Los resultados obtenidos mediante PCR-DGGE muestran diversos patrones de comunidades bacterianas...
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Los resultados obtenidos mediante PCR-DGGE muestran diversos patrones de comunidades bacterianas entre individuos, que se mantienen estables e independientes del consumo moderado de vino. La cuantificación de bacterias totales mediante q-PCR se mantiene constante tras el consumo moderado de vino, sin embargo, los géneros Streptococcus, Neisseria y Actynomices muestran diferencias significativas en la proporción relativa frente a los voluntarios que no consumieron vino. La cavidad bucal está compuesta por cientos de especies de microorganismos diferentes, siendo en su mayoría bacterias, aunque aproximadamente sólo el 50% de estas especies se pueden cultivar. Diversos estudios han demostrado que existe un efecto entre los componentes del vino y la salud bucal, sin embargo, apenas existe información acerca de la modulación bacteriana por parte de los polifenoles del vino en la cavidad bucal. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar los posibles efectos del consumo moderado de vino tinto sobre la microbiota de la cavidad bucal a través de un estudio de intervención en humanos. A partir del ADN de las muestras de saliva obtenidas de un grupo de individuos sanos que habían estado consumiendo vino de forma moderada durante 28 días, se realizaron análisis de la población microbiana a través de la separación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), así como la cuantificación relativa de las diferentes poblaciones bacterianas por PCR cuantitativa (q-PCR). EFECTO DEL CONSUMO MODERADO DE VINO SOBRE LA MICROBIOTA DE LA CAVIDAD BUCAL Raquel Tabasco, Elvira Barroso, Tomás García-Cayuela, Irene Muñoz, M. Victoria Moreno-Arribas, Begoña Bartolomé, M. Carmen Martínez-Cuesta, Carmen Peláez y Teresa Requena Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid. E-mail: [email protected] Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (proyectos AGL2009-13361-C02-00 y CSD2007-00063 Consolider Ingenio 2010 FUN-C-FOOD), la Comunidad de Madrid (proyecto ALIBIRD P2009/AGR-1469) y CYTED (IBEROFUN 110AC0386). Raquel Tabasco agradece al Instituto Danone la concesión de una beca de investigación. RESULTADOS M icroorganism os Secuencia 5´-3´ Tam año de am plicón (bp) Eficiencia de prim ers (% ) F:CGGTGAATACGTTCYCGG R:GGW TACCTTGTTACGACTT F:TGGAAACAGRTGCTAATACCG R:GTCCATTGTGGAAGATTCCC F:CTCCTGGAAACGGGTGG R:GGTGTTCTTCCCGATATCTACA F:AGATGGACCTGCGTTGT R:GTGAACTTTCCACTCTCACAC F:A(C /T)C AAC C TG C C C TTC AG A R:CGTCCCGATTAACAGAGCTT F:GGTGTCGGCTTAAGTGCCAT C G G A(C /T)G TAAG G G C C G TG C F:CTGGCGCGGTATGGTCGGTT R:GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG F:C (A/T)AAC G C G ATAAG TAATC R :TG G TAAC ATAC G A(A/T)AG G G F:CTCCTACGGGAGGCAGCAG R:CACCCACAAACGAGGCAG F:GGAGTGGGTTGTACCAGAAGTAGAT R:AGGAGGTGATCCAACCGC Bacterias totales L actobacillus Bifidobacterium S treptococcus Haemophilus 142 86,8 90 120,5 95,9 95,3 92,6 109,4 V eillonella 140 103 273 Actinomyces P revotella, P orphiromonas, Bacteroides Neisseria F usobacterium 230 593 550 343 135 124 81,5 97,1 94,3 M icroorganism os Secuencia 5´-3´ Tam año de am plicón (bp) G radiente (% ) F:AACG CG AAG AACCTTAC+ G C R:CGGTGTGTACAAGACCC F:GGAAACAGGTGCTAATACCG R:ATCG TATTACCG CG G CTG CTG G CAC +G C F:GTTTGATCCTGGCTCAG