LA ESFEROCITOSIS HEREDITARIA Y SU DIAGNOSTICO EN LA...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Facultad de Medicina

Departamento de Medicina

5301486286

LA ESFEROCITOSIS HEREDITARIA YSU DIAGNOSTICO

EN LA PRACTICA CLINICA

María del Pilar Ricard AndrésMadrid, 1993

Colección resis Doctorales. NY 212/93

x-ss-L2rs7-r--S

© María del Pilar Ricard Andrés

Edha e imprime la Edhorial de la UniversidadComplutense de Maddd. Servicio de Reprograf la.Escuela de Estomatología. Ciudad Universitaria,Madrid, 1993.Ricoh 3700Depósito Legal: M-30783-1993

La Tesis doctoral de D.r ¡Ñ~~&A- 2&’ZQ.4IKL/~

Utulada 1k ~.

Director Dr. D% ~fue leída en la Facultad de MEDIO <líA de laUNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDel dla?r. de [}tt~.. cfe 191.2ante el tribunal constituidopor los slguient$s Profesores:

Presiden teVocalVocal..jr~.e.6=rdccu. ~

VooakdtsSecretario~ 1&x%’ft~

habiendo recibido la calificación de . cuwxgte uc..aahx&ct.L.

Madrid, a..+ de.. ti Lo . de 19.42.El Secrelarlo del Tribunal

IJNIVERS¡dAd COMpLUTENSE dE MAdRidFACULTAd dÉ MEdiciNA

A ESFEROCITOSIS HEREDITARIA Y SU DIAGNOSTICOEN LA PRACTICA CLIN 1CM’

TESIS DOCTORAL

MARIA dEL PiL&n R¡cÁrtd AndRés-MAdRid, 1992-

FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

‘LA ESFEROCITOSIS HEREDITARIA Y SU Dlt.GNOSIiCO

EN LA PRACTICA CLíNICA”

Memoria presentada para

Grado de Doctor en Medicina

por la Universidad Complutense

por la licenciada D’ Marfa del

Andrés y dirigida por la Dra.

Gilsauz Rodriguaz, Profesora

Departamento de Medicina.

optar al

y Cirugfa

de Madrid

Pilar Ricard

D’ Florinda

Titular de!

Madrid, Mayo de 1992

Este trabajo se ha realizado merced al Proyecto de Investigación del

Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social PISS 86/737.

DR. D. CARLOS PEREZACtJA CLAHAGYRAND, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTODE MEDTCTNADE ¡A FACULTAD DE MEDlCIi~A. fl.C.M.

INFORMA: Que una vez examinado el Trabajo rrc,sentado por Di~a.Ma DEL PILAR RICAED ANDRES. titulado: ~LAESFEPOCITOSIS HEREDITAPIA Y SU DIAGNOSTICO EN LAPRACTICA CLíNICA”, diri

9ido por 10 Profra, Dra.Dña.Florinda Gilsartz Rodriguez, este nepartaniento dAsu conformidad para qwe dicho trabajo sea le=do ydefendido en público con vistas a su aprobación 00510

Tesis Doctoral.

Fecha reunión El Director del DepailatnemtOConsejo Departamento

1 dc Junio de 1.992

F4o.: prof. C~rlnt P~revagua¡locha y <torta)

1 de Junio 1.9~2

D FLORINDA CILSANZ RODRíGUEZ, DOCTORA EN MEDICINA y

CIRUGÍA Y PROFESORA TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE MEDICINA

DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

CERTIFICO: Que la Tesis Doctoral titulada LA ESFEROCITOSIS HEREDI

TARIA Y SU DIAGNOSTICO EN LA PRACTICA CLíNICA”, ha

sido realizada por D@ Marfa del Pilar Ricard Andrés bajo mi

dirección y reúne las caracterfsticas necesarias para optar al

Grado de Doctor en Medicina y Cirugfa.

Y, para que asf conste, a los efectos oportunos, firmo el plesente

certificado en Madrid, a veintiseis de Mayo de mil novecientos noventa ~

dos.

Pdo.: Dra. O’ Florinda Gilsanz

INDICE

AGRADECIMIENTOS

ABREVIATURAS

1. INDICE GENERAL

1. INTRODUCCION

2. OBJETI\’OS

3.\IATERIALES Y METODOS

4. RESULTADOS

5. DISCUSiON

6. CONCLUSIONES

7. RESUMEN

8. BIBLIOGRAFIA

IL INDICE DE FIGURAS

III. INDICE DE GRAFICAS

IV. INDICE DE TABLAS

Y. INDICE DE ARBOLES GENEALOGICOS

AGRADECIMIENTOS

A la Dra, D~ Floririda Gilsana por su amistad y ejemplo, cuya direc-

ción. ayuda y confianza constantes e incondIcionales han hecho posible es-

ta Tesis Doctoral

A la Dra. D’ Isabel Millán, del Servicio de Bicesradistica de la Clí-

nica “Puerta de Hierto”, por su amabilidad y valiosa intervención en la

práctica e interpretación del tratamiento estadístico.

A D’ Elena Salinas y a D. Juan A. Torres, ATS/DUE del Laboratorio

de Hematología del Hospital “12 de Octubre”, por su colaboración inesti-

mable y por su amistad.

A los Dres. D. Francisco j. Aracil ;‘ O. Luis F. Villa, del HospitalIiniversicarlo “Príncipe de Asturias’, por brindarme gentilmente su tiempo

y sus conocimientos de informátlc~ en la elaboración de las gráficas, ár-

boles genealógicos y figuras.

A mis compañeros del Ser~’lcio de Hematología del Hospital Univer-

snahio “Príncipe de Asturias”, tanto personal médico como técnico y auxi-

liar, por su simpatía, disposición y muchas veces agradable compañía

duranie la realización de parle del trabajo experimental. Asimismo deseo

expresar ml agradecimIento a los Servicios de Hematología, de Análisis

Clínicos y de Medicina Nuclear del Hospital ‘12 de Octubre”, y al Servi-

do de Análisis Clínicos del Hospital Universitario “Príncipe de Asturias”.

A DI Rosa Trueba, biblIotecaria del Hospital Universitario “Príncipe de

Asturias’, por su interés y eficaz labor.

A toda mi familia por su comprensión y paciencia infinitas, especial-

mente a mi esposo, Fernando, por su apoyo y por las muchas horas que

no le he podido d~dicar; a mi da Angelines, que con tanto cariño y es-

fuerzo ha mecanograliado esta Tesis Doctoral, y a mi padre, Enrique,

sIempre a punto para ayudar en lo posible.

Pero, sobre todo, mi agradecimiento va dirigido a los enfermos y sus

familias, verdaderos protagonistas de este trabajo, Que sin su decidida co-

laboración nunca hubiese existido.

ABREVIATURAS

contenido de la membrana eritrocitarle en ankirina.

análisis de la tarianza.

tanto por ciento de hematíes con concentración de hemoglo-

bina entre 35 y 37,5 g/dL.

tanto por cienro de hematiés con concentración de hemoglo-

bina entre 37,5 y 40 gIdL.albúmina sérica bovina.

concentración de hemoglobina

coeficiente de variación.

div lothreitol.

esferocítosis hereditaria.

enfermos do EH esplenectomizados.

enfermos de EH no esplenectomizados.

eritropoyetina.

grados de libertad.

hemoglobina.

concení ración de hemoglobina corpuscular media medida

directamente.

hemoglobina corpuscular media.

corpuscular media calculada.

he matoc nto.

desviación standard de la distribución de los hematíes se-

gún concentración de hemoglobina.

tanto por ciento de hematíes con concentración de hemoglo-

bina mayor de 41 g/dL.

número de hemaries.

intervalo de confianza.

lactato deshidrogenasa.

ácido nibonucleico mensajero.

densidad óptica, absorbancia.

buifer salino fosfato pH 7,2—7,4.

Ank/B3:

ANOVA:

Ares 1:

Area II:

BSA:

CHCNi:

CV

DTT:

EH:

EHE:

EHNE:

EPO:

1.:

1-ib:

HC:

HCM:

Hct:

% Hiper:

Ht les:

IC:

LDH:

mRN.A:

00:

PB5:

lv

PCCEI-I: Programa de Control de Calidad Externo en Hematología.

Comité de Estandarización en Hematología. Asocia~ión

Española de Hematología y Hemocerapia.

PEH: progenitores de. enfermos de EH sin historia familiar.

PMSF: feniírnerilsulfonllfluoride.

coelicienre de correlación simple.

RDW: coeficiente de variación de la distribución de los hematíes

según volumen.

ROO: resistencia globular osmótica.

SD: desviación standard.

SDS: dodecilsullato sádico.

SDS—PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SOS.

Sp/B3: contenido de la membrana eritrocitaria en espectrina.

5SF: solución salina fisiológica (CI Ma 9 gIL).TBST: bufler tris salino con Tween 20.

TEMED: N, N, Y, N’ tetrametiletiíendlamina.

VCM: volumen corpuscular medio.

media ar¡tmótica.

1. INDICE GEN ERAL

Página

1. INTRODUCCION ~ í

1.1. Apunte histórico 2

1.2. Concepto clínicos de la Esferocitosis Hereditaria <EH) 3

1.2.1. Definición y prevalencia 3

1.2.2. Herencia 4

1.2.3. Manifestaciones clínicas 5

1.2.4. Complicaciones 6

1.2.5. Asociación con otras enfermedades 8

1.3. Base molecular de a EH 9

1.3.1. Composición y estructura de la membrana eritrocitaria . 10

1.3.2. Las proteínas de la membrana eritrocitaria. Estructura,

genética y función 14

1.3.3. El esqueleto de a membrana eritrocitaria. Organización

y modulación 24

1.34. Función del esqueleto de la membrana erítrocitaria

1.3.5. Defectos moleculares de la EH 30

1.4. Fisiopatología de la EH 33

1.5. DiagnóstIco de la EH 38

1.5.1. Datos cífnicos 38

1,5.2. Morfologfa eritrocitaria y datos hematológicos 39

1.5.3. Resistencia globular osmótica. Otros tests diagnósticos ... 44

¡.5.4. Estudio del defecto molecular de la EH 48

1.6. Tratamiento y pronóstico

2. OBJETiVOS 53

3. MATERIALES Y METODOS 59

3.!. Enfermos y controles 60

3.2. Citometrla de difracción de luz láser 61

3.3. Morfología de la serie roja 64

VII

Página

5.3.3. Características citométricas de la EH. Relación

con otros datos 185

5.3.4. Eficacia estadística de la citomet rfa de luz lá-

ser en el diagnóstico de a EH 186

5.3.5. Fragilidad osmótica, esferocitosís y EH 187

5.3.6 Rol de la SOS-PACE de la membrana eritrocí-

tana en el diagnóstico de la Si] 168

5.4. ProgenItores de EH sin historia familiar 1~2

5.5. ClasIficación de la EH según sir expresión biológica .. 194

6. CONCLUSIONES 198

7. RESUMEN 201

8. BIBLIOGRAFíA 205

II. INDICE DE FIGURAS

Página

1. — Esquema del esqueleto de la membrana eritrocitaria 12

2. — Esquema de la electroforesis en ~eí de poliacrilamida en pre

senda de SDS (SDS-PAGE) de la membrana erierociraria .... 14

3, — Organización espacial del transportador aniónico o banda 3 . 16

.4. - Organización tetramérica de la espectrina y sus asociaciones í 8

5. — Anatomía molecular de la espectrina 20

6. — Complejos de unión dei esqueleto de la membrana erítrocira—

ria 22

7. — Estructura de la proteína 4.1 22

8. — Esquema de la anatomía ultraestructural del esqueleto de la

membrana eris rocitaria 25

9. — Esquema de los reordenamientos del esqueleto de la membra-

na en la deformación reversible de los hematíes 2810. - Esquema de la génesis de esferocitos en la EH 34

11. — Patobiología de la EH ‘612. — Morfología eritrocitaria en la EH 40

13. — Transformación discocito a esferoestomaioclío y esferoequino

ctto Al

¡4. — Esquema de la citometria de apertura—impedancia 42

15. — Esquema de la citometria por difracción de luz láser 43

¡6. — Fragiiidad osmótica de los hematíes en la EH 45

ti. — Densitometrías de SDS—PAGE de la membrana eritrocitaria.

Control y EH 49

18. - Distribuciones de los hematíes según concentración de hemo-

globina por cilometria de luz láser. Control y EH

19, — SDS—PAGE de la membrana erítrocitaria65

71

III. INDICE DE GRAPICAS

Página

1. — Distribución de frecuencias. Variables edad y gravedad ¡18

2. — Distribución de frecuencias. Variable sexo 119

3. — Distribución de frecuencias. Variable herencia 120

4. — Distribución de frecuencias. Variable gravedad 121- EHNE. Correlación lineal, vasiables CHCM y 1-fC 122

6. - EHNE. Correlación lineal, variables CHCM y Arce :1 123

7, — EHNE. Correlación lineal, variables HC y % Hiper 124

8. — EHNE. Correlación lineal, variables HC y Area II 125

9. — EHNE. Correlación lineal, variables RDW y retículocitos 126

10. - EHNE. Correlación lineal, variables CÍICM y % Hiper 127

11. — EHNE. Correlación lineal, variables ROO inmediata Inicial y

RDW ¡28

¡2. — EHNE. Correlación lineal, variables ROO Incubada media í’

% Hiper 129

13. - EHNE. Correlación lineal, variables ROO incubada media y

RDW 130

14. — El-INE. Correlación lineal, variables ROO Incubada media y re-

rictilocitos 131

15. — EHNE. Correlación lineal, variables haproglobina y hematfes ... ¡32

16. - EHN’E. Correlación lineal, variables EPO y hematfes 133

17. — EHNE. Correlación lineal, variables EPO y hemoglobina 134

18. - EHNE. Correlación lineal, variables EPO y hematocrito 13$

19. — EHNE. Correlación lineal, variables EPO y RDW 136

20. — EHN’E. Correlación lIneal, variables, gravedad y liematies 137

21. — EHNE. Correlación lineal, variables gravedad y hemoglobina ... 138

22. — EHNE. Correlación lineal, variables gravedad y hematocrito 139

23. - EHNE. Correlación lineal, variables gravedad y RDW 140

24, - EHNE. Correlación lineal, variables gravedad y reticulocítos 141

25. — EHNE. CorrelacIón lineal, variables gravedad y bilirrubína total 142

26. — EHN’E. Correlación lineal, variables gravedad y EPO ¶43

27. — EHNE. Correlación lineal, variables gravedad y ROO Incubada

144

145

media

28. — EHE. Correlación lineal, variables HG y RDW

x

Página29. — EHE. Correlación lineal, variables HG y % Hiper 146

30. — EHE. Corselaclón línea], variables HG y Arce II ¶47

31, — EHE. Correlación lineal, variables HC y ROO inmediata inicial 148

32. — EHE. Correlación línea], variables % Hiper y RDW 149

33. - EHE~ Correlación lineal, variables % Hiper y ROO inmediata ini

clal 150

34. — EHNE y Controles. DistrLbuclón de frecuencias, variable HG 151

35. — EMNEy’ Controles. Disíribución de frecuencias, variable % Hiper 152

36. — EHN’E y Controles. Distribución de frecuencias, variable Arce 1. ¡53

37, - EMNEy Controles. Disttibución de frecuencias, variable Area II. 154

38. — EH, PEH y Controles. Distribución de frecuencias, variable Sp/B3 155

39. — EH, !EH y Controles. Distribución de frecuencias, variable Ank/B3 156

IV. INDICE DE TABLAS

Página

— Defectos moleculares primarios en la EH 95

II.— Abreviaturas, unidades y valores de referencia de los paráme

tros cuantitatvos 96 y 97

II].— Abretiaturas y códigos de los parámetros cualitativos 98

IV. - EHNE. Datos clínicos, bioquímicos y de membrana 99 y 100y. - EHNE. Datos hematológicos 101 y 102

VI. — EHE. Datos clínicos, bioquímicos y de membrana 103Vil. — EHE. Datos hematológicos 104

VIII.- PEH. Datos bioquímicos y de membrana 105IX. - PEH. Datos hematológicos 106

X. — Controles. Datos hemociíométrlcos. Estudio de la membrana

erir rocharía. Tabla de medias 107

XI. — Casos, Datos bioquímicos y del estudio de la mombrama en—

trocitaria. Tabla de medias 108

XII. — Casos. Datos hematológicos. Tabla de medias 109

XIII. - EHNE. Análisis respecto de la variable gravedad líO

xl’:. - Clasificación de la EH según su expreslvidad biológica 111

XV. - EHE. Datos pre y postespíenectomia .112

XVI. — EHE. Respuesta a la esplenectomía 113

XVII. - Casos y controles. Estudio intergrupo 114XVIII. — Citometria por difracción de luz láser. Estudio de la mem-

brana eritrocitaria. Eficacia diagnóstica 11$XIX. — Déficit parcial de espectrina y ankirina de la EH en la Ile

ratura 116

V. INDICE DE ARBOLES GENEALOGICOS

Página

Códigos 158

Familia A 159

Familia 8 159

Familia C 160

Familia O ¶60

Familia E ¶6!

Familia F ¶61

FamilIa G 162

Familia Fi 162

Familia 1 163

Familia J 163Familia 1< 164

Familia L 164

Familia M 165

Familia N 165

Familia O 166

Familia P ¡66

Familia Q 167

Familia R ¡67

Familia ¶68

Familia T ¶69

Familia u 170Farr,ilia y 170

Familia W 171

Familia 1< 171

FamilIa ~‘ 172

Familia 2 ¶72

a 173Familia b 173

Familia c 174

Familia d 174

1. INTRODUCCiON

2

1.1. Apunte histórico

La Esferocitosis Hereditaria (EH) fue descrita en 1871 por Vanlair y

Masius - 38,137,139 que estudiaron una familia belga cuyo propósitus era

una mujei joven aquejada de dolor abdominal recurrente, ictericia y debili-

dad. Su rnadte y hermana mayor presentaban síntomas similares. Los auto-

res apreciaron que altunos hematíes de su propósitus eran pequeños, esfé-

ricos e hipercrómicos, y sugirieron que se trataba de corpúsculos en vfas

de destrucción de los que procedía un exceso de pigmentos biliares 38,137

En 1890, Wllson comunicó seis miembros de una familia con espleno—

megalia y subictericla, aparentemente hereditarias. En 1893, Wilson y

Sranley detallaron más eí cuadro sindrómico de esta familia con episodios

de nayor ictericia asociados a cólico biliar y anemia, considerando secun-

daria a ello la afectación del bazo. Asimismo señalaron la cronicidad de

la enfermedad, que no impedía una vida duradera ~ Una de sus pacientes

falleció, su examen posrmorrem del bato reveló su congestión macro y mt—

croscópicamertie y la causa de la muerte dictaminada fue hemólisis activa

de origen espíénico 36,

La descripción más conocida de la enfermedad fue de Minkowski en

1900, con ocho casos de ictericia en tres generaciones de una familia38,137.139 Barlow y Shaw (1902) participaron la existencia de úlceras dis—

tales en las piernas de sus dos pacientes 38

En 1907, Chauffard cuantificó la fragilidad ostnótlca de sus enfermos,

observándo que difería de otros tipos de ictericia en que los hematíes

eran muy frágiles, y con la anisocitosis de los casos concluyó que las

células más pequeñas eran las más frágiles 38,137,

Más aportaciones importantes han sido las publicaciones sobre la

corrección de la hemólisis con la esplenectomia ó,113 y los estudios de

Ham y Canje sobre el urapamiento y condicionamiento esplénico de los

esferocltos 137,138, Otros trabajos revelaron amomalfa en el transporte

de membrana de cationes monovalentes y en la fosforilaclón de varias pro-

teínas de membrana, así como reducción de la superficie celular por

pérdida de lípidos ~, pero ulteriores estudios demostraron que tales anor-

malidades eran debidas a defecto subyacente de las protefnas del esqueleto

de la membrana 12,1 35 Las invesúgaciones más recientes se han polarizadoen estas proteínas ya individualizadas. Creenquist y cok. 72 observaronque ciertos ratones con anemia hemolítica esferocitica grave eran deficien-tas en especerina, posteriormente se apreció que su defecto molecularprimario era heterogéneo, pudiendo afectar bien a la cadena 0< espectrina(mutación sph), bien a la cadena (3 espectrlna (mutación ja) o bien a laankirina (mutación nb) 1% Se describió déficil parcial de espectrina en laEH humana 2

Actualmente se considera que el déficit de espect rina uega un papelprimordial en la desestabIlIzación de la bicapa lipidica de la membrana,aunque sólo en una minoría de casos podría ser el defecto molecular prI-mario, que en otros casos radicaría en la anl<irina o en otras protefnas,como comentaremos en este trabajo.

