TERAPIAS DIRIGIDAS CONTRA ... - … · TERAPIAS DIRIGIDAS CONTRA METILACIÓN DE ADN Y FACTORES DE...

1
TERAPIAS DIRIGIDAS CONTRA METILACIÓN DE ADN Y FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE MAMA: ESTUDIO PRECLÍNICO. María F. Montenegro, Antonio Piñero, Juan Cabezas, Caridad Marín, Pedro J. Galindo, José N. Rodríguez. Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca”. Murcia. INTRODUCCIÓN: Como en otros tumores malignos, el cáncer de mama es el resultado de la acumulación de alteraciones genéticas que conllevan la sobreexpresión de oncogenes y la pérdida de genes supresores. El descubrimiento de la familia de proteínas ligando metilCpG (como la MeCP2) proporciona una conexión entre la metilación del ADN y la deacetilación de histonas como mediadores de la expresión de genes. La importancia de estos mecanismos epigenéticos en la expresión de genes relacionados con el cáncer sugiere que bloquear farmacológicamente el ciclo de la metionina podría representar una estrategia atractiva para desarrollar terapias que reactiven genes supresores de tumores en células cancerosas. Nuestro grupo demostró que la terapia combinada de un inhibidor de transportadores de nucleósidos y adenosindeaminasa, como el dipiridamol (DIPY) en presencia del nuevo antifolato sintético TMECG (trimetoxibenzoilepicatequina) bloquea eficiente los ciclos del ácido fólico y de la metionina en células de melanoma, con el resultado de una muerte celular masiva. Un derivado de este último, trimetoxibenzoilcatequina (TMCG) presenta una alta actividad antiproliferativa en otras estirpes celulares tumorales epiteliales, entre ellas, en el cáncer de mama. OBJETIVO: Evaluar si la combinación de TMCG y DIPY representa una terapia epigenética válida contra el cáncer de mama. MATERIAL Y MÉTODOS: Se han utilizado cultivos celulares con MCF10 (estirpe celular epitelial mamaria humana no tumorogénica), MCF7 y MDAMB231 (estirpe celular mamaria humana tumoral) y 4T1 (estirpe celular mamaria tumoral murina) procedentes de la American Type Culture Collection. Se desarrolló también una estirpe resistente a tamoxifeno (MCF7TamR) desde la línea parental, manteniendo las células en medio enriquecido con tamoxifeno (10 nM) durante 6 meses. La inducción de la apoptosis se evaluó mediante estudio de la fragmentación de DNA mediante un kit específico (Roche Diagnostics, Barcelona, Spain) y por la tinción de Hoechst. Mediante qRTPCR arrays (Human Breast Cancer MethylProfiler de SABiosciences) se analizó la metilación de promotores de genes relacionados con el cáncer de mama. Los ensayos de interferencia de ARN para el bloqueo selectivo de la expresión de genes se realizó mediante transfección de siRNAs específicos con lipofectamina. RESULTADOS: El tratamiento de células MCF7 y MDAMB231 con DIPY inhibe el crecimiento celular, con valores de IC50 en el rango micromolar (16 µM y 20 µ M para células MCF7 y MDA MB 231 respectivamente) (Figura A). La exposición de las células a 10 µM de TMCG inhibió el crecimiento de ambos tipos celulares en un 85 % para células MCF7 y en un 75 % para las MDAMB231. La combinación DIPY/TMCG sobre las células en cultivo resultó en un fuerte efecto sinérgico con una reducción del IC50 para DIPY hasta 1,8 µM y 1.3 µM para MCF7 y MDAMb231 respectivamente (Figura 1A). Los compuestos inhibieron el crecimiento de las células mamarias tumorales de ratón 4T1 en tratamientos monoterapia pero no produjeron daño celular ya que las células no mostraron los efectos característicos como el retraimiento celular, la pérdida de contacto celular o la fragmentación citoplásmica y nuclear (Fig B). Los resultados de la combinación de DIPY y TMCG muestran que la reducción en la viabilidad celular de células 4T1 se debe a la inducción de la apoptosis (Fig C y D). Mediante qRTPCR arrays se analizó la metilación de 24 genes implicados en el cáncer de mama. En concreto, tres genes supresores de tumores (H1C1, RASSF1A y p73) mostraron alta metilación de sus promotores en células tumorales de mama comparadas con células control no tumorales (Figura E). La combinación de TMCG (10 µ M) y DIPY (5 µ M) disminuyó eficientemente el grado de metilación de estos promotores en combinaciones de 72 horas. El silenciamiento de RASSF1A con shRNARASSF1A en células MDAMB231 inhibió la muerte celular inducida por la combinación TMCG DIPY, demostrando que las células tumorales de mama tienen silenciado epigenéticamente este gen (Figura F) lo que les confiere resistencia a tratamientos inductores de apoptosis. CONCLUSIÓN: El uso concomitante de terapias contra metilación del ADN sería un tratamiento epigenético efectivo que reactiva la expresión de RAASF1A e induce la apoptosis en células tumorales mamarias. E F

Transcript of TERAPIAS DIRIGIDAS CONTRA ... - … · TERAPIAS DIRIGIDAS CONTRA METILACIÓN DE ADN Y FACTORES DE...

