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Clase III

Enzimas Son catalizadores biológicos de naturaleza proteica, ver figura 1, 2 y 3. ¿Cómo se realizan todas las actividades celulares? Mediante las enzimas, sustancias presentes en las células en cantidades muy bajas y capaces de efectuar cambios propios de los procesos celulares. Responsables de todas las reacciones químicas de la célula. Figura 1. Transcripción, transducción y síntesis de proteínas (1). El comercio de enzimas para uso industrial y doméstico asciende a centeneres de millones de dolares anualmente. Los enzimas industriales se utilizan en la producción de productos químicos y farmacéuticos. Recientemente su aplicación de enzimas inmovilizadas esta creciendo. Propiedades generales de los enzimas Tienen la especial capacidad de acelerar las reacciones químicas, sin alterarse como consecuencia de la reacción, son específicos y solo actúan en un determinado tipo de reacción. Como todos los catalizadores funcionan en una concentración molar mucho menor que la del reactivo sobre el cual funciona. Un mol de enzima facilita la conversión de muchos moles de reactivo en producto. Una molécula enzimática generalmente cataliza la conversión de 10 a 1.000 moléculas de sustrato/s. Con frecuencia estas

reacciones catalizadas por enzimas tienen lugar con velocidades de 1.000 a 1´000.000 de veces más rápidas que si no esta catalizada la reacción por la enzima. Se calcula que la ruptura de las proteínas en el proceso digestivo tardaría más de 50 años, en lugar de pocas horas sin la acción enzimática. Pueden ser: -Enzimas extracelulares o exoenzimas (funcionan fuera de la célula) -Enzimas intracelulares o endoenzimas (funcionan dentro de la célula) Propiedades Físicas y Químicas de los enzimas Son proteínas (secuencias de aminoácidos) que pueden tener unidos otros grupos químicos, se desnaturalizan con calor al igual que las proteínas, se precipitan en presencia de etanol o de aumento en la concentración de sales inorgánicas como sulfato amónico, no se difunden a través de membranas semipermeables o selectivas, ver figura 2 y 3.

Figura 2. Naturaleza de los enzimas (1). a) c) b) Figura 3. a) Estructura secundaria b) Estructura terciaria c)Estructura cuaternaria o funcional.

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Son moléculas muy grandes, su peso molecular oscila entre 10.000 y 1´000.000. Muchas están integradas a otra molécula orgánica de menor tamaño llamada coenzima, algunas coenzimas están integradas por una vitamina ejemplo las del grupo B, la parte proteíca se denomina apoenzima , unidas forman una haloenzima. A veces el grupo no proteico de un enzima es un metal, ejemplo el hierro de la catalasa, requiere de su adición para que se active. Estos iones constituyen coenzimas inorgánicas o cofactores. A veces se requiere de un cofactor y una coenzima para que actué un enzima. Se han extraído de la célula un buen número, son de eficiencia extrema al acelerar la transformación del sustrato en producto final, ver figuras 2,3,4 y 5.

Figura 3. Sustrato entrando en la enzima (1).

Figura 4. Complejo enzima-sustrato (1).

Figura 5. Catálisis (1)

Figura 6. Formación del producto (1). 1.000 moléculas de sustrato / s pueden transformarse por la acción de una molécula de enzima. Actividad molecular: número de moléculas de sustrato transformadas por molécula de enzima por minuto. Unidad de enzima: Cantidad de enzima g, mg, µg, capaz de catalizar la transformación de una cantidad de sustrato por minuto, a unas condiciones dadas de temperatura, pH, fuerza iónica. Katal: cantidad de enzima capaz de convertir una mol de sustrato en un segundo a unas condiciones dadas. No se gastan ni se alteran como consecuencia de la reacción, ver figura 6. Son inestables su actividad puede reducirse o desaparecer, dependiendo de

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diferentes condiciones físico-químicas, algunas se inactivan por pequeños cambios como la exposición a temperatura ambiente por corto tiempo. Características

1. Su alta eficiencia como catalizadores 2. Su alto grado de especificidad al sustrato,

un enzima determinado solo puede reaccionar con determinado sustrato o si acaso con un grupo de sustancias muy relacionadas químicamente.

