ESPECTROFOTOMETRÍA

Carolina Saavedra Díaz, Daniela Moraga López, Jezir Valencia Gómez

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad del Valle, Cali – Colombia

RESUMEN

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia; durante la práctica se efectuó espectros de absorción de la luz visible de sustancias coloridas donde se determinó la longitud de onda en su absorbancia máxima, encontrándose en el rojo Congo (490 nm), azul de bromotimol en medio acido (430 nm) y a pH 7.5 (610 nm), permanganato de potasio (550 nm) y una mezcla de azul bromotimol y rojo Congo(610 nm); además se aplicó y se utilizó la ley de Beer-Lambert, encontrando una relación lineal entre la Absorbancia y concentración por medio de la regresión lineal y finalmente se aprendió y reforzó el manejo del espectrofotómetro.

Palabras claves: espectrofotómetro, ley de Beer-Lambert, Absorbancia, longitud de onda, concentración.

INTRODUCCIÓN

El espectrofotómetro es el instrumento más versátil del laboratorio puede utilizarse para diferentes determinaciones analíticas. La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que se fundamenta en la absorción de estas radiaciones por parte de las moléculas. Por ello el espectrofotómetro está constituido por un foco de radiación visible o ultravioleta, que emite una radiación que atraviesa un selector, que permite escoger una radiación de una longitud de onda (λ) concreta. La radiación seleccionada incide sobre la

muestra contenida en una cubeta transparente. Una parte de la radiación es absorbida, mientras que el resto es transmitida y se mide en un detector.Cada molécula en función de su configuración electrónica puede absorber unas radiaciones específicas, que se caracterizan por su longitud de onda. Las moléculas en solución pueden absorber radiaciones de la zona ultravioleta (λ=195-325nm) o de la luz visible (λ=325-800nm).

Si cada molécula de un analito absorbe una radiación característica, la medida de toda la radiación absorbida nos permite medir la cantidad de moléculas, es decir, la concentración. La absorbancia (A), que se calcula a partir de la medida experimental de la radiación incidente y de la transmitida, y la concentración se hallan relacionadas por la ley de Beer-Lambert: A=axbxC, donde b es el camino óptico (espesor de la cubeta) y a es la absortividad específica, que es característica para cada analito, pero depende de la longitud de onda de la radiación absorbida y de las características de la solución (matriz) que contiene al analito. Para el análisis cuantitativo se construye normalmente una recta de calibrado con patrones, procurando que la matriz sea igual o muy similar a la de la muestra, y la absorbancia de la muestra se interpola en esta recta de calibrado con el fin de obtener la concentración (Guasch Torres Josep, 2006).

El objetivo de la práctica es familiarizarse con el uso y aplicación del espectrofotómetro, efectuando el espectro de absorción de luz visible de algunas sustancias determinando la longitud de onda de máxima absorción de cada una, comprobando la relación entre absorbancia y la concentración (Ley de Beer-Lambert) y aplicando dicha ley para la determinación de la concentración de una sustancia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para llevar a cabo la presente práctica esta se realizó basándose en la guía del laboratorio de biología celular y bioquímica I: Espectrofotometría, con las siguientes modificaciones:

Se hallaron las medidas de Absorbancia y concentración pero no se halló el % de transmitancia.

A cada grupo se le designo una sustancia diferente, se trabajo con el azul de bromotimol a pH 7.5.

RESULTADOS

Parte 1

A continuación se presenta una tabla correspondiente a los valores de absorbancia de cada sustancia, en relación con diferentes longitudes de onda (ƛ) y su respecta grafica.

Absorban-cia de:

longitudde onda

Azul de bromotimol

a pH 7.5.

Azul de bromotimol

en medio ácido.

Rojo Congo.

Permanganato de Potasio(KMnO4)

Mezcla: azul de

bromotimol pH 7.5 mas rojo congo.