¡.2. Conceptos clínicos de la Esferocitosís Hereditaria

¶ .2.1. Definición y ptevaiencia

La EH es el trastorno hemolítico hereditario más prevalente en la

población. Es una entidad heterogénea, de herencia autosómico dominantegeneralmente, caracterizada por una disminución de la relación superfi-cte/volumen de los hematíes, con hemólisis, presencia de esferocisos ensangre periférica, elevación de la concent ración de hemoglobina corpuscu-lar media en la mitad de los casos, aumento de la fragilIdad osmótica yrespuesta clínica favorable a la esplenectomia. Sus heterogéneas bases mo-aculares residen en defectos primarios de las proteínas de la membrana

eritrocitaria ó,12,139 que aún se desconocen en la mayor parte de los ca-~ 6,12412 139,163491

Su prevalencia estimada en la población occidental es l;5000. Esta

cifra muy probablemente infravalora la realidad, dada la gran frecuenciade casos leves y asintomáricos que se detectan solamente con ocasión delestudio familiar de un caso de EH, y la alta prevalencla descrita de fra-gilidad osmórica aumentada en donantes de sangre sanos <aproximadamentedel

La EH también afecta otros grupos étnicos como japoneses y. negros

africanos, pero se desconoce su prevalencla en ellos 6,137,139 Un estudioreciente en Argelia (de mezcla genética Europea y de Africa central

oriental y subsahauiana) cifra la frecuencia absoluta de la EH en 1:1000 ~

1.2.2. HerencIa

La EH se considera típicamente como de heTencia autosómico domi-nante en la mayoría de los casos 6,12,112,139,163 aproximadamente un

75% de los pacientes 6,112 Se han descrito casos autosómico recesivos2,3,4,30 que frecuentemente presentan hemólisís grave, y se ha observado

en tarias ocasiones que los progenitores de los enfermos sin afectación fa-

miliar aparente muestran mínimas anomalías en algunos parámetros dehemólisis y fragilidad osmótica, sugiriendo ~ue se trata de casos muy le-

ves o asintomáticos y que su descendencia afecta es homocigota o dobleheteroclgota de la carga genética responsable 2,4,6,137,139 En algunas fa-millas la forma de EH autosómico recesiva es extremadamente grave o In-cluso letal 6,137,139

Ante lo heterogéneo de la base molecular de esta entidad, son va-nos los g~nes asociados a la EH 163.

— el brazo corto del cromosoma 1 <q22—q25) alberga el locus de la cade-

na ~ espectrína ‘~0~ y existe mutación de su dominio b4 II en algu-nos pacientes con formas de EH consideradas autosómico recesivas119

— el cronosoma ¡4 (q23—q24.2) codifica la cadena ¡3 espectrina ¶8,59,

el defecto en su dominio (~ IV se asocla a aquellas EH autosómico

dominantes con una cadena <j espectrina disfuncional por ser fácilmente

susceptible de oxidación ~, quedando dañado su lugar de unión con la

proteína 4.1 y debilitadas las interacciones espectrína—actína 69,186— el cromosoma 8, concretamente Sp 11.2, contiene el gen de la ankiri-

na 27,96,116, proteÍna deficitaria en ratones con anemia hemolítica es—

ferocitica grave afectos de la mutación mb/ab 19, y se han descrito pa-

cientes con déficit parcial de ankirina tanto en EH aurosómico domi-

nante 36,82 como rio dominante ¶0,77,116, habiéndose demostrado unafuerte asociación del locus de la EH autosómico dominante con el po-

limorfismo Nco 1 del gen de la aml<irina 36, Asimismo se ha observado

delección intersticial del cromosoma 8 6 su translocación a otros cro-mosomas en varios pacientes con EH 27,32,116

5

¶2.3. Manifestaciones clínicas

La EH es una entidad caracterizada por su heterogeneidad clínica,de forma que la gravedad del defecto es variable entre enfermos de dife-rentes familias y sin embargo los individuos afectos de una misma familiasuelen presentar un grado de hemólisis similar 6,1 38, aunque en ocasiones

las manifestaciones clínicas pueden variar considerablemente entre losmiembros de una determinada familia 138,163 Se perfilan diferentes cur-sos clínicos en la EH, según la gravedad de la hemólisís 6,12,112,138,139,163.

formas típicas, en las que el paciente presenta signos de hemólisis le-ve o moderada y puede estar relativamente asintomático, aunque concierto grado de ictericia y esplenomegalia y a menudo sin anemia,compensada con reticulocitosis por hiperpíasia eritroide en la médulaósea. Estos enfermos pueden sufrir complicaciones como colelitiasis,crisis anémicas, úlceras maleolares, entre otras que revisaremos eneste epígrafe clínico,

lormas leves y asíntomáticas quizas más de un 20-30% de casos 112,163que frecuentemente se descubren al realizar el estudio familiar de ca-sos más sintomáticos, o bien durante la gestación 78, o a causa de in-fecciones transitorias como la mononucleosis infecciosa o la infecciónpor parvovirus 5 19 32,100, en otros casos se descubre por la existen-cía de coleiirlasts 113, Incluso algunos enfermos se diagnostican enedades avanzadas ~ Estos pacientes son esencialmente asintomáticos,

no presentan anemia y su reticulocitosis y evidencia bioquímica de he—mólisis son mínimas o inexistentes, y su EH solamente se detecta me-dianre el test de fragilidad osmótica incubada 6,12,138,139 (su versiónno incubada suele ser normal), que en ocasiones es sólo sutilmente su-

peuior al limite de la normalidad. También se intensifica la hemólisis

por esfuerzos físicos Intensos. posihiemenre por aumento del flujo san-

guineo espiénico, pudiendo dereriorarse de forma significativa el rendi-miento atlético en deportes de resistencia 112, Ciertos sujetos detales características han engendrado enfermos con EH de curso clínico

grave considerada de herencia autosómíco recesiva 2,3,4,6

6

— formas atipicas con hemólisis grave, Que son relativamente raras <menosdel 5% de casos), presentando el paciente una anemia hemolítica seve-ra incluso con compromiso vital desde edades muy tempranas de la vi-cia 2,4,12.30,139, En general carecen de afectación familiar aparente,según los métodos diagnósticos convencionales, y se consideran EH deherencia autosómíco recesiva 2,3,4>6,12,30,139

— forma neonatal, periodo en que la EH es comúnmente sintomática (has-ta en un 50% de casos) 112 La. ictericia neonatal es habitualmenteevidente ea las primeras 48 h de vida, aunque en un 20% de pacientespuede diferirse hasta después de la primera semana. En la mayoría delos casos la ictericia puede controlarse con fototerapia aunque enocasiones hay que recurrir a la exangulrrotransfusién. También es comúnla anemia (Kb menor de 15 g/dL) en la EH neonatal, y raramente esImportante. ÑO existe evidencia de que las EH sintomáticas en ciperiodo neonatal sean formas más graves, la mayoría de los niñosquedan relativamente asintomáticos tras este periodo. Algunos pacientespueden reqverir transfusión en las primeras 4 semanas de vida, debidoa que la respuesta medular a la anemia es perezosa, con una reticulo—citosís pobre, incluso con hematocrisos en torno a 20%, que habitual-mente mejora en el plazo de una o dos transfusiones. El diagnósticode la EH neonatal es en general más difícil que en otras etapas de lavida, con el agravante de que los hematíes fetales son osmóticamentemás resistentes que los hematíes adultos, aunque se acepta que el testde fragilidad osmótica incubado es un arma diagnóstica fiable. Enocasiones el diagnóstico diferencial con la enfermedad hemolítica delrecicin nacido y sepsis está facuLtado por los estudios familiares (posi-tivos en un 75% de los pacientes) y por la evolución clínica ~

1.2.4. Complicaciones

La evolución clínica de los pacientes afectos de EH puede estarjalonada de una serie de corn~iicaciones, que comentamos a continuación:

-Crisis anémicas, a su vez de carácter heterogéneo, distinguiéndosevarios tipos;

- crisis hemolíticas verdaderas, que son raras y se han descrito asocia-das a infecciones 113, debidas probablemente a estimulo reticuloen-dovellal 112 con cierto grado de híperesplenlsmo 83, con un discretoaumento transitorio de la hemólisLs, que habitualmente no anemizaseriamente al paciente,

7

crisis megaloblásticas, a veces como manifestación inicial de la EH,son de comienzo más gradual y se producen particularmente enembarazo como consecuencia de la mayor demanda de £cldo fólico

que conlíeva, dado que su déficit compromete la compensación crí—tropoyétíca 12,139,crkls aplásicas, tienen lugar durante infecciones virales, siendo elparvovirus 8 19 100,189 su agente causal más ptevalente. Esta infec-ción denominada eritema infeccioso o quinta enfermedad ¡89, puedeser asintomática o cursar con fiebre y escalofríos, deterioro general,síntomas de vías respiratorias altas, dolor abdominal con intoleranciadigestIva y ocasional diarrea, artralgias o mialgias, y un caracterís-tíco exantema maculopapular facial que también puede aparecer entronco y extremidades. El parvovirus 819 suprime la erlttopoyesisselecrivamemte ¶13,188 (de forma predominante aunque mo exclusivasegún opinión de otros autores 75) produciendo una anemia por hipo-piasia eritroide con resiculocitopenia, con frecuencia grave, quepuede ser la ptimera manifestación de la EH ~ La er¶tropoyeslsnormalmente se recupera al cabo de 7—10 días ¿él comienzq de lacrisis 83, 189,

Asimismo, pueden producirse crisis aplásicas por eritrosupresiónpor fármacos 83,

colelitiasís, la complicación más frecuente de los casos de EH típica,en relación con la hlperblllrrubinemla que presentan los pacientes no

esplenectomizados. Se hallan cálculos biliares aproximadamente en el50% de los pacientes (¡basta en un 85% de los enfermos adultos 83) In-cluso los afectos de formas muy leves de le enfermedad 80,163 Rara-mente se encuentran en niños y su incidencia crece con la edad aun-que se ha constatado colelitiasis incluso en el tercer año de vIda 113Estos cálculos de bilirrubina son generalmente pequefios, múltiples,facetados y raramente carcínógenos 83 Dada la alta pTevalencia deesta complicación, se recomienda la revisión ultrasonográfica periódica

de los pacientes en este sentido ~39. Se ha estimado en un estudioprospectivo que la probabilidad de que un enfermo con colelitiasisasintomática desarrolle síntomas <colecistitis, obstrucción bLliar) esdel jg%il,

8

-t,Iceras maleolares, en general infrecuentes pero indolentes y crónicascuando aparecen y que dan paso a una dermatitis eritematoedematosa.dermatosis crónica o pigmentación en caso de cicatrizar 38,139 Sedan en aquellos pacientes con formas de EH clinicamente más gravesy de edad media o avanzada y característicamente se curan rápidamen-te trai la esplenectomia 38,í39~ Su patogenia no es bien conocida,pero puede ser reflejo de la deformabilidad alterada de los esferocitos,cuyo efecto es más notorio en una región anatómica pobremente vascu—lanzada y vnlnerable a pequeños traumatismos repetidos 38139,

— otras complicaciones, como,

signos y. síntomas de expansión del compartimento medular cnt rolde,pudiendo producir cambios esqueléticos como la turricefaila o bra-quicefalia o cierta deformidad maxilofacial que supone en los pa—cientes unos rasgos asiáticos típicos. En otras ocasiones exi~reverdadera hemopoyesis extrameduiar 10,38,139,141 que se ha des-crito en diversas regiones anatómicas, y cuya afectación en cuerposvertebrales puede producir manifestaciones neurológicas de compre-sión medular o radicular; cuando se localiza en el tóra,~ (principal-mente en el mediastino inferior, retropleural y paravertebral 10>plantea diagnóstico diferencial con masas neoplásicas 10,38,139,141retrasos del crecimiento, del desarrollo esquelético y de la madura-ción sexual, que se dan en las EH clínícamente más graves 83hemocromatosis, a la que contribuye el aumento de la absorción dehierro intestinal vinculado a la regeneración erítroblástica modular,las transfusiones repetIdas en los pacientes más gravemente afectos,y en algunos casos explicable por la asociación de los defectosgenéticos de la EH y la heterocigocia de la hemocromatosis ligadaal I-3LA 52,137,139hipe resplenismo.

1.2.5. Asociación con otras enfermedades

Es conocida la asociación de la EH con el retraso psicomotor7.30,32,38,92,l1ó,139 y en tres de estos pacientes se han demostrado

delecciones intersticiales del cromosoma 8 <deI SpIl—p21.l) 27.92,116 conpérdida comprobada de un gen de la anlcirina (8 pll.2, técnica de hi—

9

bridación in situ) en dos casos, con ci consiguiente déficit parcial de an-kirina en la membrana eritrocitaria ~ Puesto que la anklrina del hema-’tic es funcional y estructuralunente similar a la anklrlna del tejido ner-vioso1 ~ se ha especulado que el déficit parcial de anicirina de estos

pacientes <constatado en sus eritrocitos) pudiera ser responsable de talretardo psicomotor 139, posibilIdad que se atenuarla dado que al menosdos de las múltiples Isoformas de la ankirina están cod~ficadas por un genseparado 182

También se ha descrito la coexistencia de EH con trastornos funcio-nales de la médula espinai38’~ 39 y cardiomiopatfa hipertrófica 130,

Es interesante considerar que las proteínas del esqueleto de la

membrana eritrocitaria, como la espectrina, ankirina y proteínas 4.1 y4,2, son comunes a otros tejidos 40,98,153,170 y cabría esperar que la

repercusión de sus defectos no fuese solamente aparente en la serle roja.Sin embargo, las espectrinas no eritroldes parecen ser prodvcto de genes¿<y (~ diferentes de los que codifican las correspondientes cadenas entro—citanas 4í,í0¶~ esta afirmación no es tan contundente para la (3 espectrí—

na 41,139, que puede ser producto de un único gen, como sucede con la

proteína 4.133170, debiendo su diversidad tisular a splicings alternatitosdei RNA nuclear heterogéneo, dando lugar a distintos RNA mensajeros34,170, 18 5

¡.3. Base molecular de la EH

El eritrocito normal tiene una forma de disco bicóncavo por su6 22exceso de superficie de membrana respecto del volumen celular ‘ , exce-

ciente que no es necesario para la célula en reposo pero si para su Super-vivencia media dc 120 días en el lecho vascular, en el que sufre numerososciclos de deformación reversible y elástica fisiológicamente 26,1.57 con elconsiguiente cambio de forma que permite al hematfe soportar fuerzas decizallamiento (superiores a 2000 dyn/cm2 cm la eyecciórt a través de laválvula aórtica) con la capacidad de adaptarse a los pequeños pasos de lamicrocirculación, con capilares y fenestraciones del hecho vascular espié—nico de 2-3 $m, calibre Inferior a los 8 pm de diámetro del enitxocitonormal 6129,132 Existen varios determinantes de la propiedad del hematíe

10

Intacto de deformarse y recobrar su forma original, entre ellos la viscosi-

dad citoplásmica, la relación superficie/volumen y la deformabilidad de lamembrana 26, determinada por el esqueleto de la membrana eritrocíta—

tía 6,12,24,26,38,4$,83,124,127,129.137,¡39

La membrana es la ptincipal estructura física del hematíe 129 Ha

sido muy estudiada, con las ventajas dc ser fácilmente accesible y de sen-cilla obtención, y cuya estructura tiene un interés general para la investi-gación en las membranas celulares de otros tejidos más complejos 8~ Es-tos estudios han permitido conocer datos de la base molecular de los de-fectos de la membrana eritrocitarla como la EH, asociada a cambios en

los genes codificadores de proteínas estructurales de la membrana en lostrabajos más recientes.

1,3.¡, Composición y organización estructural de la membrana crísrocitaria

La membrana eritrocitaula está constituida por una bicapa lipídica

con una red submembranosa anclada de proteínas filamentosas, tapizando

la superficie ciropiásmica denominada esqueleto de la membrana, de papel

primordial en el mantenimiento de la forma del hematíe y en la regula-ción de las propIedades de deformabilidad y estabilidad mecánica de lamembrana 26408427,129,149,159 (figura ti.

La membrana eritrocitaria está bien caracterizada tanto bioquímica-mente como ea cuanto a la organización estructural de sus componentes

lipídicos y protelcos. AproxImadamente, un 52% de la masa de la membra-na son proteínas, 40% son lípidos y 84 son carbohidratos 129,

Los componentes lipidicos principales son el colesterol no esterifica-

do y los fosfolipidos, que representan más dcl 95% del contenido total en

lípidos de la membrana eritrocitaria, y que se hallan presentes en un Indi-ce molar colesterolffosíolfpidos de 0,85. junto a ellos, existen también pe—qucñas cantidades de glicolípidos, glicéridos y ácidos grasos libres. Lasconcentraciones aproximadas de los fosfolfpidos en la membrana son lasslguiente~t 30% de fosfatídilcolina, 28% dc fosfatidiletanolamina, ¡4% defoslatidilserína y 25% de esfingomíelina; otros fosfolipidos como el ácidofosiatidico, fosfatidilinositoj 4—fosfato y fosfatidllinositol 4,5—dufosfatorepresentan aproximadamente el 24% restante 41,129,149,

Con la disposición en forma de bicapa, los grupos polares o hidrofí—

11.

licos de cada monocapa se orientan “hacia fuera’ en contacto con los me-dios intra y extraceluiar, mientras que las cadenas laterales de los lípi-dos, apolares, se disponen “hacia dentro” formando un gran núcleo hidró—lobo en la bicapa, que a temperaturas normales se encuentra en un estadolíquido cristalino que permite las propiedades mecánicas de la membra-na Los lípidos no se distribuyen simétricamente, de forma que los gIl—coesfingolípidos y más del 75% de los apolares fosfolipidos de colina fosfa—tidulcolina y esfingomielina se disponen en la monocapa externa, mientrasque el 80% de la fosiasidiietanolamlma y toda la fosfatidilserina. (fosfolí—pidos polares) y los fosfatidllinositoles se ubican en la monocapa interna,en la que existe un exceso de cargas positivas 41,112,~29,149,159,

La base bioquímica de esta asimetría lipidica de la membrana en—trocitaria es resultado de hechos físicos como el desplazamiento lento ysimétrico de los fosfolípidos lateralmente en el plano de cada monocapa,y la interacción directa entre las proteínas del esqueleto de la membranay los fosfolípidos polares, con consiguiente inmovilización de los mismosen la monocapa interna; sin embargo, el colesterol difunde rápidamente através de la membrana. El hematíe maduro no puede sintetizar lípidos denovo, pero es capaz de generar una considerable renovación de fosfolipidossin cambios sustanciales en su composicIón lipidica, merced a una seriede rutas metabólicas 41,112.159 Por otra parte, el contenido de colesterolde la membrana se regula mediante intercambio con el colesterol plasmá-tico 112,129

La función de la bicapa lípidica es proporcionar una continuidad fí-sica a la membrana, con impermeabilidad para los solutos a su vea, y ac-tuar como matriz o soporte en que las proteínas Integrales o transmembrá—nicas (denominación debida a que tales protefnas se extienden en toda laanchura de la bicapa lipidica) se encuentran inmersas. Su fluidez dependede la composición lipidica ¡29, Los lípidos de la membrana parecen teneruna influencia limitada en la forma del hematíe, aunque bajo cIertascircunstancias pueden determinar inrerferericlas, es conocido que una so-brecarga de colesterol determina acantocitosis, algunas drogas anfifilicascomo la lecitina y las sales biliares producen equimocitos al intercalarsepreferentemente en la monocapa externa, y otros fármacos como la clor— —

¶2

FIbra 1.— Uru.ru reí tuqueleta ~e tu r.rtruna tritrrcitariu ~rx~Yi:udr ce ?uiek

). Es JSr rrd ~rtteitr rt.bnrbr;rosr rrnutitrka ~:, ru ruÑa heuu~rr,aI re

:utrur.etrs de • ur~rluus ¶r.terour.ectadrr er.Ue si per ccn,~leic5 ce ~ri¿fl. La e,r~—~r:-to~”js5:t par tarurn ~ y ~L <bardas 1 ~ 2) era hstercdír.ercs att—

:ur:zs rrr su ca1raa para ferrar tetrunerra erare catreres C10,IeS st unen

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~tau<a tÉ, u rl oea orín al SesIrir eituríasn.1:c ~ei casal atíí-iea (tarda 31:etatirnevte erpari udc espaelalaerte tora tetrirure (3Ó, y la y’ttela L/

~ chi:rferir, C fil.

13

promacina y la procaína, generan estomatocitos al lnfilt rarse en la monoca—pa interna; se desconoce cómo participa el esqueleto de la membrana en

estos cambios 41,159

La composición proteica de la membrana etitrocitaria se estudia

mediante hemólisis hipotónica 43,50 que permite obtener la membrana ais-lada o estroma con su esqueleto, seguida de electroforesls en gel depoliacrilamída en presencia de SDS 50,95,166 (SOS—PACE, figura 2), méto-do que separa las proteínas de acuerdo con su peso nolecular y que hagenerado una nomenclatura uniforme de uso común que asigna un númeroa cada una de las 10 a 12 fracciones obtenidas según su orden de migra-ción desde la más pesada banda 1, correspondiente a la cadena 0< espec—

trina, de 240.000 daltons de peso molecular hasta los restos de monómerosde globina de ¡6.000 daltons <figura 2).