R:CACCGCTACACATGGAG F:GGGTGGTAATGCCGGATG R :G CCACCG TTACACCG G G AA +G C F:CGGGTGCTICCCACTTTCATG R:GATTCTGGCTCAGGATGAACG F:AG ATG G ACCTG CG TTG T +G C R:GTGAACTTTCCACTCTCACAC F:A(C /T)C AAC C TG C C C TTC AG A R :C G TCCCG ATTAACAG AG CTT +G C F:CTGGCGCGGTATGGTCGGTT R :G CCG ACG TTG G AAG TG G TAAAG +G C F:G AACG CTAG CTACAG G CTT +G C R:CCAATGTGGGGACC 276 40-58 Bacterias totales 450 30-60 Lactobacillus 400 30-50 500 nested Bifdobacterium 500 40-55 1400 nested S treptococcus 550 25-50 V eillonella 343 40-70 Neisseria 103 30-70 Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides Tabla 1. Lista de cebadores para DGGE utilizados en este estudio. Tabla 2. Lista de cebadores empleados en el estudio y eficiencias obtenidas con cada pareja de cebadores a d 2 3 4 5 6 7 8 1 a d a d a d a d a d a d a d Perfiles microbianos de saliva obtenidos por PCR- DGGE Fig.1. PCR-DGGE con cebadores de bacterias totales Carriles 1, 2, 3 y 8: antes (a) y después (d) del periodo de consumo moderado de vino. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles (no consumidores de vino) Los perfiles microbianos de la saliva de los individuos antes y después del consumo moderado de vino, obtenidos por PCR- DGGE, no mostraron relación entre el consumo de vino y los perfiles de bandas. Las diferencias encontradas indican mayor variabilidad entre individuos que la que podría asociarse al consumo de vino. a d 2 3 4 5 6 7 8 1 a d a d a d a d a d a d a d S Fig.2. PCR-DGGE con cebadores específicos para Streptococcus. Se observa una banda mayoritaria y presente en todos los individuos, cuya secuenciación permitió su identificación como S. mitis - S. oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans, predominantes en la cavidad bucal. a d 2 3 4 5 6 7 8 1 a d d a d a d a d a d a d a Cuantificación de la microbiota bucal mediante q- PCR Fig.3. PCR-DGGE específicas para Veillonella El perfil de bandas obtenido para Veillonella muestra una mayor diversidad bacteriana, al igual que se observó en Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides y Neisseria, géneros mayoritarios en la cavidad bucal. Voluntarios Log ufc/ml ± desv. est INICIO Log ufc/ml ± desv. est FINAL Consumidores vino 8,37 ± 1,09 8,40 ± 1,56 Voluntarios controles 7,92 ± 1,16 7,70 ± 0,81 Tabla 3. Resultados obtenidos de la cuantificación de bacterias totales en saliva, empleando cebadores universales y una recta de calibrado con diluciones decimales de ADN de un cultivo puro de E. coli (Eficiencia = 93,3%, r 2 = 0,995, slope= -3,493). Los resultados estadísticos (Student- t) no mostraron diferencias significativas en el número total de bacterias de la saliva debido al consumo moderado de vino. Controles Consumidores de vino ND: no detectado D.E.: Desviación estándar Tabla 4. Resultados obtenidos de los ratios relativos de cada especie después de los 28 días de estudio en ambos grupos de voluntarios. La cuantificación relativa se calculó de acuerdo al método de Pftaffl et al. (2002). Los resultados del análisis por q-PCR de los géneros bacterianos, antes y después del consumo de vino, mostraron diferencias en la proporción relativa de Streptococcus (P=0,042), Neisseria (P=0,003) y Actynomices (P=0,003), asociadas al consumo moderado de vino. ESTUDIO DE INTERVENCIÓN Individuos sanos de ambos sexos Edad: 25-45 años No fumadores Sin tomar antibióticos en 6 meses •Periodo de lavado (15 