Enzimas: catalizadores biológicos

Hay dos condiciones fundamentales para LA VIDA. Primero, que los entes vivos

deben ser capaces de AUTODUPLICARSE, y segundo que el organismo debe ser capaz de catalizar

sus reacciones químicas, en forma eficiente y en totalmente selectiva.

Enzimas.

• Los procesos metabólicos están constituidos por una serie de reacciones químicas, que son Termodinámicamente posibles y la mayoría de ellas son espontáneas, pero sin los catalizadores biológicos ocurrirían en escalas de tiempo muy diferentes a la escala que ocurre en su presencia. Sin enzimas las reacciones químicas serian muy lentas, o nunca tendrían lugar, y por lo tanto la vida tal como la conocemos no seria posible.

Zymogen activation by proteolytic cleavage

Enzimas: conceptos

• Las Enzimas ocupan un lugar central en todos los procesos bioquímicos de las células.

• Actúan en secuencias ordenadas y catalizan cientos de pasos de reacciones que por ejemplo degradan nutrientes y realizan transformaciones Energéticas, generando macromoléculas a partir de simples precursores.

• Esto se logra gracias a la acción coordinada de enzimas regulatorias, vías metabólicas, etc. coordinadas en un juego armonioso en paralelo en una gran cantidad de actividades necesarias para sostener la vida.

Modulacion de la actividad enzimatica por modificacion covalente

Enzimas: conceptos

• El estudio de las enzimas tiene una importancia practica inmensa.

• En algunas enfermedades, especialmente aquellas asociadas con un factor genético, debido a la ausencia de una o mas enzimas, o bien debido a que existen pero no son funcionales.

• Para otras enfermedades, la actividad excesiva de una enzima puede ser la causa de la misma.

Relación Enzima-Sustrato

Enzimas: conceptos

• La medida de las actividades enzimáticas en sangre o en plasma, células elementos formes o muestras de tejidos son muy importantes en el diagnostico de una gran cantidad de enfermedades.

• Muchas drogas farmacéuticas ejercen su efecto biológico a través de efectos de interacción con las enzimas de un ser vivo.

• Las enzimas son una herramienta practica importante, no solo a nivel medico sino en una gran variedad de otras disciplinas, como en la industria química, alimentaria y agricultura entre otras.

Relacion Enz-Sustrato y Enz + Productos: principio de accion de

masas

Particularidades.

• Muchas enzimas tienen estructuras proteicas.• Un grupo muy importante de enzimas de estructura

de ARN, son las ribozimas.• Si la enzima es desnaturalizada, generalmente

pierde su capacidad Enzimática.• Existe una relación entre estructura y función.• Muchas enzimas requieren de la presencia de un

ión metálico para ejercer su actividad. • Cofactores o coenzimas.

Clasificacion de enzimas•Oxidorreductasas – oxidacion reduccion•Transferasas – transfieren uno o mas

grupos funcionales.•Hidrolasas – hidrolisis•Isomerasas – rearreglos intramoleculares•Ligasas – combinan dos moleculas•Quinasas – transfiere un grupo fosfato a

una molecula.•Fosfatasas – elimina un grupo fosfato de

una molecula

Clasificación de enzimas

Algunas coenzimas

Cofactores y Coenzimas

Metales en Enzimas

La conversion de sustrato en producto y la Energia necesaria

para ello

Constante de equilibrio de una reacción Enzimática y energía libre

Cinetica enzimatica

Herramientas y técnicas del analisis cinetico

Velocidad de reacción: estudiada por la CINÉTICA QUÍMICA

Termodinámica = fundamenta la posibilidad de ocurrencia de una reacción química

Cinética = fundamenta los tiempos reales de ocurrencia de una reacción química.

Para iniciar el estudio de una reacción, es necesario saber

1) Su Estequeometria

2) Identificar reacciones químicas colaterales

3) La Medida de concentraciones de reactivos y

productos a distintos tiempos de iniciada la reacción.

4) Temperatura y presión a la cual se lleva a cabo.

La CINÉTICA QUÍMICA es Empírica

Ley de acción de masas de una reacción química simple

EstequeometríaMolecularidadReversibilidadSustratosProductosVelocidad de reacción v

v

Dada:

v

n: orden de reacción estequiométrico

PROCEDIMIENTOS EN CINÉTICA

1. Establecer la ecuación de velocidad en forma experimental.

2. Analizar los valores de la constante de velocidad, desde un punto de vista termodinámico (efecto de la temperatura y la presión), según el Principio de Le Chatellier.

3. Proponer un mecanismo de reacción consistente con la ecuación de velocidad.

Cinetica enzimatica y el estado estacionario.