Se han utilizado diversos procedimientos para deducit la ubicaciónen la membrana de estos polipéptidos; para determinar sí una proteína sedispone hacia la superficie interna o externa, se han realIzado preparacio-nes de membrana marcadas en una u otra superftcie con yodo radioactivo,y los estudios de las asociaciones entre p;otelnas han permitido conocersu ordenación en la membrana 149,159 Así pues, las proteínas de la mem-

brana se dividen en dos grupos principales: integrales y periféricas 41,112,129,149,15 9

Las proteínas integrales o transmembránicas están estrechamenteunidas a la membrana por medio de interacciones hidrofóbicas con la bica—pa lipídica, abarcan en su extensión toda la anchura de la membrana ytienen diferentes dominios estructurales y funcionales, tanto dentro del es-pesor de la bicapa como a los lados de la misma. Son de este tipo deproteínas la banda 3 o canal aniónico y las glicoforinas.

Las proteínas periféricas de la membrana se encuentran en su caracitoplásmica, como espectrina, actina y proteína 4.1., integrantes del es-

queleto de la membrana eritrocitaria. Estas proteínas pueden ser fácilmen-te ext raídas de la membrana con soluciones de baja fuerza lónica o —

más completamente mediante altas concentracIones del detergente no ¿ni-co Tritón X—100 41,112,129.149,159 Existen otras proteínas periféricasque no forman parte del esqueleto, como la ankirlna y la proteína 4.2,

14

PM N0 copias/céiula

240 200220 200200 100

96 1606

86 260

76 200

Nombre

a especirina¡3 espectrinaankirina

canal atilótilco

Banda

122.1

3

‘ti

4.2

Membranaeritrocitaria

(a&b> -

43 106 dematina

42 500 cetina

35 500 gliceraldehido3.fosfato-DIi

29 460

4.936

.7

ii~ara 2.— tequera de la ,¡ectroforeals ea te1 de póllarrllanida en presencia te Sil

(SM.PAlt> de lo reobrar, eritrecitarta tto~ .1 sistea, de r,irtanko y col,.<¶971 ~, co tlrtt6r para próteineo roo tael te Coarasie. t~ fraccloo,s pro—teltas st sapams acoto se peso molerular (W) y se les asisna tic :rden romirító

te actor mayor rlírac¡Ln, toe obedece a Co mayor a bener peso rolerular.

~ne mequieten condiciones muy especiales pasa su aislamIento de la mcm—beana (obtención a partir de vesículas etltrocltarlas con la supeollela Itite—

sim hacia (veo, y libres de espectrína y actina) ‘4í•

1.3.2. Las protefnas de la membrana esitsocitarta. Estructura, genética, y

función

Las proteínas integrales más abundantes y mejor estudiadas de la

membrana eritroeltamia son las glicoforinas (una familia de sialoglicoproceínas) y la. banda 3 o camal anléníco.

II

Las glicoforinas son un grupo formado por cuatro glicoproteinas ri-

cas en ácido siálico denominadas A, 8, C y D, que constituyen aproxima—.

damerite un 2% del contenido protéico total de la membrana ~. Las gilco-formas A, B y C están constituidas por 131, 72 y 128 amInoácidos respec-tivamente y son producto de genes diferentes, sitos en el cromoso-

ma 4 (q28—q31) para las glicoforinas A y 8 y en el cromosoma 2 (q14-qZl)para la glicoforina C 41,116,129,138 Estas proteínas están formadas por

tres dominios: un dominio citoplásmico que contiene un acúmulo de resi-

duos básicos próximo a la membrana, un dominio hidrofóbico que se dispone

en b¿. -hélice extendida en la anchura de la bícapa lípidica, y un dominioext racelular muy glicosilado 9. Las glicoforinas A, 8 y C son responsables

de la especificidad antigénica de los grupos sanguíneos MN, Ss y Ge

respectivamente 41,112,129,138 La presencia de los carbohidratos confieren

una fuerte carga negativa a la superficie celular, que funcionalmente redu-ce la interacción de los hematíes entre sf y con otras células, como elendotelio vascular 9,í29~ La glicoforina C (28.000 daltons) juega un papelprirtiocdial en la unión del esqueleto de la membrana a la bicapa lipidicapor su interacción con la proteína 4,1 9Aí,112,129,136,¡38,149,159 La gil-coforina D parece ser una forma acortada de glicol¿rina C 138 Este gru-po de sialoglicoprratefnas se identifican como bandas PAS positivas de laSDS-PAGE 9.

La banda 3, canal aniónico o transportador anióníco es la principalproteína integral y representa un 25% del contenido protéico total de lamembrana erítrocitarla 41,129 (figura 3). Está formada por 911 aminoáci-dos, con un peso molecular de 95.000 daltons (el 6—7% de la población esheterocigota para una variante funcionalmente normal de 96.000 daltons 112)y está presente en aproximadamente 1 millón de copias/célula formandodimeros y tetrámeros unidos no covalentemente tanto en la membrana co-mo en solución 41,1I2,138 Se ha demostrado que es producto de un genlocalizado en el cromosoma 17 (q21-qter) 114,116 La banda 3 está constí—

ruida por tres dominios estructural y funcionaimente diferentes (figura 3).Comienza en un dominio citoplásmíco hidroiflíco de 43.000 daltons que

contiene el —Ni]2 terminal (aminoácidos 1 a 403), protruye unos 25 nm

de la superficie Interna de la membrana, exhibe una charnela flexí—ble 41,107 y funciona independientemente interacruando con diversas pro-teínas citoplásmícas y de membrana, como la hemoglobina, varios enzimas

16

fijen 5.— trcantrarl~o taparial dr’. %vaosttTtactn arlíerite a tarea 3 (r.od&fitato de

‘.~íí ~). 1,, lInees de pantro Indican ronre de inzertidoabre. tj y t2 500

1:o cantos de cl;est¡fn írlretrhtiea. 1 deerta incas ftSfrniIOdts. O acreía les

lc:alizstlrre, arrodeadas de ar¿án Sara el ¡IDI (un ireibidór del tranepertt

onOinica> que oc sapaner situadas en o terca de la entrada caten,, al canal aO¡OM—

e:. t~l se refiere al allaaoaeCrIfa rorifitada, en trctrsan~roíUcaro ttnplt5t.5351 y PíO s~n las ebreal atar rs te oíl tera] dcii do—3—frs feto desOí dr nicena sa y ras <O.

;I1:eraia tirase. SC representa un grapo sulOterilo reactiro.

—3~ 0< —f

anionico

zona de union coriL GZPDaldolasa,PG’<j Hb,tuscPOS de

DOMINIO

CiTOPLASMICO

17

glicoliticas (gíiceraldehrdo 3 fosfato deshidrogenasa o banda 6, aldolasa yfosfofructokinasa), hemicromos y ankirina (cuyo lugar de unión abarca re..giones no contiguas en la vecindad de la charnela flexible) proteína 4.1 yproteína 4.2. 41,107,112,138 Tras eí dominio citoplásmico, la banda 3atraviesa 12 veces el espesor de la bicapa lipidica y forma el hidroMbicodominio transmembránico de 52.000 dalaons <amInoácidos 404 a 882) queconstituye el transportador aniómico, y el ácido dominio cafboxiterminai(aminoácidos 883 a 911), también en el citoplasma y de función descono-cida. La banda 3 contiene un oligosacárido ramificado unido a ella por en-lace N—glicosldico, que protruye 5 nm de la superficie externa de la mem-brana 41 y que expresa especificidades antigénicas de los guapos sanguí-neos AB H e Ii y el antígeno del envejecimiento eritrocltarlo 41,112,129Existen dos funciones claramente establecidas de la banda 3 en la membra-na del hematíe: el transporte de aniones, con intercambio con CV’ yCO3W, y la unión física de la bicapa lipidica con el esqueleto de lamembrana, principalmente que su unión con la aeakirlna y secundariamentepor su interacción con las proteínas 4.1 y 4.2 41,107,112,129,138,149 Laregulación de la unión banda 3- ankirina no es bien conocida, y sólo unaparte de la banda 3 está ocupada por anl<irlna <existe 1 millón de co-pias/célula de banda 3 y 100.000 copias de ankirina/célula) a pesar deque se sínteríza en exceso 138•

Existen otras proteínas integrales en la membrana eritrocitaria, co-mo la acetilcolinesterasa, el transportador de glucosa, la ATPasa sodio—potasio, diversos receptores de hormonas, proteínas plasmáticas y drogas,y proteínas con determinantes antigénicos de grupos sansuineos como Rlj,Duify y Kell. Estas proteínas aún no han sido bien caracterizadas en sutotalidad y es posible que algunas tengan funciones de transporte o de fi-jación del esqueleto de la membrana subyacente 112,129,

Unida a la bicapa lipidica por algunas de las proteínas Integrales,existe una red filamentosa de proteínas periféricas configurando el esque-leto de la membrana <figura 1), cuyos componentes primordiales son la es—pectrina, actína y proteína 4.1, que describiremos a continuación.

La espectrina (figuTa 4)es elcomponente más importante y abundantedel esqueleto de la membrana, con 200.000 copias/célula, y está formadapor dos cadenas, ~ y 3 (240.000 y 220.000 daleons respectivamente) eS—tructuralmente relacionadas pero funcionalmente distintas. Ambas cadenas

18

Fiqara .— Qroanlaaci6a tetranfrita de la espectrina y sas asocictiones (modificeda de

Faler ~ Leda tetrireero de espectrina, formado por hetaradimeros de caderas

(3 . se ant a la reotrana teleilar por asaclacifla de las cadenas <~ espet..tripa tsr 1> avOirina <banda 2.’.), unIda a su rer direetarerte cor el depinto rita—

r1~sr.irr urí ratel entérIco (ban,a 3) y por torerlín de la prutefnia ti con la cli—

:c.farira (It). Se la ocrastrada ~uela proteína t..2 estoILliza la unión entre

la andrina y el donde cltoplisrita de la banda 3.

se diponen entaelazándose alineadas de forma antiparalela para constituir

los heter¿dfmeros o<~ , formaciones largas (97 nm>, finas y vermifor-mes 41,112,129,136,138,149,159 en donde se han identificado tres principa-les regiones funcionales: la. cabeza o zona de contacto de heterodímeros,que se asocian merced a ella para fonmar tetrámeros, la reglón de unióncon la ankiuina, sito en la cadena (3 , y la cola o lugar de contacto conla actina y la proteína 4.1. l36,138,165, La espectrina es una proteínamuy flexible capaz de asumir diversas conformaciones, característica crí-tica para las propiedades mecánicas de la membrana normal 112, Losgenes que codifican sus cadenas se encuentran ubicados en el cromosoma¡ fq22-a25) ~ para la cadena oc y en el cromosoma 14 (q23—q24.2) enel caso de la cadena ~ ~ Dichas cadenas están compuestas por unasucesión de subunidades repetitivas alineadas linealmente, de 106 arnlnoáci—dos, 12.000 daltons y 5 nm de longitud cada una, constituidas a su vezpor tres segmentos antíparalelos y ~e helicoidales ¡65• Tales subunidadessepetitivas están unidas entre si por pequeñas regiones no helicoidales queconfieren a la proteína su típica flexibilidad í¡2~ Asimismo, cuando la es-pect rina se somete a digestión tniptica y subsiguiente análisis bidimensio—nal con isoelecttoenfoque y SDS—PAGE, se identifican una serie de domí—

19

nios, cinco en la cadena 0< y cuatro en la cadena j~, Implicados en lasreglones funcionales previamente descritas 41,112,13ó,138,149,159,164 (fi—.

gura 5). Los heterodimeros de espectrina se asocian por medio de sucabeza para formar tetrámeros ( ~ >2 de 194 nm de longitud que sonlas estructuras predominantes en el esqueleto de la membrana, aunquetambién rueden formarse olígómeros mayores 112,129~ Las colas de los te-trámeros de espectrina se unen con olígómeros cortos de actina (figu-ra 4).

La actina eritrocítarla, de 45.000 daltons y con unas 500.000 co-pias/célula, está configurada en oligómeros filamentosos cortos muy uni-formes, de aproximadamente 35 nm de longitud, formados por unas 12 mo-léculas de actina organizadas en dos hileras paralelas y 0< helicoIdalesque contienen cada una 6 unidades de actina globular 15,112,138 estruccuras moduladas y estabilizadas por la tropomiosina eritrocítaria. Esta pro-teína, que migre en la SDS-PAGE en la región de la banda 7, es undímero de dos subunidades de 27.000 y 29.000 daltona de la que existenalrededor de 80.000 coplas/célula, cumpliéndose la estoqulometria de 6moléculas de actina por cada una de tropomiosina 15,112,138, Los datosdisponibles permiten sugerir que cada oligómero de actina filamentosa seasocla con dos moléculas de tropomiosina, cada una de ellas en sendo ejede las dos « hélices de monómeros de actína globular que configuranel oligómero de actina 15,112,138 Existen otras proteínas asociadas a laactina, como la dematina o proteína 4.9, la miosína y otras proteínas del

sistema contráctil actomioslna 112,138 La dematina o proteína 4.9, de48.000 daltons, es un trimero en su forma nativa que in vitro se une a laactina y polimeriza sus filamentos, pero su función en la membrana entro—citarla se desconoce 112,138

Como promedio, tres colas de espectrina se asocian con cada olígó-

mero de actina para configurar una red Irregular de disposición aproxima-daniente hexagonal 129 Cada unión entre espectnína y actina está estabí—llaeda por la proteína 4.1. en ausencia de la que tales uniones son débilese InefIcaces 112,129,149 (fIguras .4 y 6).

La proteína 4.1 es una estructura globular de 5,7 nm que coexiste

en dos formas, 4.1 a de 622 aminoácidos y 80.000 daltons y 4,1 b de 78.000daltons. La proteína 4.1 b predomine en los reticulocítos y se transformaera proteína 4.1 a según el hematíe envejece 70,112,138, Ambas formas son

- ‘— $11 —~ c—pm —~ F— fl~—e

e

e——--—— al—4 e—.- GE —-4 e—.—. aN—.en--—o12—e —aV—-—-4

N 2345676 9¡9~jlIi213t4t5lse7 te?9111 c

PP -.

C1 eeI7,615t4í3121ú1098 765432 t JNPp

Fi~ara 5.— Anatamía rr¡a:ular de la espectrira (rodificado de Luz, ~ “~, y de

Skrhet,19~i 15~y La espeterira estí taristitulda por unidades repetitives hení—leas (erzerír it dcl.,, y nirriablerente la vielsina de la cadena oe. ) alineadas,

cede era de lib armncíridas en forra de tres segoentes antiraralele, y ¿4 hellcol—

dales. El carboalla lerrínal de la cadera estA rey restorllado. Se definen

car:t drrInics resistentes a la trmnisíre er la reden, a¿ y cuatro ere la cadena

zona de unten conankirina

zona de autoasociaclondedineros de espectrina

a~lna y proteina 4.1

21

Flgara 6.— Complejos dc ur¡~n del estaeleta de la írie,n~rana er¡trrcltarla (modificada

da PeleA, I99~ ~ A ellos se unen las tetrirneros de esperirlna. totie forrados

por nllg6ncrrs cortos de actína fílamnentusa estabtljandos por trnpnrñoslna, ¡retel—

na 4.1, que promueve la celán de la espectrina a la adina y se une a ¡a glirofo—

rica c (st) canal aai¿nlco y lípidos de la hicape interne, adduclma, que fatilita

la conexián entre espectrina y acuno, dematina (banca 4.9) qae se une a la attlna,

y posIblemente tiras proteinus relacionadas con el sistema tantríctil actoniesina.

glicoforína O

22

virtuainente idénticas tanto estructural como funcionalmente (el sistemade SDS-PAGE de Laemmli ~ es capaz de separarlas, a diferencia del m&-todo de Fairbanl<s ~ que ideneifíca una sola banda 4.1) y se considera laproteína 4.1 como una única entidad 112, con 200.000 copias/célula, codifi-cada por Un gen localizado en el brazo corto del cromosoma i (p32-pter)junto al locus Rh 33,41,138 Se trata de una proteína muy asimétrica(figura 7) que exhibe cuatro dominios cuando sufre proreolisís limitada

Iregion vartabie

ptOtOinS 4.l~ y 4.lbl

lugares de union paraglicciorita Oiostatidhlserinaprorcine 3

cAMp-PI<

peontueve a asociucionespétlrina . acune

rIgen 7.— Estructura de la ¡retefena 4.1 (modIfIcado de tun, 19f7 112), (~ daninlo ami—

ratercinul dc la neiltula es Imito y cantiene cuatro titíes rearticos y los luga—

res je talán para el Alt, fasfaeidilserlna, banda 3 y gílcoforína 1. [1 dominIo

ttrtoailoterrlral e’ ~cldoy la betertíeneldad en esta roto es la respensacle de

las Istiorajaste.la y 4,11. Situados entre arbns se encuentran sendos dammnlus los—

rr ji ades por la m’otnlnkmasa t (PK—t) y por tea k Iras, AMPc dependí erCe (c iMP— Pr),

dóctinin ~stevrtn:ttr de la asocíaclán espettnina.attlna. La proteína tel natita

prcbablen,nte sea ~lobalar; la oríanhaaclán propuesta en este esquema es especule—

tina.

Pie-O

23

con químotripsína ~ El dominio amino terminal, de 30.000 daltons ycarga positiva, contiene la zona de unión de la proteína 4.1 con las glico—formas A y C, la banda 3, los fosfatidilinositoles y los lípidos de carganegativa de la monocapa interna de la membrana 112,138, El dominio deunión con espectrina y actina, de 8.000-10.000 daltons, está en la veclmdaddel dominio carboxiloterminal 41,138 Esta proteína es susceptible de los—forilación en varios puntos, y cuando tiene lugar por la protein Icinasa C<PK-C) y la klnasa AMPc dependiente (cAMP-PK>, se debílita ¡a unión dela proteína 4.1 con la espectrína 102,138 La unión de la proteína 4.1 conla glicoforina A sólo es posible si ésta forma complejo con fosfatídil mo—sitoles fosforllados 108,138 Le proteína 4.1 tiene al menos dos funcionesesenciales <figuras 4 y 6), la primera es la estabilización de la unión en-

tre espectrina y acrina 15 y la segunda consiste en fijar los extremos dís—tales de los tetrámeros de espectrina a la membrana en virtud de suunión con la glicoformna C, el canal oniónico y los lípidos negativamentecargados de la monocapa interna de la membrana 1¡2,138 La estabilizaciónde la unión entre espectrina y actína está mediada por interacción directade la proteína 4.1 con la espectrina pero sin unirse directamente con laactina 15.138

La adducina es otra proteína del esqueleto asociada a espectrmna yactmna. Se compone de dos subunidades de 105.000 y 100.000 daltonsfonmando un hererodímero que cuenta con 30.000 copias/célula. Se unetanto a espectrmna como a actina promoviendo la asociación entre ambas,según la estoqulomerria de dos moles de espectrina por cada mol de addu-cina 123 (figura 6). La unión de esta proteína al esqueleto queda inhibidapor la proteína 4.1, cabe la posibilidad de que las dos proteínas compitanpor un mismo lugar de la molécula de espectrina. La adducina está muyfosiorilada y es la principal proteína de unión de la calmodulina en el es-queleto de la membrana eritrocitaria 15,123438, La unión de la calmodu—lina a la adducmna inhibe su efecto estimulador de la Interacción entreespectrína y actína 15,123,138 con lo cual las concentraciones intraceltrela-res de calcio poseen un rol primordial en la regulación de estas asociacio-nes 129

La ankirlna o banda 2,1 <que comigra con la banda 2 en el sistemade SDS-PAGE de Laemmii ~~>es una proteína primordial en la fijacióndel esqueleto o la membrana eritrocitaria. Es grande y de forma piramidal,

24

con 1.879 aminoácidos, 210.000 daltons, 8,3 x 10 nm de calibre Y 100.000copias/célula, es decir, una molécula de ankirina por cada tetrámero deespecerina. La anlairmna es producto de un gen sito en el cromosoma 8(píí.2> 27,96.116 Es una proteína globular, asimétrica y polar constituidapor dos dominios funcionales separables mediante proteolisis suave 178: undominio aminoternmnal positivamente cargado de 90.000 daleons, responsa..ble de la unión de la ankirina con el dominio citoplásmico de la banda 3,y un dominio de unión a la espectrina, neutro, de 72.000 daleons y muyfosforilado, con alta afinidad por la cadena de la espectrina, fijándolaa la membrana. La estructura primaria de la ankirlna propone próximo alcarboxilo terminal un tercer dominio regulador 7~nl38, cuya alteracióndetermina la producción de polipéptidos menores tipo anlcirmna <sindeinas,como nombre genérico), que aparecen en la SOS—PACE de la membranaeritrocitaria como bandas adicionales 2.2, 2.3 y 2.6 74,112,138 La ankirí—na se une a la cadena de la espectrina en una región de ella localizadaa 20 nm del carboxilo terminal, involucrando los dominios (31 y (3 II 112,¡29, 164 (fIgura 5).

