HOSPITAL REGIONAL LAMBAYEQUE

SERVICIO DE LABORATORIO CLINICO

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

DEL AREA DE HEMATOLOGIA

Chiclayo, 2012

INTRODUCCION

El principal objetivo del área de Hematología del Servicio de Laboratorio del

HRL es proporcionar, con la máxima calidad y la mayor brevedad posible, el

informe de resultados de la medición de las magnitudes hematológicas de un

paciente, . Aquí se cuenta con tecnología de punta que permite la realización

de una gran cantidad de pruebas que facilitan al médico ayudas para el

diagnóstico, tratamiento y seguimiento de sus pacientes.

Las magnitudes laboratoriales se utilizan normalmente para obtener un punto

de referencia en el diagnostico, evolución o pronóstico de una enfermedad. El

médico solicita una prueba determinada y obtiene un valor cuantitativo y/o un

informe del Profesional del Laboratorio Clínico, que interpreta y le ayuda a

confirmar, descartar o ver la evolución³n de una determinada patología. La

introducción de analizadores automáticos ha permitido al laboratorio aumentar

el número de pruebas y acortar el tiempo de respuesta.

De esta forma se han diseñado protocolos, en cada uno de los cuales se

realizan distintas determinaciones analíticas dependiendo de la patológica del

enfermo.

SECCION I

GENERALIDADES

1.1. OBJETIVOS

- Proporcionar al personal que labora en el área de Hematología del Laborato-

rio de Hospital Regional Lambayeque los procedimientos que permitan contri-

buir de manera eficiente, con calidad y calidez a la atención de los pacientes,

desde la recepción de las muestras, su procesamiento y la emisión de infor-

mes, reuniendo criterios de aceptación nacional e internacional

1.2. CAMPOS DE APLICACIÓN

Para aplicación en el área de de Hematología del Laboratorio de Hospital Re-

gional Lambayeque

1.3 RESPONSABILIDADES:

- Dirección Ejecutiva del Hospital Regional Lambayeque

- Jefatura de Servicio de Laboratorio Clínico del Hospital Regional Lambaye-

que

- Personal Profesional Tecnólogo Médico y Técnico de Laboratorio y Auxiliares

de área de de Hematología del Laboratorio de Hospital Regional Lambayeque

1.4. CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCION Y MANEJO DE

LAS MUESTRAS

DISPOSICIONES GENERALES

·Ayuno: Para ciertos estudios que requieren muestras sanguíneas que deben

conservar condiciones de ayuno. Dicho tiempo puede variar entre 8 horas a 12

horas. Sin embargo, otros ensayos no requieren esa condición.

. En caso de recolectar la sangre con jeringa y aguja estériles, los tubos deben

llenarse con celeridad, evitando movimientos bruscos que acarreen roturas de

glóbulos rojos y posterior hemólisis.

ANTICOAGULANTES PARA RECOLECCION DE MUESTRAS

Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formación de coágulos.

Existen diferentes tipos de ellos en polvo o líquidos.

Selecciónese el anticoagulante apropiado según el estudio a realizarse.

Describiremos brevemente los disponibles a manera de información:

.

EDTA (Etilen Diamino Tetra Acetato) : Usado para estudios celulares hema-

tológicos , es factible su uso en el trabajo bioquímico de algunos componentes

( ej. Glucosa )

Citrato de Sodio: Usado en concentraciones al 3.8% generalmente para estu-

dios de coagulación.

Heparina: Se utiliza en presentaciones con concentraciones de litio y sodio.

Para estudios bioquímicos es preferible el uso de heparina con litio.

Códigos de colores internacionales: Adoptados por muchas compañías que

proveen los tubos con anticoagulantes para su uso cómodo, pues permiten una

recolección prefijada de sangre, la cual se mezclará con la correspondiente

cantidad de anticoagulante.

· Tapa Roja: Sin Anticoagulante

· Tapa Violeta: Con EDTA.

· Tapa Celeste: Con Citrato de Sodio.

· Tapa Verde o Blanca : Con Heparina.

· Tapa Gris : Con Oxalatos.

SECCION 2:

MEDIDAS DE

BIOSEGURIDAD

2.1. INFORMACION GENERAL

Se tiene como referencia el Manual de Normas de Bioseguridad del

Instituto Nacional de Salud.

2.2. RESPONSABILIDADES

La bioseguridad del laboratorio compromete a todo el personal; se deriva de

esta afirmación que cada empleado debe comunicar a sus superiores cualquier

acto o condición que atente contra ella, así como contribuir a su cumplimiento.

Sin embargo, es aconsejable que el Jefe de Laboratorio o un designado se en-

carguen de la supervisión de las normas.

2.3 PRINCIPALES MEDIDAS EN LABORATORIOS

2.3.1. Protección Individual

Este equipo incluye: mascarillas, gafas de protección ocular y bata o mandiles

apropiados, además de una buena provisión de guantes.

La infraestructura tomará en cuenta la necesidad de regaderas o suminis-

tros de agua potable.

2.3.2. Almacenamiento de Líquidos Inflamables

Utilizar recipientes adecuados, perfectamente identificados y dispuestos en ar-

marios o mobiliario de seguridad.

Disponer señales en el área de almacenamiento y extintores suficientes y en

vigencia.

2.3.2. Saneamiento del medio

Mantener limpieza e higiene en mobiliarios, zonas de trabajo, pisos, corredo-

res, indumentaria.

Disponer de adecuados recipientes de basura y mantenerlos cerrados. Destinar

espacio suficiente para la alimentación del personal, así como vestidores para

comodidad de los mismos.

2.3.3. Prevención de Incendios y Riesgos Eléctricos

Mantener como requisitos mínimos:

Capacitación del personal en los tópicos pertinentes.

Señalizaciones adecuadas para las vías de escape en caso de incendios

o siniestros.

Identificar los extintores portátiles y mantenerlos en buen uso.

Utilizar cables de tres conductores (con toma a tierra) en todas las instala-

ciones eléctricas.

Se aconseja el uso de tomas de corriente de un solo enchufe, evitando las co-

nexiones múltiples.

2.4. LAS REGLAS DE BIOSEGURIDAD INVIOLABLES

Lavado de manos del personal después de haber manipulado material in-

feccioso.

No permitir pipetear con la boca

Prohibir al personal comer, beber o fumar en zonas de trabajo.

Evitar el uso de cosméticos en áreas de trabajo.

No guardar alimentos o bebidas en los refrigeradores de trabajo.

Mantener el laboratorio limpio y aseado. Descontaminar superficies de tra-

bajo una vez al día.

Usar batas, uniformes, mandiles en el ambiente de labores. No trasladar di-

cha indumentaria fuera del mismo.

Autorizar el paso a la zona de trabajo al personal del mismo y a todo aquel

que sea informado de los requisitos para su permanencia en el lugar. Mantener

las puertas cerradas.

No permitir niños en zonas de trabajo.

Prohibido absolutamente el ingreso de animales, con excepción de al-

guna finalidad dentro de las funciones del laboratorio.

Utilizar guantes en todos los trabajos que impliquen relación directa con ma-

terial sanguíneo.

Esterilizar en autoclave el material de desecho permisible de dicha ac-

ción, antes de su eliminación.

2.5. DESINFECCION

Los desinfectantes recomendados para el trabajo general de laboratorio son:

Lejía: Hipoclorito sódico. El cloro es un desinfectante universal, activo contra to-

dos los microorganismos. En general se utiliza en forma de hipoclorito sódico,

con diversas concentraciones de cloro libre. Se trata de un agente oxidante,

potente corrosivo para los metales. Las soluciones de hipoclorito se degra-

dan poco a poco, por lo que es necesario prepararlas con frecuencia.

Como desinfectante general para toda clase de trabajos de laboratorio, se utili-

zará una concentración de 1gr/L (1000 ppm) de cloro libre. En los casos de sal-

picaduras de sangre o en presencia de material orgánico en

cantidad apreciable, para la desinfección se debe recurrir a una solución más

concentrada de 10 g/L (10 000 ppm), de cloro libre.

Compuestos fenólicos. Muchos compuestos fenólicos que constituyen la base

de cierto número de desinfectantes corrientes. Los compuestos fenólicos pue-

den emplearse cuando no se dispone de hipocloritos, diluyéndolos de acuerdo

con las recomendaciones del fabricante.

Yodo y yodoformos. La acción de estos desinfectantes es parecida a las de

los hipocloritos; las superficies limpias pueden tratarse eficazmente con

soluciones que contengan 0.075 g/L (75 ppm) de yodo libre. Los yodoformos

pueden diluirse en alcohol etílicos para el lavado de manos o como esporicida.

Alcohol etílico y alcohol isopropilico. Estos desinfectantes son de menos efica-

cia que los ya mencionados.

2.6 ELIMINACION DE DESECHOS

Los desechos no contaminados se introducen en bolsas negras y pue-

den eliminarse con la basura corriente.

Los objetos agudos y cortantes, como las agujas hipodérmicas y jerin-

gas, deben colocarse en recipientes rojos con paredes que no puedan traspa-

sarse fácilmente. Cuando estos estén llenos, se colocan en bolsas anaranja-

das para desechos contaminados y se incineran.

El material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización, se co-

loca en recipientes impermeables poco profundos, que contengan una cantidad

de desinfectante suficiente para cubrir el contenido. Los recipientes se colo-

can luego en autoclave. No se efectúa ninguna

limpieza previa; cualquier limpieza o reparación que sea necesaria se hace

después del paso por la autoclave.

Los materiales contaminados para eliminación como todos los cultivos, san-

gre y sueros suelen esterilizarse en autoclaves. La eliminación de las muestras

de suero es muy importante. Cada área debe tener recipientes de basura para

descartar las muestras. Es importante tener presente que al descartar los dese-

chos no producir aerosoles.

SECCION 3.

DESCRIPCION DEL AREA DE HEMATO-

LOGIA DEL HOSPITAL REGIONAL LAM-

BAYEQUE LA

3.1 AREA FISICA

El área es de 10.00 m x 6 m., piso con losetas y paredes revestidas con con-

creto y con mayólica, con mesas de acero.