400 0.048 0.163 0.212 0.071 0.415430 0.021 0.210 0.239 0.046 0.390460 0.012 0.175 0.323 0.043 0.462490 0.022 0.103 0.404 0.090 0.624520 0.050 0.035 0.384 0.153 0.660550 0.078 0.008 0.233 0.156 0.036580 0.147 0.001 0.093 0.047 0.701610 0.189 0.003 0.043 0.012 0.884640 0.142 0.001 0.034 0.007 0.652670 0.032 0 0.024 0.009 0.181700 0.007 0.001 0.336 0.003 0.129

Tabla No 1. Determinación de los espectros de absorbancia.

350 400 450 500 550 600 650 700 7500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1 Azul bromotimol 7.5

Azul bromotimol (ácido)

Rojo congo

Permanganato de Potasio

Mezcla de azul de bromotimol y rojo congo

Fig. No 1. Espectros de absorción de las sustancias utilizadas en la práctica según la tabla No. 1

Parte 2.

En la siguiente tabla se encuentran los valores correspondientes a la absorbancia de cada sustancia, incluyendo la solución problema.

Tabla No. 2.Comprobación de la ley de Beer – Lambert

Absorban-cia de:

Tubo

Azul de bromotimol a

pH 7.5.

Azul de bromotimol en medio ácido.

Rojo Congo. Permanganato de Potasio(KMnO4)

1 0,072 0,071 0,348 0,0342 0,119 0,112 0,238 0,0843 0,252 0,203 0,438 0,1514 0,411 0,293 0,63 0,2495 0,506 0,38 0,785 0,3146 0,883 0,56 1,233 0,4747 0,811 0,799 1,551 0,6178 0 0 0 0Solución problema

0,934 0,536 0,92 0,389

En seguida es presentada la tabla correspondiente a las concentraciones iníciales de cada sustancia.

Tabla No.3 Concentraciones y volumen de agua inicial usado para cada una de las sustancias usadas.

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8Solución de

100mg/l de la sustancia, (L)

2.5 x 10-4 5 x 10-4 1 x 10-3 1.5 x 10-3 2 x 10-3 3 x 10-3 4 x 10-3 0

Agua destilada en

litros

9.75 x 10-3 9.5 x 10-3 9 x 10-3 8.5 x 10-3 8 x 10-3 7 x 10-3 6 x 10-3 0.01

Para hallar la concentración final de cada uno de los tubos según la tabla No. 3 se procedió a utilizar la ecuación No.1

C1x V1= C2 x V2 Ecuación No.1

Al despejar se obtuvo la ecuación No. 2

C1 x V1= C2 Ecuación No.2 V2

En la siguiente tabla se muestran las concentraciones de cada uno de los tubos, obtenidas por medio de la ecuación N°2

Tabla N°4 concentración de cada uno de los tubos.Tubo Concentración (mg/L)

Tubo 1 2.5Tubo 2 5Tubo 3 10Tubo 4 15Tubo 5 20Tubo 6 30Tubo 7 40

Mediante el cálculo de la concentración de cada uno de los tubos que fue igual para cada sustancia, se procedió a realizar una grafica de absorbancia Vs concentración para establecer de una solución problema su concentración.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

f(x) = 0.0155628749292587 x + 0.00206847764572718R² = 0.998864479012994

f(x) = 0.0366852292020374 x + 0.0911324278438033R² = 0.978512160177897

f(x) = 0.0191941143180532 x + 0.00834012450481048R² = 0.996825870110977

f(x) = 0.0229962648556876 x + 0.0296196943972836R² = 0.93671571878586

Absorbancia

Concentracion mg/ L

Fig. N° 2.Comportamiento gráfico de la Ley de Beer - Lambert

La siguiente tabla muestra los valores correspondientes a la concentración de la solución problema, obtenidos desde Excel y los obtenidos mediante regresión (calculadora).

Tabla N°5 concentración de la solución problema.Sustancia

Variable

Azul de bromotimol a

pH 7.5.

Azul de bromotimol en medio ácido.