TERAPIAS DIRIGIDAS CONTRA METILACIÓN DE ADN Y FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN PARA EL

TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE MAMA: ESTUDIO PRECLÍNICO.

María  F.  Montenegro,  Antonio  Piñero,  Juan  Cabezas,  Caridad  Marín,  Pedro  J.  Galindo,  José  N.  Rodríguez.  Hospital  Clínico  Universitario  “Virgen  de  la  Arrixaca”.  Murcia.  

INTRODUCCIÓN: Como en otros tumores malignos, el cáncer de mama es el resultado de la acumulación de alteraciones genéticas que conllevan la sobreexpresión de oncogenes y la pérdida de genes supresores. El descubrimiento de la familia de proteínas ligando metil‑CpG (como la MeCP2) proporciona una conexión entre la metilación del ADN y la deacetilación de histonas como mediadores de la expresión de genes. La importancia de estos mecanismos epigenéticos en la expresión de genes relacionados con el cáncer sugiere que bloquear farmacológicamente el ciclo de la metionina podría representar una estrategia atractiva para desarrollar terapias que reactiven genes supresores de tumores en células cancerosas. Nuestro grupo demostró que la terapia combinada de un inhibidor de transportadores de nucleósidos y adenosindeaminasa, como el dipiridamol (DIPY) en presencia del nuevo antifolato sintético TMECG (trimetoxibenzoilepicatequina) bloquea eficiente los ciclos del ácido fólico y de la metionina en células de melanoma, con el resultado de una muerte celular masiva. Un derivado de este último, trimetoxibenzoilcatequina (TMCG) presenta una alta actividad antiproliferativa en otras estirpes celulares tumorales epiteliales, entre ellas, en el cáncer de mama.

OBJETIVO: Evaluar si la combinación de TMCG y DIPY representa una terapia epigenética válida contra el cáncer de mama.

MATERIAL Y MÉTODOS: Se han utilizado cultivos celulares con MCF10 (estirpe celular epitelial mamaria humana no tumorogénica), MCF7 y MDA‑MB‑231 (estirpe celular mamaria humana tumoral) y 4T1 (estirpe celular mamaria tumoral murina) procedentes de la American Type Culture Collection. Se desarrolló también una estirpe resistente a tamoxifeno (MCF7TamR) desde la línea parental, manteniendo las células en medio enriquecido con tamoxifeno (10 nM) durante 6 meses. La inducción de la apoptosis se evaluó mediante estudio de la fragmentación de DNA mediante un kit específico (Roche Diagnostics, Barcelona, Spain) y por la tinción de Hoechst. Mediante qRT‑PCR arrays (Human Breast Cancer Methyl‑Profiler de SABiosciences) se analizó la metilación de promotores de genes relacionados con el cáncer de mama. Los ensayos de interferencia de ARN para el bloqueo selectivo de la expresión de genes se realizó mediante transfección de siRNAs específicos con lipofectamina.

RESULTADOS: El tratamiento de células MCF7 y MDA‑MB‑231 con DIPY inhibe el crecimiento celular, con valores de IC50 en el rango micromolar (16 µM y 20 µM para células MCF7 y MDA‑MB‑231 respectivamente) (Figura A). La exposición de las células a 10 µM de TMCG inhibió el crecimiento de ambos tipos celulares en un 85 % para células MCF7 y en un 75 % para las MDA‑MB‑231. La combinación DIPY/TMCG sobre las células en cultivo resultó en un fuerte efecto sinérgico con una reducción del IC50 para DIPY hasta 1,8 µM y 1.3 µM para MCF7 y MDA‑Mb‑231 respectivamente (Figura 1A). Los compuestos inhibieron el crecimiento de las células mamarias tumorales de ratón 4T1 en tratamientos monoterapia pero no produjeron daño celular ya que las células no mostraron los efectos característicos como el retraimiento celular, la pérdida de contacto celular o la fragmentación citoplásmica y nuclear (Fig B). Los resultados de la combinación de DIPY y TMCG muestran que la reducción en la viabilidad celular de células 4T1 se debe a la inducción de la apoptosis (Fig C y D). Mediante qRT‑PCR arrays se analizó la metilación de 24 genes implicados en el cáncer de mama. En concreto, tres genes supresores de tumores (H1C1, RASSF1A y p73) mostraron alta metilación de sus promotores en células tumorales de mama comparadas con células control no tumorales (Figura E). La combinación de TMCG (10 µM) y DIPY (5 µM) disminuyó eficientemente el grado de metilación de estos promotores en combinaciones de 72 horas. El silenciamiento de RASSF1A con shRNA‑RASSF1A en células MDA‑MB‑231 inhibió la muerte celular inducida por la combinación TMCG ‑DIPY, demostrando que las células tumorales de mama tienen silenciado epigenéticamente este gen (Figura F) lo que les confiere resistencia a tratamientos inductores de apoptosis. CONCLUSIÓN: El uso concomitante de terapias contra metilación del ADN sería un tratamiento epigenético efectivo que reactiva la expresión de RAASF1A e induce la apoptosis en células tumorales mamarias.

E  

F