3.2. INFRAESTRUCTURA

Existen conexiones eléctricas, de agua y desagüe, mesas de trabajo,

escritorios y sillas.

3.3. RECURSOS HUMANOS

· 04 Tecnólogos Médicos

· El personal profesional realiza turnos rotativos, según programación de Rol

de Servicio de Laboratorio del HRL

El turno de la mañana inicia a las 7:30 a.m. y culmina 1:30 p.m.

El turno de la tarde inicia a las 1:30 p.m. y culmina 1:30 p.m.

El turno de Guardia Diurna se inicia a las 7:30 a.m. y culmina 7:30 p.m.

El turno de Guardia Nocturna se inicia a las 7:30 p.m. y culmina 7:30 a.m.

3.4. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales:

Para Toma de Muestras :

· Guantes

· Jeringa, aguja

· Tubo recolector

· Algodón 70°

· Alcohol

· Ligadura

· Lancetas

· Capilares

· Contenedor de desechos

· Plumón indeleble

Para procesamiento de muestras:

· Reactivos de Trabajo (según cada análisis)

· Tubos de ensayo

· Pipetas de vidrio

· Micropipetas

Para reporte de resultados:

· Formatos

· Lapiceros

Equipos:

· Microscopios Olympus

. Analiazdor Hematoloógico Sysmex 4000i

· Coagulo metro Bioclin

. Centrífuga de tubos

3.5. EXAMENES QUE REALIZA

HEMATOLOGIA:

Hemograma

Hematocrito

Grupo sanguíneo y factor Rh

Velocidad de Eritrosedimentación

Recuento reticulocitos

Recuento de plaquetas

Estudio de lámina periférica

Constantes corpusculares

Investigación de Bartonella

Gota gruesa

Coombs directo

Coombs Indirecto

Tiempo de Coagulación

Tiempo de Sangría

Tiempo de protrombina

Tiempo de tromboplastina parcial activada

Tiempo de trombina

Fibrinógeno

SECCION 4.

PROCEDIMIENTOS PARA EL

DIAGNOSTICO DE LABORATO-

RIODE HEMATOLOGIA

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE

I.- OBTENCIÓN DE SANGRE CAPILAR

Es el método empleado cuando se necesita tan solo una pequeña cantidad de

sangre, ya que los estudios a realizar así lo requieren. El sitio más apropiado

para obtener sangre capilar es la yema del dedo. En los niños más pequeños,

es más conveniente obtenerla del talón ó del dedo pulgar del pie. Los detalles

relativos a los recipientes y portaobjetos que se utilizan, se indican a continua-

ción.

VENTAJAS.

- Facilidad con que puede obtenerse

- Especialmente útil en pacientes geriátricos y en niños, en particular, recién

nacidos.

DESVENTAJAS.

- Sólo logra obtenerse una pequeña cantidad de sangre que puede ser insufi-

ciente.

- Es un método por lo general tardado y que tiende a provocar hemólisis de la

muestra

- En pacientes inmunocomprometidos puede provocar infecciones, ex-

cepto cuando se realiza la punción después de 8 a 10 min. de contacto

con la piel con un buen antiséptico.

II.- OBTENCIÓN DE SANGRE VENOSA

Es el principal método de extracción de sangre en el laboratorio de análisis clí-

nicos, ya que es relativamente fácil de realizar.

VENTAJAS.

- Nos permite hacer múltiples exámenes y en repetidas veces si se desea,

con la misma muestra. Las alícuotas de plasma y suero pueden congelarse

para futura referencia.

DESVENTAJAS

- Puede provocar la coagulación de la sangre si el procedimiento lleva mucho

tiempo.

- Algunos componentes no son estables en sangre anticoagulada.

- Puede dificultarse en niños, pacientes obesos ó en estado de shock.

- Puede ocasionarse hemólisis de las muestras afectando ciertas determina-

ciones, por las siguientes causas:

Por forzar el paso de la sangre al tubo

Por agitar el tubo enérgicamente

Por extraer sangre de un hematoma

Anticoagulantes Empleados.

Estas sustancias impiden la formación de coágulos. El mecanismo por el

que se evita la coagulación, varía según el anticoagulante; por ejemplo, EDTA,

citrato y oxalato se unen con el calcio, mientras que la heparina impide la

conversión de protrombina en trombina.

Los tubos deben invertirse varias veces para asegurar la mezcla adecuada

después e la recolección, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

El sitio más práctico para obtener sangre venosa es la flexura anterior del

brazo, de preferencia justo por arriba de alguna de las ramas venosas que allí

se encuentran. Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son

las más comunes para la venopunción.

Las tres venas principales que se utilizan son:

1) vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del

pulgar de la mano; 2) vena basílica, ubicada en la parte inferior del antebrazo

y del lado del dedo meñique de la mano; y 3) vena cubital mediana, que co-

necta las venas basílica y cefálica en la fosa antecubital ( flexión del codo) y

es la vena de elección. Si el paciente aprieta el puño después de aplicar el tor-

niquete, la vena se tornará más prominente.

El torniquete facilita la obtención. En los niños pequeños se pueden utilizar

otros sitios; si es así, es mejor que la sangre la obtenga alguna persona con ex-

periencia. Usar una aguja puntiaguda, nunca menor de calibre 21 y una jerin-

ga de 5 ml ó de 10 ml.

Tanto la aguja como la jeringa deberán estar limpias, secas y estériles.

MATERIALES

Materiales de Laboratorio

CANTIDAD DESCRIPCIÓN

1 Tubos de recogida de muestras con EDTA

1 Aguja de Vacutainer

1 Contenedor de Vacutainer

1 Lanceta

1 Torundas de algodón con alcohol isopropílico

1 L igadura

PROCEDIMIENTO.

A.- PUNCIÓN CAPILAR

A.1. Indicaciones.

En lactantes, se realiza en la superficie plantar interna ó externa del talón. En

niños de más de un año, en la superficie palmar de la última falange del se-

gundo, tercero ó cuarto dedo de la mano. La punción no deberá realizarse en

una parte edematosa ó congestionada, ó donde la piel se encuentra fría y cia-

nótica.

A. 2. Identificación del Paciente

Asegurarse de que el paciente llegue en condiciones óptimas y tranquilizarlo.

Colocar al paciente adecuadamente.

Checar el material para la extracción:

A. 3. Técnica.

1. Limpiar cuidadosamente la piel en el sitio de punción y a su alrededor con

algodón mojado en algún desinfectante , como alcohol de 70%.

2. Secar el área con gasa estéril seca.

3. Puncionar con una lanceta estéril ó aguja desechable. El movimiento debe

ser rápido y la punción suficientemente profunda para asegurar que la sangre

fluya libremente. La salida de la sangre puede facilitarse ejerciendo una sua-

ve presión en la cara lateral del dedo. A corta distancia del sitio de pun-

ción.

4. La sangre deberá fluir libremente. Si se ejerce demasiada presión, se diluirá

con los líquidos tisulares, lo que la puede hacer inapropiada para estudio.

5. Descartar siempre la primera gota de sangre, limpiándola con una gasa

seca y dejar el sitio de punción limpio y seco.

6. Obtener la cantidad requerida de muestra, aspirando la sangre con pi -

peta ó colocándola en un portaobjetos.

B.- PUNCIÓN VENOSA

B.1 Indicaciones.

Debe indicarse al paciente la posición correcta, que puede ser sentado ó recos-

tado, apoyando bien el brazo en posición horizontal.

Elegir la vena adecuada, prefiriéndose la cubital mediana, la vena basílica, la

cefálica, las venas de la muñeca, tobillo y mano, ya que resultan fáciles de

palpar.

B.2 Técnica

1. Se identifica al paciente comprobando que la solicitud de exámenes corres-

ponda al mismo

2. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que efectivamente

el paciente no ha ingerido alimentos

3. Hay que dirigirse al paciente e informarle sobre el procedimiento a que va a

ser sometido. Se debe tranquilizarle, eliminando en lo posible su tensión.

4. Se ha de colocar adecuadamente al paciente, según éste se encuentre sen-

tado, o en decúbito prono, para tener acceso fácil y cómodo a la fosa antecubi-

tal.

5. Hay que preparar todo el material, incluidos los tubos para recogida de la

muestra, el torniquete, los objetos que se emplean para limpiar la piel, las jerin-

gas, cuando sea necesario, la aguja estéril para extracción de sangre y disposi-

tivo utilizado para fijar la aguja al tubo de extracción al vacío.

6. Se solicita al paciente que cierre el puño para que las venas resulten más

palpables.

7. Se selecciona una vena adecuada para la punción. Se prefieren las venas

de la fosa antecubital, en particular la cubital interna y la cefálica. También pue-

den utilizarse las venas de la muñeca, el tobillo y la mano.

Si existiera ya un catéter intravenoso en un brazo, se utilizará el otro para la ex-

tracción de la muestra.

8. Preparar la cápsula insertando la aguja pero dejando un poco flojo la capu-

cha de la parte externa de la misma para retirarlo al momento de la punción.

9. Se aplica un torniquete varios centímetros por encima de la zona de punción

(aproximadamente a cuatro dedos sobre el doblez del brazo). No hay que dejar

nunca el torniquete más de 1 minuto. En casos excepcionales no debe usarse

el torniquete, por ejemplo cuando en el pedido está el Calcio.

10. Se limpia la zona de la venopunción con una torunda embebida en solución

en alcohol antiséptico. Se comienza en el punto de la punción y se prosigue la

limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento en espiral. Se deje que la zona

se seque y no se toca con ningún objeto que no haya sido esterilizado previa-

mente.

11. Se fija firmemente la vena tanto por encima como por debajo del lugar de

punción, con la ayuda de los dedos pulgar y medio, o índice y pulgar.

12. Se realiza la venopunción.

a) Se penetra a través de la piel con la aguja formando un ángulo de aproxima-

damente 15º con el brazo y con el bisel hacia arriba. Se sigue la dirección de la

vena con la aguja.

b) Se introduce la aguja con suavidad pero con la suficiente rapidez para redu-

cir las molestias del paciente. No hay que enterrar la aguja.

c) Si se utiliza una jeringa, se tira hacia atrás del émbolo, con tensión lenta y

uniforme a medida que la sangre va fluyendo en su interior.