La proteína 4,2, de 72.000 daltons, está presente en la membranaerleocitaría en el mismo número de copias que la ankirina, y se une deforma saturable a vacias proteínas, corno el dominio citoplásmico de labanda 3, anlcirina y proteína 4.1 93,138, y se ha demostrado que la pro-teína 4,2 esrabíliza la interacción entre ankirmna y banda 3 138,148

Una vez repasadas las proteínas integrales y periféricas de la mem-brana eritrocitaría, comentaremos su organización, constituyendo un esque-leto de la membrana fijado a la bicapa lipidica, estructura compuesta quedota a la membrana del hematíe de sus propiedades mecánicas únicas.

1.3.3. El esqueleto de la membrana erítrocítaría. Organización y modulación

El esqueleto de la membrana ericrocitaría es una red proteicasubmembranosa de 3 a 6 nm de grosor medio que tapizo directamente lacara cltopl~smíca de la bicapa lipidica, fijando un 60% de ella 112,138 Suunidad básica es una malla irregular aproximadamente hexagonal de tetrá-meros de espectrirar Interconectados entre si por complejos de unión ‘41,¡04.1¡2,129,136.138 ¡‘49 159 <figura 8). Estos complejos de unión (figu—ta 6) cemedan los nudos de la red, dispuestos eta los vértices de los hexá—

25

figura 8.— Esquorra de la anatomía ultraestructural del esqueleto de la nembrana entro—

citarlo (rodificato de lío, ~81 lOte) ~I esqueleto celular, aislado por estrurelín

cro Initén r—lCO de ms lípidos y protelnrs Integrales de la membrana y ortifí—

citírrente entendido, erbibe una totiiqtrarl6u, en nalla dIspuesta heragonalteate

aungon tambl6n ton furraclin de pent~gotos y heptlganos, en qn,> los ladns de los

pclioaans crorespraden a tetrineros de espertrlna <Spte) y osaslonalrente dables te—

trfneros <2SrI,) o heoi.r.rros (Spb) ea tuya mitad apnnnlmadarrente se halla le nalirí—

ma, Los tonplejos de andén representan lo, nudos de la red esqcelfllca.

genes y formados pos actinia ollgomésica, proteína 4.1 y otras proteínasasociadas, corno iz tropontiosína estabiltazado los oligórneros de zaina,proteína 4.1 y aciducína, reforzando la unión de espectrina y actina, y de-

matina y ciertas proteínas del sistema contráctil aceomiosína 15,112,129,i36438,149 Los tetrámeros de espectrína (ocasionalmente hexémeros ytetrámeros dobles) conforman los lados de los hexágonos, cuyos vértices

corresponden a los complejos de unión <figuras 4 y 8), de forma que el

tetrámero formado por AsociacIón de las cabezas de dos heterodime—ros de espectrina se une mediante sus dos colas a sendos complejosde unión. Tal organización estrucetaral ha sIdo confirmada mediante micro-

fotografía electrónica de alta resolucIón 104 y confiere al esqueleto de

/

26

la membrana su carácter bldimensional 112 Las diferentes uniones yasociaciones entre proteínas dentoo del plano del esqueleto de la membrana

se han denominado interacciones horizontales 41,136,

- El esqueleto de la membrana eritrocitaria queda fijado a la bicapa

lipidica mediante varias asociaciones <interacciones verticales), de las quedos son fundamentales:

— era la proximidad de su centro, y merced a una de sus cadenas j~ a ca-da tetrámero de espectrina se une a la ankirina, que a su vez se une

directamente con el dominio citoplásmico del canal aniónico,

— por medio de sus extremos disrales, los tetrámeros de espectrina se

unen a la proteína 4.1, la cual se asocia a las sialoglicoproteinas 1 rans—

nembránicas, principalmente la glicoforina C y bajo ciertas condiciones

la gilcoforina A ¡08,138

asimismo se han descrito otras interacciones, aunque débiles, protagoniza-das por la especírina y la proteína 4.1 con la fosfaridiletanolamlna y la

[osiatídilserinan fosfolipidos predominantes en la monocapa interna 31,138,

IAl

La biogénesis del esqueleto de la membrana eritrocítaria exhibetres pasos limitantes en la configuración de una red esquelética estable

¡38:— la síntesis del transportador anióníco, que posee zonas de alta afinidad

para la ankirit,a,

— la disponibilidad de anklrina, con lugares de unión de alta afinidad por

• a cadena ~ espectrina, habiéndose comprobado que la cantidad de

espectrina unida al esqueleto depende críticamente de la ankirina dis-

ponable,

— la síntesis de la cadena (~ espectrina, que es considerablemente más

reducida que la de la cadena & espectrina.

Esta biogénesis del esqueleto de la membrana, con la síntesis y asO-

ciaciones de sus proteínas entre si y con la membrana tiene lugar en losnarmoblastos en diferenciación, persistlertdo la producción de espectrina,ankirina y proteína 4,1 hasta el estadio de retículocito 76,138,

Pero la organización del esqueleto de la membrana no es fija en

espacio y tiempo, puesto que durante sria circulación el hernatfe cons-

tantemente sufre ciclos de deformación y recuperación de su forma origi-

mal, cambios dinámIcos necesariamente acomodados por ci esqueleto de la

27

membrana, que probablemente se deben a una modulación o regulacióndinámica de las interacciones entre proteínas.

Son mecanismos potenciales de regulación de las asociaciones de

las proteínas del esqueleto entre si y con las proteínas integrales de lamembrana la foslorilación 1 ‘

2”49a las variaciones de las concentraciones

intracelufares de magnesio y de 2,3 difosfoglicerato (2,3—DPG) en los ci-clos de oxIgenación—desoxigenación, y los efectos de la calmodulina conse-cutivos a un calcio intracelular elevado ~ No se dispone de datos de lasrutas metabólicas que siguen estos mecanismos moduladores, aunque exis-ten evidencias de que la fosiorilación en el caso de la proteína 4.1 deter-mina una disminución de su afinidad por la espectrina y en su capacidadpara promover asociaciones entre espectrina y actina (sin embargo, no seconocen efectos directos de la fosforilación de otras proteínas del esque-leto de la membrana). Paralelamente, el aumento de los niveles de 2,3—DPGy las concentraciones elevadas de calcio Intracelular, junto con la calmodu—lina, parecen desestabilizar, respectivamente, las Interacciones entre espec—trlna-actina-prOteirla 4.1 y entre especrrina—actlna—adducina 129 Portanto, la membrana del hematié es una estructura dinámica en la que lasinteracciones entre proteínas están siendo constantemente moduladas ycuya función esencial es dotar al hematíe de una membrana muy flexibley a la vez muy estable y resistente mecánicamente.

¡.3.4. FuncIón del esqueleto de la membrana eritrocitaria

El hematíe ha de estar capacitado para ser muy delormable, pero

resistente, Así pues, la deformabilidad de la membrana 2ó,¡27 se definecomo el grado de deformación que se induce en la membrana por unadeterminada fuerza aplicada, lo que significa que a mayor deformabilidad,menor fuerza es necesario aplicar para que la célula atraviese los capila-res. La estabilidad de la membrana es el grado máximo de deformaciónque la membrana puede sufrir y sobrepasado el mal la célula ya no es

capaz de recuperar completamente su forma inicial; la estabilidad de lamembrana normal permite al hematíe circular sin fragmentarse; si laestabilidad disminuye supone fragmentación celular, a pesar de una dinámi-ca circulatoria normal 24,129

Estas propiedades están reguladas por los componentes de la mem-

brana (figura 9). En estado de reposo, las moléculas de espectrina se en-cuentran en una conformación plegada. Cuando cambia la forma geométrí—

28

rlgure 9.— [aquerrade los neorderianientos del esqueleto de la membrana en la deforma—clin reversible de los hematíes (rodlficado de Moirandas, 1991 129> la defonmacilo

rencrollule se acompala de cuello en la tarea 9eanitnlca del hematíe a supeefitie

celular constuate. Desde el estado dc reposo, con la deformación se produce una ex—

tensión paulatina de ¡a membrana. Sobrepasado su límite, requeriría un aumento de

superfIcie que sependnia la ruptura de los complejos de unión, con la conslgulenite.

frageentaclin celul.n.

II29

ca del eritrocito, se produce una deformación reversible de su membrana,manteniendo su superficie constante, durante la cual se reorganiza la red.

esquelética de forma que ciertas moléculas de espectrina se estiran, mien-

tras otras Se repliegan y comprimen; si aumenta la deformación, la mem-

brana se extiende más, llegando algunas moléculas de espectrina a alcaniar

su extensión lineal máxima. Este punto es el limite de la deformabilidad

reversible, y la subsiguiente aplIcación de fuerza requerirla vn aumento desuperficie, con la ruptura de las interacciones de las proteínas del esque-leto entre si y con la membrana, dando lugar a fragmentación celular;por tanto, la disrupolón de dichas interacciones entre proteínas supondrían

un deterioro fundamental de la estabilidad mecánica de la membrana

eritrocítaría 24,129 Sin embargo, para que la membrana se deforme rior-

maimente, su esqueleto debe ser susceptible de reordenamientó con des-

pliegue y repliegue de las moléculas de espectrina. Por ello, el aumento

de las asociaciones de las proteínas del esqueleto entre si y con la mem-brana reduciría esencialmente la deformabilidad de la membrana 6,24, 26,45,124.127,129

La deformabilidad celular es la capacidad de deformación del hema-tíe mientras fluye. Esta propiedad depende de tres factores distintos 6,24,26,45,124,129.

— la forma o geometría celular, que define su relación superficie/volumen,

— la viscosidad citoplásmica, definida por la concentración intracelularde hemoglobina,

- la deformabilidad de la membrana, que directa o Indirectamente depen-

de del esqueleto de la membrana.

Resulta fundamental para el eritrocito el mantenimiento de unarelación superfIcie/volumen idónea para desempeñar óptimamente su fun-ción en el torrente circulatorio. La pérdida de membrana conlleve una re-ducción de la superficie celular, que determina una geometría celular es-férica sin exceso de superficie, carencia que dismInuye la deformabilidadcelular y compromete tanto la función como la supervivencia del hema-tic 24,129 El esqueleto de la membrana, asociado a las proteínas integra-les de la misma, son determinantes claves de la compleja conducta mecá-nica de la membrana erítrocitaria 24,124,127,129,

r

30

1.3.5. Defectos moleculares en la EH

La base molecular de la EH es heterogénea y sus defectos prima-

nos afectan a las proteÍnas de la membrana enitrocitaria ¡2,136,138,139

(tabla 1>. Sin embargo, el déficit parcial de espectrina es el elemento uni-

ficador de la mayor parte de los casos de EH 3,4,6,12,136438,139 y los

datos disponibles sugieren que puede ser resultado de defectos moleculares¶36

diversosEn las EH autosómico dominantes, forma clásica de la entidad,

las anomalías primarias halladas son:

— el déficit leve a moderado de espectrina y ankirina (HS Sp’ Ank’j,

que probablemente es el defecto primario más prevalente en este gru-

po de pacientes 3,4,36,82,139, habiéndose constatado una relación

directa entre la reducción del contenido de la membrana erit rocitaria

en espectrina <con 63 a 81% del contenido normal>, la gravedad del

curso clínico de la enfermedad y la fragilidad osmótica de los hema-

líes, reflejando la reducción de la superficie respecto del volumen ce—

lular £4, así cono una reducción acompañante del contenido de la

membrana en anl<irina 2,3,4 inicialmente considerado consecuencia y

no causa del déficit de espectrina y atribuido a degradación de la

anklrina no fijada ~. Posteriormente se ha demostrado la herencia de

EH dominante ligada a un determinado polimorfismo del gen de laankirina 36 en una gran familia cuyos ¡9 mIembros afectos exhibían

82 a 90% del contenido normal en espectrina y ligeras reduccionesdel contenido en ankirina; existen casos similares con mayores dismi-

nuciones del mismo 82 Además se han comunicado casos de EH aso-

ciados a delecciones intersticiales del cromosoma 8 <Sp—> o transioca—

clones recíprocas heterocigotas que involucren Sp 11.2, donde se en-

cueníra el locus del gen de la anl<inina 27,116 También se ha demos-

tracio que la transmisión de la EH dominante no está ligada a polimor-

fismos de los genes de las cadenas oc o <3 de la espectrina 36,185,

Así pues, en este grupo de EH el déficit de espectrina es secun—

darlo a un defecto prirrrar¡o en el gen de la anicirina aún por caracte-

rizar y que determinaría la alteración de la estructura o función de

dicha proteína 36-82,138

-la anomalía del dominio IV de la espectrina con unión defectuosa a

la proteína 4.1 (HS (~ Sp—4.l) 13,69,186 cuya prevalencia se conside—

31

ra no superior al 10% de las EH 112,13.7n139, Caracterfsticametlte, los

enfermos presentan células espiculadas o acantocitos en la extensión

de sangre periférica iii,íBó, El defecto tiene la peculiaridad de ser

susceptible de corrección itt vLrro por agentes reductores sugiriendo

que la cadena j~ de la espectrina es anormalmente sensible al daño

oxidativo ¡3,112,138,13% agudizado por los radicales de oxigeno de los

macrófagos en el condicionamiento espíénico 136,180 Por razones no

aclaradas, estos pacientes son parcialmente deficia,ntes en espectrina,

exhibiendo alrededor del 80% de su contenido normal 12,112,136,137.138139; probablemente la espectrina defectuosa se desliga fácilmente de

la membrana y es degradada por proteasas que selectivamente afectan

a la espectrina aislada 112,187,

La forma autosómico dominante de EH se ha estimado que afectaaproximadamente a un 75% de los pacientes 6,12,112, so se han descrito

casos homocigotos, que se consideran incompatibles con la vida ¡12

Un 25% de las El-] carecen de afectación familiar aparente a los

medios diagnósticos convencionales 6,12,112 Este grupo de enfermos es he-

terogéneo e incluye formas dominantes de penetrancia variable <existe evi-

dencia de que gran parte de los progenitores de estos casos presentan un

mínimo déficit de espectrina que sugiere su afectación por EH asintométí—

ca ‘4>, nue’as mutaciones s verdaderas formas autosómico recesivas de la

entidad, sin posibilidad de distinguir definitivamente entre estas tres opcio-

nes en la mayor parte de los casos, y probablemente la última sea de

escasa frecuencia. Se han encontrado los siguientes defectos en EH auto—

sómico recesivas:

- el déficit severo de espectrina y anhirína (HS sp’ Ank~) 29, observadoen pacientes con anemia hemolítica grave de respuesta parcial a la

esplenectomia con importante microesferocitosis y poikilocitosis con

marcadas alteraciones del contorno de los hematíes em la extensión

de sangre periférica y que presentan aproximadamente la mitad de

los contenidos normales de la membrana en espectrina y anl<irina sin

anomalías en su estructura o función 29, RecIentemente se Ira consta-

tado reducción del mRNA de la anl<irina con reducción de su sintesisen los reticulocitos de un enfermos, siendo sin embargo normal laproducción de cadenas « espectrína e incluso aumentada caso de las

32

cadenas (3 ~‘‘. Por tanto, el defecto primario supone una síntesis de

ankirina disminuida con consiguiente menoscabo en Su incorporación a

la membrana eritrocitaria, conllevando una reducción de la unión deespectrína a la misma ~, cuyo contenido puede ser solamente un 30%

de la. normalidad 2,3,4,118 En algunos casos la herencia no pudoestab)ecerse inequívocamente, puesto que no fue posible estudiar alos progenitores, si bien los hermanos de los pacientes fueron hema—

tológicarnenre normales, incluido el estudio de los contenidos de lamembrana en espectrina y ankirina 29,

la alteración del dominio oc II de la espectrina, detectado en algunasfamilias mediante digestión triptica y análisis bidimensional (combina-ción de isoeieccroenfoque y SOS—PAGE) de la espectrina 118,119 Este

defecto se ha denominado oc lía, se reconoce por la acidificación delpunto isoeléctrico de los péptidos integrantes de dicho dominio oc II,y existen en forma homocigota en pacientes con anemia hemolítica yeta forma heterocigoca y asíntomática en sus progenitores y descenden-

cia, Dado que el paso limitante en la generación de los cimeros d,e

espectrina es la síntesis de su cadena ~ 76,99438 los individuos he—

terocigotos be. lía pueden compensar la anomalía con una adecuada

producción de cadena oc espectrina merced al alelo normal 41,118,-el déficit completo o parcial de la proteína 4.2 (HS 4.2+/4.20> 81,138,139,148, con la particularidad de que los casos descritos son japone-

sea, por la acción en la que el defecto quizá sea más prevalente ~Es improbable que sea una verdadera.anomalla primaría de la EH; enalgún caso el déficit de proteína 4.2 se ha normalizado con la esplenec—tomia o con la solución quirúrgica de una ictericia obstructiva en losdéficlts asociados a ella 138,139 Recordando que esta proteína seune a la ankirlna y al dominio citoplásmico del canal aniónico y esta—biliza la unión de ambas 93,138,139,148 el déficit de proteína 4.2 pue-de ser secundario a altecación del dominio citoplásmico de la banda3 y/o de la ankirlna ¶38~ se ha demostrado que la membrana de unpaciente Incorporaba dei icitariamente la proteína 4.2 normal, sugirien—que el defecto primario residiera en el lugar de unión que para estaproteína posee el dominIo citoplásmico del canal anióníco 84.138, depatrón de digestión c riptica anormal 84,

— la ariomalia de la banda 3, enlazado con el epígrafe anterior, se hadescrito su migración electroforética anormal conformando una banda

más estrecha, densa y anódica de lo habitual 13¡,138 conjuntamente

33

con su digestión triptica anormal sugestiva de una gilcosilación dete-

riorada y asociada al déficit de proteína 4.1 en dos pacientes 13i~

También se han comunicado casos de EH dominante con contenido de

espectrina normal y déficit de banda 3 85,115,121,122 (con déficit

probablemente asociado a él de la proteína 4.2, que en ciertos casosse ha relacionado con un defecto del dominio citopiásmico de la

banda 3 84> Es posible que los defectos moleculares del canal anlóní—

co sean más comunes de lo sospechado y que casos de EH de estas

características hayan sido incorrectamente diagnosticados.

De forma puntual, se han descrito en la EH otras alteraciones

como tetramerizaclón defectiva de la espectrina y esínectrina no extracta—

ble 112n137a139; posiblemente algunas de estas observaciones sean debidas

a aspectos técnicos o correspondan a epifenómenos relacionados con otros

factores inherentes a las células de la EI-I, como deshidratación intracelea-lar, cambio en la edad media de las células o condicionamiento esplérril—

co 112

Ante lo expuesto. se deduce que el defecto molecular primario cau-sal del déficit de espectrina, común a la mayor parte de los casos de

El’], radica en esta proteína solamente en das grupos de pacientes: lasformas de herencia autosómica recesiva del dominio o< lía y aquellos en—,

fermos afectos de formas dominantes con anomalía del dominio <~ IV de

la espectrina con unión defectuosa a la proteína 4.1. En el resto de los

casos de EH, el déficit de espect rina seria secundario a defectos molectala-

res. primarios de otras proteínas de la membrana eritrocítaria, que anclan

el esqueleto a la bicapa ilpidica (interacciones verticales).

El déficit de espect rina típico de la EH determina que la membrana

del hematíe sea inestable, con eliminación de la bicapa lipidica rio fijada

al esqueleto en forma de microvesículas 7,83,136.138 generánciose células

de superficie reducida (figura 10>, cuyo rasgo característico es el aumento

de la fragilidad osmótica 129,136 como comentaremos posteriormente.

1.4. Fisiopatologfa de la hemólisis en la El-?

La lesión celular esencial en la EH determina una pérdida de super-

udc del hematíe resfecto de su volumen 35,182, reflejo de una pérdida

de lípidos de membrana 3~. In vitro se ha inducido un aumento de la libe-

ración de vesículas lipidicas de las membranas de estos pacientes sonietien-

do los hematíes a Incubación en condiciones de deplección Intracelular de

ATP 35, a fuerzas de cízallamiento elevadas 25, o a Incubación de los es—

34

tromas erieroclearios en medios isotónicos 103 Las vesículas así liberadas

contienen componentes lipidicos, proteínas integrales y pequeñas cantidade~

de hemoglobina, carecen de proteínas esqueléticas (excepto proteína 4.1)

y son invisibles al microscopio óptico ~ Además, los estudios de la

superficie de los esferocitos mediante microscopia electrónica han demos-

trado evaginaciones de la misma 7,83,138 que llegan a líberarse en forma

de miceovesiculas, en las que se pierden pequeñas partes de la membrana

celular (figura íD> 7,136,138

El proceso determinante de la pérdida de lípidos de membrana en

la EH consiste en un sustento Inadecuado del plasmolema por el esqueleto

subyacente 103, cuya base molecular se cimenta en su menor densidad a

causa del déficit parcial de espectrina (figura 10) 136,137,138 De hecho,

se ha confirmado la reducción en la densidad de las proteínas esquelétí—

<1

EH

Horrrial

figura le.— Esquera de la gkres!s de eefe,acltcs cm la :K :adaptadc de i5re, 1989 78),

fiepreserea la Mr¿tesís de la p&rdlda Ce superfIcie de nembrana en henatíes dell—

cientes r.artiainente en corectriria.

