazaría usted el liquido de Turk?3. Cuál es la diferencia máxima de células que debe existir entre los cuatro cuadrantes

para poder decir que la cámara está bien montada y no hay un error?4. Nombre por lo menos tres causas fisiológicas y tres causas patologías que den

leucocitosis y leucopenia respectivamente.5. Si tiene un recuento de 10.000 leucocitos por mm³ (Unidades Clásicas) cómo lo

informaría en unidades internacionales?

Bibliografía





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VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

ANEXOS No. Anexo NO APLICA

Laboratorio No 11Tema: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

ObjetivoElaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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Determinar el valor relativo y el valor absoluto de cada tipo de célula blanca presente en el extendido de sangre periférica, coloreado con Wright

Fundamento

Hay diferentes grupos de glóbulos blancos, los llamados polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y los mononucleares (linfocitos y monocitos). Los leucocitos neutrófilos son los más numerosos y porcentualmente los más significativos que se encuentran. Su función es la fagocitosis que se entiende como si fuera una absorción y digestión de sustancias extrañas (bacterias, cuerpos extraños, tejidos etc). Las formas inmaduras que aparecen cuando hay un estímulo intenso medular para su producción se llaman cayados (por la forma del núcleo); suele indicar la existencia de actividad intensa de las defensas contra infecciones por bacterias. Los leucocitos eosinófilos se llaman así por el color rojo en el que aparecen al microscopio por una tinción con eosina. Suelen estar elevados en ciertas enfermedades causadas por alergia o por infecciones parasitarias. Los basófilos suelen tener un comportamiento similar.Los leucocitos mono nucleados son los linfocitos y los monocitos. Tienen un núcleo celular único y pequeño. Sus funciones son las combatir infecciones virales y bacterianas Si bien el recuento total nos da un número aproximado de los leucocitos que hay en la muestra de sangre, dicha prueba no diferencia que tipo de leucocitos es el que observamos (Neutrofilo, basofilo, eosinofilo, monocito, linfocito) por tal razón se hace necesario efectuar un análisis que nos identifique cada una de estas poblaciones y nos diga su número relativo (%)en sangre. A esta prueba que diferencia el tipo de célula leucocitaria en sangre la denominamos RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS.El recuento diferencial de Leucocitos se efectúa tiñendo con colorantes ácido-básicos (Wright) que permitan diferenciar las poblaciones de acuerdo a la afinidad de las estructuras por los componentes del colorante.


Tipo Descripción

01 MAT Extendidos de sangre Lamina Extensora, lamina de extendido, equipo personal de protección, soportes de coloración, vasos para lavado.

02 MAT gradillas, 03 MAT Caja de petri

ReactivosElaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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Ítem

01 Aceite de Inmersión

02 Colorante de Wright, solución buffer


ProcedimientoPaso1

1. Tome uno de los extendidos de sangre que ya este seco y colóquelo sobre los soportes metálicos para colorear. Asegúrese de que el soporte este equilibrado. 2. Coloque sobre el extendido el colorante de Wright de tal forma que cubra toda la lámina en su totalidad, y que el colorante bajo NINGUN motivo se le riegue. Deje el colorante por lo menos 4 minutos actuando sobre la lámina.3. Sin quitar la lámina del soporte adicione la solución buffer de tal forma que cubra todo el extendido sin que se derrame el colorante o buffer por los bordes de la lámina.4. Con una pipeta plástica sople la mezcla buffer-colorante hasta que este emita un brillo metálico. Sople suavemente sin regar el colorante. A partir de este momento, cuente 5 minutos y deje la lámina con el colorante y buffer.5. Pasado este tiempo tome un recipiente con agua destilada o de chorro de la llave y lave la lamina sin quitarla del soporte6. Quite la lamina del soporte y límpiela por la parte de abajo (donde no está el extendido) con el fin de quitar el exceso de colorante.7. Deje secar el extendido a TEMPERATURA AMBIENTE y en posición VERTICAL. Debe quedar seco por las dos caras8. Totalmente seco el extendido enfóquelo en objetivo de bajo poder (10X) para localizar el cuerpo del extendido.9. Localizada esta área del extendido pase a 100X, agregue una gota de aceite de inmersión.10. Realice el recuento en sentido que al mover el carro no se repitan células haciendo un zigzag sobre el cuerpo del extendido.11. Cuente 100 leucocitos y vaya estableciendo un diferencial de cada una de las células usando un sistema manual de recuento, aunque también existen los tabuladores mecánicos.