No debe realizarse este movimiento con excesiva rapidez, ya que podría hemo-

lizarse la sangre o colapsarse la vena.

d) Si se utiliza un tubo al vacío, en cuanto la aguja haya penetrado en la vena,

se dirigirá el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujeción. Al

mismo tiempo se sujeta tenuemente la aguja en su lugar. Una vez que haya lle-

nado el tubo, se retira, cogiéndolo por su extremo y tirando suavemente de él.

13. Cuando la sangre comience a fluir, se suelta el torniquete.

14. Una vez que se haya extraído toda la muestra, hay que indicar al

paciente que relaje el puño y que no bombee con la mano.

15. Se coloca suavemente sobre el punto de la punción una bola de algodón

estéril. Se extrae la aguja y a continuación se ejerce presión sobre la zona.

16. Se venda el brazo. En general es suficiente una tira de esparadrapo sobre

la bola de algodón, para detener la hemorragia.

17. Se mezclan los tubos con el anticoagulante.

18. Se comprobará el estado del paciente; por ejemplo, si se ha mareado y si la

hemorragia está controlada.

19. Se elimina el material contaminado: agujas, jeringas, algodones, etc.

20. Se marcan las etiquetas y se registra la hora en que se extrajeron las

muestras.

21. Se envían los tubos de sangre para su análisis a los correspondientes de-

partamentos del laboratorio. Si es preciso, se hace constar la hora en la solici-

tud.

HEMOGRAMA

Es uno de los análisis de laboratorio más frecuentemente solicitado por los mé-

dicos para el diagnóstico, evaluación y seguimiento de muchos padecimientos,

especialmente en los casos de enfermedades hematológicas. Además de servir

para monitorear los valores de los diferentes elementos de la sangre cuando

así se requiera.

Actualmente el hemograma o biometría hemática se realiza a través de equi-

pos automatizados, como el utilizados en nuestro laboratorio, Contador

Hematológico Ssmex 4000i, los cuales en corto tiempo proporcionan al médico

20 o más parámetros, contando con la observación del Tecnólogo Médico,

quien revisa al microscopio las posibles anormalidades de las diferentes líneas

celulares al enviar el equipo diferentes banderas de alarma.

Es importante tener en cuenta que los elementos celulares que se encuentran

en la sangre no siempre reflejan la verdadera situación de los órganos produc-

tores de las células sanguíneas, por lo que, en muchas ocasiones, el médico

solicita otros estudios para llevar a cabo un diagnóstico.

Definición: El hemograma completo (por su sigla en inglés es CBC) es la prue-

ba de laboratorio en la se van a cuantificar y evaluar diferentes grupos celula-

res, las glóbulos rojos (eritrocitos), los glóbulos blancos (leucocitos), las

plaquetas, el contenido de hemoglobina, y otros parámetros relacionados con

su cantidad, forma y contenido, de los cuales les estaremos hablando en otros

apartados.

Utilidad Clínica: Ayuda a diagnosticar problemas específicos de la sangre

como la anemia y otros trastornos como determinados cánceres como las leu-

cemias; permite a monitorizar la pérdida de sangre y la respuesta de un pacien-

te a la terapia contra el cáncer, como la quimioterapia y la radioterapia; permite

sospechar cuadros agudos infecciosos y/o inflamatorios, y así, su utilidad clí-

nica resulta invaluable.

El hemograma de Shilling constituye uno de los exámenes de laboratorio más

usados en el campo de la hematología. Comprende las siguientes prue-

bas:

RECUENTO DE LEUCOCITOS

Método manual

1) Agregar 20 ml de sangre a un tubo de ensayo conteniendo 0,38 ml de solu-

ción de Türk. Esta solución contiene acido acético al 1 % en agua destilada y el

agregado de una punta de espátula de azul de metileno.

2) Homogeneizar la mezcla.

3) Cargar las cámaras de recuento, procediendo tal como se realizó para el

caso del recuento de hematíes.

4) Ubicar el reticulado de la cámara con bajo aumento, constatar la ausencia

de burbujas y que la distribución sea regular.

5) Aplicando mayor aumento se procede al recuento de los elementos

presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cámara. Las cuentas

de los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En caso con-

trario debe cargarse nuevamente la cámara.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica

nuevamente el recuento empleando una dilución 1:10. Si por el contrario el nú-

mero resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

6) Cálculo:

Donde: m=número de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de

superficie y d=dilución utilizada

Valores de referencia

Adultos 4.000 - 11.000 / mm3

Recién nacidos 10.000 - 25.000 / mm3

Niños de 1 año 6.000 - 18.000 / mm3

Niños de 4 a 7 años 6.000 - 15.000 / mm3

Niños de 8 a 12 años 4.500 - 13.000 / mm3

DETERMINACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA:

RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

1) OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota

pequeña de sangre (1-2 mm) recién obtenida, ya se trate de punción digital, o

del talón (en pediatría) o de la última gota de sangre extraída con la jeringa y

que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes

porque altera la morfología de las células.

Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los

ángulos (extensor), se realiza la extensión de la gota de sangre: conservando

un ángulo menor de 45° respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se

apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que

la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avan-

za con firmeza y no muy rápidamente. Así se obtiene una fina película de san-

gre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rápidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las células.

Un extendido así obtenido poseerá tres áreas de diferente espesor y con

distribución también distinta de leucocitos:

1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto

de partida de la extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del núme-

ro de linfocitos.

2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en

ésta se observa un exceso de granulocitos y monocitos.

3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las

células.

2) COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

Se deben teñir con una de las tinciones de Romanowsky las cuales varían en

sus propiedades de tinción, y por lo tanto, es importante seleccionar una y fa-

miliarizarse con ella.

La coloración de Wright es muy confiable y sencilla, pero otras también lo

son, tales como la de Giemsa. Leishman ó May- Grünwald, las cuales son

igualmente satisfactorias, aunque puede variar la tinción de un lote a otro de

colorante.

PRINCIPIO Y METODOLOGÍA .

Los frotis de sangre deben confeccionarse con láminas portaobjetos de vidrio

que previamente se hayan lavado y secado de manera conveniente, con la fi-

nalidad de eliminar cualquier resto de grasa que pudiera quedar en ellos y

evitar así una mala calidad en la tinción. Los frotis de sangre son esenciales

para el estudio morfológico y cuantitativo de las células sanguíneas. . En un

frotis bien realizado, la tinción será de mejor calidad.

TINCIÓN DE WRIGHT

La finalidad de la tinción de Wright es lograr que el alumno se sienta

capacitado para preparar adecuadamente algunos de los reactivos y colorantes

más comúnmente empleados en las áreas de hematología y microbiología, que

como químico clínico tiene la obligación de conocer y dominar.

Técnica: Tinción de Wright.

1. Seleccionar un portaobjetos nuevo de 25 X 75 mm para hacer ex-

tendidos, que tenga la orilla relativamente lisa.

2. Obtener una pequeña cantidad de muestra de sangre periférica.

3. Colocar una pequeña gota de sangre a 2 ó 3 mm de la orilla de un portaob-

jetos limpio y seco. Colocar el portaobjetos para hacer extendido en un ángulo

de 30 a 45 grados con respecto al portaobjetos que tiene la muestra y hacer

contacto con la gota.

4. El extendido de sangre se seca con el aire. Una vez seco, se escribe con lá-

piz el nombre del paciente en una orilla del portaobjetos.

5. Cubrir el portaobjetos completamente con el colorante. Después de 1 minu-

tos añadir un volumen igual de amortiguador. Soplar ligeramente para mezclar

uniformemente. Aparecerá un brillo metálico verde.

6. Después de 5 minutos enjuagar cuidadosamente con agua de la llave ó

amortiguador de fosfatos, al principio con chorro delgado y suavemente y des-

pués con el chorro fuerte para eliminar todo exceso de colorante. Limpiar el re-

verso del portaobjetos en posición erecta. Cuando se haya

secado, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos rectangular y fijarlo con una

gota de líquido de montaje. Se puede usar sólo aceite de inmersión en una

preparación temporal.

Resultados Esperados.

Los resultados esperados en la tinción serán los siguientes: Hematíes en color

rosa.

Núcleos de los leucocitos de azul púrpura, con la cromatina y paracroma-

tina netamente diferenciadas.

Gránulos neutrófilos del citoplasma, lila ó violeta

Gránulos eosinófilos, rojo tirando a naranja.

Gránulos basófilos, púrpura tirando a azul oscuro.

Plaquetas, color lila oscuro.

Citoplasma de los linfocitos, azul claro. Citoplasma de los monocitos, ligero

azul.

HEMATOCRITO

Mide la fracción que comprende a los glóbulos rojos (masa globular), respecto

al volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar. Puede expresarse

en porcentaje o como valor decimal.

6.3.2 Método de microhematocrito

Materiales requeridos:

- Capilares rojos y azules (75 mm x 1,5 mm).

- Plastilina

Procedimiento:

♦ Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo

del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con

anticoagulante de Wintrobe o EDTA. Debe llenarse aproximadamente 70% -

80% del capilar.

♦ Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina.

♦ Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrífuga de

microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la pla-

taforma.

♦ Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm.

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comer-

cio.

Uso de la escala:

♦ Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de

eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismo nivel

de la línea horizontal correspondiente al cero.

♦ Desplace el tubo a través de la escala hasta que la línea marcada con el nú-

mero 1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigile que el fondo

de la columna de eritrocitos continúe sobre la línea cero. El tubo debe encon-

trarse completamente en posición vertical.

♦ La línea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicará la

fracción de volumen de éstos.

Valores de referencia: Hombres 40% - 50% Mujeres 38% - 44%

Niños (5 años) 38% - 44% Lactantes (3 meses) 37% - 42% Recién nacidos

50% - 58%

La disposición celular es:

Parte superior, una columna de plasma.

En la interfase están los leucocitos y plaquetas.