35

cas en estromas eritrocitarios intactos de pacientes afectos de EH con dé—

flcirs de espectrina moderados y graves ~ En la mayoría de los pacien-

tes con déficit parcial de espectrina, la integridad ultraestructural de losesqueletos de la membrana es prácticamente normal, aunque con menor

cantidad de tetrámeros de espectrina interconectados con complejos de

unión, disminución aparantemente proporcional al grado de déficit de

espectrina que en las EH graves basta para producir disrupción de la

arquitectura del esqueleto ~ Tales hallazgos concuerdan con la ausencia

de fragmentación celular en la microscopia óptica de las extensiones de

sangre periférica de casos leves de EH y con la estabilidad mecánica casi

normal de las membranas y los esqueletos eritrocitarics de la mayoría de

los pacientes (a excepción de las (3 Sp—4.1 y las formas con déficit graves

de espectrína) 126,127 Además, la pérdida de superficie de la membranaa

reflejada en la disminución de la resistencia osmótica, es proporcional al

grado de déficit de espectrina 3,4,25 y con la gravedad de la hemólisis 139~

Por tanto, el déficit parcial de espectrina causa disminución de la

densidad del esqueleto, que al no fijar adecuadamente toda la membrana,

produce desestabilización de la bicapa lipidica y se liberan pequeñas porcio-

nes de lípidos y proteínas integrales no sujetas en forma de nicrovesicu-

las 121,138, ocasIonando con ello la pérdida de superficie respecto del

volumen de los hematíes en la EH <figuras 10 y 11).

Los esferociros son hematíes deshidratados 137,139, hecho reflejado

en su característico aumento de la concentración de hemoglobina corpus-

cular media 83,137 Poseen un bajo contenido en agua y potasio con aumen-

to de la permeabilidad pasiva al sodio 12,83,137, cuya magnitud no secorrelacciona con el grado de hemólisis 182 y que presuntamente es secun-darla al defecto del esqueleto de la membrana 87, La sobrecarga intrace-

lular de sodio resultante se compensa con su extrusión por la Na+ —

ATPasa, con el consiguiente aumento de metabolismo del AlT y estímulo

de la glícolísís ~ esta hiperactividad de la bomba produce deshidrata-

ción celular, puesto que contribuye a su empobrecimIento en cationes mo-

novalentes 83,137,139 Contribuye a la deshidratación la activación de

otras rutas metabólicas, como la pérdida selectiva de potasio por daño oxí—

dativo 133, es posible que los esferocitos sufran in vivo tal agresión en su

contacto temporal con los macrófagos productorés de radicales libres,

como sucede en ci bazo83137’139.

Y

36

oÉncrr DE ESPECTRINA

Densidad dlsmlflufda delesqueleto de la membrana

Posible agresión adicional

X a la espectiina (¿oxidación ?)

DesestabilizaCIón de la CondIcIonamiento esplénico,bicapa lípídica, liberación ~< lnayor pérdida de área celularde mícrovealculas

1~Menor suped lele/volumen>microesferocitosis

NtDisminución de la deformabilidad

de la célula roja

Secuestro de esferocitos en

la mícrocírculaclón dei bazo

y

[¡turs 11,— Patablrlorfa de la it (radif!cada ~ePalee, 199037).

Los esferocitos presentan una deformabilidad reducida 127, propor-

clonal al déficit parcial de especerina 25,179 y principalmente motivada

por la pétdlda de superficie respecto del volumen celular 25 (sin embargo,

la deformabílídad de la membrana eritrocitaria en la EH es normal o au-

mentada 124,179> uniendo a ello su mayor viscosidad interna por la deshi-

dratación Intracelular 28,124 Como consecuencia, los esferocitos no pue-

den atravesar las lenestraciones de las células endoteliales de la pared

de los sinusoides esplénícos, de donde la sangre pasa a la circulación veno-

Sa 83,180 Así los rígidos esferocitos quedan atrapados y se acumulan en

la pulpa roja, dando lugar al característico hallazgo anatómico de conges-

rión de la misma con senos venosos relativamente vados 56,86

Una vez atrapados en el bazo, los esferocitos sufren el denominado

condicionamiento esplénico. Consiste en que la célula es sujeto de agresio-

neo que determinan una mayor pérdida de superficie respecto de su volu-

men, con el consiguiente aumento de la densidad celular. Esta afectación

37

se ha constatado en hematíes obtenidos de la pulpa roja durante la espíe—nectomía, que son más esféricos, con mayor fragilidad osmótica y con

menor contenido Intracelular en cationes que los obtenidos de la circula-

ción sístémíca 137, A ella vuelven parte de las células condicionadas,

decectables in vit ro, como la “cola” de la curva de fragilidad osmótica,

indicando, la existencia de células con marcada reducción de su superfi-

cíe 38, que son más frágiles. De hecho, la esplenectomia hace desaparecer

esta población celular 38,83137,139

Son factores condicionantes la hipoxia y acidosis de la sangre

esplénica, así como la agresión de los hematíes por los radicales de oxíge-

no de los onacrófagos, con el consiguiente daño a las proteínas intracelu-

lares 174 y pérdida de potasio’33; se ha demostrado in vítro, en condicio-

nes de conservación y almacenamiento de hematíes, que la cuantía de la

oxidación de la espectrina es proporcional al grado de vesiculación celu-

lar ¶76, La deplección de glucosa motivada por éstasis esplénico, con el

consiguiente deterioro en la producción de ATP, no parece ser un factor

importante, puesto que se ha demostrado que el contenido de ATP es -nor-

mal en los hematíes obtenidos del bazo en el momento de la esplenectomLa

de los pacientes ~~439, Realmente el bato puede inducir lesiones estruc-

turales adquiridas en la membrana eritrocitarla en la EH 190, producidas

por la retención de los esferocitos dentro de los cordones esplénicos y su

exposición a diversos factores adversos, como la acidosis, el stress oxida—

ti~o. la fagocitosis por macrófagos, el daño causado por enzimas lisosómí—

cas granuloclílcas y un aumento de la susceptibilidad de la espectrino a

la autodigestión Poe proteasas endógenas 120 De hecho, se ha comprobado

por microscopia de fuerza atómica que la superficie de los hematíes en

la EH es irregular exhibiendo pseudópodos de 50—80 nm 190, que presumí-

blemente sean precursores de las evaginaciones visibles por microscopiaelectrónica 7,83,138 que llegan a liberarse como mícrovesículas 7,136,138,

El condicionamiento es producto de varios episodios de éstasls es—

plénico 38,83,137,139 Ei flujo sanguíneo esplénico en la EH oscila entre

¡0-20% del volumen de eyección cardíaca 83 y sólo un 1—10% de la sangre

que entra en el bazo queda retenida en sus cordones, mientras que mas

del 90% se incorpora rápidamente a la circulación venosa 180 Con cada

paso del esferocito a través del compartimento cordal aumenta su esferici-

dad y se favorece su reeni. rada en el mismo, y se ha calculado que se

38

precisan de ¡O a 30 pasos por dicho compartimento para la formación dcl

microesferocito a punto de ser destruido83.

La mayoría de los esferocitos son destruidos en el bazo, pero no

es este órgano el lugar exclusivo de la hemólisis 139 El final es la fago-

citosis dela célula por los macrófagos, que a su vez aumentan el número

en el bazo 56,86, El cambio qufmico que dosencadena la fagocitosis no se

conoce; posiblemente esté implicada una anomalía en la orientación de

los fosfolipidos de la bícapa lipidica; se ha demostrado que aquellos hema-

tíes que exhiben fosfatidilserlna en su superficfe son rápidamente reconoci-

dos y fagocitados por los macrófagos In vítro 150, En algunos pacientes

con formas clínicas graves de EH se ha demostrado dicha alteración de la

disttibuclón losfolipidica 109, que es posible que tenga lugar en los esfero—

citos ya repetidamente condicionados por el bazo.

Sin embargo, el déficit parcial de ospectrina responsable de la des—

estabIlización de la bicapa lipidica no necesariamente es el defecto mole-

cular primario, que puede radicar en la ankirlna 30,36,77,82,116 o en

otras proteínas como la banda 4.2 Sl o la banda 3 64,

La figura 11 resume y esquematiza los aspectos fislopatoIégicosde la EH,

1.5. Diagnóstico de la. EH

La EH se descubre en cualquier edad de la vida, desde el nacimien-

to hasta la ancianidad, aunque la mayoría de los pacientes se detectan en

la infancia o la juventud. La EH se diagnostica fácilmente, en general,

mediante la historia clínica, exploración física y estudios hematológicosrutinarios dirigidos que comentaremos a continuación.

¡.5.1. Datos clínicos

Los rasgos clínicos clásicos de la EH son anemia, ictericia s’ esp!e—

nomegalia 12112.l.38 pero en muchos casos no es así y los pacientes no

están ictéricos nl anémicos. Esto se debe a la gran variabilidad de la en-

fermedad, cuya historia natural viene determinada por el equilibrio eno re

la eritropovesis y la hemólísís ~3.

En los niños, la forma de presentación más frecuente (50% de los

casos) 112 es la anemia, seguida de ictericia, esplenomegalia o historia fa-

miliar del defecto. Pero la mayoría de los pacientes se hallan asintorráti-

39

cos, con ocasional desarrollo de crisis anémicas e ictericia intermitente.

Cuando existe espíenomegalia suele ser discreta <rara vez es masiva) y no’

existe correlación entre el tamaño del bazo y la gravedad de la El-] 112

1.5.2. Morfología cnt rocitaria y datos hematológicos

La mayor parte de los casos de EH <aproximadamente un 80%)

presentan hemólisis compensada con anemia mínima o ausente, con tana

cifra de reticulocitos anormal habitualmente superior a 6%. Esta retículo-

cicosis es un signo de hemólisis mucho más fiable que la hiperbilirrubine-

mia, que presentan sólo un 50% de pacientes.

La clave morfológica de la EH es el esferocl.o <figura 12), que

en la extensión de sangre periférica aparece como un hematíe redondo

sin zona pálida central, con menor diámetro celular medio y apalentemen-

te mayor hemoglobinización que el hematíe normal 12,112.139 caracterís-

ricas que traducen la geometría celular defectuosa por su reducida rela-

ción superlicie/volumen, con el consiguiente aumento de la densidad celu-

lar :especro del discocito normal. De hecho, la microscopia electrónica

demuestra que relativamente pocas células son verdaderamente esféricas,

existiendo un abanico morfológico desde discos gruesos hasta ‘arios estadios

de esieroestomatocíros (figura 13) 38.112,139 lo cual a veces puede In—ruirse en la extensión de sangre periférica. En las formas leves de la en-

fermedad, la morfología erhrociraria puede parecer normal debido a que

a pérdida de superficie celular puede ser tan pequeña que resulte inapre-

dable, dando la impresión de discocitos gruesos más que de esferocitos ~Además, en un 20—25% de los casos, los típicos microesforocitos resultan-

res del condicionamiento espiénico son relativamente escasos y la morfolo-

gla enirrocitaria puede ser considerada normal Incluso por observadores ex-

perinlenrados 112

Se han descrito otras anomalías morfológicas asociadas en EHatípicas con hemólisis grave, como la irregularidad en general del contor-

no celular, presencia de células con formas de champiñón (‘pinceredcelis’) y células espiculadas, éstas también descritas en las formas de EH

aurosómico dominante, designadas HS (3 Sp—4.l 12.38,112,¶37.¶39,lBó

Esta morfología eritrocitaría coexiste con los clásicos signos de

heniólisis. como la policromasia y ocasionalmente presencia de cuitrobias-

tos en sangre periférica, reticulocitosis e hiperpíasia rojo en la médula ósea,

41

junto con hlperbilirrubinemía no conjugada y elevación de la lactato deshí-

drogenasa <LDH), descenso de la haproglobina y presencia de urobilinógenden la orine 137—139 Estos datos pueden ser normales o sólo sutilmenteanormales en los casos de EH leveo asintomática 137—139

Herflocitométrlcamente se aprecie un volumen corpuscular medio

(VCM> dentro de limites normales, pero que realmente es relativamente

bajo si se tiene en cuenta el aumento de reticulocítos, cuyo volumen celu-

lar es superior al de los hematíes maduros 38,112,137 La hemoglobina cor-puscular media es asimismo normal 38,1 12,137 Característicamente, existeun aumento de la concentración de hemoglobina corpuscular media (CH CM>por encima de 36 g/dL en la mitad de los casos aprcxlmadamenee 38,122,

137 como reflejo de una discreta deshidratación celular producida porunos contenidos intracelulares de agua y potasio descendidos y de sodio

~CecoTranstormacion diococdo . estenoequinoceo

Transtotunficion dismoho .ooleróeotomotocdo

FIgure 13.— rarsfernaclón de dlscecito a esferoestomataclta y esferoeqoinotitO (n.rdl—

ficado de Bulí, 1990 22>, Ca la (it se puede apretiar or abanico de formas ce~alofC5

desde discocitos normales a estoratocltos, esferoestnratocltrs y densas oltroeste—

rodeos. [ea las liS <3 Sp—teA se han destrito esferoetrlnntitot.

r

42

docerodomaterno

célula atravesandola apertura — e,

___ electrodonoe rno

diluyente— ccnduclor

rIgor, ik— turaera dr la ritorreerfa ce apertura—1«pedan:ia. Seori la célula atravie-

sa la apertura autrurta la ,esistencia entre los elecerrdrs, generindose un pulso

st cuenta y rt!de.

normal o elevado 12.112.137 Sin embargo, las El-] leves y moderadas pueden

no ser detectadas si el estudio hematológico se limita a la utilización de

un cirómetro convencional 64,83,140, como los basados en el sistema de

apertura—Impedancia (figura ¡4), debido a que no ofrecen medidas exactas

del volumen celular de los esferocitos por interferencia de su concentra-

ción de hemoglobina entre otros factores, y por consiguiente tampoco es-

timan adecuadamente la CHCM, que se computa a partir del VCM medi-

do 125,128,171, Estos citómearos convencionales son incapaces de estimar

correctamente una CHCM superIor a 35 g/dL 125 por su medida Inexacta

del volumen de las células deshidratadas 128

Por ello, resulta necesario recurrir a otros métodos, como la cito—

metria por difracción de luz láser (figura 15), más adecuada para la eva-

luación de la EH ~ ¶40 por su capacidad de medida directa, simultánea, -

exacta y libre de interferencias del volumen y concentración de hemoglobi-

‘43

detector de

oc

fIgura 15.— tsquena de la eltarotrin por difracci¿n de luz láser (Sisterras it de

lechnlcon 114>, e ío largo de su flujo, la cilula es iluminada por una fuerte de

luz láser. Se mide la difracción de lo luz que produce cada efluía en seadus íngu-

lun alto y bojo.

na (HC> en hematíes esterificados isovolumétricamente y fijados con g¶u—

taraldehido 173, Se ha demostrado que esta tecnología estima con exacti-

tud valores de VCM comprendidos entre 30 y 120 iL y de 01CM ontre

27 y 45 g/dL 125,l28~ El método, además, cuantifica los hematíes con con-

centraclón de hemoglobina superior a 41 g/dL, computándolos en el pará-

metro denominado % Hiper, que se ha demostrado orlentativo de la presen-

cia de eslerocitos (junto con los parámetros concentración de hemoglobi-na corpuscular media medida directamente, lIC, y desviación standard dela distribución según concentración de hemoglobina, HOW) 64

El estudio de la médula ósea en la EH, como hemos señalado

anteriormente, revela hiperpíasia roja> en la que los ant robiastos son mor-

fológica y reológicamente normales, ya que el defecto celular de la entidad

Wdetector deari*ulo bajo

44

se expresa solamente en los hematíes circulantes, en cuya patogenia, por

tanto, no contribuye la eritropoyesis ineficaz 112 Esta exploración de mé>

dula ósea es rara vez necesaria.

1.5.3. Resistencia globular osmótica. Otros cests diagnóstIcos

El test de Resistencia Globular y Osmótica <RGO>, particularmente

su versión incubada, ha sido probablemente la prueba más útil para el

diagnóstico de la El-?. Mide la lisis in vitro de los hematíes suspendidos

en soluciones salinas progresivamente más hipotónicas. Está basado en que

la membuana eritrocítaria normal es inextensible y permeable al agua,comportándose las células como verdaderos osmómetros 142, de tal formaque se produce un paso rápido de agua a través de la membrana hasta el

equilibrio del medio Intracelular con la solución hipotónica en que el

hematíe se encuentra suspendido, con el correspondiente aumento de volu-

men celular hasta su esfericidad. Alcanzado este volumen hemolítico cri-cico (mínima relación superficie/volumen>, el eritrocito estalla al ser sumembrana inextensible, liberándose la hemoglobina a la solución circundan-

te. Por tanto, el deterrñinante critico de la fragilidad osmótica es la rela-ción superficie/volumen de los hematíes 6,12,16,112,139,

En el caso de la EH, los esferocitos presentan un defecto de su-

perficie de membrana respecto del volumen celular, con la consiguiente

deformidad esférica. Por ello su volumen hemolítico critico está notable-

mente reducido y se hemolizan más que los hematíes normaks en solucio-

nes salinas hipotónicas 12,112,139 y este aumento de la fragilidad osmóti-

ca es proporcional al déficit de espectrína 4,136 y generalmente traducela gravedad clínica de la El] 4,6, La discreta deshidratación de los esfero—

citos no influye en su fragilidad osmótica, a diferencia de otras patologías,

debido a que en la EH predomina de forma absoluta el defecto de super-

ficie respecto del volumen celular, y de hecho los esferocícos más densos

y deshidratados son osmótícamence más frágiles ¡4,137

La curva de fragilidad osmótica en la EH <figura 16) muestra confrecuencia un aumento global de la misma (curva tipo normal), aunque co, pa-

cientes no esplenectomlzados puede apreciarse una “cola’> reflejo de la exis-

ronda de una población de hematíes particularmente frágiles por el condi-

cionamienro esplénico (curva caudada), que desaparece con la esplenecrio—

mía 38,83,137,139 Aquellos enfermos cor, formas clínicas moderadas y gravesde la entidad exhiben una curva diagonal en la que tales poblaciones celulares

u

45

se solapan 38,39.137,139 En los casos de EH leves y asíntomácicos esdonde se plantea la mayor dificultad diagnóstica dado que la ROO Inmedia-

ta o no incubada es normal con cierta frecuencia; en tales casos el defec-to resulta casi siempre evidente en la ROO postincubación 38,112, 137,139

Este tratamiento de los hematíes previo al estudio de su fragilidad osmóti-ca repróduce la eritroscasis, incubando las células en condiciones estérilesy de deprivacién de glucosa. lo cual acenetia su pérdida de superficie demembrana y eventualmente acrecienta su fragilidad osmótica 12,16,39,139.

sin embargo, aunque la incubación aumenta la sensibilidad de la técnica, In—

%lisis

100

rlgura 16.— rrarfl idad ram¿tlca de lun ceraÑes er la En, (r.rdiflcadr de ralek,

Perfiles de las tareas normol (e) Indicaliva dr un aunento rlcbal de la fragilidad

os’ítita, caudada CC> o con rna ‘cría” dt tenaties ruy frígiles, y dianonal (1).

%ClNa

46

troduce un elemento de imprecisión que hace sus resultados menos unifor-

mes, con pérdida de su especificidad 38,ó6,137.¶39,163,

Se han utilizado otros cests diversos para el diagnóstico de la EH,

que en general carecen de ventajas respecto de una RGO cuidadosamente

realizada y que descutiremos brevemente a continuación:

-la autohemólisis, que estudia la hemólisis espontánea de los hematíes

incubados en su propio plasma en condiciones estériles y estáticas 38,83

reproduciendo las condiciones de la ericrostasis 83; con ello el he-macie pierde superficie de membrana, aunque el mecanismo de la

hemólisis es más complejo 17~ En ausencia de glucosa añadida, la auto—

hemólisis a las 48 h está aumentada en la EH, efecto que se previene

con la adición de glucosa 38,39, Esta técnica se consideró sensible en

la detección de la EH 38, pero las formas moderada y graves de la en-

fermedad con considerable reticulocitosis y abundantes esferocicos con-

dicionados por el bazo no corrigen su mayor autohemólisis con la adi-

ción de glucosa 83~112il67; también las EH muy leves y asincomáticas

pueden no tener la autohemólisis aumentada 38~ Además, los resultados

muestran cierra variabilidad entre los laboratorios e incluso al estudiar

un mismo paciente> y hay aparente gran cantidad de falsos positivos

entre la población normal, no siendo un test especIfico 83,112 Esta

prueba ha sido progresivamente menos utilizada y es menos sensible

que la RGO postincubación 137,

-los rests de lisis en glicerol, que miden el tiempo en producirse un 50%

de hemólisís de una muestra de sangre fresca o incubada en un tampón

glicerol-salino hipotónico ~9, y se basan en que el glicerol enlentece

la entrada de agua a los hematíes suspendidos en dicha solución, deforma que se puede. medir el tiempo hasta su lisis tras alcanzar un vo-

lumen hemolítico critico 39. En su versión standard, esta prueba carece

de la suficiente sensibilidad y especificidad para ser útil en el diagnós-

tico de la EH 5’4,112,137439• La versión acidificada de este test tieneuna sensibilidad relativa y cuestionable por depender de muchos facto-

res 21, a los que debe una baja reproductibilidad entre los laborato-

nos 54,163 y no es específica 21,1¡2,137,139,146,163

El “plnk tesr” es una adaptación de lo anterior, basada en la

determinación de la hemólisís final en una solución con glicerol y

acidificada que goza de una reproductibilidad y sensibilidad elevadas ~

47

Se ha demostrado que la RGO postincubación es superior al ‘pink

tese’ en sensibilidad y especificidad diagnóstica de la EH 21, o al

menos equivalente 54,89, Existen además modificaciones del ‘pink

tesú’ 54,88,89 que requieren mínimas cantidades de sangre capilar<l0—2OjiL) sin necesitar venopunción, que se han recomendado para elestudio de neonaros y niños 89 y como método de screening de la po-

blación pon su ejecución fácil ~.