Como los enzimas aceleran las reacciones La función principal de una enzima es rebajar el nivel de energía de activación necesario para que tenga lugar una reacción química. La energía de activación es la cantidad de energía necesaria para inducir en una sustancia un estado de reactividad. El enzima se combina con la sustancia (S) induciéndole una situación transitoria que requiere una menor energía de activación, para que tenga lugar la reacción, ver figura 7. Ley de rapidez para una reacción simple catalizada por un enzima. Considérese una reacción con un reactivo, el sustrato S, y un producto, P. S P (1) Si es catalizada por un enzima los sustratos y productos así como su concentración permanecen iguales. Lo que significa que la enzima acelera la reacción en dos sentidos E S P (2) Es por su unión con el sustrato que la enzima efectúa la conversión a producto, y esto puede expresarse como dos equilibrios

Figura 7. Como puede verse una reacción catalizada por un enzima tiene una energía de activación más baja y por tanto se necesita menos energía para que tenga lugar (2). Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas. Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

PEESSEK

K

K

K++ →

←→←

3

4

1

2 (3)

Las mediciones cinéticas más comunes de las reacciones catalizadas por enzimas son las de incremento uniforme en la concentración del producto que ocurre en una solución diluida de la enzima, a la cual se ha añadido un exceso de sustrato. Inmediatamente después de que E y S se mezclan , el producto comienza a formarse a una

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rapidez constante. Este incremento constante en la concentración del producto, d[P]/dt, se designa como v0, la “velocidad inicial en estado estacionario” . Se considera que v0 es una velocidad inicial porque solo se consume una proporción muy pequeña del sustrato mientras se están haciendo las mediciones, la [S] prácticamente es constante y la v0 que se mide corresponde al valor inicial de la [S]. La concentración de producto [P], será muy pequeña en las condiciones antes descritas. De esta manera puede pasarse por alto la reacción inversa de E con P para formar ES, luego la ecuación (3) se convierte en:

PEESSEKK

K++ →→

←31

2 (4)

En ambas ecuaciones (3) y (4) esta implícita la recirculación de E. por definición un catalizador no es consumido por la reacción que cataliza, explícitamente se representa en la ecuación (5)

PEESSEKK

K++ →→

←31

2 (5)

habrá una fase de inducción con una duración de una fracción de segundo antes de que se alcance la v0 en estado estacionario. Por lo general se ignora en la cinética de estado estacionario. La concentración total de E se define como E0, antes de que se añada el S E0=[E], una vez se ha añadido E0=[E] + [ES]. [ES] durante la breve fase de inducción aumenta hasta alcanzar su valor de estado estacionario y permanece constante, durante esta etapa de la reacción, cuando v0 se mide y es constante. Briggs y Haldane utilizaron la condición de estado estacionario de [ES] constante y la condición de concentración inicial de [S] constante para formular ecuaciones que relacionan v0 con las constantes cinéticas y las concentraciones de enzima y de sustrato. Debido a que el P solo puede formarse por desdoblamiento de ES, gobernado por la constante de velocidad K3, puede concluirse que la velocidad en las condiciones de velocidad inicial es:

[ ]ESkV 30 = (6)

Si se evalúa ES en términos de E0, [S] y las constantes cinéticas, la ecuación (6) dará el resultado esperado por Briggs y Haldane.

Figura 8 Modelo cinético de estado estacionario (3) Un valor constante para [ES] requiere que las velocidades de formación y degradación de ES sean iguales. La velocidad de formación de ES esta dada por k1[E][S]. Puesto que ES puede perderse en dos reacciones, desdoblándose en E+S ó E+P, la velocidad de degradación de ES está dada por la expresión [ ] [ ]ESES kk 32

+ . Al igualar las velocidades de formación y degradación se tiene que:

[ ][ ] ( )[ ]ESSE kkk 321 += Despejando las variables de las constantes y combinando estas últimas se tiene que:

[ ][ ][ ] kk

kkmES

SE =+

=1

32 (7)

Donde km se designa como la constante de Michaelis, en honor a quién desarrollo las primeras formas de la ecuación simple de cinética enzimática. Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura 8)

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Figura 9 Maud Menten, Leonor Michahelis Dado que en la ecuación (6) aparece [ES] y no [E], se sustituye E0 - [ES] por E en la ecuación (7) para obtener

[ ]( )[ ][ ] kE

mESSES

=−0

Resolviendo la ecuación para [ES] se tiene que:

[ ] [ ][ ] kE

mS

SES

+= 0 (8)

Sustituyendo en (6)

[ ]( )[ ] kEkV

mS

S+

= 030 (9)

Esta ecuación es una forma del resultado de Briggs y Haldane. Las reacciones catalizadas enzimáticamente presentan cinética de saturación En algunos experimentos, puede no conocerse la concentración de enzima E0, por lo que es conveniente sustituir el producto k3E0 por Vmáx, velocidad máxima.