Parte inferior está la columna de Eritrocitos

GRUPO SANGUÍNEO Y FACTOR RH

Fundamento:

En 1.901, el investigador austríaco Landsteiner descubre la presencia de

ciertas sustancias (hoy identificadas como glucoproteínas) presentes en la

membrana de los glóbulos rojos, que pueden actuar como antígenos (es decir,

provocar la formación de anticuerpos, proteínas específicas que se aglutinarán

contra aquellas sustancias) en los individuos cuyos glóbulos rojos no presenten

las mismas glucoproteínas. Nace así el conocimiento de los grupos

sanguíneos, la explicación de la causa de los fracasos de tantas transfusiones

sanguíneas, y una vía hacia el conocimiento de las condiciones óptimas para

realizar transfusiones.

Los primeros grupos sanguíneos determinados son los que constituyen el lla-

mado sistema ABO:

- Los individuos del grupo A presentan en sus glóbulos rojos el antígeno (o

aglutinógeno) A, y pueden sintetizar anticuerpos (o aglutininas) o anti B, espe-

cíficas contra el aglutinógeno B.

- Los individuos del grupo B presentan en sus glóbulos rojos el aglutinógeno B,

pueden sintetizar aglutininas específicas o anti A contra el aglutinógeno A.

- Los individuos del grupo AB presentan glóbulos rojos con antígenos A y B, y

no elaboran ninguna aglutinina contra estos antígenos.

- Los individuos del grupo O no presentan aglutinógenos A ni B, y por tanto

pueden sintetizar aglutininas anti A y anti B.

Según esto se comprende que los individuos del grupo AB pueden recibir san-

gre de cualquier individuo (son receptores universales), mientras que sólo pue-

den donar a otros individuos del grupo AB. Las personas del grupo O

pueden dar sangre a cualquier individuo (son dadores universales), pero sólo

pueden recibirla de otra persona del grupo O.

En 1.927 se descubrieron nuevos antígenos en los glóbulos rojos, e incluso lle-

gó a descubrirse que el antígeno A constaba de dos fracciones: A y A .

En 1.940, Landsteiner y sus colaboradores descubrieron un nuevo antígeno

que sí que afectaba fuertemente a la viabilidad de las transfusiones: el factor

Rh, así llamado porque se descubrió en sangre del mono Macacus rhesus. Los

individuos portadores de este antígeno son llamados Rh+ , y los que no poseen

este antígeno, Rh -. Estos últimos pueden elaborar una aglutinina contra el fac-

tor Rh, de ahí que un Rh+ puede dar sangre a otro Rh+ , pero no a un Rh -,

mientras que un Rh + puede recibir sangre de un Rh+ o de un Rh-

Posteriormente, se ha visto que el factor Rh consta en realidad de tres

antígenos, C,D,E; pero como el más activo de los tres es el antígeno D,

normalmente la determinación del tipo sanguíneo se hace teniendo en cuenta

solamente la presencia de este aglutinógeno.

Materiales:

- Portaobjetos

- Palillos

- Lancetas

- Suero “Anti – A”

- Suero “Anti – B”

- Suero “Anti D”.

-Lectina A1

Técnica:

1. Poner una gota de sangre en tres portaobjetos limpios. Añadir a uno de ellos

una gota de suero “anti A” a otro una gota de “anti B” y al otro una de “anti D”.

2. A continuación se une la gota de sangre con la del suero y si pasados unos

segundos, se produce aglutinación, es que el resultado es positivo.

3. Si es positivo en A, es del grupo A; si es positivo en B, es del grupo B; si lo

es en los dos, es del grupo AB; y si no lo es en ninguno, es del grupo O. Si

aglutina con el “anti

D” es Rh + y si no es Rh-.

VELOCIDAD DE ERITROSEDIMENTACIÓN

La velocidad de sedimentación es un examen hematológico que no está

incluido en el desarrollo de un hemograma; sin embargo, es una prueba muy

importante por su gran sensibilidad, pues resulta normal en las enfermedades

funcionales, así como en los procesos inactivos o estrictamente locales.

La diferencia de gravedad especifica entre eritrocitos y plasma ocasiona la pre-

cipitación de los primeros en el fondo del tubo que contiene sangre anticoagula-

da con una velocidad que es medida en determinada cantidad de tiempo.

MÉTODO DE WINTROBE

Fundamento

Al igual que el método de Westergren, este método mide la tendencia de los

eritrocitos a la sedimentación al colocar sangre anticoagulada en un tubo pe-

queño. Se lee la columna de plasma al cabo de una hora de reposo. Procedi-

miento

Se llena el tubo de Wintrobe con la aguja de Pasteur y se coloca en un soporte

de manera que quede completamente recto, observar a la hora que tanto han

descendido los glóbulos rojos, midiendo en esa distancia en la escala del tubo

de Wintrobe cuya marca superior sea cero.

Resultados

Medir los milímetros descendidos de glóbulos rojos mediante la columna de

plasma por encima del paquete globular.

Valores de referencia Hombres : 0 - 5 mm/hora Mujeres : 0 - 10 mm/hora

RECUENTO RETICULOCITOS

Los reticulocitos son glóbulos rojos inmaduros formados por ARN y

protoporfirina en el citoplasma.

Fundamento

Los reticulocitos contienen una fina red de ARN y protoporfirina que se puede

teñir con el azul de cresil brillante. Este colorante en combinación con una mis-

ma cantidad de sangre anticoagulada se mezcla y con la ayuda de la tempe-

ratura (baño maría) se produce la coloración de estos eritrocitos jóvenes visua-

lizándose en los frotices sanguíneos por microscopía.

Materiales

♦ Láminas portaobjetos.

♦ Tubos de ensayos de 12 x 75 mm.

♦ Embudo.

♦ Filtro de papel.

♦ Pipetas Pasteur con chupones.

♦ Contador manual (no imprescindible).

♦ Solución saturada de azul de cresil brillante (filtrada).

Procedimiento

♦ En el tubo de ensayo colocar dos gotas de sangre total con anticoagulante.

♦ Inmediatamente adicionar con la ayuda de una pipeta Pasteur la misma canti-

dad de colorante.

♦ Mezclar la solución.

♦ Se coloca luego en baño maría por espacio de 10 a 15 minutos.

♦ Se realizan frotices sanguíneos.

♦ Se lee con objetivo de 100x

Resultados

Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo de inmersión. Cuente cui-

dadosamente:

♦ Cantidad total de glóbulos rojos.

♦ Número total de reticulocitos que haya entre ellos.

El recuento se ha venido haciendo clásicamente de forma manual mediante la

observación en el microscopio óptico. El resultado se da en porcentaje sobre

cada 100 hematíes. Es más útil calcular el número de reticulocitos por litro, me-

diante la fórmula:

Observación

En la actualidad existe la posibilidad de hacer el recuento rutinario de forma au-

tomática en el Sysmex 4000 i, mediante aparatos específicamente diseñados al

respecto, bien a través de adaptaciones de los clásicos autoanalizadores para

hemogramas. En estos casos se puede conocer, además, las distintas propor-

ciones de reticulocitos según su grado de maduración, su volumen medio y el

índice de maduración.

Valores de referencia

Adultos 0,5 - 1,5% Al nacer 2,5 - 6,0%

Causas de aumento

El número de reticulocitos aumenta en todas las circunstancias en las que exis-

te un incremento de la eritropoyesis, tales como en la hemólisis, como respues-

ta a sangrados o tras el inicio de un tratamiento antianémico que ha resultado

eficaz.

Causas de disminución

Como la producción de reticulocitos es necesaria para compensar las pérdidas

fisiológicas de glóbulos rojos maduros, una disminución de su número es la ex-

presión de un estado arregenerativo o hiporregenerativo de la serie roja. Esta

circunstancia es típica de anemias aplásicas, anemias carenciales y

enfermedades inflamatorias y neoplásicas.

ESTUDIO DE LÁMINA PERIFÉRICA

Se debe considerar lo siguiente:

Calidad del frotis

Debe abarcar 80% de la lámina con cabeza, cuerpo y cola. Extensiones

gruesas dificultan la visualización e identificación celular, mientras que las del-

gadas originan una distribución anormal de los elementos.

Eritrocitos

Se estudia su tamaño, forma, color y si existen inclusiones o elementos

extraños como se verá más adelante.

Plaquetas

Estudiar tanto cualitativa como cuantitativamente, debiendo observarse de 3 a

10 plaquetas aproximadamente por 100 glóbulos rojos o varias plaquetas y gru-

pos ocasionales por campo. Visto con objetivo de inmersión, no debe existir

menos de una plaqueta por campo.

LEUCOCITOS

Determinar las proporciones de las distintas clases de leucocitos normales y

anormales en la sangre.

Procedimiento

Se examina la lámina a pequeño aumento para comprobar si los elementos ce-

lulares están bien distribuidos.

Si es favorable se examina con el objetivo de inmersión. La parte ideal para vi-

sualizar células para la fórmula leucocitaria es en la parte final del cuerpo y

comienzos de la cola, recorriendo la lámina de izquierda a derecha o de arriba

hacia abajo

Valores de referencia

Morfología normal de la tres series hemáticas.

TIEMPO DE COAGULACIÓN

El tiempo de coagulación es un estudio creado en 1939. Nos da un indicio

aproximado de la eficacia global del mecanismo intrínseco de la coagulación.

La prueba carece de valor para las insuficiencias ligeras de distintos factores,

porque basta con una pequeña cantidad de trombina para producir un coágulo

fibrina. Todavía es menos útil para las anomalías de las últimas etapas de la

coagulación.

PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

El tiempo de coagulación mide el intervalo de tiempo necesario para que una

muestra de sangre completa recién obtenida coagule in vitro a 37°C y evalúe

en forma general el mecanismo de coagulación intrínseco.

Dos son las finalidades más relevantes de este método:

Evaluar la función del sistema intrínseco de la coagulación sanguínea. Vigilar la

eficiencia de la administración de heparina.

MATERIAL:

Equipo de laboratorio.

- Baño María a 37°C

- Cronómetro

Material de Laboratorio.