días) •Periodo de consumo de vino (250 ml/día) durante 28 días MUESTRA DE SALIVA Recogida de muestras: Enjuague bucal con 15 ml de agua Centrifugación y recuperación del sedimento celular. Extracción del ADN genómico total: Rotura mecánica con bolas de vidrio Incubación a 70 ºC con buffer de lisis Kit NucleoSpin® Tissue CONCLUSIONES MATERIALES Y MÉTODOS INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO Voluntarios Lactobacillus Bifidobacterium Streptococcus Veillonella Prevotella Neisseria Fusobacteria Actynomices Haemophilus V5 0,64 0,86 0,87 0,75 1,36 2,23 1,80 0,64 1,08 V6 0,73 ND 1,04 0,68 0,58 0,83 0,53 1,06 1,71 V7 0,71 0,85 0,83 0,75 1,70 0,60 0,93 0,12 0,46 V8 0,84 0,38 0,71 2,27 1,47 6,82 1,92 ND 1,00 V9 1,08 1,41 1,17 1,41 1,59 0,55 1,51 0,97 0,94 V16 0,63 1,26 0,71 0,62 0,44 0,60 1,56 ND 3,74 V17 1,24 1,31 1,13 1,01 0,79 0,88 0,73 1,01 0,78 V28 1,21 3,87 1,30 0,57 0,90 1,93 0,66 1,22 1,56 M edia ± D .E. 0,88 ± 0,25 1,42 ± 1,14 0,97 ± 0,22 1,01 ± 0,58 1,10 ± 0,49 1,80 ± 2,13 1,20 ± 0,55 0,84 ± 0,40 1,41 ± 1,02 Voluntarios Lactobacillus Bifidobacterium Streptococcus Veillonella Prevotella Neisseria Fusobacteria Actynomices Haemophilus V1 0,90 0,47 1,08 1,36 1,22 1,60 1,33 2,11 0,67 V2 1,97 1,66 2,08 1,51 2,46 0,62 2,07 ND 1,68 V10 1,06 ND 1,25 0,98 0,83 0,55 1,00 ND 3,18 V11 0,64 ND 0,95 1,15 0,59 0,27 0,68 0,68 1,10 V12 1,11 ND 0,72 0,70 0,75 2,80 0,66 4,71 0,86 V13 1,16 1,32 1,51 2,24 0,73 0,40 1,19 5,01 0,51 V14 0,91 0,59 0,76 0,81 0,79 1,67 0,49 0,72 1,04 V15 0,99 0,46 0,28 0,57 1,01 0,46 0,62 3,54 0,47 V18 0,73 0,35 0,76 0,32 1,01 2,82 1,48 1,12 2,68 V19 1,08 1,58 1,06 1,02 0,83 0,66 0,66 0,73 0,50 V20 1,25 1,60 1,22 0,66 0,98 0,81 0,82 0,90 0,63 V25 0,67 0,37 0,79 2,07 2,32 1,10 1,70 0,94 0,85 V26 1,05 3,05 0,96 1,66 0,99 1,36 0,64 0,67 1,70 V27 0,76 1,48 0,71 0,80 1,03 2,31 0,89 0,66 1,34 M edia ± D .E. 1,02± 0,33 1,17 ± 0,83 1,01 ± 0,43 1,13 ± 0,57 1,11 ± 0,57 1,24 ± 0,88 1,02 ± 0,47 1,82 ± 1,65 1,23 ± 0,83
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Los resultados obtenidos mediante PCR-DGGE muestran diversos patrones de comunidades bacterianas entre individuos, que se mantienen estables e independientes del consumo moderado de vino. La cuantificación de bacterias totales mediante q-PCR se mantiene constante tras el consumo moderado de vino, sin embargo, los géneros Streptococcus, Neisseria y Actynomices muestran diferencias significativas en la proporción relativa frente a los voluntarios que no consumieron vino.
Los resultados obtenidos mediante PCR-DGGE muestran diversos patrones de comunidades bacterianas entre individuos, que se mantienen estables e independientes del consumo moderado de vino. La cuantificación de bacterias totales mediante q-PCR se mantiene constante tras el consumo moderado de vino, sin embargo, los géneros Streptococcus, Neisseria y Actynomices muestran diferencias significativas en la proporción relativa frente a los voluntarios que no consumieron vino.
La cavidad bucal está compuesta por cientos de especies de microorganismos diferentes, siendo en su mayoría bacterias, aunque aproximadamente sólo el 50% de estas especies se pueden cultivar. Diversos estudios han demostrado que existe un efecto entre los componentes del vino y la salud bucal, sin embargo, apenas existe información acerca de la modulación bacteriana por parte de los polifenoles del vino en la cavidad bucal.
