LA METILACION DEL ADN Y SU MANIFESTACION … · La metilación es un proceso de modificación de...

Revista CENIC Ciencias Biológicas Val. 28, No. 3, 1997.

RESEÑA BIBLIOGRAFICA

LA METILACION DEL ADN Y SU MANIFESTACION EN LAS PLANTAS

M. Ramos Leal, T.D. Dinkova y M. Quintero.* Dpto. BioPlantas, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Avenida 25 y 158, Playa, Apartado Postal 6990, Ciudad de La Habana, *Instituto Superior de Ciencias Médicas de Sanctí Spirítus, Cuba.

Recibido: 22 de marzo de 1996.

RESUMEN. Se revisan algunos de los aspectos más sobresalientes sobre la metilación del ADN y su importancia en las plantas, a sa- ber: factores que la afectan, su relación con la expresión génica del ADN y métodos de detección.

ABSTRACT. Remarkable aspects on DNA methylation and its importance in plants are reviewed, affecting factors, relation to gene expression and detection methods.

INTRODUCCION

Muchos cambios heredables en el funcionamiento de los genes no pueden ser explicados por variaciones en las secuencias del ADN. Tales mecanismos epigenéticos influyen en la función del gen en la mayoría de los organismos com- plejos y pueden incluir efectos tales como funcionamiento de transposones, activación y silencio telómerico, etcétera.’

La metilación es un proceso de modificación de carácter reversible que experimenta el ADN después de ser sinteti- zado mediante la conversión enzimática de los desoxirribonu- cleótidos a metildesoxirribonucleótidos.2 Todas las bases ni- trogenadas del ADN pueden metilarse en diferentes posicio- nes, aunque la base que con mayor frecuencia aparece metilada es la citosina en su posición 5. Se planteaq ue el5%d e la citosina presente en una molécula de ADN está metilada en dicha posición. Cerca del 90% de los residuos de 5- metilcitosina (5mdC) en el ADN eucariótico se encuentran en la secuencia dinucleotídica C-X-G (X = A ó T).3,4 El nivel de metilación puede entonces definirse como la relación entre el contenido de metildesoxicitosina (mdC) y el de desoxicitosina total, tanto metilada como sin metilar:

mdC dC = (mdC + dC)

FACTORES QUEAFETANLAMETILKXDN Da ADN

Cada organismo posee su patrón de metilación que de- pende en muchos casos de la etapa de su propio desarrollo.5 De igual forma, cada tejido tiene su propio patrón de meti- lación, el cual es necesario para mantener su estado de dife- renciación.

Ha sido determinado que los patrones de metilación durante la replicación del ADN se mantienen estables y se ha podido precisar que los sitios metilados están sobre ambas cadenas y que además, se heredan de forma clonal.

Los patrones de metilación dependen también de la actividad metilante de la célula. Se han sugerido dos tipos de actividad metilante: la de novo y la de mantenimiento. La de novo es responsable de la metilación de sitios, los cuales no son metilados sobre ninguna de las cadenas de ADN. La ac-

tividad de la metilasa de mantenimiento actúa inmediata- mente después de la síntesis del ADN y adiciona grupos metilos a sitios hemimetilados (metilados en una sola cadena), es decir, a la nueva cadena recién sintetizada. Esta actividad de mantenimiento o de protección es la responsable de la herencia clonal de un patrón de metilación. En este caso, sólo se conservan las citosinas metiladas en la secuencia CPG.~ En el caso de los organismos eucariontes, las célu- las somáticas son muy eficientes en la metilación de mantenimiento o protección, pero la de novo es rara en este tipo de células.6

La mayoría de los patrones de metilación de los genes están correlacionados con su expresión.6 En el caso de la hipometilación, no siempre puede verse esta correlación. Cuando se trata de la hipometilación de genes no específicos para un tejido determinado, la expresión de dichos genes no está necesariamente relacionada con una función del tejido. Sin embargo, la hipometilación específica de tejido puede ser también relativa al patrón de expresión específico de cada tejido.

FUNCIONES BIOLOGICAS DE LA METILACION

La metilación y la expresión de genes

No está totalmente definido el papel que juega la meti- lación en las funciones de expresión del genomio.5 Sin embargo, existe la certeza de que la metilación ocupa un lugar clave en el control de los mecanismos que gobiernan la fun- ción de los genes y el proceso de diferenciación de los organismos. Desde hace muchos años se ha reconocido que la metilación juega un papel importante en el control y regu- lación de la actividad de los genes, aunque sin conocer los detalles de este papel en todos los casos.