- el estudio de la estabilidad mecánica de los hematíes mediante ektaci—

tometría 25,28 método capaz de medir la relación superficie/volumen

celular y el área de membrana, además de su índice de deformabilidad

y estabilidad mecánica, habiendo sido propuesto como una alternativa

sensible para el estudio de la pérdida de superficie celular en la EH 25,

Se ha demostrado que en esta enfermedad existe una reducción de laestabilidad mecánica de la membrana ericrocitaria directamente propor-

cional a la reducción de su superficie celular in vivo y su contenido

cnt espectrara 25,179

El conjunto de los tests diagnósticos referidos está basado en la

disminución de la relación superficie/volumen consiguiente a la esfericidad

celular, cambio comn¶n a lo heterogéneo del defecto molecular subyacenteen la EH. Por tanto dichos tests son indicadores óciles de cal esfericidadde los hematíes y la anormalidad de los resultados no es diagnóstica deuna entidad específica; pueden indicar la existencia de esfelocicos, perono la causa de la esferocitosis <que puede existir en otros estados hemolí—

ricos) y en ocasiones es imposible establecer un diagnóstico definitivo deaquellos pacientes con resultados limite.

Con estas consideraciones se ha descrito recientemente la criohe—

mólisis hípercónica 569, una sencilla prueba diagnóstica basada en que los

hematíes de la EH exhiben un patrón hemolítico especifico y sin igual

ante los cambios de temperatura cuando están suspendidos en soluciones

hípertónicas ¡68, comportamiento que es independiente de la relación

superficle/voltamen celular 169, con una sensibilidad diagnóstica del 100%

incluso de las EH leves t asintomáticas, y también muy alta especificidad.

El mocanisrro de la crlchernólisis hiportónica no está aclarado, pero se ha

sugc nido qué Aotu nc licúo de modificaciones secundarias del esqueleto de la

membrana erisrocitania a causa de los defectos primarios determinantes

de la. EH 168

48

Es probable que en un futuro más o menos próximo estos tests

diagnósticos sean sustituidos por la identificación directa del defecto

molecular etiológíco de la EH.

1.5.4. Estudio del defecto molecular de la EH

El déficit parcial de espectrína y otros defectos cuantitativos de

las proteínas del esqueleto pueden estimarse mediante SDS—PAGEde las

membranas eritrocitarlas aisladas y densitomecria de los geles teñidos (el

sistema de Laernrnll permite la separación de la banda 4.1 en sus so—

formas 4.la y 4.lb a costa de perder la resolución de las bandas 2 y 2.1,

correspondientes, respectivamente, a cadena (~ espectrína y ankirina) 50,95,166~ con este método se calculan los contenidos de la membrana en espec—

tuina, aralcirina y otras proteínas respecto de la banda 3 como los cocien-

tes de sus áreas densitométricas versus el área de la banda 3 (figuras 2

y 17) 3,4,30,1 31, El procedimiento está matizado por las variacIones del

contenido de lo membrana en banda 3, de forma que antes de la espienec-

torala la cantidad es menor por liberación in vIvo de porciones de la mem-

brana con banda 3 como mlcro~’esfculas, y particularmente durante el con-

dicionamiento esplónico, lo que supone una sobreesríma artefaccual de los

contenidos reales de las proteínas; por otra parte, la espienectomia redu-

ce tal pérdida de membrana in vivo con la posibilidad de infraestimar di-

chos contenidos de las proteínas al ser referidos a la banda 3 3,4,5,139,

Asimismo se ha realizado cuantificación de espectrina mediante ra—

dioinmunoensayo ~ método que resulta más sensible para la detección

de déficits ligeros 137,139 y que permite medir el número de moléculas

de espectríaria por hematíe.

La cromatografía de afinidad de extoactos de espectrina sobre

proteína 4.1 InmovIlizada permite explorar el defecto HS jbSp—4.1 ¶86, El

análisis bidimensiornal <isoelect roenfoque combinado SOS—PACE) tras di-

gestión enzimática controlada de las proteínas permite advertir sus anoma-

lías estructurales, y ha resultado útIl para la evaluación de los defectos

de la especarina 1 ~elía y 1-lS (b Sp-4.1 en el caso de la EH> 13,l¡8,119;

también se ha aplicado a las aiteraclones de la banda 3 84,131 con resul-

tudt’s. pon el momento, preliminares; sin embargo no ha ofrecido datos po-

altivos en el estudio de la ankirina 138, La microscopia electrónica 104,106

permite apreciar la reducida densidad del esqueleto de la membrana en la

r¡~ura 17.— tnrslturetr!as de SIS—PAGE de la membrana orltrocltarla. Control y Elt. loo

trara~as ubitads a la irqulerna comprender. la lunoltud total de la electrcirreslo.

A la derecha se en ISr1e.ado ¡a lectura a la especirina, nakirtna y bunda 3, aceden—

da amalifícada la anchura de las pítos <lensitómetro ¡teleta 2~—Pratess

Normal

Esferocitosis Hereditaria

50

EH, observándose en la mayoría de los casos de déficit de espectrina leve

a moderado unas redes esqueléticas, sin otras anormalidades que una

reducción del nómero de tetrámeros de espectrina, que se unen a cada

complejo de unión en correlación con la gravedad del déficit de dicha pro-

ceína 104,. El estudio de la longitud de los fragmentos de restricción de

los polimorfismos (RFPLs) del DNA ha permitido la vinculación de la

herencia de la EH con un determinado polimorfismo del gen de la anki rl —

na 36 en formas dominantes, con déficit de especarina y ankirina; otros

autores han evaluado los niveles de mRN’A y la síntesis y unión a la

membrana de espectrina y anklrina en reticulocitos ~

Esta investigación del defecto molecular básico de la EH puede

ser tremendamente complicada, ya que los factores determlnant es del

déficit de espectrina, y su correspondiente expresión clínica, pueden ser

al menos tan complejos como en los síndromes talasémicos 138

1.6. Tratamiento y pTonóstlco

La esplenectomia es el tinico tratamiento de la EH6,12,t12,139,

¡54,163,183 por su efecto “curativo’ soboe la anemia y la hiperbílirrubine—

mia debido a que permite que los esferocítos permanezcan más tiempo en

el torrente circulatorio, aunque su supervivencia pueda mantenerse discre-

tamense acortada en un estado hemolítico compensado en general leve,

con consiguiente reducción o desaparición de la híperpíasia roja; en aque-líos pacientes más gravemente afectos con hemólisis crónica sintomática

(síndrome anémico, retraso ponderoescatural> la esplenectomia produce

una drástica mejoría clínica con corrección parcial de la hemólísis 4,6,30,38, reduciendo o incluso suprimiendo en su caso el requerimiento c ransfu—

sional 163

Evidentemente, la esplenectomia no revierte el defecto moiecula.r

primario causal de la enfermedad. Hemoperiféricamente, persiste la presen-

cia de esferocitos y aparecen los clásicos cambios postesplenectomia, con

leucocitosís, trombocítosis, cuerpos de Howell—Jolly y acantocitosis pronun-

ciada aunque inofensiva, que puede llegar a afectar a un 10—20% de los

hematíes dc los enfermos aespíénícos 83 Asimismo se mantiene la carac-

cerísaica de mayor fragilidad osmótica de los eritrocitos 38,139,154.¡83

pero desaparece la cola de la curva correspondiente a las células condicio-

nadas por el bazo 38—139

51

La ospienectomia no está exenta de riesgos> aunque son menores

en la El-? que en otras enfermedades hematológicas 83.139,181 con morbi.’

mortalidad postoperatoria inmediata de O y849%n versus 4 y 13,5%, respec-

tivamente, en series recientes 181, y sin olvidan la sepsis postespienectomia.

con una incidencia de 0,2 casos por 100 personas y año (siendo la inciden-

cia de una infección grave, en general, de 7,2 casos por 100 enfermos y

año> ¶51 y 2,2% de mortalidad, susceptibles de reducción con la profilaxis

adecuada (vacuna antineumocócica polivalente y adminimración de penicili-

na 117,163, riesgo que perdura muchos años después de la cirugía 49. Por

nodo ello, no se justifica la esplenectomia indiscriminada, e incluso la ten-

dencia actual se dirige a evitarla 163,

Los propóskos principales de la esplenectomia son suprimir el me-

noscabo de la capacidad física y vitalidad de los pacientes, evitar la cole—

litiasis por la hemólisis crónica y prevenir crisis anémicas graves que

precisen transfusión 38,44 Así pues, la espienectomia está indicada en

todos los enfermos de EH con hemólisis sintomática o retraso del creci-

miento <síntomas que se dan principalmente en las formas moderadas y

graves) 112.137,¡39 siendo aconsejable en este caso no realizarla antes

de los 3—5 años de edad por el riesgo aumentado de infe¿ción postesple—

nectomia de los niños pequeños aesplénícos 38,112,139,183 La indicación

es cuestionable en las EH leves o asintomáticas con colellalasis o historia

familiar de ella, dada la reducida probabilidad de que cal complicación

produzca manifestaciones clínicas 7í~ los resultados de la comparación de

los riesgos de la esplenectomia electiva versus la actitud expectante en

caso de colelltiasis asintomátíca favorecen esta última conducta 117,181

En los pacientes mayores de 60 años no se recomienda, en general la

cirugía por la mayor morbimorcalidad quirúrgica y anestésica de los indi-

viduos de edad avanzada y que con frecuencia presentan enferm edades

asociadas que aumentan el riesgo operatorio 183, prefiriéndose en este

grupo de enfermos la actitud conservadora 58,154, La decisión final de la

esplenectomia se basa en el criterio clínico y radica en la edad, sintoma-

tología y quizá en la probabilidad de una profilaxis adecuada de las infec-

clones posrespienecrom(a J8’4~ algunos autores reclaman el rol en este

sentido del grado de déficit de espectrlna 4~ como parámetro predictivo

do la respuesta a la esplenectomía 4,163, ya que aquellos enfermos con

contenidos de espectrina superiores al 80% de los niveles normales no

suelen precisar esplenectomia en la Infancia o adolescencia ‘~‘4.

52

Si la esplenectomio está indicada y existe colelitiasis, debe reaii—

zarse la colecistectomía en el mismo acto operatorio 38,í54í63,í83, en el

cual también deben buscarse y retirarse bazos accesorios en caso de exis-

tir.

Clásicamente se afirma que los enfermos afectos de verdadera EH

siempre responden a la espleneccomía 112, cuyos fracasos obedecen a la

coexistencia de la EH con otras anemias hemolíticas, o bien a la existen-

cia de bazos accesorios (hasta en un 39% de los pacientes) y esplenosís 38.139; estas dos alírimas posibilidades pueden sospecharse por la ausencia de

cambios hemoperiféricos poscesplenectomia, aunque su diagnóstico requiere

procedimientos de diagnóstico por la Imagen, particularmente métodos iso—

tópicos 38,139,

Por otra parte, todos los enfermos con procesos hemolftlcos tienen

riesgo de déficit de ácido fólico, por lo que resulta recomendable prescri-

bir suplementos del mismo.

Ante todo lo expuesto, queda patente que el pronóstico de la EH

es muy variable de un paciente a otro, dependiendo de la magnitud deldefecto, su curso clínico, complicaciones y necesidades terapéuticas de ca-

da caso,

2. OBJETIVOS

54

La EH es el trastorno hemolítico hereditario más prevalente en la

población, con herencia en general autosómico dominante, una empila ex—

presividad clínica y respuesta favorable a la esplenectomia cuando es nece-

saria. Se caracteriza por hemólisis, presencia de esferocleos en sangre pe-

riférica, elevación de la CHCM, aproximadamente en la mitad de los ca-

sos, y el típico aumento de la fragilidad osmótica de los hematíes que ha

continuado siendo el test de confirmación diagnóstica desde las observa-

clones de Chauffard (1907> 38, y que refleja la reducción de la relación

superficie/volumen Inherente al defecto Intrínseco del eritrocitoó,12.112,139163 En la mayoría de los casos este defecto se ha relacionado con

un déficit parcial de espectrina en la membrana eritrocitaria proporcional

a la gravedad del curso clínico de la enfermedad 2,3,4,121 y que podría

ser secundario a un déficit parcial de ankirina asociado recientemente des-

cneo 30,36,82

Sin embargo, no todos los enfermos siguen este perfil clásico en

que el diagnóstico es incuestionable. Aproximadamente un 25% de las

EH 2.112,163 carecen de historia familiar evidente con los métodos diagnós-

cicos convencionales y clinicamente suelen cursar con mayor afectación

del curso clínico 3,4,6.8.12,112,137.139,163 aunque rara vez con anemia he—

molíca dependiente de transfusión 2 y respuestas parciales a una espienec—

romía precoz 2,4,6,12,30,113,137,139 Estos pacientes constituyen un grupo

heterogéneo que Incluiría casos esporádicos por nuevas mutaciones, formas

de herencia recesiva y ejemplos de herencia dominante con penetrancia

genética reducida 1i2~ A este respecto Agre <¶989)6 sostiene que la EH

dominante y recesiva son enfermedades distintas y no la mera expresión

homocigota o hererocigoca de un defecto; por su parte, Delaunay y cois.

(1990)41 consideran que el fenotipo de la EH es el resultado de un gen

mutado modulado por la actividad de su correspondiente alelo y/o la acti-

vidad de otros genes nao alélícos, lo que explicarla la amplitud del espec-

tro clínico de la entidad. Sí los progenitores de estos enfermos sin histo-

ria familiar están afectos ha de ser muy levemente al pasar desapercibidos

a los métodos diagnósticos convencionales.

Este problema enlaza con la dificultad diagnóstica que a menudo

plantean los casos leves o asintomáricos a la metodología tradicional 64,

55

112,140,163 Estos son un 20—30% de las EH 112,163, aparecen frecuente-

mente en los estudios familiares de casos más evidentes y plantean una

serie de problemasr

— presentan una pequeña cantidad de esferocitos en sangre periférica

cuya l~entificación morfológica es subjetiva y difícIl 140 y su CHCM es

anodino

— el grado de hemólisis es ligero

- a fragilidad osmótica no incubada es normal y lo. incubada acaso no

está notablemente aumentada.

Disponer de otras técnicas que teóricamente fuesen capaces de cu-

brir el vacio de los métodos convencionales eliminarla la dificultad diag-

nóstica de la EH leves o asincomáticas, permitiendo discernir si los proge-

nitores de casos sin historia familiar del defecto están o no afectos, loque quizá aportase alguna solución sobre la herencia de tales enfermos.

Hemos evaluado en este sentido la citomecria de difracción de luz láser y

la SDS—PAGE de los estromas ericrocitarios aislados con estimación de los

contenidos protelcos de la membrana, ambas son técnicas conocidas, senci-

lías y fácilmente disponibles.

La citometria de difracción de luz láser, según los sistemas H de

TechniconTN4 <figura 15), mide de manera exacta, directa y simultánea la

intensidad de la luz difractada por cada hematíe (previamente esterificado

isovolumétricamente y ligeramente fijado con glutaraidehído> en dos interva-

los angulares 128-171. La tecnología ofrece medidas exactas de MCMentre 30 iL y 120 IL y de CI-ICM entre 27 g/dL y 45 g/dL ¡28, y propor-

ciona rápidamente Información cuantitativa de la presencia de hematíes

con el aumento de la concentración de hemoglobina característico de los

esferocicos, al ser células deshidratadas 12a112a128a139 Esta es una ventaja

fundamental frente a los cítómecros convencionales <figura 14), que no Son

capaces de estimar correctamente CHCM superiores a 35 g/dL por sumedida inexacta del volumen de las células deshidratadas ¶28; además la

rigidez, esfericidad nativa y elevada concentración de hemoglobina del

esierocito impiden la medida correcta de su volumen y de su CHCM, pon

ser can parámetro calculado a partir de VCM 125,I28,171,173 Inconvenientes

que dificultan la detección de casos leves o asincomáticos de EH 64,¡40

En cambio, la citometría de difracción de luz láser resulta óptima

para el estudio de la EH por su facultad de medida directa, simultáneo y

56

exacta del volumen y la concentración de hemoglobina de los hematíes,

con Información sobre la presencia de esferocitos en la curva de distribu-

ción de los hematíes, segón concentración de hemoglobina <figura 18) y

sus parámetros derivados HG <concentración de hemoglobina corpuscular

media estimada directamente) HDW <desviación standard de la distribución)

y particularmente % Hiper o porcentaje de hematíes de concentración de

hemoglobina mayor de 41 g/dL. Dichas variables son verdaderos indicadores

de esferocitosis entendida como la existencia de esferocitos en una mues-

tra dada, hecho no exclusivo nl patognomónico de la EH.

El rol diagnóstico de la citometria de difracción de luz láser en

la EH sólo se ha evaluado en dos estudios 64,140 Patí y cois. (1989) 140

han considerado básicamente su aspecto cualitativo y han encontrado

muy especifico del problema el perfil de las curvas de distribución de los

hematíes, Giisanz y cols. <1989) 64 han demostrado en un trabajo prelimi-

nar del actual la utilidad de HC, HDW y % Hiper en la detección de esfe—

rocitosis en la EH. Pero el nómero de pacientes no esplenectomízados in-

cluidos ha sido pequeño en ambos estudios (¶2 y 22 casos, respectivamen-

te), Por otra parte, nadie ha evaluado la eficacia estadística del método

como prueba diagnóstica de esferocitosis aplicada a la EH, que en caso

afirmativo resolverla dos problemas:

— sustituirla la subjetividad y dificultad de la identificación de esferocitos

en una muestra por parámetros cuantitativos Indicadores de esferocinosis

obtenidos de modo rápido y sencillo,

- representarla una alternativa real al clásico estudio de fragilidad osmóti-

ca y variantes, que con frecuencia no son lo suficientemente sensibles

en el diagnóstico de la entidad y que en definitiva son también indica-dores de esferocitosis, al estar basados en la pérdida de la relación su-

perficie/volumen del esferocito.

Estos argumentos tienen especial trascendencia sobre todo en el

diagnóstico de las formas clínicas leves y asintomáticas. Además, el proce-

dimiento permitiría cuantificar el grado de esferocitosis inherente a la

gravedad de la EH, hecho ya demostrado en un pequeño nómeno de enfer-

mos 64,

La SOS—PACEde la membrana eritrocitaria es conocida desde los

trabajos de Fairbanks y cols. (¡971) so, Su aplicación al estudio de la EH

ha permitido apreciar en la mayoría de los enfermos un déficil parcial de

57

espectrina directamente proporcional al grado de afectación clínica 2,3,4,12,44,139 al que posteriormente se han asociado déficits parciales de

ankirlna <tanto en EH dominantes 36,82 como recesivas 30,116), de pro-

tefna 4.2 ocasionalmente 81,138,139,148 <relacionado en ciertos casos con

un defecto del dominio cicopiásmíco de la banda 384,138> y recientemente

de la bandA 3 115,121,122,131 (tabla 1>. Se ha descrito en progenitores de

EH sin historia familiar que el contenido de espectrina menor del 97% de

la normalidad se asocia a un aumento de la fragilidad osmótica ~. A

pesar de que el contenido de la membrana eritrocitaria en ankirlna se ha

explorado en varias ocasiones, siempre ha sido en serles muy cortas 30,36,82 , y se ha sugerido que el déficit combinado de especerina y anklrlna

<HS Sp~Anld) es el más prevalente en la EH 3,4,36,82,116,139 aunque no

existen estudios confirmatorios en grupos mayores de enfermos. Si la téc-

nica se incorporase a la rutina diagnóstica de la EH, se aminoraría la di-ficultad diagnóstica de las formas leves y aslntomáticas 163, y por ende

de los progenitores de las EH sin afectación familiar aparente, probable-

mente proporcionando datos que contribuyan a esclarecer la herencia dei

defecto en estos pacientes.