Rojo Congo. Permanganato de Potasio(KMnO4)

Excel Reg. Excel Reg. Excel Reg. Excel Reg.A 0.029 0.029 0.008 0.008 0.091 0.09 0.002 0.002B 0.023 0.022 0.019 0.019 0.036 0.036 0.015 0.015R 0.967 0.967 0.998 0.998 0.989 0.989 0.999 0.999R2 0.936 0.936 0.996 0.996 0.978 0.978 0.998 0.998[ ] 39.35 41.13 27.79 27.79 23.03 23.05 25.8 25.8

DISCUSIÓN

El espectro electromagnético, representa las regiones visible y no visibles mas importantes de la distribución energética, al considerar la luz (fotón) de máxima Absorbancia que absorben las sustancias, donde cada fotón tiene una energía , que está dada por (E=hcv/ λ), donde h corresponde a la constante de planck y v corresponde al número de ondas, donde se observa que la energía es inversamente proporcional a la longitud de onda y directamente proporcional al número de onda, por lo tanto en el caso de rojo congo al tener una menor longitud de onda 490 nm, presentó una mayor energía y una Absorbancia de color Verde-Azul, el azul de bromotimol en medio acido, mostró una longitud de onda muy pequeña 430 nm y una Absorbancia de color Violeta, el azul de bromotimol a pH 7.5 tiene una longitud de onda mayor (610 nm), y por lo tanto su energía es baja presentando un color de Absorbancia Amarillo. El pH la polaridad del solvente o moléculas vecinas y la orientación de los cromóforos “es la parte o conjunto de átomos de una molécula responsable de su color”, son factores que originan variaciones en los valores, en el caso del pH son debidas al efecto de éste sobre la ionización del compuesto. Aún así la existencia de iones inorgánicos en disolución acuosa absorbe suficiente energía radiante en la región del visible, lo que permite su determinación espectrofotométrica directa, incluso en muy bajas concentraciones, en la mezcla de azul de bromotimol pH 7.5 más Rojo Congo la Absorbancia de una solución a una longitud de onda dada es la suma de las Absorbancia de cada una de las especies en la solución a esta longitud de onda, es decir la Absorbancia es aditiva en esta mezcla se encontró una longitud de onda de (610 nm) que era de color Amarillo (Harris, 1992).

Por otro lado, en la segunda parte de la práctica se comprobó la ley de Beer-Lambert, utilizando nuevamente el espectrofotómetro; pero esta vez se utilizó el máximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un analito, que mostrará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto será la que se utilizará en el análisis espectrofotométrico de dicho analito (Wade, 2004).

Hay que tener en cuenta que las sustancias utilizadas (analito), se encuentran en la región visible; se puede apreciar el color visible de una solución y corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm. (Díaz Nieves Abril, et al. 2004)

Por su parte, La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará.

Durante la práctica se analizó la variación de la absorción con respecto a la concentración de sustancias como el azul de bromotimol, rojo congo, y el permanganato de potasio. El rojo Congo tiene la particularidad que los espectros de las formas ácida y básica del colorante en igual concentración presentan la misma absorbancia a una longitud de onda denominada “punto isosbéstico". Esta longitud de onda es independiente de la concentración del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un parámetro fijo de referencia (Duymovich Claudio, 2005). En el caso del azul de bromotimol, se trabajó a un pH de 7.5 y a un pH ácido y se observó que a pesar de que en algunas concentraciones eran muy similares sus absorbancias, la longitud de onda trabajada para cada uno de ellos era distinta; por lo que no se pudo decir que en el azul de bromotimol exista un punto isobéstico. Para el permanganato de potasio, su color de absorbancia fue el anaranjado por presentar una longitud de onda de 610 nm y el color refractado fue un azul- verdoso.

Mediante medidas espectrofotométricas se determinan las concentraciones de la forma asociada y de la disociada de una sustancia sobre la base de que: ambas formas obedecen la ley de Lambert-Beer y que las concentraciones de las mismas son determinables, ya sea porque absorben a diferentes longitudes de onda o bien porque se cumple la condición de aditividad (Duymovich Claudio, 2005).