CANTIDAD DESCRIPCIÓN

3 Tubos de vidrio de 12X75

1 gradilla

PROCEDIMIENTO. Método de Lee-White

Se extrae sangre venosa , la que debe ser perfecta, pues la contaminación

con linfa puede modificar los resultados.

Preparar el baño María a 37°C, colocando una gradilla dentro de él, con 3 tu-

bos de 12 X 75.

Se le realiza al paciente una punción de 3 ml poniendo en marcha el

cronómetro en el momento en que entra la sangre a la jeringa.

Terminada la punción, se deposita 1ml de sangre en cada tubo y se vigilan

cada 30 seg., inclinándolos suavemente y anotando el tiempo en que coagula

cada uno de ellos.

Se suman los tres tiempos, y se calcula el promedio, obteniendo así el resulta-

do.

Durante el proceso, evitar la agitación, que podría retardar el tiempo de coagu-

lación.

Valores de Referencia: 4-10 minutos

TIEMPO DE SANGRIA

El tiempo de sangrado es una medida de Integridad vascular y plaquetaria. Las

plaquetas se adhieren a la colágena expuesta ( subendotelial) y después entre

ellas, para formar un agregado que obtura la herida. Para la agregación plaque-

taria, también es necesario un factor del plasma: el factor de Von Willebrand.

PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

El tiempo de sangrado se mide determinando el tiempo necesario para que de-

jen de sangrar los pequeños vasos subcutáneos que han sido lesionados por

una Incisión estandarizada. Uno de los mayores problemas que confronta la

medición del tiempo de sangrado es la reproducibilidad. Por esta razón se han

desarrollado tres generaciones de pruebas, cada una con aumento en la estan-

darización de la herida en profundidad y longitud.

El método más antiguo es el de Duke, que consiste en hacer una punción del

lóbulo de la oreja con una lanceta estéril. La desventaja de este método es que

es muy difícil estandarizar la profundidad de la incisión. Además, si el paciente

tiene un serio problema hemorrágico, el sangrado en el tejido celular blando del

lóbulo de la oreja puede causar un hematoma grande.

Equipo de Laboratorio

- Cronómetro.

Material de Laboratorio

CANTIDAD DESCRIPCIÓN

1 Lanceta desechables estériles

1 Tiras de papel filtro

1 Torundas de algodón con alcohol

PROCEDIMIENTO

Técnica: Método de Duke.

1. Limpiar perfectamente el lóbulo de la oreja o la yema de un dedo con una

torunda con alcohol. Dejar secar.

2. Puncionar el sitio elegido con la lanceta, echando a andar al mismo tiem-

po, el cronómetro. La punción debe hacerse en un solo movimiento, introdu-

ciendo la lanceta hasta el fondo y sin hacer movimientos laterales de ésta para

no rasgar la piel o hacer más amplia la punción.

3. Sin tocar la piel, con una t'ra de papel filtro, secar la gota de sangre que

salga por el sitio de pund6n cada 30 segundos, hasta que ea papel flltro ya no

absorba sangre.

4. Anotar el tiempo en que deje de sangrar . Ventajas: es muy sencillo de

realizar .

Desventajas: Las condiciones de la prueba no son constantes, por lo tanto los

resultados son imprecisos.

4.3 Valores de Referencia: Método de Duke: 1 a 4 minutos

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (PTTK)

Principio

Esta prueba mide la fase intrínseca de la coagulación, en presencia de

una“tromboplastina parcial” (cefalina), la cual sustituye la acción del factor pla-

quetario tres. Se obtiene máximo efecto de contacto por la adición del

kaolín.

Materiales:

♦ Plasma citratato del paciente.

♦ Plasma citratado control.

♦ Cefalina kaolín (comercial).

♦ Cloruro de calcio 0,025 M.

♦ Pipetas automáticas de 0,1 mL.

♦ Cronómetro.

Método:

♦ Precalentar el cloruro de calcio a 37 ºC en baño maría por 5 minutos.

♦ En un tubo de 12 x 75 mm a 37 ºC, añadir 0,1 mL de plasma y 0,1 mL de la

solución de cefalina kaolín previamente agitada. Accionar el cronómetro. Agitar.

Incubar a 37 ºC por 10 minutos.

♦ Añadir 0,1 mL de cloruro de calcio (Ca Cl2). Accionar el segundo cronómetro.

Agitar los tubos suavemente a intervalos de 10 segundos, hasta 30 segundos,

y agitar rápidamente hasta la formación del coágulo. Anotar el tiempo.

♦ Estudiar el plasma del paciente y control por duplicado. Varias pruebas pue-

den ser realizadas simultáneamente a intervalos de dos minutos.

Resultados

Se anota el tiempo que tarda en coagular.

Interpretación

El PTTK es una prueba importante de despistaje, detectando las deficiencias

más insignificantes (debajo de 25% de los niveles normales) de los factores XII,

XI, IX, VIII, X, V. Esta prueba es mucho más sensible que el TCST para la de-

tección de estas deficiencias. Su utilidad más importante es en la detección de

las deficiencias congénitas de los factores VIII y IX. No detecta deficiencias del

factor plaquetario tres y factores VII y XIII. Esta prueba está alargada también

en presencia de heparina.

Valores de referencia

De 30 a 45 segundos. Observación

En el mercado existen varios preparados comerciales. Si se utiliza cualquiera

de estos preparados, seguir estrictamente las indicaciones del fabricante.

TIEMPO DE TROMBINA

Principio

Mide el tiempo durante el cual el fibrinógeno presente en el plasma se transfor-

ma en fibrina por la adición de una cantidad estandarizada de trombina. Explo-

ra la última fase de la coagulación con excepción del factor XIII.

Material

♦ Plasma citratato del paciente.

♦ Plasma citratado control.

♦ Trombina en solución salina 0,9% diluir con 6 mL.

♦ Cronómetro.

Método

♦ Colocar en un tubo de 12 x 75 mm en baño maría a 37 ºC 0,2 mL de plasma.

♦ Incubar un (1) minuto.

♦ Añadir 0,1 mL de trombina y poner en marcha el cronómetro.

♦ Medir el tiempo de coagulación.

♦ Hacer igual con plasma control normal (ambos por duplicado).

Resultados

Se anota el tiempo que tarda en coagular.

Interpretación

Son causas comunes de prolongación del tiempo de trombina: presencia de he-

parina o aumento de los productos de degradación del fibrinógeno/fibrina, hipo-

fibrinogenemia, disfibrinogenemia o presencia de una paraproteína que in-

terfiera con la polimerización del fibrinógeno.

Valores de referencia

De19 ± 2 segundos.

TIEMPO DE PROTROMBINA (Prueba de Quick)

Principio

Mide el tiempo que tarda en coagular una muestra de plasma, desprovisto de

plaquetas y anticoagulado con citrato sódico, al ponerlo en contacto con una

suspensión de tromboplastina cálcica (sustituto de la tromboplastina tisular fi-

siológica). El resultado se da en porcentaje referido al de un plasma testigo.

Según la relación:

La prueba de Quick también se conoce con el nombre de tiempo de protrombi-

na, explora la vía extrínseca y común de la coagulación en las que intervienen

los factores I (fibrinógeno), II (protrombina), V, VII y X.

Es una prueba de gran interés y muy utilizada con fines de screening,

diagnóstico y control del tratamiento con anticoagulantes orales.

Materiales

♦ Plasma citratado del paciente.

♦ Plasma normal de control.

♦ Pipetas de 0,1 mL y 0,2 mL.

♦ Cronómetro.

Método

♦ El tubo conteniendo la tromboplastina cálcica (Ortho) debe ser incubado a 37

ºC (dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).

En un tubo de 10 x 75 mm añadir 0,1 mL de plasma del paciente.

♦ Incubar a 37 ºC por 1 ó 2 minutos.

♦ Añadir 0,2 mL de tromboplastina previamente calentada en el tubo con el

plasma del paciente; simultáneamente, disparar el cronómetro. Mover el

tubo para mezclar los reactivos. Dejar el tubo en reposo a 37 ºC por

aproximadamente

8 ó 10 segundos.

♦ Remover el tubo del baño maría y mover el tubo por inclinación hasta que el

coágulo se forme. Anotar el tiempo.

♦ Repetir duplicado del paciente y control.

Resultados

Se anota el tiempo que tarda en coagular.

Interpretación

El tiempo de protrombina es expresado en segundos con el valor del control

(cada cual es la media de pruebas duplicadas). El valor del control (y paciente)

depende de la tromboplastina y de la concentración del citrato y hematocrito.

Un tiempo de protrombina prolongado indica deficiencia de los factores II, V,

VII o X también está prolongado en la hipofibrinogenemia y heparinemia.

El tiempo de protrombina es utilizado como una prueba de despistaje y también

como control para pacientes anticoagulados con drogas antagonistas de la vita-

mina K.

Valores de referencia: 12 a 14 segundos.

DIAGNOSTICO DE MALARIA

GOTA GRUESA

Es una técnica de rutina y consiste en una muestra de una gota de sangre con-

formada por numerosas capas en su mayoría de glóbulos rojos, los que son

deshemoglobinizados durante la coloración con giemsa. Esta concentración de

glóbulos rojos facilita la detección de los parásitos que pudieran estar

presentes en su interior en densidades bajas.

FROTIS:

Es una capa delgada, única de células sanguíneas, fijadas con metanol y colo-

readas con giemsa, que facilitan la observación de las características morfoló-

gicas de los parásitos presentes en los glóbulos rojos.

El examen en ambos casos (gota gruesa y frotis) se realiza con aumento de

1000x con aceite de inmersión.

OBTENCIÓN DE MUESTRA HEMÁTICA

En malaria, la muestra de sangre periférica se obtiene para preparar dos clases

de películas, una gruesa y una delgada (gota gruesa y frotis, respectivamente),

para su examen por microscopía directa.

La gota gruesa está conformada por numerosas capas de células sanguíneas,

en su mayoría glóbulos rojos, los que son deshemoglobinizados durante la co-

loración con Giemsa. Esta concentración de glóbulos rojos facilita la detección

de los parásitos que pudieran estar presentes en el interior de alguno de ellos

cuando la densidad es baja.