Para los organismos procariontes, un efecto que poten- cia la acción de la metilación del ADN, concierne a las actividades de metilación dam y dcm.’ La dam (DNA-adenina metilasa) metila adenina, creando 6-metiladenina en la secuencia GATC. Por su parte, la dcm (DNA-citosina metilasa) metila citosinas internas, creando 5mdC en la secuencia CC(A/T)GG. La dam parece jugar un papel importante en la rep~t$ón del ADN, discriminando la cadena hemimetila- da. s

3

Sin embargo, parece ser que la principal importancia de estas actividades de la metilación está en actuar como limi- tante de la acción de las endonucleasas de restricción in vivo, en el caso de las bacterias. La presencia de residuos de hidroximetilcitosina glicosilados sustituyendo a las citosinas en el ADN, las hace inaccesibles endonucleasas de restricción,“-’ Y

por tanto, resistentes a las aunque éste no es el único

mecanismo de resistencia in vivo a las endonucleasas. La función esencial de la 5mdC parece ser la de modifi-

car las interacciones ADN-proteína durante el proceso de transcripción.‘4,‘5 El efecto de la modificación in vivo probablemente involucra muchas proteínas diferentes, incluyendo aquellas que van formando la estructura de la cromatina. En este sentido, el ADN metilado tiene un papel en la conforma- ción de ella.16

Una de las regulaciones de la transcripción del ADN es la inactivación de los genes para su expresión mediante la metilación. Este mecanismo involucra los genes que están dentro de la conformación de la cromatina no activa. Se conoce que la densidad de metil-CpG cercano al sitio promotor actúa como un determinante crucial de la represión de la transcripción. Los llamados promotores débiles son totalmente reprimidos por la metilación dispersa, mientras que los fuertes se reprimen sólo por una densidad incrementada de grupos metil-CpG.‘4

Según Razin y Cedar, ” existe una relación inversa entre la metilación del ADN y la expresión de los genes.

El grado de metilación de las regiones del ADN cerca- nas al promotor parece tener una gran importancia en la ex- presión génica, debido probablemente al estado de la cromatina y la asequibilidad de sus proteínas reguladoras. Por ende, el grado de metilación debe tener relación también con el grado de diferenciación celulari y con la expresión diferen- cial de los genes. Esto parece estar relacionado con lo plan- teado en este trabajo acerca de la función esencial que posee la 5mdC de modificar las interacciones ADN-proteína.

Debe señalarse que aunque muchas de estas aprecia- ciones resultan confirmaciones para los organismos procariontes, en el caso de los eucariontes, existen sistemas y funciones muy similares.‘8

La metilación en las plantas

El genoma de las plantas superiores se encuentra mucho más metilado que el de otros organismos.‘g En los animales la metilación es de aproximadamente 8 %, mientras que en plantas puede llegar normalmente hasta un 30% .” En ellas existen diferentes factores que pueden provocar cambios en los patrones de metilación. Uno de ellos es la edad del cultivo. Se ha encontrado que las semillas jóvenes presentan niveles de ADN metilado mucho menores que los tejidos ya maduros como las yemas.“’ También se ha determinado que la amplificación de los genes está acompañada de incrementos en su metilación.22. En el cultivo de tejidos se han observado muchas alteraciones en el genomio, incluyendo la metilación. Trabajos realizados en maíz han mostrado que la hipometilación ocurre 3,5 veces más frecuente- mente que la hipermetilación, en líneas regeneradas obteni- das a partir de dos embriones.23

El proceso de metilación ha sido obsetvado con frecuencia en las plantas transgénicas.24,25 Por su importancia, vale detenerse brevemente en este aspecto.

La posibilidad de entender un poco más no sólo las bases moleculares de la metilación, sino también, la ex- presión de la regulación génica en los eucariotes y la tec-

nología de la transgénesis, resulta en extremo interesante. Actualmente, gran cantidad de trabajos sigue un enfoque combinado en el cual se estudian estrategias de ingeniería genética en plantas, con la regulación de la expresión génica a través de genes silentes o metilados.26”’ Matzke y Matz- ke”’ en plantas transgénicas de tabaco, han demostrado que el estado silente, dependiente de la homología del promotor (única región homóloga entre transgenes),ocurre a nivel trans- cripcional y está asociado con incrementos de la metilación. Este estado silente puede ser mantenido aún en el segundo retrocruce. También determinaron la presencia de diferentes loci silentes que contenían multicopias metiladas del gen transferido.