El objetivo de este trabajo ha sido estudiar los posibles efectos del consumo moderado de vino tinto sobre la microbiota de la cavidad bucal a través de un estudio de intervención en humanos.
A partir del ADN de las muestras de saliva obtenidas de un grupo de individuos sanos que habían estado consumiendo vino de forma moderada durante 28 días, se realizaron análisis de la población microbiana a través de la separación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante (DGGE), así como la cuantificación relativa de las diferentes poblaciones bacterianas por PCR cuantitativa (q-PCR).
EFECTO DEL CONSUMO MODERADO DE VINO SOBRE LA MICROBIOTA DE LA CAVIDAD BUCAL
Raquel Tabasco, Elvira Barroso, Tomás García-Cayuela, Irene Muñoz, M. Victoria Moreno-Arribas, Begoña Bartolomé, M. Carmen Martínez-Cuesta, Carmen Peláez y Teresa Requena
Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid. E-mail: [email protected]
EFECTO DEL CONSUMO MODERADO DE VINO SOBRE LA MICROBIOTA DE LA CAVIDAD BUCAL
Raquel Tabasco, Elvira Barroso, Tomás García-Cayuela, Irene Muñoz, M. Victoria Moreno-Arribas, Begoña Bartolomé, M. Carmen Martínez-Cuesta, Carmen Peláez y Teresa Requena
Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid. E-mail: [email protected]
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (proyectos AGL2009-13361-C02-00 y CSD2007-00063 Consolider Ingenio 2010 FUN-C-FOOD), la Comunidad de Madrid (proyecto ALIBIRD P2009/AGR-1469) y CYTED (IBEROFUN 110AC0386). Raquel Tabasco agradece al Instituto Danone la concesión de una beca de investigación.
RESULTADOSRESULTADOS
Microorganismos Secuencia 5´- 3´Tamaño de
amplicón (bp)Eficiencia de primers (%)
F: CGGTGAATACGTTCYCGGR: GGWTACCTTGTTACGACTTF: TGGAAACAGRTGCTAATACCGR: GTCCATTGTGGAAGATTCCCF: CTCCTGGAAACGGGTGGR: GGTGTTCTTCCCGATATCTACAF: AGATGGACCTGCGTTGTR: GTGAACTTTCCACTCTCACACF: A(C/T)CAACCTGCCCTTCAGAR: CGTCCCGATTAACAGAGCTTF: GGTGTCGGCTTAAGTGCCATCGGA(C/T)GTAAGGGCCGTGCF: CTGGCGCGGTATGGTCGGTTR: GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAGF: C(A/T)AACGCGATAAGTAATCR: TGGTAACATACGA(A/T)AGGGF: CTCCTACGGGAGGCAGCAGR: CACCCACAAACGAGGCAGF: GGAGTGGGTTGTACCAGAAGTAGATR: AGGAGGTGATCCAACCGC
Bacterias totales
Lactobacillus
Bifidobacterium
Streptococcus
Haemophilus
142 86,8
90
120,5
95,9
95,3
92,6
109,4
Veillonella
140
103
273
Actinomyces
Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides
Neisseria
Fusobacterium
230
593
550
343
135
124
81,5
97,1
94,3
Microorganismos Secuencia 5´- 3´Tamaño de
amplicón (bp)Gradiente (%)
F: AACGCGAAGAACCTTAC+ GCR: CGGTGTGTACAAGACCCF: GGAAACAGGTGCTAATACCGR: ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC +GCF: GTTTGATCCTGGCTCAGR: CACCGCTACACATGGAGF: GGGTGGTAATGCCGGATGR: GCCACCGTTACACCGGGAA +GCF: CGGGTGCTICCCACTTTCATGR: GATTCTGGCTCAGGATGAACGF: AGATGGACCTGCGTTGT +GCR: GTGAACTTTCCACTCTCACACF: A(C/T)CAACCTGCCCTTCAGAR: CGTCCCGATTAACAGAGCTT +GCF: CTGGCGCGGTATGGTCGGTTR: GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG +GCF: GAACGCTAGCTACAGGCTT +GCR: CCAATGTGGGGACC 276 40-58
Bacterias totales 450 30-60
Lactobacillus400 30-50
500 nested
Bifdobacterium500 40-55
1400 nested
Streptococcus 550 25-50
Veillonella 343 40-70
Neisseria 103 30-70
Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides
Tabla 1. Lista de cebadores para DGGE utilizados en este estudio. Tabla 2. Lista de cebadores empleados en el estudio y eficiencias obtenidas con cada pareja de cebadores
a d2 3 4 5 6 7 81
a d a d a d a d a d a d a d
Perfiles microbianos de saliva obtenidos por PCR- DGGEPerfiles microbianos de saliva obtenidos por PCR- DGGE