El frotis consiste en una capa delgada, única de células sanguíneas. Esto facili-

ta la observación de las características morfológicas de los parásitos presentes

en los glóbulos rojos, sobre todo para la identificación de la especie del parási-

to, cuando este no ha podido ser identificado por gota gruesa.

Además, el frotis debe ser utilizado siempre para rotular e identificar al

paciente.

Después que los datos del paciente han sido registrados en forma apropiada,

las muestras de sangre se procesan de la siguiente manera:

1. Sostener la mano izquierda del paciente, con la palma hacia abajo seleccio-

nar el tercer dedo a partir del pulgar o el dedo índice (EI dedo gordo del pie

puede ser utilizado en niños).

2. Limpiar el dedo con una pieza o torunda de algodón ligeramente humedecido

en alcohol, utilizando golpes firmes para retirar suciedad y grasa de la yema del

dedo.

3. Secar el dedo con un algodón limpio y seco, utilizando golpes firmes para

estimular la circulación de la sangre.

4. Sostener el dedo del paciente con la mano izquierda, tomándolo por sus la-

dos y manteniendo una suave presión sobre ellos para favorecer la salida de

sangre

5. Punzar el borde de la yema del dedo con una lanceta estéril y un mo-

vimiento rápido, presionar suavemente el dedo para extraer la primera

gota de sangre y limpiar con una torunda de algodón seco. Asegúrese que nin-

guna hilacha de algodón, que pueda mezclarse posteriormente con la sangre,

permanezca en el dedo

Trabajando rápidamente y manipulando láminas completamente limpias, colec-

tar la sangre de la siguiente forma:

a. Aplique suave presión al dedo para extraer una gota de sangre y colocarla

inmediatamente en contacto con el primer tercio externo de la superficie de la

lámina. El tamaño de esta gota se aproxima al tamaño de una cabeza de fósfo-

ro.

b. Presionar nuevamente el dedo y colectar una segunda gota de sangre más

pequeña que la primera, en el centro de la lámina, para realizar el frotis.

c. Limpiar la sangre restante del dedo con una torunda de algodón humedecido

en alcohol e indicar al paciente que presione esta torunda contra el lugar de la

punción por 5 minutos.

DESCRIPCIÓN DE GOTA GRUESA Y FROTIS

GOTA GRUESA

Una vez obtenida la muestra, realizar la gota gruesa de la siguiente manera:

utilizando uno de los ángulos de una segunda lámina (lámina auxiliar) esparcir

rápidamente la gota de sangre y extenderla uniformemente hasta formar una

gota gruesa de 1 cm de lado o de diámetro. La sangre no debe ser excesiva-

mente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferencia, realizar el

homogeneizado de la muestra en una sola dirección, en forma concéntri-

ca (de adentro hacia fuera o viceversa).

FROTIS

1. Utilizando la misma lámina auxiliar, ponerla en contacto con la superficie de

la lámina que contiene la gota central y hacerla correr firmemente a lo largo de

su borde en un ángulo de 45°. Asegúrese de que ocurra un contacto parejo con

la superficie de la lámina todo el tiempo que la sangre esté siendo esparcida,

de tal manera que el frotis sea homogéneo y fino. Siempre manipular las lá-

minas por los bordes o por una esquina para realizar el frotis.

2. Luego de haber secado el frotis, rotular con lápiz de carbón suave, escri-

biendo en la parte más gruesa el código, número y fecha de la muestra. No uti-

lizar bolígrafo para etiquetar la lámina. Dejar secar la

lámina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polvo, calor e

insectos.

3. Si no existiera centro de diagnóstico, envuelva la lámina seca en el formato

de registro del paciente y enviar al Laboratorio de Referencia tan pronto como

sea posible.

4. La segunda lámina utilizada para esparcir la sangre puede ahora ser utiliza-

do para el siguiente paciente y una segunda lámina limpia del paquete será

usado como lámina extensora.

El frotis se usa como herramienta auxiliar para discriminar entre las diferentes

especies

COLORACIÓN DE LA MUESTRA HEMÁTICA PARA EL DIAGNÓSTICO PA-

RASITOLÓGICO DE MALARIA

Antes de proceder a la coloración de la gota gruesa, fije el frotis sumergiéndolo

en metanol, por tres segundos y déjelo secar

Asegúrese de preparar el volumen de colorante diluido en cantidad suficiente

para las láminas que debe colorear

MÉTODO DE LÁMINA INVERTIDA

Este método de coloración se usa para colorear la gota gruesa y frotis de varias

láminas a la vez en una bandeja especial de coloración hecha de material acrí-

lico, la inversión de las láminas disminuye la probabilidad de precipitado del co-

lorante.

Procedimiento

Coloque la bandeja de coloración sobre una superficie plana (mesa de trabajo)

cerca del lavatorio o recipiente, de tal forma que facilite la eliminación de los lí-

quidos que se usarán en la coloración. Acomode las láminas que desea

colorear en forma invertida (con la muestra hacia abajo), espaciándolas

entre ellas de tal manera que pueda agregarse el colorante lámina por lámina

(dejar fluir el colorante por el borde de la lámina)

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS PARÁSITOS DE MALARIA

El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos

microscópicos óptimos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersión.

Una lámina puede declararse como negativa, sólo después de observar 100

campos microscópicos

sin haber encontrado parásitos. Si se encuentran parásitos, deben examinarse

también los 100 campos microscópicos; esto asegura detectar la posibilidad de

infección mixta (más de una especie presente en una muestra de sangre).

En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los pa-

rásitos

Examen del frotis de sangre

Este examen requiere mayor tiempo de observación en comparación con la

gota gruesa, debido a que la concentración de los elementos sanguíneos es

mucho menor.

Se debe realizar en las siguientes circunstancias:

a. Cuando no es posible examinar la gota gruesa por alguna razón (Ejemplo:

por ser muy pequeña).

b. Cuando no es posible identificar en la gota gruesa la(s) especie(s) de

Plasmodium.

El aspecto que debe presentar esta preparación al microscopio debe ser:

a. Fondo limpio y libre de residuos los eritrocitos deben estar teñidos de color

rosa pálido.

b. El núcleo de los leucocitos, de color morado oscuro y gránulos bien

definidos.

c. Los gránulos de Schüffner deben verse como un moteado en los eritrocitos

que contienen P. vivax.

d. La cromatina de los plasmodia se tiñe de color rojo grosella intenso y el cito-

plasma de azul violáceo o azul cielo.

DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD PARASITARIA

El resultado se deberá informar de la siguiente manera:

Cualquier número inferior a 40 parásitos en 100 campos debe escribirse el nú-

mero de parásitos encontrados en la lectura.

Si observó más de 40 parásitos, use la siguiente escala:

+/2 De 40 a 60 parásitos en 100 campos

+ Un parásito por campo en 100 campos

++ De 2 a 20 parásito por campo en 100 campos

+++ De 21 a 200 parásitos por campo en 100 campos

++++ Más de 200 parásitos por campo en 100 campos

REPORTE DE LA DENSIDAD PARASITARIA EN CASO DE MALARIA POR

P. falciparum

Si la infección malárica es por P. falciparum, además de la densidad parasita-

ria, se debe registrar las fases de desarrollo de la siguiente manera:

F = anillos únicamente

F y Fg = anillos y gametocitos

Fg = gametocitos únicamente

DIAGNOSTICO DE BARTONELLA

La efectividad y éxito del diagnóstico bacteriológico depende en gran medida

de la obtención y el transporte oportuno de las muestras al laboratorio, por

esta razón el equipo de salud involucrado debe entender la naturaleza

crítica de mantener la calidad de las muestras durante todo el proceso.

Tipos de muestra para el diagnóstico directo:

• Frotis sanguíneo de sangre periférica en láminas portaobjetos

OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE

Procedimiento

Para la obtención de muestras de frotis sanguíneo y sangre total seguir las

indicaciones del Manual de procedimientos de laboratorio para la obtención

y envío de muestras,

Errores comunes al preparar las muestras de frotis sanguíneo.

Se deben seguir las siguientes indicaciones para evitar errores:

• No colocar la cantidad adecuada de sangre en la lámina. El tamaño de la gota

para hacer el frotis sanguíneo, idealmente es una gota similar a aquella

formada cuando se hace una gota con una aguja hipodérmica Nº 21.

- Si la gota es muy grande el extendido será muy grueso, se formará una

película con varias capas superpuestas de células, la coloración quedará

oscura y durante el examen no se podrán observar las células que están por

debajo de otras y que podrían estar infectadas.

En caso contrario si la gota es muy pequeña, se obtendrá un frotis de

distribución pobre y no homogénea de las células, por lo tanto no se examinará

la cantidad adecuada de glóbulos rojos disminuyendo la posibilidad de

encontrar células infectadas.

• No usar láminas con grasa (sin lavar) para hacer el frotis. En estas láminas la

sangre se esparcirá en forma irregular, lo que dificultará la lectura.

• No usar láminas mal enjuagadas. Las láminas con algún rastro de detergente

pueden alterar el colorante en el momento de la tinción.

• No usar láminas con borde astillado o irregular para hacer el frotis. En este

caso la sangre se esparcirá irregularmente, el frotis no será homogéneo, y se

formarán muchas colas dificultando la lectura.

• No guardar las muestras inadecuadamente. Al dejar las muestras de frotis

expuestas al ambiente externo, la presencia de insectos, polvo, entre otros,

podrían dañar la muestra.

• No preparar las muestras sobre láminas rayadas. En este caso también se

producen extendidos irregulares y no homogéneos de la muestra de

sangre.

• No colorear las muestras mucho tiempo después de haberlas obtenido.

Esto dificulta la coloración de la lámina y por lo tanto se tienen resultados

insatisfactorios.

COLORACIÓN DEL FROTIS SANGUÍNEO CON GIEMSA

La coloración de Giemsa es una modificación de la coloración de Romanowsky,

está disponible en cualquier laboratorio y nos permite detectar los glóbulos

rojos infectados por Bartonella bacilliformis en sus formas bacilares,

cocobacilares o cocoides. La muestra debe ser fijada con metanol antes del

proceso de tinción.