[ ][ ] kVV

m

máx

SS

+=0 (10)

La justificación de esta versión modificada de la ecuación de Briggs y Haldane es que la velocidad

máxima se alcanzará cuando esencialmente toda la enzima este es forma es decir, cuando ES ≅ E0. Cuando la [S]=Km en la ecuación (10) el denominador de la ecuación será 2[S] y el numerador [S]Vmáx. Esto significa que la V0 será igual a 1/2Vmáx. cuando [S]=km. En esta situación [ES]=0.5E0, como lo índica la ecuación (8). En la figura 5 se muestra la hipérbola rectangular característica que se obtiene al graficar la ecuación (10). Conforme [S] aumenta hasta varias veces el valor de Km, se aproxima a un valor de saturación, el cual es indicado por V0 que se aproxima a Vmáx. Dicha concentración de sustrato 20 ó 100 veces Km, se dice que es la concentración de saturación del sustrato debido a que virtualmente toda la enzima debe estar en la forma [ES]. En la velocidad de la reacción no es posible obtener ningún incremento adicional debido a que la concentración de E libre en estado estacionario, [E], es bastante pequeña. A las concentraciones de saturación del sustrato, la ecuación (6) se convierte en:

VEkV máx≡= 030 (11)

De esta forma K3 es el cociente de Vmáx/E0, el cual es el número de moles de sustrato que se convierten en producto por unidad de tiempo dividido entre el número de moles de enzima. Este es el número de recambio para una reacción de un solo sustrato y un solo producto, generalmente esta dentro del intervalo de 1 x 104 por segundo. Km, definida por la ecuación (7) para una reacción de un solo sustrato, es una relación de constantes de velocidad. Para la gran mayoría de enzimas que carecen de números de recambio muy grandes, K3 será más pequeño que K1 y K2. En esta condición Km será aproximadamente igual a Ks=K2/K1. De esta forma valores muy pequeños de Ks índican una gran afinidad de la enzima por el sustrato, es decir la formación del complejo [ES] se ve termodinámicamente favorecida. Los valores típicos de Km están dentro de los límites de 10-2 a 10-7 M, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será, en efecto, muy pequeña, como se índica en la figura 5, y será casi proporcional al concentración de sustrato [S]. Se espera que una reacción catalizada enzimáticamente sea de primer orden en cuanto a concentración de sustrato a una baja [S], pero de

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orden cero en el caso de una gran [S], como se indica en la figura 10.

Figura 10. Gráfica de las velocidades iniciales en estado estacionario de una serie de reacciones catalizadas por la misma concentración de enzimas, variando la concentración del sustrato [S], para cada reacción. La velocidad de reacción se aproxima a Vmáx cuando los valores de [S] son muy grandes (3). Experimentalmente, la Km puede estimarse utilizando una gráfica de V0 contra [S], como en la figura 10, estimando un valor de Vmáx y encontrando después el valor de [S] que corresponde a una v igual a 1/2Vmáx. para una reacción simple catalizada por enzimas, Km es este valor de [S]. Sin embargo Vmáx es un valor asintótico y, por tanto, difícil de estimar con exactitud. La gráfica de Lineaweaver y Burk es uno de los varios tipos de análisis que pueden hacerse para estimar Km y Vmáx. En estos análisis se utilizan todos los datos de v contra [S], en lugar de aquellos puntos que están próximos a a Vmáx y Km. Esta gráfica se basa en la ecuación (10) que se ha modificado utilizando el recíproco de ambos lados de la ecuación. El resultado es:

[ ] VVk

máxmáx

m

SV111 +

=

que tiene la forma de una ecuación lineal simple, y=mx + b, donde m=Km/Vmáx y b= 1/ Vmáx. En la figura 11 se muestra una gráfica de Lineweaver y Burk, 1/v contra 1/[S]. Un inconveniente es que los puntos para valores pequeños de [S] tienden a influir más marcadamente en los resultados obtenidos.

