UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA Y TEXTIL LABORATORIO DE BIOQUIMICA Y

MICROBIOLOGIA PROFESORA: Ing Teresa Alvarado Y CONTENIDO: I. OBJETIVOS

II. MICROSCOPIO a. PARTES b. TIPOS DE MICROSCOPIOS c. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

OBJETIVO El objetivo de la presente práctica es: 1. Familiarizar al estudiante con el uso del microscopio así como de los materiales básicos de

laboratorio en el uso de la microbiología. EL MICROSCOPIO Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. El microscopio compuesto está formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3.Sistema mecánico.

1. El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y está formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar) 2. El sistema óptico está formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y está formado por los objetivos, tubo y el ocular. 3. El sistema mecánico está formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y está formado por la base, estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y porta revolver

Función básica de cada parte del microscopio: a.- Sistema mecánico Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la

preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.

Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos. Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor. Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión. Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular. Revolver. es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de

distinto aumento Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos

que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.

b.- Sistema de iluminación Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características:

6V, 5-15 W ó 12V, 50-100 W Diafragma de campo. Está situada en la base del microscopio y su función es la de regular el

diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación.

Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.

c. Sistema óptico Oculares.- El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de

los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo. Datos importantes grabados sobre la periferia de un ocular: 1) Corrección esférica (CPL); 2) Ocular de gran campo (W); 3) aumentos (10X); 4) distancia focal amplia (1,8) y

5) Para observación con gafas. Tubo.- El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio,

este puede ser monocular o binocular, además está adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El tubo generalmente está diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total

Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y está diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuáles son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente: 1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 2)

2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos 3.- El lado superior derecho la apertura numérica. 4.- El lado inferior la distancia mecánica 5.- El lado inferior derecho el espesor del cubre objetos 6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo

Índice de refracción: Se denomina así a la relación existente entre la velocidad de la luz en el aire y su velocidad

en el medio transparente utilizado. De la misma manera, se pueden obtener los índices de refracción de una serie de sustancias que se utilizan en la construcción y tallado de las lentes de los objetivos. La velocidad de la luz es de 300,000 Km/sg en el aire. Al atravesar un medio transparente como el vidrio del cual están fabricados las lentes de los microscopios, su velocidad se reduce a 200, 000 km./sg. Por lo tanto el vidrio tendrá un índice de refracción de 1.5; pues el índice de refracción de un objeto o una sustancia transparente se expresa mediante la fórmula:

IR= Ve l o c idad de la l uz en el aire Velocidad de la luz en el medio A continuación se muestran los índices de refracción de una serie de sustancias transparentes que se emplean en microscopía para construir lentes o como sustancias de inmersión: Agua = 1.3300 Aceite de inmersión = 1.5150 Fluorita = 1.4340 Vidrio (crown) = 1.5200 Flint = 1.6600

Poder de resolución. Se define así la capacidad de un objetivo de poder distinguir la distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. La calidad de una imagen, en la que se observe la claridad, nitidez y la riqueza de detalles, depende del poder de resolución del objetivo. El poder de resolución (PR) de un objetivo depende de la longitud de onda () del rayo luminoso utilizado y la apertura numérica del sistema óptico del objetivo. El PR (d) se expresa según la siguiente formula:

Esto significa que si empleamos un objetivo de AN = 1.25 con una longitud de onda de 560nm, el poder de resolución será de 273nm, la cifra obtenida nos indica que el objetivo será capaz de distinguir o resolver la imagen de dos puntos que en el objeto están separados entre sí por 273nm. Si la separación de ellos es menor a esta cifra el objetivo no podrá distinguirlos como dos puntos separados. La cifra resultante de aplicar la fórmula se denomina límite de resolución.

Un cálculo más exacto del poder de resolución se obtiene cuando en la fórmula se añade la apertura numérica del condensador, tal como se observa en la fórmula (b). Cuando se efectúa correctamente la iluminación del objeto utilizando (adecuar la distancia apropiada del condensador y la regulación de captación de la luz abriendo o cerrando el diafragma iris del mismo) la apertura numérica del condensador, la imagen que forma el objetivo logra mostrar el máximo poder de resolución. Por ejemplo si se emplea el mismo objetivo del caso anterior (de AN = 1.25), el mismo tipo de luz ( = 560nm) y se ilumina la muestra con un condensador de AN = 8

TIPOS DE MICROSCOPIOS Los tipos de microscopio son: 1. Simple 2. Electrónico permitían un aumento de 200 0003. Petrográfico o polarizado 4. De fase 5. De campo ultravioleta 6. Rayos X 7. Interferenciales

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO Mira el microscopio asignado a usted y compararla con la fotografía de la figura 1.1. Tenga en cuenta que

sus partes de trabajo se establecen en un marco robusto que consta de una base de apoyo y un brazo para llevarla. (Nota: Al levantar y llevar el microscopio, siempre use las dos manos, una para agarrar el brazo con firmeza, y el otro para apoyar la base (fig. 1.2). Nunca levante por la parte que mantiene las lentes.