En otros trabajos, se encontraron igualmente, niveles muy variables de expresión, empleando transgenes inser- tados en plantas.30 Pueden incluso causar la inactivación de genes homólogos residentes en el genoma de la planta re- ceptora, fenómeno que ha sido llamado co-supresión y ha sido descrito en tabaco y petunias2g’30 Empleando mutantes transgénicos de Arabiciopsis spp. Paszkowski y COI.,~’ estu- diaron la existencia de genes, que aunque metilados, man- tenían un nivel de expresión génica.

Uno de los factores que mayor influencia ha causado sobre la metilación lo constitu&en las hormonas que forman parte del medio de cultivo.26’ Como ha sido referido anterior- mente, se conoce que cada tejido tiene su propio patrón de metilación, es decir, un nivel basal, el cual se determina en ausencia de auxina y que es importante para mantener el estado de diferenciación celular. La alteración de este patrón provoca serias consecuencias en varios procesos, entre ellos en la embriogénesis somática.27 Para células en diferencia- ción en presencia de alto contenido de auxinas, el ADN se encuentra hipermetilado y la embriogénesis se detiene, de igual forma que cuando existen agentes hipometilantes.

Esta metilación que varía más o menos de forma aleato- ria como respuesta a las auxinas, no es específica para el tejido y es reversible, siendo una señal para distinguir y desor- ganizar los patrones diferenciantes. También puede provocar un cambio en el programa que en este caso conduce a la adquisición del potencial embriogénico.

El nivel de auxinas, tanto naturales como sintéticas, ha mostrado un fuerte efecto en el contenido de 5mC en el ADN de callos y células en el cultivo. La metilación puede incre- mentarse en un intervalo amplio, desde 15 hasta 70% , con relación a la citosina total. El ácido indolacético (AIA) y el inositol incrementan la metilación no específica del ADN genómico en células rizogénicas de zanahoria en crecimiento, en ausencia de kinetina (inhibidor de la inducción de raíces). En cambio, al incluirla en el medio se reduce la metilación del ADN.“”

Efecto del 2,4-D sobre la metilación

Se han realizado estudios con varios reguladoresdel crecimiento, entre ellos, la auxina sintética ácido 2,4-dicloro- fenoxiacético (2,4-D),32 de amplia utilización en el cultivo de tejidos vegetales in vitre.

La presencia de 2,4-D en el medio, es un importante fac- tor en la iniciación de la embriogénesis somática,33 debido a que es el responsable de la inducción de la dediferenciación en el tejido y proliferación de callos34. Sin embargo, más tarde su presencia influye negativamente en el estableci- miento y la regeneración de plantas a partir de cultivos de callos y de suspensiones célulares. Los estudios morfológicos de los callos neoformados a partir de suspensiones celulares

4

de caña de azúcar, mostraron que a las concentraciones de 3,Oy 1,5 mg/L de 2,4-D la presencia de embriones somáticos fue pobre. Sin embargo, a concentraciones de 0,5 mg/L se observó la presencia de embriones bien definidos, además de primordios foliares precoces.35

Estos resultados corroboraron que a altas concentraciones de auxina se favorece la formación de callos no embrio- génicos (Ramos Leal y col., en preparación), pudiendo ocurrir variaciones en la metilación del ADN celular, debido al efecto hipermetilante del 2,4-D.

La utilización de agentes hipometilantes ha contribuido a dilucidar en parte el proceso de metilación.5 Entre ellos, se encuentran la 5azacitidina (5AzaC), el dimetilsulfóxido y el butirato, los cuales son inhibidores de la metilasa de mantenimiento. La 5-AzaC actúa como un inhibidor competitivo de esta enzima.24 Algunos autores han asociado los procesos de diferenciación con la desmetilación de sitios específicos. Esto se ha evidenciado induciendo la diferenciación con inhibidores de la ADN-metilasa.’ Sin embargo, esta prueba no resulta aún concluyente. Casi todos los genes tejido-específi- cos, se encuentran totalmente metilados en los tipos de célu- las que no expresan los genes, mientras son modificados en células que muestran transcripción activa. Esta modificación consiste en la desmetilación en las células de expresión.‘g

Importancia del estudio de la metilación durante el proceso de embriogénesis somática en plantas

La frecuencia con que ocurre la embriogénesis somática en plantas ha motivado que en los últimos tiempos muchos estudios hayan sido dirigidos hacia este proceso, dada la potencialidad que ofrece para la biotecnología como basamento teórico de la llamada semilla artificia/.36 Como se trata de un proceso de diferenciación netamente regulado por la ex- presión de genes específicos en cada etapa del desarrollo, el grado de metilación del ADN debe necesariamente tener una influencia importante. En los últimos años, varios reportes ha- cen énfasis en la metilación como un proceso regulatorio del desarrollo normal de la embriogénesis.