Para realizar correctamente la medición de las sustancias mencionadas anteriormente, se midió en contra de un blanco que contiene todas las sustancias usadas en la prueba, excepto

el compuesto que se quiere medir. El blanco se colocó primero en el instrumento y se ajustó luego la extinción a cero (100% de transmitancia) antes de tomar las lecturas para la muestra, lo cual se realizó efectivamente en la práctica (Plummer, 1981).

Para llevar a cabo la etapa de calibración, se representó la absorbancia de las muestras de concentración conocida a la longitud de onda de máxima absorbancia, frente a la concentración de dichas muestras. De esta manera se obtiene la curva de calibración. Esto fue entonces lo obtenido al graficar la concentración vs. absorbancia, en la cual se observó que la segunda aumentaba a medida que aumentaba la primera, la cual posee un comportamiento lineal (regida por la ley de Beer) (Plummer, 1981).

Mostrando que la absorbancia está relacionada linealmente con la concentración de las especies absorbentes y con la longitud de la trayectoria de la radiación. La relación lineal entre la absorbancia y la longitud de la trayectoria de la radiación a una concentración fija, es una generalización para la que hay pocas excepciones. (Anónimo)

Para el cálculo de la relación lineal fotométrica se realizó un estudio de regresión lineal de la recta hallada: Y = a + b X, Donde b es la pendiente de la recta y a la ordenada al origen. La pendiente b representa la linealidad fotométrica. La recta ideal sería Y = X por lo cual la pendiente ideal es 1,00 que indica que el instrumento responde linealmente en el rango de absorbancias estudiadas. Por el método de mínimos cuadrados se calculo a y b. fue utilizada la calculadora y un programa de computo (Excel).

Determinado el espectro de absorción de esa sustancia al graficar de la absorbancia de la sustancia en función de la longitud de onda. Al determinar las longitudes de onda de los picos de absorción, estos pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molécula. La absorción UV-Vis no es, sin embargo, una prueba específica para ningún compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de absorción de los compuestos, así como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotómetro. (Anónimo, 2007)

Por medio de esta práctica se logró aprender el uso correcto y manejo del espectrofotómetro de absorción UV-visible utilizándose sustancias que presentan color y que por medio de la espectrofotometría se puede observar su región de absorbancia en determinada longitud de onda; también determinó la longitud de onda de máxima absorbancia de cada sustancia, efectuando además espectros de absorción de luz visible y corroborando la relación lineal entre absorbancia y concentración, según la ley de Beer-Lambert.

BIBLIOGRAFIA

Anónimo, “Determinación Espectrofotométrica de pKa”. Licenciatura en Química, Química Analítica III Universidad Nacional de La Plata.

Anónimo. 2007. “Práctico de bioquímica y biofísica”. Biología celular.

Díaz Nieves Abril, Bárcena Ruiz J. Antonio, Fernández Reyes Emilio, Galván Cejudo

Aurora, Jorrín Novo Jesús, Peinado Peinado José, Meléndez-Valdés Fermín Toribio, Túnez

Fiñana Isaac. 2004. “Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales- Córdoba

Duymovich Claudio, Acheme Rosana, Sesini Sandra, Mazziotta Daniel. 2005. “Espectrofotómetros y Fotocolorímetros Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana”

Guasch Torres Josep. Reflexiones Sobre el Análisis Enológico (II): El Laboratorio Enológico (1ª) "Enólogos" nº 41 (mayo-junio 2006).

Harris, D. 1992. “Análisis Químico Cuantitativo”, Editorial Iberoamericana. Estados Unidos Pp.495-499

PLUMMER, D.T. 1981. Bioquímica práctica. Editorial McGrawHill Latinoamericana. Traducido de la segunda edición. Bogotá-Colombia.

Wade, L. G., 2004. Química orgánica, 5 edición, Prentice hall, Madrid,