Fig.1.2.- Partes del Microscopio 1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos están limpias: de no ser así, límpielas cuidadosamente con papel especial para óptica. No tocar las lentes con los dedos. 2) Coloque la preparación (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente, que el objetivo de menor aumento está en posición de empleo. 3) Para bacteriología, iluminar la preparación bajando el condensador (más contraste), y con el diafragma abierto.

4) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el microscopio lo permite. 5) Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfocar: a) Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando para ello el

macrométrico. No realizar dicha operación mirando por el ocular, pues correría el riesgo de “clavar” el objetivo en la preparación con el consiguiente destrozo de ambos. 19 b) Enfoque con el micrométrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque nítido.

6) Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine el foco con el micrométrico. Si la imagen no está ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de x10. El objetivo de x40 trabaja muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser “clavado” en la preparación y resultar manchado con aceite de inmersión si se observa la preparación ya usada con éste último. 7) Empleo del objetivo de inmersión:

a) Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el objetivo de x40 b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de la luz. c) Termine de girar el revólver hasta la posición del objeto de inmersión, asegurándose de que éste no toca la preparación, pero sí la gota de aceite. d) Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. Recuerde que la distancia entre el objetivo y la preparación es mínima. e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no puede volverse a colocar los objetivos de x10 y de x40 sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersión girando el revólver hacia el objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde éste último. f) Finalizada la observación de una preparación, y antes de retirarla de la platina, se colocará el objetivo de menor aumento girando el revólver en el sentido hacia la lupa. Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación. g) Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente con un papel especial para óptica. Compruebe también que el objetivo de x40 está limpio.

Figure 1.4 Examples of Bacterial Shapes as Seen with the Bright-field Light Microscope. (a) Staphylococcus aureus cocci; singular, coccus (1,000). (b) Bacillus subtilis rods or bacilli; singular, bacillus (1,000). (c) A single, large spirillum; plural, spiralla (Spirillum volutans;1,000). (d) Numerous, small spirilla (Rhodospirillum rubrum;1,000). MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1) No se deben tocar nunca las lentes con las manos, sino con pañuelos especiales

para lente. 2) No dejar nunca una preparación sobre la platina cuando no esté usando el microscopio. 3) Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revólver. 4) Después de utilizar el objetivo de inmersión límpielo. En caso de que el aceite se haya secado, avise al docente para limpiarlo con xilol. 5) No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (macro y micrométricos, platina, revólver y condensador). 6) No cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del ocular. 7) Cuando finalice el trabajo ponga el objetivo de menor aumento en posición de

observación. 8) Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión de prácticas.

POSIBLES CAUSAS DE UNA MALA IMAGEN Cuando usted tenga problemas al momento de querer visualizar tenga presente los siguientes ítems: l. Verificar que la iluminación sea la correcta. 2. Verificar que las lentes del objetivo estén limpias. 3. Comprobar que entre el diafragma de campo y el de abertura, no haya ningún filtro difusor. 4. El centrado del revólver porta objetivos debe ser el correcto. 5. El portaobjetos y el cubreobjetos deben estar limpios. Comprobar que el primero esté bien colocado, y que no haya dos cubreobjetos superpuestos. 6. Verificar la limpieza de todo el sistema óptico. Esto se puede efectuar haciendo girar por separado los oculares que el microscopio posea, comprobando si las pequeñas motas de suciedad se mueven Si es así, es que hay que limpiar el ocular. Luego, habrá que hacer girar el tubo ocular en su conjunto; éste no debe ser desmontado nunca, pero sí se pueden limpiar cuidadosamente los prismas soplando sobre las superficies accesibles. El objetivo puede limpiarse desenroscándolo ligeramente y ayudándose de un pincel seco. 7. Comprobar que el aceite de inmersión sea el suficiente, sin burbujas ni impurezas, y que no sea fluorescente. 8. Asegurarse de que el objetivo está bien enroscado. 9. Verificar el grosor del cubreobjetos, portaobjetos y medio de montaje, que es decisivo, sobre todo en medianos y grandes aumentos. Es importante, igualmente, no colocar dos cubreobjetos superpuestos. 10. La montura del condensador debe estar bien centrada y la frontal bien sujeta, en el caso de que sea abatible. Comprobar que la cremallera esté bien apretada, para mantener la posición. 11. La intensidad lumínica no debe ser débil, ni excesiva. No hay que regularla nunca con el diafragma del condensador. 12. Tener cuidado de no utilizar objetivos de contraste de fases para observaciones de campo claro, sobre todo cuando trabajamos con grandes aumentos. 13. Si el microscopio tiene espejo, es necesario comprobar que la cara plana sea la que proyecte el haz luminoso sobre el diafragma del condensador. 14. Utilizar una combinación correcta entre el ocular y el objetivo, pues puede ocurrir que el ocular sea demasiado potente. Cuestionario 1¿A que llamamos poder de resolución de un microscopio? 2¿Que es la apertura numérica? 3¿Cuál es el trabajo del aceite de inmersión? 4¿Que diferencias existe entre una bacteria, un virus y un hongo 5¿ Cual es la diferencia entre el poder de resolución y poder de aumento de una lente. ¿Qué se entiende por el término "parfocal"? 6.¿Por qué el objetivo de baja potencia es colocado en posición cuando el microscopio se almacena 7¿ Cómo se puede aumentar la resolución en el microscopio?