Fig.1. PCR-DGGE con cebadores de bacterias totalesCarriles 1, 2, 3 y 8: antes (a) y después (d) del periodo de consumo moderado de vino. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles (no consumidores de vino)
Fig.1. PCR-DGGE con cebadores de bacterias totalesCarriles 1, 2, 3 y 8: antes (a) y después (d) del periodo de consumo moderado de vino. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles (no consumidores de vino)
Los perfiles microbianos de la saliva de los individuos antes y después del consumo moderado de vino, obtenidos por PCR-DGGE, no mostraron relación entre el consumo de vino y los perfiles de bandas. Las diferencias encontradas indican mayor variabilidad entre individuos que la que podría asociarse al consumo de vino.
a d2 3 4 5 6 7 81
a d a d a d a d a d a d a d
S
Fig.2. PCR-DGGE con cebadores específicos para Streptococcus.
Se observa una banda mayoritaria y presente en todos los individuos, cuya secuenciación permitió su identificación como S. mitis - S. oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans, predominantes en la cavidad bucal.
Fig.2. PCR-DGGE con cebadores específicos para Streptococcus.
Se observa una banda mayoritaria y presente en todos los individuos, cuya secuenciación permitió su identificación como S. mitis - S. oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans, predominantes en la cavidad bucal.
a d2 3 4 5 6 7 81
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Cuantificación de la microbiota bucal mediante q-PCRCuantificación de la microbiota bucal mediante q-PCR
Fig.3. PCR-DGGE específicas para Veillonella
El perfil de bandas obtenido para Veillonella muestra una mayor diversidad bacteriana, al igual que se observó en Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides y Neisseria, géneros mayoritarios en la cavidad bucal.
Fig.3. PCR-DGGE específicas para Veillonella
El perfil de bandas obtenido para Veillonella muestra una mayor diversidad bacteriana, al igual que se observó en Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides y Neisseria, géneros mayoritarios en la cavidad bucal.
VoluntariosLog ufc/ml ± desv. est
INICIOLog ufc/ml ± desv. est
FINAL
Consumidores vino 8,37 ± 1,09 8,40 ± 1,56
Voluntarios controles 7,92 ± 1,16 7,70 ± 0,81
Tabla 3. Resultados obtenidos de la cuantificación de bacterias totales en saliva, empleando cebadores universales y una recta de calibrado con diluciones decimales de ADN de un cultivo puro de E. coli (Eficiencia = 93,3%, r2= 0,995, slope= -3,493). Los resultados estadísticos (Student- t) no mostraron diferencias significativas en el número total de bacterias de la saliva debido al consumo moderado de vino.
Co
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no
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ND: no detectadoD.E.: Desviación estándar
Tabla 4. Resultados obtenidos de los ratios relativos de cada especie después de los 28 días de estudio en ambos grupos de voluntarios. La cuantificación relativa se calculó de acuerdo al método de Pftaffl et al. (2002).
Los resultados del análisis por q-PCR de los géneros bacterianos, antes y después del consumo de vino, mostraron diferencias en la proporción relativa de Streptococcus (P=0,042), Neisseria (P=0,003) y Actynomices (P=0,003), asociadas al consumo moderado de vino.
Los resultados del análisis por q-PCR de los géneros bacterianos, antes y después del consumo de vino, mostraron diferencias en la proporción relativa de Streptococcus (P=0,042), Neisseria (P=0,003) y Actynomices (P=0,003), asociadas al consumo moderado de vino.