Ante el estado del problema decidimos estudiar un colectivo de

62 casos de EH y 12 progenitores de enfermos sin historia familiar con

los siguientes objetivos:

1.— identifIcar subgrupos homogéneos según edad> herencia, gravedad delcurso clínico y antecedentes de esplenectomia, y analizar sus caracte-

rístícas.

2.— Respuesta a la esplenectomia.

3.— Valorar la contribución de la citometria de difracción de luz láser aldiagnóstico de la EH merced a sus indicadores de eslerocitosís, discu-

tiendo varios aspectos:

su eficacia estadística en el diagnóstico de la EH

si traduce la intensidad de la esferocitosis inherente a la afecta-

ción del curso clínico, considerando el problema de los casos

leves o asintomáticos y el cambio tras la esplenectomía

su relación con otros parámetros de heméllsls

si puede reemplazar en la metodología diagnóstica de la EH a

las técnicas de fragilidad osmótica y variantes, que resultan

laboriosas y no lo suficientemente sensibles.

4.— Evaluar la contribución al diagnóstico de la EH de la SOS-PACE de

58

las membranas ericrocitarias aisladas y el cálculo de sus contenidos

proreicos, analizando:

su eficacia estadística

la frecuencia de los déiicins proteicos, su variabilidad con la gra-

vedad de la EH y su relación con otros parámetros de hemólisís.

5.- EstudIar a los progenitores de EH con las dos técnicas anteriores en

busca de signos objetivos de esferocitosis y de defectos proteicos de

la membrana cnt rocitaria, reflexionando sobre la Información obtenida

y su posible repercusión en la herencia en los enfermos sin afectación

familiar aparente.

6.— Clasificar la EH segnin su grado de expresión clinicobiológica, Integran-do los indicadores de esferocirosis ofrecidos por la citomerría de

difracción de luz láser y los indicadores de déficit proteico de la

membrana erirrocicaria.

3. MATERIALES Y METODOS

60

3.1. Enfermos y controles

El presente estudio se ha llevado a cabo en los Hospitales “12 de

Octubre” y PríncIpe de Asturias” sobre 62 pacientes previamente diagnos..

ticados de EH. Cincuenta y tres casos presentaban clara historia familiar

y procedían de 21 famIlias. En 2 pacientes no fue posible el estudio fami-

liar. Siete casos carecían de historia familiar y el estudio de padres y

hermanos, si los había, no permitió en ellos el diagnóstico de EH; decidi..

nos incluir en el presente estudio a sus progenleores, de los cuales fue

posible acceder a .6 parejas.

Cuarenta y dos enfermos proceden del Hospital “12 de Octubre” y

veinte <2, 8, 29, 30, 35, ló, 48, 49, 59—69, y 24> del Hospital “Príncipe

de Asturias”. El diagnóstico previo de EH se habla realizado en base al

hallazgo de esferocitos en la extensión de sangre periférica, test de Coombs

directo negativo, elevación de la concentración de hemoglobina corpuscular

media (CHCM>, aumento de la cifra de reticulocitos y LDH sérica con

descenso de hapeoglobina, y aumento de la fragilidad osmótica de los he-

marlos incubada <tras 24 h a 37~C en condiciones estériles) i2,38,83,112,137,139 Diecinueve pacientes hablan sido esplenectomizados.

La valoración de la historia familiar y personal de los pacientes,

de edades comprendidas entre 4 meses y 66 años, se realizó mediante con-sulta retrospectiva de las historias clínicas y entrevista personal con todos

ellos en el momento del comienzo del estudio, de octubre de 1989 a

marzo de 1990. Se evaluaron los siguientes aspectos: sexo, pedignee, edad

actual t’ al diagnóstico, motivo del diagnóstico (habiendo contemplado den-

tro de este apartado posibilidades como anemia crónica, ictericia neonanal

o no neonacal, esplenomegalia, crisis anémicas y estudio familiar por exis-

tencia de parientes afectos; en el caso nómero 33 el diagnóstico de EH

fue casual y debido a estudio por trombocitopenía), antecedentes de crisis

anémicas, documentación de coleliníasís y edad en el momento de laesplenectonia en caso de haberla sufrido. Tales datos permitieron agrupar

a los pacientes en categorías segnin el curso clínico del defecto 12,38,44,S3,112.137,í39

A continuación de la entrevista, se obtuvo muestra de sangro de

los pacientes por venopunción limpia destínándose una parte a determina—

61

clones bioquímicas séricas como bilirrubina total LDH, sideremia, ferrítína,

haptoglobina y erltropoyetlna (EPO). La segunda parte de la muestra obte—.

nída se anticoaguló con EDTA tripotásíco y se sometió al exámen hemato-

lógico consistente en la realización de hemograma con estudio de la mono—

logia de la serie roja, recuento de reticulocitos, resistencia globular osmó-

tica (liGO) inmediata y postincubación de la sangre durante 24 h a 37~C

en condiciones estériles, y estudio de la membrana eritrocitaria mediante

SDS—PAGE e lnmunob¡oc antiespectrina de los estromas aislados. El estudio

ha incluido también una ecograf fa abdominal en todos los pacientes de al

menos 4 años de edad, dirigida a valorar esplenomegalia no palpable y/o

col elitiasis,

Se evaluaron asimismo 12 progenitores de 6 pacIentes que carecían

de historia familiar; sus muestras de sangre fueron estudiadas exactamente

de la misma forma que en el caso de los enfermos.

Como reí enencia para el estudio, se obtuvo muestra de sangre de

140 controles adultos sanos (6 de ellos esplenectomizados por rotura trau-

mática del bazo) y se anticoaguló con EDTA tripotásico. Sus hemogramas

tuvieron por objeto el cotejo de los parámetros hemocitométricos con pa-

cientes y progenitores. Veinticuatro controles no esplemectomizados fueron

procesados simultáneamente con los casos para el estudio de la membrana

erittccltaria mediante SDS-PAGE e lnmunobloc antiespectrina desde la pre-

paración de los estromas.

3.2. Citometria de difracción de luz láser

Se eligió la citometria por difracción de luz láser como método

de realización de todos los hemogramas, utilizando para ello el aucoanail—

zador H-l TechniconTM.

En el sistema de apertura—impedancia <figura 14), la magnitud del

impulso generado por una célula no sólo depende de su volumen, sino tam-

IMán de su forma, que está determinada por su deformabilidad cuando

atraviesa la apertura ~ Este factor depende de la viscosidad cítoplásmica,

a su vez InfluIdo por la concentración de hemoglobina. Esto significa queen este sistema la medida del volumen está afectada por la concentración

de hemoglobina 128,173 En la EH la rigidez de la célula supone un factor

superficie relativamente elevado en este sistema, determinando, en conse-

cuenda, sobreestima del volumen e iniraestima de la concentración de he-

moglobina 171•

62

Los citómetros convencionales por difracción de luz miden el

volmen de los hematíes en la luz difractada a un determinado intervalo

angular ~ En este sistema la orientación de las células en el haz de

luz es un factor primordial en la valoración de su tamaño, como también

lo es la concentración de hemoglobina intracelular, que determina la

densidad ¿ptica e indice de refracción del hematíe> y en consecuencia la

cantidad y dirección de la luz difractada 171,173 Por ello, para una señal

de difracción dada; la desconocida concentración de hemoglobina faisea el

volumen asociado a dicha señal 128

El método elegido evita el problema de la Interferencia de la con-

ceníración de hemoglobina en la medida del volumen de los hematíes,

debido a su capacidad para determinar directa, simultánea e independíen-.

temente volumen y concentración de hemoglobina en cada célula mediante

medida de la luz monocromática difractada en dos diferentes intervalos

angulares 128~ La dependencia de la difracción de los cambios de forma y

orientación de la célula queda abolida por esferificación isovolumétríca de

los hematíes por un método similar al descrito por Ponder 142 hace apro-

ximadamente medio siglo. La preparación citoqulmica requiere un solo

reactivo tamponado <que incluye 1 mg/dL de SDS y 0,1% de glutaraldehido

en PBS 290 mosm/Kg, pH 7n4>a según método de Kim y Ormétein 91> que

rápidamente encoge la membrana hasta la formación de una esfera sin

alteración del volumen total de la célula, esfera que queda ligeramente

fijada para ser presentada al detector 128,171, evitando así los cambios

en la forma inducidos por fuerzas generadas en el fluido durante el flujo

celular 128, Así los hematíes esféricos se comportan como simples esferas

dieléctricas homogéneas 173, objetos en que es muy sencillo medir la luz

difractada porque es uno de los pocos casos en que las ecuaciones deMaxwell para los fenómenos electromagnéticos pueden resolverse completa-

mente, y la teoría de Míe90describe de fonma precisa su difracción. Para

ello, el sistema de detección óptica mide la intensidad de la luz difracta-

da en dos Intervalos angulares (figura 15>, uno de ellos bajo> entre 20 y

39, y otro intervalo angular más alto, entre 59 y 152> y partiendo de

este par de intensidades, un procesador electrónico de datos basado era la

teoría de difracción de Míe deriva el correspondiente par de valores para

el volumen y el indice de refracción (verdadera función lineal de la con—

do 128,171473 De esta forma, se determinan de modo directo, simultáneo.

63

independiente, presiso y exacto volumen y concentración de hemoglobina

para cada hematíe en una muestra de Sangre, construyéndose los correspon—,

dientes histogramas Según volumen y segain concentración de hemoglobina,

y a partir de los histogramas se computan volumen corpuscular medio

(VCM>. concentración de hemoglobina corpuscular media <CHCM), coefi-

ciente de variación de la distribución por volumen <RDW) y desviación

standard del histogeama según concentración de hemoglobina <HDW) 128,171,173

Se ha comprobado que este método cubre con exactitud un amplio rango

de medidas de VCM (30—120 IL) y de CHCM(27—45 g/dL) en contraste

con los citómetros convencionales, en los cuales tan CHCM superior a

35 g/dL no puede ser estimado correctamente 125 por su medición inexac-

ta del volumen de las células deshidratadas 128, como son los esierocí—

tos 12,38,83,112,137,139

La rigidez, esfericidad nativa y característico incremento en la

concentración de hemoglobina de los hematíes de la EH no permiten en

citómetros convencionales obtener medidas exactas de volumen por interfe-

ronda de la concentración de hemoglobina, entre otros factores, ni de

CHCM, ~aior computado a partir del VCM 125,128,171,173 con lo que

pueden pasar desapercibidas formas leves o moderadas de dicho defecto 64,140, Nuestro método por tanto, resulta más adecuado para el estudio de

la EH, por su capacidad de medida directa y libre de lnrerferenctas,

independiente, simultánea y exacta de volumen y concentración de hemo-

globina (HC) 64.140

Utilizando el autoanalizador H—i Technicon TM se evaluó la serie

roja de pacientes, progenitores y contnoles mediante los siguientes paráme-

tros: número de hematíes, hemoglobina, VCNI, hemoglobina corpuscular me-

dia (HCM), concentración de hemoglobina corpuscular media calculada(CI-ICM) y medida directamente (HC), tanto por ciento de hlpercromfa o

porcentaje de hematíes con concentración de hemoglobina superior a

41 g/dL (% Hiper) y RDW.

En un intento de evaluar la posibilidad de una mejor sensibi!idad

diagnóstica del método seleccionando corno umbral para la detección de

esferocitos concentraciones de hemoglobina inferiores a 41 g/dL (valor

por encima del cual ci autoanalizador define el parámetro % Hiper), se

calculó la proporción de estos hematíes directamente de las curvas de dis-

tribución según concentración de hemoglobina, dada la imposibilidad de ad—

64

ceso a la computadora. La superficie bajo dicha curva se dividió en 3

áreas (figura IB> en casos y controles:

- Aren 1: eritrocitos con concenuraciones de hemoglobina entre 35 y

37,5 g/dL,

Aren II: hematíes con concentraciones de hemoglobina de 37,5 a

40 g/dL,Aaea III: hematíes cuya concentración de hemoglobina supera

40 g/dL.

La superficie de estas áreas se midió en un Mop \‘ideoplan Kontron R y

se expresó como porcentaje del área total bajo la curva.

3.3. Morfología de la serie roja

Se examinaron mediante microscopia óptica extensiones de sangre

periférica (anticoaguiada en EDTA tripotásico) de cada uno de los pacien-

res y progenitores teñidas en tinción panóptica de Wright 184 Se buscó la

existencia de esferociros, policromasfa y poikilocitosis, en particular formas

con superficie espiculada o acantocleos en ausencia de espienectomia,

cua presencia ha sido detectada en pacientes con EH por defecto gené-

tico en la unión de la proteína 4,1 con la ~ espectrina (HS ~Sp-4.l) 186,

~ marcadas irregularidades del contorno celular, apreciadas en enfermos

con déficit combinado de espectrina y anklrlna (HS Sp4AnaK>) 30

3.4, Retlcuiccinos

En todos los pacientes y progenitores se practicó recuento de rerí-

culocitos, partiendo de sangre total anticoagulada en EDTA tripotásico.

Se utilizó como colorante supravital el nuevo azul de metileno ~ por su

superioridad sobre otros agentes tintoriales 48, La tincrón se realizó en

los treinta minutos siguientes a la extracción de sangre, procediendo

segón la técnica habitual y con recuento de 1000 hematíes37’48.

3.5. Resleencia globular osmótica

Se realizó el test de la resistencia globular osmótica <RGO> en

muestras do sangre de pacientes y progenitores como método de evalua-

ción de la relación superficie/volumen de los hematíes ~, tanto de forma

inmediata en muestras recientes anticoaguladas con EDTA triporásico

como postincubación a 37~C durante 24 h en condiciones estériles; las de-

terminaciones inmediatas se llevaron a cabo dentro de las dos primeras

horas de la extracción de las muestras de sangre.

65

e • 1 • 1‘‘‘‘La

Goncentraclon dehemoglobina(050 gIdL)

¡ • ¡

1 • ¡ • 1.1 • 5 . IJ~¡

Esferocitosis Hereditaria

Gonceniracion dehemoglobina<0 -50 g fdL)

¡

rigor. ¶8.— Dlstrlburiories de las OlerLaties segón conreutratión de benauloblna por rito—

netuir de luz líneo. toatrol y tli. Se esprciilc.n las Arcas definidas bajo la cor-

va. it la Elt la dstrlbuclbn re anríla y drsy¡a,a ron rayores calores de Areas 1 y

II y con a,aricibn de :~l~.1as te cemcentraeióa de berralabira surerlor a 41 rldL

(% telpur).

Normal

66

Se procedió siempre de forma habitual 16,39 Muy brevemente, se

preparó una batería de soluciones salinas hipotónicas a pl-i 7,4 en uw

rango de concentraciones de 1 a 10 g/L CINa (para el estudio de las

muestras incubadas se incluyó adicionalmente la concentración de 12 g/L

de CINa); tras su distribución en sendas alícuotas se añadió sangre total

a cada una de ellas en proporción 1 a 100 y una vez agitado todo suave-

mente por inversión se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos.

Posteriormente se centrifugaron los tubos a 1200—ISOD g durante 5 minutos

y se separaron los sobrenadantes. El grado de hemólisis producida se

midió espectrofocométricamente a 540 nm en cada sobrenadante, utilizan-

do para ello un aparato Specrronic 70 (de Bausch and Lomb R >~ Se con-

sideró como 100% de hemólisis la producida en la alicuota con 1 g/L de

CINa y 0% de hemólisis la correspondiente a 9 g/L de CINa, utilizando

ésta como blanco (en caso de hemólisis en ella sé consideré como blanco

el sobrenadante de la fracción con 12 g/L de CINa). Se cuidé que la ab—

sorbancla de la alicuota 100% de hemólisis no excediese 0,5 unidades, dilu-

yendo con CINa 1 g/L en caso de ser necesario, El porcentaje de hemó—

lisis en cada tubo se caiculó segón la siguiente ecuación:

% hemólisis= 00 muestra al 100,00 tubo lg/LCINa

con los resultados se confeccionaron las curvas de fragi!idad osmótica, re-

presentando cada concentración de CINa versus el porcentaje de hemólisis

producida por ella; en condiciones normales se obtiene una curva sigmoide

casi simétrica.

En nuestro trabajo, hemos expresado la RGO definiéndola por tres

puntos: lisis inicial o concent ración de CINa a la cual comienza a producir—

se hemólisis, lisis completa o concentración de CiNa en la que se ha pro-

ducido la máxima hemólisis y fragilidad media o concentración de CINa

causante del 50% de hemólisis. En todos los estudios se construyó la

curva completa y se examinó su trazado normal, diagonal o caudado <fi-

gura 16) 38,39.137,139

3.6. Estudio de la membrana eritrocitaria

Se realizó en todos los pacientes, progenitores y 24 controles. A

continuación describiremos los procedimientos empleados para la preparación

67

de los estromas erierocitaflos, estimación del contenido proteico total de

los mismos, estimación del contenido de espectrina y arriltinina de la mcm—-

brana del hematíe e inmunoblot antiespectrina.

3.ó.I. Preparación de los estromas ericrocitarlos

Partiendo de sangre venosa de casos y controles recogida era EDTA

nolpocásico, como máximo a las ‘48 horas de su obtención y conservando

siempre las muestras a 4QC hasta el momento de procesarías, se prepara-

ron membranas eritrocitarias según se ha descrito previamente 3,29,43,50,~ Para ello, se desleucotízó ¶a sangre venosa mediante una columna de

celulosa microcristalina en suero salino fisiológico (5SF), y tras lavar ¡oshematíes 6 ‘eces en 5SF fueron sometidos a lisis hipotónica a 4~G en20-40 voidmenes de PO

4Na3 5 mM, EDTA 1 m M a pH 8, con fenilmetil—

suilonlífluoride <PlnISF> 0,3 mM corno inhibidor de las proreasas cora el

fin de minimizar las protecalisis, centrifigundo a continuación a 0—4QC a

300.000 g durante 15—20 mInutos ce, centrífuga refrigerada Sorvalí R, con

posteriores 2-3 lavados más en la misma solución de lisado hasta que los

estromas eritrocitarlos aparezcan blancos o de aspecto cremoso.

Las membranas obtenidas se repartieron ea, alícuotas de 0,1 ml y

se conservaron congeladas entre —40 y ~70VC hasta su utilización (en los

casos y controles en que ésta no fue inmediata a su preparación) como

máximo al cabo de 1 semana,

3.6.2. Determinación del contenido proteico total

Se determinó la cantidad de proteína total contenida en las mem-Rbranas erisrocitarias obtenidas mediante Bio—Rad 1 Proteira Assay segxan

su procedimiento standard, sobre muestras no diluidas y con albúmina séri-

ca bovina (BSA> como standard pioreico. Al cabo de 5 a 60 mInutos de

la adición del reactivo colorante (contIene ácido fosfórico y meranol) en

proporción 50 a i volúmenes, se midió en especíroforómetro Gllford 260

la densidad óptica a 595 nm <CD. 595) de standard y problemas, una vez

construida la curva standard <representando gráficamente 0D595 verstas

concentración de los scandards> se extrapolaron a partir de ella las con-

centraciones proteicas de los problemas.

1

Este método está basado en que la absorbancla máxima de caría so-

lución ácida de azul de Coomasle 0—250 vira de 465 nm a 595 nm cuando

68

tiene lugar su unión a las proteínas 155 de forma que permite la aplica-

ción de la ley de Beer pata cuantificar proteínas con exactitud, mante-

niendo la adecuada proporción entre reactivo colorante y muestra, y ha si-

do utilizado por otros autores para estimar el contenido proteico de los

estromas eritrocírarios 29,97

3.6.3. EstimacIón del contenido de espectrina y ankirina

Para ello las membranas eritrocitarlas obtenidas se sometieron a

electroforesis desnaturalizarate con 1% de dodecil sulfato sódico (SDS> en

gel de poilacrilamida (SDS-PAGE) homogéneo al 5,6%, en placas de 1 mm

de espesor y 8 x 8 cm, segón el sistema continuo de Fairbanks y cols.

<1971>50 y utiliando material de Blometra R• Brevemente, la solución

formadora de gel se elaboró con 5,6% de poliacrilamída (partiendo de una

solución acuosa de acrilamída al 40% y bísacrilamida 1,5%, utilizando

resma Amberlite MB—6 R para su purificación y desionización>, SDS 1%,

y acetato sádico 0,02 M, EDTA 0,002 M, tris 0,04 M a pH 74, con persul—

fato amónico 0,15% y N, N’, N, N> tetrametiletilendiamina <TEMED)0,025% corno catalizadores de la polimerización; 10 mL de esta solución

permite obtener una placa de gel en el material utilizado. Una vez vertida

la solución formadora de gel entre sus soportes de vidrio, se permitió

polimerízar a temperatura ambiente durante al menos 12 a 24 horas en

posición vertical antes de su utilización; este procedimiento va dirigido a

que, la polimerización sea completa tras una primera fase rápida de gelífí—

codón ~ por tanto, de forma habitual, los geles en plaza fueron prepara-

dos el día anterior al de la correspondiente electroforesis.