La metilación del ADN se ha visto muy relacionada con procesos del desarrollo tales como la embriogénesis cigótica y la embriogénesis somática en eucariotes.‘g

En este sentido, la metilación aborda tanto la desmeti- lacíón activa como la metilación de novo. La relación entre estos dos procesos opuestos es la que promueve las bases para la formación de los patrones de metilación correctos para cada tejido. Se han realizado muchos experimentos que demuestran esta función de la metilación en la embriogénesis en animales.‘g Después de analizar los patrones de meti- lación de determinados genes en esperma y tejidos somáti- cos se observó que en el tejido embrionario existía una meti- lación mayor, con respecto a la detectada en los tejidos referi- dos. Todo esto sugirió que muchos de los grupos metilos desaparecen durante el proceso de diferenciación.6

En plantas superiores, se han realizado algunos estudios sobre la metilación durante la embriogénesis.27’37 Loschiavo y ~01.~’ observaron embriones anormales en cultivo de células de zanahoria como consecuencia de la alteración de los niveles de metilación del ADN. Los niveles de metilación tam- bién se han relacionado con la potencialidad embriogénica de las células somáticas en cultivos de callos (Ramos Leal y col., en preparación). Sin embargo, a pesar de los estudios realizados que demuestran la importancia del papel de la meti-

lación,22’27 aún no se ha llegado a tener una visión certera sobre la relación entre ella y el desarrollo de la embriogénesis.

El cambio molecular de células somáticas a embriogéni- cas es considerado como una marcada capacidad que puede hacer posible la reiniciación de un ciclo ontogénico completo sin la participación de la fertilización sexual. Es importante la activación del sistema y la inducción de la división célular en la regeneración del estado embriogénico. La vía más utilizada es aquella donde las células embriogénicas somáticas son formadas artificialmente por tratamiento de células sómaticas con auxinas.38 La metilación dentro del programa de desarrollo o la flexibilidad de los estados célulares diferenciados en plantas representa un ejemplo de un fenómeno biológico que puede ser estudiado con la expectativa de realzar mecanismos no conocidos en el control molecular de diferenciación célular y desarrollo de eucariontes superiores.

Métodos de detección de ADN metilado

Desde hace mucho tiempo se han venido empleando diferentes métodos de identificación y determinación de ADN metilado. Dentro de ellos se encuentran, la cromatografía ga- seosa, la espectrometría de masas, el empleo de anticuerpos específicos y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).2

El método de HPLC permite determinar, tanto la cantidad de bases modificadas como no modificadas.20’3g Esto se lo- gra, a través de una hidrólisis química o enzimática del ADN y posterior separación sobre un soporte adecuado.

Otro método muy utilizado es el empleo de isosquisó- meros, que son enzimas de restricción que reconocen iguales secuencias específicas en el ADN, pero que provienen de bacterias diferentes (Tabla 1). En este caso, una es sensible a la presencia de bases metiladas y la otra no. De este modo, se puede determinar el nivel de metilación del ADN por com- paración con patrones de restricción.2~23~24~3’~40 Por otro lado, si se desea detectar la metilación de un gen específico, los patrones se analizan luego de la hibridación con sondas específicas.4’

Existen múltiples enzimas que reconocen la secuencia CpG en el ADN, siendo esto de gran utilidad en los estudios sobre metilación. Entre ellas, se encuentran las parejas de isosquisómeros Msp I/ Hpa ll, Nde II/ Sau 3AI y otras.42Z43

Debe recalcarse una vez más, la enorme importancia que tiene la metilación dentro de la regulación de la expresión génica, particularmente, en procesos de eminente carácter regulatorio como la embriogénesis somática en las plantas,44r45 aún cuando no esté claramente definido dicho papel en tales procesos de desarrollo.

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TABLA I Pares de isosquisómeros de diferente sensibilidades a la metilación

Endonucleasa Sitio de reconocimiento Corta No corta

Mspl CCGG CCGG

C :iG

Hpall CCGG CCGG

Ndell

Sau3Al

BstOl

GATC GATC

GAT F5

GATC GATC

CC/(A/T)GG &T)GG

EcoRII CC(A/T)GG

GATm5C

hm5hm5 C (W)GG

m5m5 C C(A/T)GG

Z(A/T)GG

&A)GG

&A)GG hm5hm5

C C (T/A)GG

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