ESTUDIO DE INTERVENCIÓNIndividuos sanos de ambos sexosEdad: 25-45 añosNo fumadoresSin tomar antibióticos en 6 meses•Periodo de lavado (15 días)•Periodo de consumo de vino (250 ml/día) durante 28 días
ESTUDIO DE INTERVENCIÓNIndividuos sanos de ambos sexosEdad: 25-45 añosNo fumadoresSin tomar antibióticos en 6 meses•Periodo de lavado (15 días)•Periodo de consumo de vino (250 ml/día) durante 28 días
MUESTRA DESALIVA
MUESTRA DESALIVA
Recogida de muestras:Enjuague bucal con 15 ml de agua Centrifugación y recuperación del sedimento celular.Extracción del ADN genómico total:Rotura mecánica con bolas de vidrioIncubación a 70 ºC con buffer de lisisKit NucleoSpin® Tissue
Recogida de muestras:Enjuague bucal con 15 ml de agua Centrifugación y recuperación del sedimento celular.Extracción del ADN genómico total:Rotura mecánica con bolas de vidrioIncubación a 70 ºC con buffer de lisisKit NucleoSpin® Tissue
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOINTRODUCCIÓN Y OBJETIVO
Voluntarios Lactobacillus Bifidobacterium Streptococcus Veillonella Prevotella Neisseria Fusobacteria Actynomices HaemophilusV5 0,64 0,86 0,87 0,75 1,36 2,23 1,80 0,64 1,08V6 0,73 ND 1,04 0,68 0,58 0,83 0,53 1,06 1,71V7 0,71 0,85 0,83 0,75 1,70 0,60 0,93 0,12 0,46V8 0,84 0,38 0,71 2,27 1,47 6,82 1,92 ND 1,00V9 1,08 1,41 1,17 1,41 1,59 0,55 1,51 0,97 0,94V16 0,63 1,26 0,71 0,62 0,44 0,60 1,56 ND 3,74V17 1,24 1,31 1,13 1,01 0,79 0,88 0,73 1,01 0,78V28 1,21 3,87 1,30 0,57 0,90 1,93 0,66 1,22 1,56
Media ± D.E. 0,88 ± 0,25 1,42 ± 1,14 0,97 ± 0,22 1,01 ± 0,58 1,10 ± 0,49 1,80 ± 2,13 1,20 ± 0,55 0,84 ± 0,40 1,41 ± 1,02
Voluntarios Lactobacillus Bifidobacterium Streptococcus Veillonella Prevotella Neisseria Fusobacteria Actynomices HaemophilusV1 0,90 0,47 1,08 1,36 1,22 1,60 1,33 2,11 0,67V2 1,97 1,66 2,08 1,51 2,46 0,62 2,07 ND 1,68V10 1,06 ND 1,25 0,98 0,83 0,55 1,00 ND 3,18V11 0,64 ND 0,95 1,15 0,59 0,27 0,68 0,68 1,10V12 1,11 ND 0,72 0,70 0,75 2,80 0,66 4,71 0,86V13 1,16 1,32 1,51 2,24 0,73 0,40 1,19 5,01 0,51V14 0,91 0,59 0,76 0,81 0,79 1,67 0,49 0,72 1,04V15 0,99 0,46 0,28 0,57 1,01 0,46 0,62 3,54 0,47V18 0,73 0,35 0,76 0,32 1,01 2,82 1,48 1,12 2,68V19 1,08 1,58 1,06 1,02 0,83 0,66 0,66 0,73 0,50V20 1,25 1,60 1,22 0,66 0,98 0,81 0,82 0,90 0,63V25 0,67 0,37 0,79 2,07 2,32 1,10 1,70 0,94 0,85V26 1,05 3,05 0,96 1,66 0,99 1,36 0,64 0,67 1,70V27 0,76 1,48 0,71 0,80 1,03 2,31 0,89 0,66 1,34
Media ± D.E. 1,02± 0,33 1,17 ± 0,83 1,01 ± 0,43 1,13 ± 0,57 1,11 ± 0,57 1,24 ± 0,88 1,02 ± 0,47 1,82 ± 1,65 1,23 ± 0,83