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2

3

4 OBSERVACIONES:

• El Recuento diferencial y la revisión del extendido deben realizarse una vez las mediciones cuantitativas del hemograma se han realizado• El recuento esta dado sobre 100 células y no sobre el número de células totales, de ahí que también se denomina recuento relativo.• El número de células a contar viene dado por el recuento leucocitario total, se cuenta sobre 100 células para un recuento normal, 300 células para un recuento entre 20.000 y 50.000/mm³ y de 400 a 500 para recuentos superiores a 50.000/mm³• Cuando el recuento de células blancas es menor de 1.000 es difícil encontrar células en el extendido de sangre; en esta situación el diferencial se realiza contando 50 células. Este hecho debe anotarse claramente en el reporte.

• Se debe tener en cuenta que la forma diferencial varia con la edad, Los niños, en términos generales, poseen más linfocitos que el adulto normal y alrededor de los 10 años comienzan a estabilizarse los valores normales del adulto.

5 CALCULOS




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Si se conoce por la formula leucocitaria los porcentajes relativos y se sabe el recuento leucocitario total podemos calcular los valores absolutos así:

Número absoluto de células por litro= % de cada tipo de célula en el diferencial X el recuento de leucocitos por litro

Consulta

1. Dibuje los leucocitos que normalmente se observan en el frotis de sangre periférica, con las características morfológicas y tintoriales que presentan en la coloración de Wright?

2. Describa las funciones de las células descritas en el punto anterior.3. Que aspectos se deben tener en cuenta para no cometer errores en la realización de

este examen?4. En qué circunstancias fisiológicas y patológicas se presenta: Neutrofilia, Eosinofilia,

Basofilia, Linfocitosis, Monocitosis, Neutropenia, Linfopenia.

Bibliografía


WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

ANEXOS No. Anexo

NO APLICA


MORFOLOGIA Y RECUENTO DE PLAQUETAS

Objetivo

Los estudiantes estarán en capacidad de realizar un recuento de plaquetas con los diversos métodos.




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Fundamento

Las plaquetas representan fragmentos citoplasmáticos derivados de los megacariocitos. Están rodeadas por la clásica membrana celular de doble capa lipídica que contiene diversos receptores y fosfolípidos funcionalmente importantes. Las plaquetas en circulación no se adhieren unas con otras, ni a la superficie endotelial, pero pueden ser estimuladas a agregarse por varios mediadores, jugando un papel importante en la hemostasia.Para ello forman nudos en la red de fibrina, liberan substancias importantes para acelerar la coagulación y aumentan la retracción del coágulo sanguíneo. En las heridas las plaquetas aceleran la coagulación, y además al aglutinarse obstruyen pequeños vasos, y engendran substancias que los contraen.El recuento de plaquetas se realiza en sangre anticoagulada con EDTA y diluida con oxalato de amonio al 1% o citrato de sodio al 3,8% mediante el uso de la pipeta para dilución de hematíes. En el extendido se sangre periférico, las plaquetas se observan con una tonalidad levemente basófila lo cual permite detallar una zona central granular llamada cronómetro y una zona periférica más clara denominada hialómero.


01 MAT Sangre con EDTA

02 MAT Pipeta para la dilución de hematíes03 MAT Agua destilada

04 MAT Cámara de Neubauer

05 MAT Microaspirador06 MAT Caja de Petri con papel filtro humedecido07 MAT Laminas08 MAT Laminilla de cuarzo09 EQU Microscopio


01 Solución de Oxalato de amonio al 1% o solución de citrato de sodio al 3,8%02 Solución limpiadora03 Aceite de inmersión

04 Colorante de Wright




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ProcedimientoPaso1 METODO INDIRECTO

1. Realizar extendido de Sangre periférica2. Colorear el frotis con Colorante de Wright3. Dejar secar la coloración4. Primero observar en objetivo de 10X para buscar la zona ideal.5. Pasar a objetivo de alto poder 100X, Colocar aceite de inmersión.6. Identificado el sitio donde se observen 100 glóbulos rojos por campo, contar plaquetas en 10 campos microscópicos, y sumar el número total, sacar el promedio dividiendo por diez.7. Luego este resultado lo multiplicamos por una constante que es 21.000 y el resultado se da en milímetro cúbico (mm³). Si el recuento es muy bajo contar en 20 campos.