Objetivo : Describir los procedimientos técnicos de tinción del frotis sanguíneo

mediante el método de la coloración Giemsa.

Materiales para la Coloración

• Colorante Giemsa (stock).

• Solución de trabajo (colorante diluido).

• Metanol.

• Varillas de vidrio para coloración.

• Bandeja.

• Frascos gotero.

• Papel de filtro.

• Pinza.

• Embudo.

• Reloj.

• Tampón fosfato.

PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIÓN DE LA MUESTRA SANGUÍNEA

• El frotis sanguíneo debe estar seco antes de la fijación, se puede acelerar

el secado empleando calor suave como el generado por una lámpara. Evitar

utilizar demasiado calor porque esto dificulta la coloración.

Muestras de frotis sanguíneo para coloración.

• Fijar el frotis sanguíneo sumergiendo la lámina en un frasco con metanol por

tres segundos. Sacarlo y dejar secar o colocar la lámina sobre una varilla de

vidrio y cubrir la superficie con metanol y dejar que se evapore por completo

(Figura 5).

Fijación de la muestra de frotis sanguíneo.

• Preparar el colorante diluido o solución de trabajo inmediatamente antes de

iniciar la coloración (ver anexo 1) y asegurarse que el volumen preparado sea

suficiente para las muestras que se va a colorear (aprox. 1 mL por lámina). Se

debe evaluar y ajustar el colorante de trabajo en función al estado y

características del colorante madre.

Filtrar la solución de trabajo con papel filtro

.

Coloración mediante lámina invertida

Este método se utiliza para colorear varias láminas al mismo tiempo y para

evitar o disminuir el precipitado del colorante sobre el frotis sanguíneo. Para

realizar este procedimiento se usa una bandeja especial de coloración de

material acrílico o de vidrio.

• Colocar a bandeja de coloración sobre una superficie plana de preferencia

cerca de un lavatorio

• Colocar las láminas fijadas con metanol que se van a colorear en forma

invertida, es decir, con la muestra del frotis hacia abajo.

• Entre lámina y lámina debe haber una distancia tal que permita correr o

agregar el colorante a cada una de las láminas.

• Vaciar el colorante de trabajo a la altura de cada lámina sobre la bandeja

y dejar fluir el colorante por debajo de cada una de ellas

En esta forma de coloración, el precipitado del colorante se va al fondo de la

bandeja quedando la superficie en contacto con el frotis, libre de precipitado.

• Dejar colorear por 15 - 20 minutos

• Descartar el colorante y lavar la lámina a chorro suave y continuo de agua de

caño hasta que arrastre todo el exceso de colorante.

• En este procedimiento el colorante de la bandeja puede ser reusado hasta por

tres veces.

• Colocar las láminas inclinadas en una gradilla para que escurra el agua y

dejar secar a temperatura ambiente.

OBSERVACIÓN Y LECTURA MICROSCÓPICA DE LOS FROTIS

SANGUÍNEOS

Para la lectura de las láminas es importante conocer el manejo y limitaciones

del microscopio y mantenerlo en buen estado.

En la lectura se debe tener en cuenta:

a) Índice de bacteriemia

b) Forma de las bacterias

En función a estos parámetros se deben emitir los resultados para el pronóstico

médico.

• Se lee de 50 a 100 campos por lámina con la muestra de frotis sanguíneo a

1000 aumentos (objetivo de 100x) con aceite de inmersión, buscando la

presencia de formas cocobacilares, bacilares o cocoides que se encuentran

dentro de los hematíes.

• Un frotis sanguíneo tiene tres partes cabeza, cuerpo y cola; entre el cuerpo y

la cola generalmente se encuentra una sola capa de células y los hematíes

están separados, buscar esta zona para la lectura de la muestra.

• Las formas cocoides se encuentran en pares o cadenas. Si se observa un

solo hematíe con forma cocoide es preferible revisar toda la lámina, es posible

que no sea la forma cocoide sino algún artefacto.

• En un frotis positivo, se observan hematíes deformados y muchas veces

toman la forma ameboide. de hematíes infectados, para lo cual se cuenta 100

hematíes y se determina cuántos están infectados.

• Si se observa que las células infectadas son más del 50%, se leerán 50

campos.

• Si se observa que las células infectadas son menos del 50%, se leerán 100

campos.

• Si se observa que el porcentaje de hematíes infectados es menor a 5%, se

debe leer toda la lámina.

• En el reporte se debe colocar las formas bacterianas observadas, ya sea

bacilar, cocobacilar o cocoide.

• En la fase aguda de la enfermedad se observan predominantemente formas

bacilares de color rojizo o violeta, separadas o en grupos dentro de los

hematíes; con menos frecuencia se ven formas cocoides.

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y RH

Un grupo sanguíneo es una forma de agrupar ciertas características de la san-

gre que dependen de los antígenos presentes en la superficie de los

glóbulos rojos y en el suero de la sangre.

Esta ha sido la base para que se pueda clasificar a la sangre en cuatro grupos

en cuanto al sistema ABO: grupo A, grupo AB, grupo B y grupo O; y en dos con

respecto al sistema Rh: Rh negativo o Rh positivo. Lo que a la postre trae ocho

grupos posibles por las combinaciones posibles entre ambos sistemas.

Material y equipo:

· 40 tubos de ensayo de 12 x 75

· 4 pipetas Pasteur

· 1 gradilla de unicel

· 3 tubos Vacutiner con muestra sanguínea anticoagulada con EDTA

· 1 tubo Vacutainer con muestra sanguínea sin anticoagulante

· Antisuero Anti-A, Anti-AB, Anti-B y Anti-D *

· Eritrocitos con antígenos conocidos A1, A2, B y O

· 1 centrifuga

Reactivos:

Antisuero A monoclonal Aspecto: transparente Color: azul

Antisuero B monoclonal Aspecto: transparente Color: amarillo

Antisuero D monoclonal Aspecto: transparente Color: incoloro

Técnica:

Método directo

1. Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguínea anticoagulada con

EDTA y el tubo Vacutainer con muestra sanguínea sin anticoagulante, a una

velocidad de 2500 r.p.m. por 10 minutos, pues se utilizaran plasma y eritrocitos

por separado.

2. Rotular los tubos de ensayo.

3. En cuatro tubos limpios hacer una dilución de 2-5 % de eritrocitos con solu-

ción salina, de cada muestra. La dilución tomara un color rojo tenue.

4. Colocar en cada tubo rotulado una gota de la dilución de eritrocitos prepara-

da y una gota de antisuero, según corresponda.

5. Al concluir lo anterior, llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo

15 segundos a una velocidad de 1000 r.p.m. para observar mejor la reacción

antigeno-anticuerpo (formación de un botón).

6. Por último leer los tubos, observando si hubo reacción o no, y correlacionan-

do los datos obtenidos con el método inverso para determinar el grupo sanguí-

neo.

Metodo inverso

1. Centrifugar los 3 tubos Vacutiner con muestra sanguínea anticoagulada con

EDTA y el tubo Vacutainer con muestra sanguínea sin anticoagulante, a una

velocidad de 2500 r.p.m. por 10 minutos, pues se utilizaran plasma y eritrocitos

por separado.

2. Rotular los tubos de ensayo

3. Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero según

corresponda y una gota de los eritrocitos con antigeno conocido.

4. Al concluir lo anterior, llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo

15 segundos a una velocidad de 1000 r.p.m. para observar mejor la reacción

antigeno-anticuerpo (formación de un botón).

5. Por último leer los tubos, observando si hubo reacción o no, y correlacionan-

do los datos obtenidos con el método inverso para determinar el grupo sanguí-

neo.

Resultados:

Interpretación:

Para el método directo la lógica fue: si en un tubo hay formación de botón

(reacción antigeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen

el antigeno que reacciona con los anticuerpos presentes en el antisuero para

ese tubo; y si no presentan aglutinación querrá decir que no corresponde el

antigeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero, o que el antigeno esta

ausente en esos eritrocitos. De ahí que pueda observarse que una muestra

sanguínea muestre un solo tipo de antígenos del sistema ABO sobre su mem-

brana (A o B), ambos antígenos (AB), o ninguno de ellos (O). lo mismo sucede

para el sistema Rh ; al presentarlo (Rh +) o no (Rh -).

Para el método inverso el razonamiento fue: si en un tubo hay formación del

botón (reacción antigeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente

ensayado tiene los anticuerpos que reaccionan con los eritrocitos con antigeno

conocido, los cuales sirven de reactivo para esta prueba. Por lo tanto una reac-

ción positiva en este método definitivamente indica que el paciente no tiene eri-

trocitos con antígenos que reaccionarían con los anticuerpos de su plasma. De

ahí que el método se le nombre inverso.

DETERMINACION DE SUBGRUPOS

Anti- A1Lectina

El sistema de grupos sanguíneos ABO sigue siendo el primero a tener en cuen-

ta en el momento de realizar una transfusión de sangre. Los antígenos A y B

son productos génicos fácilmente detectables y constituyen marcadores ge-

néticos de gran valor. Entre los individuos A, se distinguen 2 categorías: A1y

A2.

La diferenciación entre ambas se realiza mediante la utilización de anticuerpos

monoclonales y lectinas específicas de grupo sanguíneo Dolichos biflorus (anti

A1) y Ulex europaeus (anti H).

Uso: anti-A1 Lectin se utiliza para diferenciar células rojas A1 de otros subgru-

pos A en pruebas en tubo o en placa.

MATERIAL Y EQUIPO:

· Tubos de ensaye de 10/75 mm.

· Cronometro

· Marcador

· Centrifuga serológica

MUESTRA

· Células rojas de paciente

REACTIVO:

· Anti-A1 Lectin en gotero

TECNICA:

1. Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados.

2. Adicione una gota de una suspensión de eritrocitos bajo prueba del 3- 5%

en salina. Mezcle completamente el contenido del tubo.

3. Centrifugar de 15-30 minutos de 900-1000 rpm.

4. Agite suavemente el tubo y resuspenda el botón celular. Examine las reac-

ciones resultantes macroscópicamente. Registre resultados.