Figura 11. Gráfica de Lineweaver y Burk. Todos los puntos de los datos corresponderán por supuesto a valores positivos de 1/v y 1/[S] pero con frecuencia, la línea se extrapola a valores negativos de 1/[S] para dar una estimación de Km (4). En la mayoría de los análisis, es importante utilizar valores de [S] que sean significativamente tanto mayores como menores que Km. Además se debe tener en cuenta que los valores de Km y Vmáx derivados de las gráficas de Lineweaver y Burk y otros análisis serán incorrectos a menos que las condiciones y el método experimental correspondan con la teoría que fundamenta el análisis. Por ejemplo las velocidades iniciales deben ser velocidades iniciales reales, no debe haber algún inhibidor a una concentración que cause algún efecto, etc. Nomenclatura y Clasificación de los enzimas La nomenclatura enzimática se ha establecido mediante acuerdo internacional bajo los auspicios de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica. El sufijo asa identifica a una enzima y se debe utilizar para enzimas únicos. Para complejos enzimáticos en base a sus reacciones se utiliza la palabra sistema, por ejemplo el sistema succinato oxidasa, oxida ácido succínico por el oxígeno en varios pasos catalizados por enzimas concretos.

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La base de la clasificación y nomenclatura esta en el tipo de reacción química que catalizan. De acuerdo con la clasificación Internacional, los enzimas se agrupan en seis clases principales, ver tabla 1.

Tabla 1. Clasificación de enzimas (4) Naturaleza y mecanismos de la acción enzimática La mayor parte de las reacciones enzimáticas pueden representarse por la siguiente ecuación general: E + S Complejo ES producto P + enzima E El enzima no se utiliza en la reacción, sino que se libera de nuevo para reaccionar con otra molécula de sustrato, este proceso se repite hasta que se agotan las moléculas del sustrato. La activación de una molécula de sustrato tiene lugar por su elevada afinidad química para determinadas áreas de la enzima llamados centros activos .Casi todas las enzimas intracelulares tienen un centro activo por molécula. La lactato deshidrogenasa tiene 4, la quimiotripsina, enzima extracelular tiene un centro activo. Usos analíticos y preparatorios de los enzimas La especificidad de los enzimas y su capacidad para catalizar reacciones que de otra manera serían inmensamente lentas, permite analizar cuantitativamente sangre u otras mezclas compleja

se incluso el monitoreo continuo de algunos compuestos biológicamente importantes. Se ha desarrollado el electrodo de glucosa. Puesto que una molécula de enzima convierte muchas moléculas de sustrato en producto, es posible detectar cantidades muy pequeñas del enzima utilizando una prueba sensible para el producto. Por lo general muchos métodos para análisis cualitativos y cuantitativos sensibles para sustancias biológicamente importantes depende de agentes acoplados químicamente. El acoplamiento químico de enzimas a matrices insolubles es la base de procedimientos preparatorios y analíticos de laboratorio. Con dichas enzimas inmovilizadas puede lograrse producción a escala industrial. Ver figura 12. Figura 12. Técnicas de inmovilización de biocatalizadores (5) Factores que afectan la actividad enzimática Entre los factores que afectan la actividad de enzimas están los siguientes:

1. Concentración de enzima 2. Concentración de sustrato 3. pH 4. Temperatura

Generalmente se puede decir que existe un óptimo para la relación de concentraciones enzima, figura 13, y de sustrato en el cual la actividad es máxima, figura 14. Igualmente cada enzima tiene un óptimo de pH, figura 15 y de temperatura para su funcionamiento, figura 16.

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Figura 13. a) Efecto sobre la concentración de enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática (4) Figura 14. Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática. Incrementos muy grandes de sustrato no afectan a la velocidad; esta se hace independiente de la concentración de sustrato. Figura 15. Efecto del pH sobre la actividad enzimática, la actividad máxima se da a un pH determinado y las desviaciones de este determinan menor actividad (4)

. Figura 16. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. A bajas temperaturas la actividad crece al incrementarse la temperatura hasta que se alcanza un óptimo. El posterior incremento de la temperatura provoca un descenso de actividad y la eventual destrucción de la enzima (4). La desviación de estas condiciones óptimas conduce a una reducción significativa de la actividad enzimática. Cinética de reacciones que utilizan sustratos múltiples Entre todas las enzimas, las de un solo sustrato constituyen un caso raro. Se reconocen tres mecanismos generales para los sistemas enzimáticos que emplean sustratos múltiples: 1)Mecanismo ordenado Existe un orden preciso en el cual los sustratos se asocian con los sitios activos de la enzima. Todos los productos son liberados siguiendo un orden preciso y después de reaccionar los sustratos, en la reacción: Se dice que este tipo de reacción tiene un mecanismo ordenado Bi, Bi, que indica dos sustratos, dos productos, ejemplo, la deshidrogenasa alcohólica, los dos sustratos son etanol y NAD+ y los dos productos son acetaldehído y NADH.