Dependencia de la concentracion de sustrato en funcion del tiempo:

v

Orden de reacción

En general, para cualquier reaccion del tipo A + B + C +···→ P, la ecuacion de velocidad puede ser generalizada por

A + 2 B 3 C + D

A. Definición de velocidad (1)

dt

Bd

dt

Ad

dt

Rd

Velocidad de consumo de reactivos

dt

Dd

dt

Cd

dt

Pd

Velocidad de formación de productos

J = componente

[v] = Concentración/t = molar/seg

A. Definición de velocidad (2)

dt

Bd

dt

Ad

dt

Cd

dt

Dd

2

1

3

1

A partir de la estequeometria

Por lo tanto hay diferentes velocidades relacionadas con esta reacción.

DEFINIMOS VELOCIDAD DE REACCIÓN (V)

A + 2 B 3 C + D

dt

Jd

vv

j

1

vj = Número estequiométrico de sustancia J con su signo

A. Definición de velocidad (3)

Ejemplo, dado:

2 AB(g) 2 A (g) + B (g)

vA = 1.6 x 10-4 M/seg (formación)

vAB = 1.6 x 10-4 M/seg (consumo)

vB = 0.8 x 10-4 M/seg (formación)

vr = vAB = vA = vB1/2 1/2

Orden de reacción química• Si la velocidad de una reacción es independiente

de la concentración de un reactante en particular, la reacción se considera que es de orden cero con respecto de la concentración del reactante (n = 0).

• Si la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de un reactante en particular, la reacción se considera de primer orden respecto de la concentración de dicho reactante (n = 1).

• Si la velocidad de la reacción es proporcional al cuadrado de la concentración de un reactante en particular, se considera la reacción de segundo orden o de orden dos, respecto de la concentración del reactante (n = 2).

Dado: A + 2 B 3 C + D

B. Ecuación y constante de velocidad

CONSTANTE DE VELOCIDAD k

La ECUACIÓN DE VELOCIDAD v = k [A] [B] [C] [D] [Xj] x

La ecuación de velocidad se determina EXPERIMENTALMENTE y, en general, NO SE PUEDE DEDUCIR DE LA ECUACIÓN QUÍMICA

Independiente de las concentraciones

Dependiente de la T y P

C. Orden de reacción (1)

A + 2 B 3 C + D

El exponente al que se eleva la concentración de una especie (reactivo o producto) en una ecuación de velocidad, es el orden con respecto a esa especie.

El orden de reacción global es la suma de los órdenesindividuales.

v = k [A] [B] [C] [D] [Xj] x

No tiene por que coincidir con los coeficientes

estequiométricos.

A2 + B2 2 ABka (A2) (B2)1/2

v =kb + (AB) / (B2)

Se obtiene experimentalmente.

Puede ser un número entero o fraccionario, positivo o negativo.

C. Orden de reacción (2)

v = k [A]0

Orden cero: la velocidad de la reacción no depende de la cantidad

(concentración) de ese reactivo; es decir es constante mientras [A] O

v = k [A]1

Orden uno: la velocidad de la reacción depende de la cantidad (concentración) de ese reactivo; es decir disminuirá a medida que se consume A.

v = k [A]2 ó v = k [A] [B]Orden dos: la velocidad de la reacción depende de la cantidad (concentración) de reactivo(s); es decir disminuirá a medida que se consuma A y/o B.

C. Orden de reacción (3)

ECUACIONES DE VELOCIDAD INTEGRADAS

k

dt

Adv

kdtAd

tA

Ao

dtkAd0

ktAoA

Akdt

Adv

kdtA

Ad

tA

Ao

dtkA

Ad

0

ktAoA lnln

2Akdt

Adv

kdtA

Ad2

tA

Ao

dtkA

Ad

02

ktAoA

11

Orden 0 Orden 1 Orden 2 ([A]= [B])

Orden cero, n=0

Orden uno, n=1

Orden uno, n=1. Reducción decimal D

Orden dos, n=2

Orden tres, n=3

Las unidades de k dependen del orden (global) de la reacción (las

unidades de v no cambian)

De acuerdo al orden las unidades de la constante de velocidad son diferentes

Orden cero v = k [k] = [v] [k] = M/s = M s -1

Orden uno v = k (A) [k] = [v/C] [k] = M s -1/M = s-1

Orden dos v = k (A)2 [k] = [v/C2] [k] = M s -1/M2 = M-1 s -1

Es el tiempo necesario para que para que la concentración de un reactivo

se reduzca a la mitad de su valor inicial arbitrario.

TIEMPO DE VIDA MEDIA

Orden cero t1/2 = [A]o / 2k [t1/2] = año-1, d-1, etc.

Orden uno t1/2 = ln 2 /k [t1/2] = M. año-1, M. d-1 , etc.

Orden dos t1/2 = 1 /k[A]o [t1/2] = año. M2, d. M2, etc.