2 METODO DIRECTO

1. Mezcle cuidadosamente la sangre anticoagulada por inversión, por lo menos 30 veces, con el fin de obtener una muestra homogénea.2. Llene la pipeta con la muestra de sangre hasta la marca 1.0 exactamente; haga uso del microaspirador3. Elimine el exceso de sangre de las paredes externas de la pipeta para no contaminar la solución diluente.4. Aspire el líquido diluente hasta la marca 101 exactamente.5. Sujete la pipeta entre los dedos índice y pulgar, desprenda el microaspirador y agite la pipeta en forma horizontal durante tres minutos.

6. Deje reposar la pipeta por 10 minutos si esta trabajando con oxalato de amonio al 1% con el fin de lograr la hemólisis total de los glóbulos rojos.7. En caso de trabajar con Citrato de sodio al 3,8% omita este paso8. Agite nuevamente9. Descarte las primeras 4 gotas, para eliminar el líquido del capilar e inmediatamente llene la cámara en ambos lados.10. Coloque la cámara en ambiente húmedo por 10 minutos. El ambiente húmedo se logra cubriendo la cámara con una caja de petri que llevara adherido un disco de papel filtro humedecido con agua.11. Coloque la cámara en el microscopio. Enfoque con objetivo de 40X y observe el llenado de la cámara, no deben existir agregados plaquetarios.12. Cuidadosamente enfoque el cuadrado central.13. Disminuya la intensidad de la luz y así le será más fácil distinguir y contar las plaquetas.




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14. Las plaquetas se reconocen como estructuras pequeñas, opacas, redondas o alargadas a veces con prolongaciones, que son medianamente retráctiles.15. El numero esta determinado por el conteo de los 25 cuadrados en que se subdivide elcuadrado central, descartando las plaquetas que tocan las líneas derecha e inferior.

3CALCULO

El número de plaquetas por mm³ se calcula de acuerdo a:

• Volumen del área contada: 0.1 mm³ ( 1 X 1 X 0.1)• Dilución utilizada: 1:100• Numero de células contadas

Plaquetas por mm³ = Nº de células contadas X 1 X dilución

Plaquetas por mm³ = Nº de células contadas X 10 X 100

Plaquetas por mm³ = Nº de células contadas X 1.000

4 VALORES DE REFERENCIA:

El rango normal para el recuento de plaquetas es de Unidades clásicas:

150.000 – 400.000 / mm³

.5 OBSERVACIONES

1. Correlacione el número de plaquetas observadas con el recuento obtenido en cámara, usualmente se observan de 8 – 2 0 plaquetas individuales por campo con objetivo de alto poder2. Observe el tamaño de la plaqueta circulante. Frecuentemente se pueden observar en bajo porcentaje, algunas plaquetas con tamaño mayor (macroplaquetas)3. Se debe tener especial cuidado con las soluciones diluentes, estas no deben estar contaminadas pues tanto las partículas como las bacterias pueden simular plaquetas.4. La limpieza de las cámaras y de las pipetas es extremadamente importante en este procedimiento.5. Los líquidos diluentes se deben mantener refrigerados y filtrar antes del uso 6. Si observa agregados en el recuento, el procedimiento debe repetirse.

7. No se debe reportar el recuento de plaquetas Directo sin confrontarlo con el




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extendido de sangre periférico coloreado con Wright.8. La diferencia del número de plaquetas entre los cuadrados centrales de la cámara no debe ser mayor de 10 plaquetas.

Consulta

1. Qué valores de referencia tienen las plaquetas?2. Cuál es el valor normal del volumen plaquetario medio?3. Por el método automatizado que errores se pueden tener en el recuento de plaquetas?4. Qué es el dimorfismo plaquetario5. En qué circunstancias fisiológicas y patológicas podemos encontrar trombocitosis y

trombocitopenia?

Bibliografía


VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

ANEXOS No. Anexo NO APLICA




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