Deshidrogenasa alcohólica

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CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+

Los sustratos siempre se desinan: A, B, C y D, los productos como P, Q y R y las enzimas como E, F y G. 2) Mecanismo aleatorio Cuando dos sustratos A y B se añaden a una enzima en forma aleatoria y los dos productos P y Q se liberan de la misma forma, dicha secuencia se libera como un mecanismo aleatorio Bi, Bi, la reacción general sería: Ejemplo, la enzima glucogeno oxidasa. 3) Mecanismo ping pong Para dos sustratos y dos productos el mecanismo se presenta como: En esta secuencia F representa una enzima modificada, (es decir, una enzima X, donde X podría ser un grupo fosforilado o carboxilado o cualquier otro grupo funcional transitoriamente unido a la enzima) F se combina con B y, subsecuentemente, X es transferido a B para formar el segundo producto Q y regenerar la forma original de la enzima E. Un ejemplo de esta reacción es la catalizada por la enzima acetil CoA carboxilasa Acetil CoA + ATP +HCO3 Malonil CoA + ADP + Pi La Acetil CoA cataliza una reacción acoplada, es decir, actua como mediador en la formación energéticamente desfavorable de un enlace C-C al acoplar la reacción a la reacción de hidrólisis, estructuralmente no relacionada, pero energéticamente favorable del ATP y el ADP. Inhibición de la actividad enzimática

Pueden ser fármacos, antibióticos, tóxinas y antimetabolitos. Se reconocen dos grupos de inhibidores, de acuerdo a su acción inhibitoria son reversible e irreversible. Inhibidores Irreversibles La inhibición irreversible implica la modificación de uno o más grupos funcionales del enzima. Se une en otro punto del sitio activo y evitan el funcionamiento de la enzima. Su efecto no se revierte al aumentar la concentración del S, [S], comparable con los inhibidores reversibles o competitivos, ejemplo la tosil-fenilalanil-clorometil-cetona TPCK de la quimiotripsina, a muy bajas concentraciones la inactiva, la amida o ester usual del ácido carboxílico es sustituido por el grupo clorometil. Inhibidores Reversibles Estos inhibidores solo se asocian transitoriamente a la enzima, implica un equilibrio entre la enzima y el inhibidor, K1, es una medida de afinidad del inhibidor por la enzima. Se conocen tres tipos de inhibición reversibles.

1) Inhibición competitiva 2) Inhibición no competitiva 3) Inhibición incompetitiva

1) Compuestos que pueden estar relacionados estructuralmente con el sustrato se combinan reversiblemente con la enzima o cerca del sitio activo. Se forman los complejos ES y EI pero nunca se forma el complejo EIS, altas concentraciones de los sustratos, superarán la inhibición al hacer que la secuencia de reacción se desplace hacia la derecha, de acuerdo con la ecuación En la inhibición por retroalimentación, el producto de una reacción que esta 1 o más pasos actúa como inhibidor de la enzima, importante metabólicamente y suele ser de tipo competitivo. En la figura 7, se muestran las curvas cinéticas típicas observadas en

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este tipo de inhibición. En la tabla 2 se resumen los parámetros de inhibición. Un ejemplo clásico de Inhibición competitiva es el efecto del ácido malónico sobre la succínico deshidrogenasa, la cual oxida rápidamente el ácido succínico en ácido fumárico. Si se agregan cantidades crecientes de ácido malónico, que se asemeja al succínico en estructura, la actividad de la succínico deshidrogenasa disminuye considerablemente. A su vez esta inhibición puede rervertirse aumentando la concentración del sustrato ácido succínico.