RESULTADOS ESPERADOS DE TIPIFICACION

DETERMINACION DE RH

INTRODUCCIÓN:

El factor Rh es una clase de proteína que se encuentra en los glóbulos rojos de

la sangre, cuando alguien tiene esa proteína se le considera “Rh Positivo”.

Cuando no la tiene es “Rh Negativo”. El factor Rh es hereditario y se transmite

en dos genes. El Factor Rh positivo es dominante, es decir si una persona tiene

un gen positivo y otro negativo, su factor Rh será positivo.

Esta prueba es importante en el diagnostico y estudio de la eritroblastosis

fetal, en la que los glóbulos rojos del niño se encuentran sensibilizados con

anticuerpo materno. Es útil también en el diagnostico de la anemia hemolíti -

ca adquirida (anticuerpos sobre los glóbulo rojos del mismo pacien -

te), así como la determinación de eritrocitos sensibilizados en sangre usa-

dos para transfusión.

Las dos clasificaciones más importantes para describir grupos sanguíneos en

humanos son los antígenos y el factor Rh. Las transfusiones de sangre entre

grupos incompatibles pueden provocar una reacción inmunológica que puede

desembocar en hemólisis, anemia, fallo renal, shock, o muerte.

MATERIAL:

· Tubos de ensayo de 12 x 75

· Pipetas Pasteur

· Gradilla

EQUIPO:

· Centrifuga

MUESTRA:

· Eritrocitos lavados 3-5% del paciente

REACTIVOS:

· Antisuero Anti-D

· Suero anti globulina humana.

· Antisuero D monoclonal Aspecto: transparente Color: incoloro

Suero anti globulina Humana Aspecto: transparente Color: verde

TÉCNICA: Determinación de Rh

· Prepare una suspensión de glóbulos rojos al 3-5 % en solución sali-

na. Los glóbulos deben ser lavados previamente 5 veces con el objeto de

eliminar las proteínas del plasma.

· Rotular 3 tubos, para la previa identificación de Rh.

· Ponga 1 gota de la suspensión lavada en cada tubo.

· Añada una gota de anti suero D monoclonal.

· Mezcle y centrifugue 15 seg. Y observe si hay aglutinación.

Detección de sangre Du

Nota: esta técnica se le realiza a los tubos problemas que no aglutinan .

· Los tubos que no tuvieron aglutinación en la determinación de Rh se in-

cuban 15 min, y posteriormente se lavan 3 veces con sol. Salina

· Previamente lavados se le agregan 2 gotas de suero de COOMBS.

· Centrifugar 15 seg y observar, desprender botón

INTERPRETACIÓN: Para el primer método: Aglutinacion: Rh positivo

No aglutinación: realizar prueba de detección de sangre Du.

Detección de sangre Du Aglutinación. D débil (Du positivo) No aglutinación:

Rh negativo

TEST DE COOMBS DIRECTO

El examen de Coombs directo se utiliza para detectar autoanticuerpos contra

los propios glóbulos rojos (GR) de un individuo. Es una prueba que sirve para

demostrar el revestimiento de los eritrocitos in vivo, (mientras los eritrocitos es-

tán circulando en el individuo). La prueba se realiza agregando directamente el

reactivo de Coombs a los eritrocitos, previamente lavados para eliminar otras

proteínas no fijadas a el; una prueba directa positiva significa que la relación

antígeno-anticuerpo ocurrió in vivo, es decir que la fijación del anticuerpo sobre

el antígeno se realizo en el organismo del individuo en estudio.

Las indicaciones principales de esta prueba son: diagnostico de enfermedades

hemolíticas, ictericia o anomalías en la apariencia de los glóbulos rojos bajo el

microscopio, ya que estos anticuerpos algunas veces destruyen los glóbulos ro-

jos y causan anemia; para investigar reacciones en transfusiones. Para investi-

gar la inducción de drogas en células rojas sensibilizadas, medicamentos (por

ejemplo, quinidina, metildopa, procainamida y otros) que pueden llevar a la pro-

ducción de estos anticuerpos.

OBJETIVO: Determinar la presencia de anticuerpos en la superficie de los gló-

bulos rojos del individuo.

MATERIAL

10 Tubos de 12/75

10 Pipetas Pasteur

1 Gradilla.

Centrífuga.

Baño María a 37°C.

MUESTRA:

Eritrocitos lavados de (3-5%) del donador o paciente. REACTIVO:

Suero de Coombs*

*Suero anti-globulina humana Lafon. Lote 406 Cad: 31/01/09. Color: verde. As-

pecto: transparente.

TECNICA:

Colocar en un tubo de ensaye dos gotas de suero de Coombs mas una gota de

globulos rojos (3-5%).

Centrifugar a 1000 rpm durante 20 seg.

Desprender el botón suavemente y buscar la presencia de aglutinación.

LECTURA:

Aglutina.- Prueba de Coombs directa es positiva.

No aglutina.- Prueba de Coombs directa es negativa

TEST DE COOMBS INDIRECTO

Las reacciones antígeno-anticuerpo pueden observarse in vitro por:

— Hemólisis: la unión antígeno-anticuerpo se traduce en lisis de los eritrocitos

en presencia del complemento (siempre que el anticoagulante empleado no

capture los iones Ca y Mg necesarios para la activación del complemento).

— Aglutinación: los anticuerpos que reaccionan en medio salino se conocen

como anticuerpos completos o aglutinantes (comúnmente tipo IgM).

MATERIAL

Tubos de ensay0.

Pipetas Pasteur.

Gradilla.

MUESTRA

Muestra de sangre con Anticoagulante EDTA.

MATERIAL Y REACTIVOS

Microcentrífuga.

Baño María ó Estufa.

Antisuero RO-Antiglobulina humana (Poliespecífico Anti IgG C-d)

Albummina bovina

TÉCNICA

Lavar los eritrocitos con solución salina (3 veces).

1. Agregar una gota de Eritrocitos Lavados O Rh + Diluido al 5% con solu-

ción salina 0.9%.

2. Agregar 2 gotas de suero de paciente .

4. Centrifugar y observar, anotar desprendimiento del botón.

AGLUTINACIÓN– Positivo

NO AGLUTINACIÓN - Lavar 3 veces

5.- Agregar 02 gotas de albumina

6. Incubar tubos a Baño maría a 37°C durante 20 min.

7. Centrifugar después de haber pasado el tiempo.

8. Desprender el botón de eritrocitos y observar.

AGLUTINACIÓN– Positivo

NO AGLUTINACIÓN - Lavar 3 veces.

9. Con solución salina 0.9% lavar los eritrocitos de los tubos q no tuvieron glu-

tinación 3 veces.

10. Decantar y agregar 2 gotas de reactivo de Coombs

AGLUTINACIÓN – Positivo

NO AGLUTINACIÓN - Lavar 3 veces.

INVESTIGACIÓN DE CÉLULAS LE

Fundamento

El lupus eritematoso diseminado es una enfermedad inflamatoria crónica del te-

jido conectivo que ocasiona cambios bioquímicos y estructurales en la piel, arti-

culaciones y músculo, por lo general con ataque de múltiples órganos. A la pos-

tre puede causar la muerte por insuficiencia de órganos vitales especialmente

los riñones.

En el lupus eritematoso se produce un anticuerpo de carácter antinuclear. Este

anticuerpo puede atacar a los neutrófilos. La célula se rompe y queda en liber-

tad el núcleo, convertido en una masa eosinofílica amorfa y de gran tamaño.

Esta masa es fagocitada por otro neutrófilo el cual ocupa casi todo el espacio

celular. La imagen que se presenta una vez hecha la tinción, es inconfundible y

recibe el nombre de células LE.

La técnica que se presenta a continuación intenta provocar el fenómeno celular

LE in vitro, lo que favorece su producción machacando el coágulo a través de

una fina malla. Sin embargo, ocasionalmente pueden presentarse las células

LE en otra enfermedad en la que también se producen anticuerpos antinuclea-

res, particularmente en las llamadas colagenopatías.

Finalidad

- Facilitar el diagnóstico de LE.

- Evaluar el tratamiento de la enfermedad

Método sin coágulo:

1- Sacar sangre al paciente, y colocar en frasquito con las perlasque posean 1 gota de

heparina.

2- Dejarlo rotar en el agitador por 30 minutos, o bien agitar vigorosamente por 5 a 10

minutos para generar la lisis del leucocitos.

3- Llevar la muestra a estufa de 37 ºC entre 1 a 4 horas, para darle tiempo a los leucocitos

enteros a fagocitar los restos de los lisados y que decanten los glóbulos del plasma.

4- Con la jeringa de aguja larga aspirar la capa de leucocitos, en la interface plasma-

glóbulos rojos y descargar dentro de 2 a 4tubos de macro hematocrito.

5- Centrifugar a muy baja velocidad (500-1000 rpm), por 5minutos.

6- Aspirar nuevamente con la jeringa la capa de leucocitos de los tubos, y descargar en los

portas, y realizar los extendido con extensor.

7- Colorear por el método de Wright y ver con objetivo de inmersión

Observación e interpretación:

Buscar los campos bien coloreados y con las células bien separadas, evitando lo

observación de células "pegoteadas" por efecto de la lisis y la extensión.

La prueba es positiva cuando se hallan leucocitos que fagocitaron restos nucleares de los

lisados, o bien los tenga adheridos en su superficie, que se notara por la diferencia de color

entre el resto nuclear y el núcleo de leucocito entero, y se informara "Se observan células

LE"

El "Fenómeno de Roseta" se debe a la adhesion de 2 o mas neutr ofilos a un resto nuclear.

Es raro de observar, y se debe diferenciar de las celulas "pegoteadas" propias de extendido.

La presencia de leucocitos vacuolados no indica necesariamente la presencia de células

LE, ya que fagocitaron cualquier resto celular.

La prueba no es totalmente especifica, debido a que enfermedades autoinmunes también

generan células LE, y no tiene gran sensibilidad, ya que es negativa en 30% de pacientes

con lupus.

ANEXOS