Reacciones t1/2 (s)

Muy lentas >4 x 10 7 (1 año)

Lentas 105 (1 día)

Relativamente rápidas 4 x 103 (1 hora)

Rápidas 102-10-1

Muy rápidas < 10-4

41

DETERMINACIÓN experimental DE LA ECUACIÓN DE VELOCIDAD

MÉTODO DEL AISLAMIENTOLa concentración de todos los reactivos, excepto uno, están en gran exceso

v = k [A] [B] [B] en exceso; permanece igual v = k´ [A]

MÉTODO DE LAS VELOCIDADES INICIALES

Se extrapola al comienzo arbitrario t=0

v = k´ [A] vo= k´ [A]o log vo = log k´ + log[A]o

MÉTODO GRÁFICO

ktAoA ktAoA lnln kt

AoA

11

Reacción multiorden

Para una reaccion deOrden n-esimo

Vs. tiempo

Con k de pendiente positiva

Enzimas multi sitios activos. Acción cooperativa. Buscar cuales pueden

ser???

DEPENDENCIA DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN Enzimatica, CON LA TEMPERATURA

Explosión Catálisis Oxidación Oxido nitrico + O2

del carbón

De la Temperatura, afecta la constante de velocidad

ln k = - Ea / R.T + ln A

A = factor de frecuencia (extrapolado)

Ea = energía de activación de la reaccion quimica catalizada

A.PARÁMETROS DE ARRHENIUS para una reaccion enzimatica (cambios en el valor de la constante de reaccion en funcion de la 1/Temperatura)

ECUACIÓN DE ARRHENIUS

ln k = -Ea/RT + ln A

k = A. e-Ea/RT

INTERPRETACIÓN DE LOS PARÁMETROS( Teoría de las colisiones)

LA ENERGÍA DE ACTIVACIÓN ES LA ENERGÍA CINÉTICA MÍNIMA QUE DEBEN TENER LOS componentes REACTIVOS PARA PODER FORMAR PRODUCTOS

EL FACTOR PREEXPONENCIAL A, ES UNA MEDIDA DE LA VELOCIDAD A LA QUE OCURREN LAS COLISIONES INDEPENDIENTEMENTE DE SU ENERGÍA.

Cinética Enzimática

Derivacion de Michaelis - Menten

Velocidad de formación de ES, v

Velocidad de desaparición de ES, v

Efecto de la concentracion de sustrato sobre la velocidad de una reaccion enzimatica.

Saturacion de la velocidad de conversion de sustratos a productos…. KM

Derivación de Ec M-MEn el equilibrio ambas velocidades se igualan… y

Ec M-M

Ecuación de Michaelis - Menten

Y cuando vo = vmax / 2 [S] = Km

Michaelis-Menten

Transformacion de Lineweaver-Burk.

V max varia mucho su valor de una enzima a otra

Parametros de la transformacion de Lineweaver-Burk

K cat: n° de moles transf / U de tiempo (en segundos)

K cat suele usarse como parámetro de la reacción Enzimática, ya que es un paso limitante de la reacción globalK cat = k2 / Et

Parametros de Michaelis-Menten para algunas enzimas ordenadas por aumento en

el Kcat/Km

Especificidad enzimatica. Preferencia de la quimotripsina para distintos

sustratos.

Especificidad. Constantes de velocidad para la hidrolisis por la quimiotripsina.

Otras parametrizaciones: Eadie-Hofstee

][max

S

KmVVV

Determinacion de parametros cineticos enzimaticos por

linealizacion

Inhibicion Enzimatica.Cinetica Enzimatica : velocidad de reaccion y

orden de reaccion.Orden cero, uno y dos...

Formación del complejo E-S y el mecanismo de inhibición Enz

Inhibición enzimática aplicado en fármacos. Clasificación

Esquemas con las diferentes inhibiciones (I) enzimáticas de tipo reversibles

65

Inhibicion Competitiva

Competitividad por un segundo sustrato

Esquema de la reaccion de Inhibicion Enzimatica reversible competitiva

Un ej. sustrato y su inhibidor

competitivo

69

Los Efectos de la

inhibicion competitiva

en los parametros

de la cinetica enzimatica

Transformacion de Lineweaver-Burk para un inhibidor competitivo

71

Efectos en parámetros de la cinética enzimática, por el incremento de la concentración de un inhibidor

72

Inhibicion reversible

Acompetitiva o No

Competitiva

Esquema de Reaccion para Inhibicion Reversible No Competitiva

Efectos de la Inhibicion

Reversible no competitiva

sobre parametros

de la cinetica enzimatica

Lineweaver-Burk para inhibidor rev. no competitivo

Esquema de Inhibicion Enzimatica Reversible Mixta

Inhibición E. R. Mixta No Competitiva

Lineweaver-Burk, para un inhibidor mixto

Síntesis de mecanismos de inhibición enzimática y sus representaciones

Resumen de las distintas formas de inhibicion enzimatica.

Inhibidores Irreversibles de enzimas

Inhibidores Irreversibles de enzimas

Valores de parámetros cinéticos aparentes para diferentes modelos

Graficas secundarias para la determinacion de parametros cineticos

Bibliografia

• Bioquímica. Lehninger. Mc Graw – Hill. 2002.

• Bioquímica, ejercicios y problemas. Serie Schawnn. Mc Graw – Hill. 1998.