Tabla 2. Parámetros cinéticos de los inhibidores (4). Figura 17. Efectos de un inhibidor competitivo sobre la velocidad de reacción como función de la concentración de sustrato. Nótese el valor sin cambios de Vmáx y el valor incrementado de Km que son característicos de la inhibición competitiva y que se observan tanto en la gráfica directa (a) como en la gráfica de Lineweaver y Burk (b) (4).

2) Inhibición no competitiva: los compuestos se unen reversiblemente con la enzima o con el complejo enzima sustrato. las reacciones son: Figura 18. Efectos de un inhibidor no competitivo sobre la velocidad de la reacción como una función de la concentración de sustrato. Nótese el valor

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disminuido de Vmáx y el valor sin cambios de Km, los cuales son característicos de la inhibición no competitiva y que se observan tanto en la gráfica directa (a) como en la gráfica de Lineweaver y Burk (b) (4). Por tanto difiere de la competitiva en que el inhibidor puede combinarse con ES y S con EI, en ambos casos para formar el complejo EIS. Dado que el sitio de unión del inhibidor no es idéntico al sitio activo, ni modifica a este directamente, la Km no se altera, en la tabla 2 se observa la ecuación que define la inhibición no competitiva, y la figura 18, muestra los gráficas directa y reciproca para este tipo de inhibición enzimática. Las ecuaciones que predicen estos resultados aparecen en la tabla 2. 3) Inhibición Incompetitiva: Los compuestos que se combinan reversiblemente solo con el complejo ES, pero no con la enzima libre. No es superado por altas concentraciones de sustrato, la Km’, en presencia del inhibidor es consistentemente más pequeña que el valor de Km de la reacción no inhibida. Esto implica que S se une más firmemente a la enzima en presencia del inhibidor. La figura 19, muestra los gráficas directa y reciproca para este tipo de inhibición enzimática. Las ecuaciones que predicen estos resultados aparecen en la tabla 2. Factores que afectan la formación de enzimas El contenido enzimático de las células de los tejidos es relativamente constante. Sin embargo, la célula bacteriana está expuesta a un ambiente en continuo cambio. Por ejemplo E. coli puede crecer a un pH ácido o alcalino (4.5-9.5), a temperatura ambiente o por encima de la temperatura corporal, aeróbica o anaerobicamente. Las células de E coli que han crecido en condiciones que corresponden a uno u otro extremo, no contienen las mismas cantidades de enzimas. Por lo que respecta a la influencia del sustrato específico en la formación de enzimas, se pueden establecer dos grupos:

Enzimas constitutivos: producidos por las células en todo momento. Figura 19. Efectos de un inhibidor incompetitivo sobre la velocidad de la reacción como una función de la concentración de sustrato. Notese la disminución del Km aparente que da Km’ (llamada también S0.5. La Vmáx también ha disminuido. Estoa resultados pueden observarse tanto en la gráfica directa (a) como en la gráfica de Lineweaver y Burk (b) (4). Enzimas Inducibles: Se producen en la célula únicamente como respuesta a la presencia de un determinado sustrato, es decir, cuando se necesitan, este proceso se llama inducción enzimática y el sustrato recibe el nombre de inductor. La β-galactosidasa es un ejemplo de enzima inducible; su inductor es el azúcar lactosa. Determinación de la actividad enzimática Puede medirse por diversas técnicas. Algunos procedimientos requieren instrumentos especiales, mientras que otros un tubo de ensayo y reactivos. Se debe conocer lo siguiente:

1. Naturaleza de la reacción que cataliza 2. Cofactores y coenzimas requeridos

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3. Concentraciones necesarias de sustrato y de cofactor o coenzima

4. pH óptimo 5. Temperatura óptima 6. Un procedimiento analítico sencillo para

medir desaparición de sustrato o aparición de productos de la reacción.

La concentración del sustrato ha de estar por encima del nivel de saturación al objeto de que la velocidad inicial de la reacción sea proporcional únicamente a la concentración de enzima. Los cofactores y coenzimas deben añadirse en exceso. Todo esto asegura que el verdadero factor limitante sea la concentración de enzima (a su pH temperatura óptimos). Generalmente es más exacto medir formación de producto de reacción que desaparición de sustrato. Naturaleza y mecanismos de la regulación enzimática La actividad enzimática se puede regular de dos maneras: 1) control directo de la acción catalítica, puede realizarse sobre el mecanismo catalítico como tal, o bien a través de su acoplamiento con otros procesos y 2) control genético, incluye los procesos de inducción y represión enzimática. 1) Control directo de la acción catalítica: Se ejerce por alteración de las concentraciones de sustrato o de sustancias que reaccionan, por ejemplo al aumentar un sustrato aumenta la velocidad hasta alcanzar un valor límite. Control directo por acoplamiento con otros procesos: Implica la regulación por ligandos (moléculas capaces de fijarse a la enzima)

Retroinhibición: El ligando que ejerce la regulación es el producto final de una ruta metabólica, puede bloquear su propia síntesis inhibiendo la actividad de los primeros o de enzimas que actúan en dicha ruta. Activación por precursores: El ligando regulatorio es el precursor del primer metabolito de una ruta, activa o estimula la actividad del último enzima de la secuencia de reacción. Control dependiente de energía: Los adenilatos son los ligandos de reacción dependientes de energía, ATP, ADP y AMP.

Propiedades de fijación de enzimas regulatorios: los enzimas regulatorios estan sujetos a la acción del metabolito regulador que puede ser activador o inhibidor. Disminuye la actividad enzimática, disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato que se fija a un sitio diferente del sitio catalítico, estos enzimas tienen dos o más sitios de reconocimiento, se les llama enzimas alostéricos ya que donde actúa el efector es diferente del sitio catalítico por tanto el sitio alostérico regula la actividad enzimática.

Cuando la célula se adapta a un ambiente diferente los mecanismos de inducción y represión entran en juego. 2) Control genético de inducción y represión enzimática: Se lleva a cabo por la inducción y la represión de la síntesis de enzimas. Cuando se requiere una sustancia inductora el proceso recibe el nombre de inducción. Cuando otras sustancias actúan como correpresores el fenómeno recibe el nombre de represión. Los correpresores se unen a el represor, formamdo un complejo activo capaz de actuar sobre el gen operador y bloquear la síntesis del RNAm o unirse al inductor y formar un complejo inactivo incapaz de unirse al gen operador y se lleva a cabo la síntesis de RNAm. La secuencia de aminoácidos la determinan los genes estructurales y la velocidad de síntesis de los genes reguladores. Jacob-Monod, denominaron operon a un grupo de genes consecutivos, que forman una unidad operacional. Cuando se añaden inductores como la lactosa, se produce un incremento en la velocidad de síntesis de la β-galactosidasa (hidroliza la lactosa a glucosa y galactosa), la β-galactósido permeasa (transporta la lactosa al interior de la célula) y la tiogalactósido transacetilasa (de función fisiológica desconocida), los genes se designan como z, y y a respectivamente. La velocidad de síntesis esta regulada por los genes reguladores, que se denominan i, p y o, tal como muestra la figura 20, i es el gen represor, p el gen promotor y o el gen operador. En el gen promotor p, donde se fija la RNA polimerasa, que cataliza la síntesis de RNAm. El control negativo lo ejerce el represor lac, en union del correpresor, forma un complejo represor-correpresor (puede ser glucosa o galactosa), el cual se fija al gen o y bloquea la transcripción. Los inductores estimulan la síntesis de RNAm lac, fijándose al represor y disminuyendo la afinidad para el operador. Tanto la represión como la

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inducción representan sistemas de control negativo, ya que la síntesis de enzima solo puede tener lugar cuando el represor se separa del operador. Se dice que tiene lugar un control positivo de la síntesis de enzima cuando se requiere una asociación entre una proteína y una parte de la región regulatoria de un operón, para la expresión de genes estructurales asociados.

Figura 20. Operon lac (1) Bibliografía 1. Bruce Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell. USA. 2. Pelczar J. Michael. Elementos de Microbiología. 1984. Ed. Mc Graw-Hill México. Pg 235-273. Brock Madigan. Biología de los microorganismos. Prentice Hall, Madrid 1999. Octava Edición. Pg 118-121. 3. En línea http://www.bgu.ac.il/~aflaloc/BioHTML/Goodies/DeriveMMEqn.html. Consultada en Mayo de 2002. 4. Conn Eric, Stumpf Paul, Bruening Geioge, Doi Roy. Bioquímica Fundamental. México. Editorial Limusa. 1996. pg 131-181. 5. Ocampo Q. L. Eloísa. Inmovilización de células de Acetobacter aceti en soportes elaborados por té cnica Sol-Gel. Tesis de maestría. Universidad Nacional de Colombia.