De cara a la electroforesís, las muestras de estromas erítrocíta—

ríos fueron suspendidas en un volumen de ‘sampie bufler (SOS 1% sucro—

Sa ¶0%, tris 0,01 M EDTA 0,001 M, dithiothreitoi 0,04 M, a pH 8 con Ci H

y con azul de bromofenol 1% como colorante trazador) ~ incubando a

continuación a 370C durante 20—25 mInutos; con ello se consigue disrup—

ción de la membrana y unión del SOS a las protefnas ~ con reducción

de los puentes disulluro mediante el dithloíhreinol <DTT> 5~.

Una vez preparadas las muestras de membranas erlerocitarias de

pacientes y controles para SOS—PAGE se realizaron las electroforesis en

una cubeta vertical Mlnigel-.Electrophoresís de Biometra R con una fuente

ECóCO (4.000 Voits. Constant Power Supply) de E-C Apparatus Corporaelon.

Se utilizó un tampón con SOS 1%, tris 0,04 M, acetato sódico 0,02 M,

69

EDTA 0,002 M a pH 7,4 como buifer de electroforesls 50, y se trabajó a

temperatura ambiente. Cada gel en placa preparado segón el método 9material descrito contenía 10 pocillos para aplicación de muestras, de

forma que en cada ensayo se incluyó un control y nueve problemas <pacien-

íes y progenitores) distintos. La aplicación de las muestras se realizó me-

diante una pipeta Hamilton Microliter R Syringe 705 dIspensando aproxima-

¿amente 25 yg de proteína en cada pocillo, con rapidez, sin pzoducir

tubulencias y evitando la mezcla de la muestra con el buifer de electrofo-

resis para no perder una buena delimitación de las bandas, lo que sucede-

ría si se aumentase la altura de la columna de muestra aplicada ~ Tras

una e~ectroforesls Inicial de 5—10 minutos de duración a 70 V y 20 mA,

destinada a que la muestra aplicada penetre en el interior del gel, se lle-

vó a cabo la SOS—PAGE a 40 mA y ¡70 V como condiciones (siendo siem-

pre la intensidad la función dominante). Las electroforesis se dieron por

concluidas cuando el colorante trazador alcanzaba ci borde Inferior del

gel en placa, transcurriendo hasta elio 80-100 minutos. No se realizó

refrigerado del gel porque no es necesario, incluso sí se aprecie cierto

calentamiento al tacto cuando la electroforesis tiene lugar atemperada

por el aire ambiente, ya que se ha constatado que el calor generado en

los geles raramente es fuente de artefactos significativos en SDS—PAGE ~

Después de desmoldar los geles, se tiñeron y destiñeron por difu-

sión a temperatura ambiente en bandejas de acero inoxidable bajo agita-

ción continua aproximadamente a 30 sacudidas por minuto ~ utilizando

para ello un agitador rotatorio inmunetics R Rocking Plarform (de Rella-

ble Scientific R >, manteniendo como regla la proporción de 20 volúmeneS

de solución de unción o destinclón por cada volumen de gel ~ La Unción

se realizó por inmersión del gel durante 45 minutos en una solución con

azul de Coomasie R 250 0,1%, SO4Cu 0,i% (mejora la calidad de la tin—

ción) con metanol 30% y ácido acético 10%; para su elaboración, previa-

mente se disolvieron los solutos en agua destilada, añadiendo inmediatamen-

te antes de teñir los geles los volúmenes correspondientes de metanoi y

ácIdo acético. La destinclón se llevó a cabo en una solución de metanol

25% y ácido acético 10%, que Iba siendo renovada aproximadamente ca-da 15—20 minutos hasta conseguir una decoloración del fondo del gel,

transcurriendo aproximadamente 120-160 minutos en total. El azul de Coo-

masía utilizado en el sistema presumiblemente se une a las proteínas por

70

medio de Interacciones, tanto lónicas como hidrofóbicas, pero no tiñe los

complejos SDS-protefna eficientemente por competición con el SOS para~

la unión a las proteínas; por ello los pasos de la tinción y deseinclón

requieren un ajustado equilibrio, en el que el alcohol ha de tener al menos

cuatro funciones, la primera por producir una precipitación directa de las

proteínas desnaturalizadas por el SOS, la segunda por extracción del SOS

de los complejos proceicos inmoblllzados5S la tercera por deshidratación

y encogido del gel, contribuyendo, por tanto, a su fijado al reducir el ta-

maño efectivo de poro disponible para la difusión, y una cuarta función

consistente en mantener el colorante en forma monomérica para facilitar

su penetración en el gel encogido. En este esquema no está claro sí el

ácido acético tiene una función especial; se considera como razón de suuso que promueve la fijación y estabilizo la unión del colorante (aniónico)

a las proteínas por mantener en éstas una carga positiva s~.Los geles tratados segón este procedimiento exhibían un patrón de

bandas teñidas por azul de Coomasie similar al descrito clásicamente 50,166 (figura 19). Se estimó el contenido proteico de las mismas mediante

densitomerria 29>30,51>106,166 a 540 y 570 nm en un aparato Helena

Process — 24 (figura ¡7), con Integración del área bajo los picos de la

espectriria <bandas 1 y 2>, de la anklrlna (banda 2.1), de la banda 4 <no

conseguimos una neta definición de las bandas 4.1 y 4.2, por lo que con-

sideramos globalmente banda 4) y de la banda 3, y se expresaron los

contenidos de los estromas erlerocitarios en espectrina, ankirlna y banda

4 como el cociente entre el área de cada una de ellas y el área calcula-

da para la banda 3 (por ejemplo, cociente espectrina/banda 3)3,4,30 (fl~

gura ¶7). Se realizaron cuatro determinaciones para cada caso (pacientes

y progenitores> y control> considerando como valor definitivo su media

aritmética.

Todos los ensayos de determinación del contenido de espectrina,

ankirinu y banda 4 de los eseromas eritrocitarios se realizaron por dupli-

cado, en dos días distintos.

Los geles teñidos se conservaron mediante secado entre dos hojas

de celofán 177 utIlizando un Gel—Dryíng Frame R de JKA—Biotech Aps

<distribuido en España por Menariní). Este sencillo aparato consta de unmarco con cuatro patas y cuatro pinzas, con cuatro listones de plástico

que encajan perfectamente en las muescas que para ello presenta el mar-co; se complera con una placa cuadrada de 22 x 22 cm que se dispone — -

72

en el interior del marco destinada a sujetar el gel en placa mientras se

está montando entre las hojas de celofán <de JKA—Bloaech Aps>. Este

aparato permite el secado simple y rápido de los geles en placa, habien-

do sido preconizado por Kyhse—Andersen por ser el método de secado

de mejores resultados en sus manos ~ El procedimiento es sumamente

sencillo: en primer lugar se equilibraron los geles de pollacrilamida duran-

te toda ¡a noche en glicerol al 3% (como alternativa se ha propuesto In-

cluirlo en el agua del ditimo lavado); este paso previene la rotura del

gel durante el secado. A continuación se ablandan dos hojas de celofán

en agua destilada, y una vez colocado el Gei—Drylng Frame R en una su-

perficie lisa, con las patas hacía arriba y la placa cuadrada en su inte-

rior, se dispone encima una hoja de celofán cubriendo las cuatro muescas

que presenta el marco. Seguidamente se coloca el gel sobre la hoja de

celofán, en el centro de la placa cuadrada y sobre él la segunda hoja de

celofán. En este momento es conveniente frotar suavemente, con los de-

dos protegidos por guantes hasta eliminar todas las burbujas de aire

entre el gel y el celofán. El siguiente paso supone tensar y sellar la pila

de celofán y gel mediante encajado de los listones de plástico en las

muescas del marco y su posterior fijado con las pinzas. Una vez separado

el Gel—Drying Frame R de la placa cuadrada> se coloca sobre sus patas,

de forma que puede ser secado por aíre a través de sus dos caras. Eltiempo de secado de los geles es de una noche a la temperatura ambiente

del laboratorio, pero puede reducirse a ¡ hora si el aparato se sitúa

frente a una fuente de calor. Los geles secos no se doblan y presentan

una superficie lisa que ofrece resultados óptimos en la densitometrla ~‘~‘17, pudiendo conservarse sin deterioro indefinldamente.

3.6.4. lnmunoblot antiespectrina

Para evaluar la existencia de productos de degradación de la es—

pectrina en la membrana cnt rocitaria, los estromas de pacientes, proge-

nitores y controles fueron sometidos a análisis Inmunoquimico mediante

lnmunoblot, también conocido como Western—blotting 23~ Es un métodosensible para detectar fragmentos de degradación derivados de una pro-

teína mayor ‘, Para llevar a cabo este estudio en pacientes con EH Se

ha utilizado un método 2,29>30 derivado del descrito por TowbIn et al 172;

en nuestro caso se ha aplicado un método similar, modificado 156 del

descrito por Elkon 46

73

Partiendo de unas SOS—PAGE reden realizadas, se equilibraron los

geles desmoldados en fosfato bufier salino <PBS) pH 7,2—7,4 durante no

más de 1—2 mInutos, disponiendo a continuación la transferencia de las

proteínas, separadas por pesos moleculares en el gel, a una hoja de

nitrocelulosa como medio de soporte, según el siguiente procedimiento y

en el slgtx¶ente orden: sobre la superficie de una bandeja metálica se co-

locó el gel equilibrado, y aplicada directamente sobre él una hoja de nl—R

trocelulosa (Blometra , tamaño de poro de 0,2 Fm recortada exacta-mente al tamaño del gel y previamente mojada en PES por flotación, A

continuación se colocaron 3 capas de papel de filtro para blotting <Blome—

tra R B3/B51) mojadas en PBS y un paquete de hojas secas de papel ab-

sorbente corriente, todo ello recortado siempre a la dimensión exacta

del gel, disponiendo seguidamente encima una placa de cristal y sobre

ella 0,5 Kg de peso; eí grosor total de esta unidad de transferencia des-

crita fue de 2 cm aproximadamente. Se cuidó escrupulosamente en cada

uno de los pasos evitar y eliminar burbujas de aire, y se trabajó con

guantes para no dañar especialmente geles y hojas de nitrocelulosa. De

esta forma, siempre a temperatura ambiente> la transferencia se compietó

en 3 horas, al cabo de las cuales se levantó cuidadosamente la membrana

de la superficie del gel y se procesó para detección inmunológica de la

espectrina transferida. Los geles residuales de la transferencia fueron te-

ñidos con azul de Coomasie y conservados según se ha descrito en la es-

timación del contenido de espectrina y anicirina, aunque sin valorarlos

densitométricanlento por razones obvias.

Una vea inmovilizadas las proteínas esqueléticas en la membranade nitrocelulosa, se procedió a la inmunodeteccióra de espectrina, según

el sistema Protoalot ~ V’estern Blot AP Regular System, Rabbit (Prona—

ga R), utilizando como anticuerpo primario un antisuero policlonal de co-

nejo, antiespectrína eritrocitaria de ratón (Chemicon R>. En todo momento

se trabajó a temperatura ambiente, realizando todas las incubaciones y

lavados en un contenedor de vidrío ligeramente mayor que la membrana y

cora agitación suave, evitando siempre que quedaran secas las hojas de ni-

trocelulosa. Para las incubaciones con el anticuerpo y la reacción de co-

br> se utilizó la cantidad de solución justamente suficiente para sumergir

la membrana con la superficie de la transferencia hacia arriba, volumen

habitualmente de 0,1-0,15 mL/cm2 de área de la membrana y que en

nuestro caso se mantuvo en 0,15—0,25 mL/cm2 para asegurar la adecuada

74

inmersión de la hoja de nitrocelulosa en la solución, En el caso de la eta-

pa de bloqueo <explicada posteriormente) y lavados, se realizaron con al

menos el doble del volumen referido a nuestro supuesto.

Para llevar a cabo este proceso, el primer paso consiste en el

bloqueo del exceso de los lugares de unión de las proteínas en el cual la

membrana de nitrocelulosa reden separada del gel tras finalizar la trans-

ferencia, se equilibra y aclara en TBST <Tris 10 mM, CINa 150 mM

Tween 20 0,05%, y pH 8 con Cli-f), siendo incubada a continuación en So-

lución Bloqueante <TBST con albómina sérica bovina, ESA, 1%> durante

30 minutos, con lo que se consigue saturar los lugares de unión inespecifi—cos de proteínas. No resulta conveniente reutilizar la Solución Bloqueante

usada, puesto que pierde esta capacidad.

La segunda etapa fue la unión del anticuerpo primario adecuada-

mente diluido en I’BST (según la dilución de trabajo para Wesrern—biotting

recomendada por el fabricante para cada lote de ancisuero), reemplazando

la Solución Bloqueante por dicha dilución e incubando 30 minutos; finali-

zado este tiempo se realizaron 3 lavados de la hoja de nitrocelulosa en

TBST de 5—10 minutos de duración cada uno, con el fin de retirar el an-

ticuerpo no unido, quedando lista para el siguiente paso.

La tercera etapa consistió en la unión del segundo anticuerpo, en

nuestro caso antí IgO (Fc> de cabra anticonejo conjugado con fosfatasa al-

calina <Proto Blot R> a 1r7500 como dilución recomendada en TBST, con

incubación aquí de la membrana de microcelulosa 30 minutos, y una vez

transcurridos, se lavó de nuevo la membrana 3 veces durante 5—10 minutos

cada vez en IBST para retirar el anticuerpo no unido. Llegado este punto.

se secó la hoja de nitrocelulosa mojada en papel de filtro para dar co-mienzo a la reacción reveladora de color.

La cuarta etapa fue la reacción de color, transfiriendo la membra-

na a la Solución Reveladora de Color, preparada sobre una base de buifer

para fosfatasa alcalina <AP buffet constituido por Tris 100 mM, CINa

100 mM, CI2Mg 5 mM, pH 9,5 con CIH) sobre la que se añadió por cada

10 mL de AP buffet, 66 L de sustraro nitroazul de tetrazoilo (NBT, 50

mg/mL en dimetil formamida, Promega R> y una vez mezclado, 33 y~. L

de susanaco 5—bromo-4—cloro—s indolil fosfato (BCIP, 50 mg/mL en dimenlí

formamida, Promega R» mezclando también a continuación; esta solución

se protegió de la luz fuerte y se utilizó en el plazo de 1 h de haber sido

75

elaborada. En esta solución las áreas reactivas de la membrana de nitroce-

lulosa tomaron color púrpura en 1 a 15 minutos, considerándose el resul-

tado óptimo al cabo de 50 minutos de reacción, que permitió la mejor in-

tensidad de color de las bandas de espectrina sin aumento de la coloración

de fondo (el desarrollo de color aún podía haber tenido lugar durante al

menos 4 h, pero a expensas de una coloración de fondo progresivamente

mayor). En este punto Se interrumpió el desarrollo de color, aclarando la

hoja de nitrocelulosa en agua desionizada durante al menos 15 minutos,

con cambio del agua al menos 2 veces,

Para su conservación, la membrana de nitrocelulosa se dejó secar

al aire sobre papel de filtro. Una vea seca, se mantuvo almacenada prote-

gida de la luz.

3.7. BIoquímica Sérica

Se estudió la bioquímica sérica general en muestras frescas de

suero de pacientes y progenitores mediante los autoanalizadores Technicon

SMAC R e Hitachi 717 Automatic Analyzer R (Boehringer Mannhelm en

los 20 casos correspondientes al Hospital “Príncipe de Asturias” de Alcalá

de Henares, números 2, 8, 30, 31, 36, 37, 49, 50, 62—72 y 77>. Se compu-

taron los parámetros siguientes: lactato deshidrogenasa (LDH, Ul/L>,

bilirrubina total (Ef mg/dL) y sideremia ( 1V.g/dL), con LDH 230-380Ui/L, bilirrubina total 0—1 mg/dL y sideremia 37—158 yg/dL como valoresde referencia. La evaluación de las cifras de haptoglobina, ferritina yEPO se realizó según se describe a continuación:

— la haptoglobina se cuantificó mediante nefelometría, utilizando el

ArrayTN4 Protein System, de Beckman R (42 casos procedentes del

Hospital “12 de Octubre”) y el sistema de antisuero ¡‘4 y nefelómetrode Behring R <20 casos correspondientes al Hospital “Príncipe de Astu-

rías”). Con este procedimiento, tras una reacción inmunoquimica con

anticuerpos específicos, la haptoglobina forma inmunocomPlejOs, de for-ma que las concentraciones existentes pueden ser determinadas cuanti-

tativamente mediante la medición de la difusión luminosa 145 La eva-

luación se realizó mediante una curva standard trazada con la ayudade diluciones standard, con 13— 163 mg/dL como rango de valores dereferencia, expresando siempre los resultados en mg/dL,

— la ferritina se determinó, en los 42 casos pertenecientes al Hospital“12 de Octubre” medIante un ensayo en fase sólida por IRMA1, en el

e

76

que la radioactividad unida a dicha fase sólida fue registrada por uncontador gamma, y los resultados se refirieron a los correspondientesstandards do calibración recomendados por el fabricante del <it TAN—DEM-R-FER Ii (l-lybritech Europe SA.). En los 20 casos procedentesdel Hospital “Príncipe ¿e Asturias’>, el valor de ferritina sérica se de—

terminó con un ensayo IMxFerrltina de Abbott ~ consistente en un In—munoensayo enzimático de microparticulas <MEIA> ~ utilizando comosustrato fosfato de 4 ..metii~umbeliierona. En todos los casos, los resul-tados se expresaron era ng/mL, con los siguientes valores de aeferenclat‘arones ¶7-230 ng/mL, mujeres 14-150 mg/mL con método IRMA> y27-300 ng/mL y 15—130 ng/mL, respectivamente, con método MEIA;

— la EPO se midió en rodos los casos en muestras frescas de sueromediante un radíoinmunoensayo competitivo 63 que utiliza eríííopoyorií—na humana tecombinante como trazador y standard, según procedimien—de aplicación del Klt EpO~TracTXí 125/RíA <INCSTAR Corporation).Los resultados se expresaron en mU/mI-., con los siguientes valores de

relerencla: varones V7,2 5,5 mU/mL y mujeres 18,8 .1 6,2 mU/riaL.

La tabla II comperadia estos valores normales.

3.8. Tratamiento estadístico

Será desglosado en los apartados correspondientes a control de ca-lidad, estudio de la curva de distribución de los hematíes, según concen-tración de hemoglobina, análisis estadístico general aplicado a casos ycontroles, y evaluación de la eficacia estadística de las pruebas diagnósti-cas aplicadas.

3.8.1. Control de calidad

La citornetria de difracción de luz láser se sometió a los habitua-les controles de calidad internos y externos segrin el Programa de Controlde Calidad Externo en Hematología (PCCEH, Comité de Estandarización enHematología, Asociación Española tic llematologla y Hemoterapia), cuIdán-dose asimismo la calibración del haz de luz láser con OTM (Optical Test~lateriafl.El control interno fue la única posibilidad de control de calidadaplicable a jos parámetros derivados de la curva de distribución según con-centración de hemoglobina, cuya precisión o reproductlbílídad (grado deconcordancia entre una serie de resultados obtenidos con el mismo métodopor repetición sobre una misma muestra) se calculó siendo expresada co-mo coelícienre de variación (CX’) 47,

77

También se realizó control de calidad del sistema utilizado paraSDS-PAGE mediante el cálculo de precisión del método. La precisión oreproductibilidad intraensayo se obtuvo repitiendo una determinación sobrela misma muestra en el mismo ensayo, en el caso de los estrorrias entro-citanos, llevando a cabo la electroforesis de una misma muestra aplicadavarías veces en el mamo gel en placa. La precisión o reproductibilidad Ira-terensayo se caiculó repitiendo el estudio de una misma muestra en va-ríos ensayos sucesivos y con t’anlas muestras; en nuestro supuesto se rea-lizo SOS-PACE de unas muestras determinadas en días y geles en placadistintos. Así la precisión intraensayo se evalué sometiendo a un mismocontrol 10 veces a 5135—PACE en eí mismo día y ensayo> aprovechando los10 pocillos para aplicación de la muestra de los geles en placa de traba-jo> calculando a continuación los cocientes Sp/B3. Anl</83 y 24/B3 co-

rrespondientes a cada una de las 10 carreras obtenidas; estos valores fue-

ron analizados estadistícamente, y se obtuvo su media aritmética (~), des-viación standard (SD>, CV e intervalo de confianza del 95% (IC 95%>. Lavariabilidad interensayo se estudió sobre 15 controles, cada uno de [oscuales fue sujeto de SOS-PACE en das días y ensayos distintos; una vezcalculados los cocientes Sp/ES, Ank/B3 y B4/B3 se analizaron estadística—mente sus resultados con comparaciones emparejadas enero medias 67medIante el test de Student—Newman—Keuls de comparación múltiple demedias y el contraste de Studenr, precedidos por el análisis ~ie la t’u-

rianza (ANOVA) F de Snedecor.

3.8.2. Estudio de la curva de distribución de los hematíes segón concentra-

ción de hemoglobina5e ha realizado en enfermos y progenitores de EH sin afectacIón

familiar aparente> veesus 140 controles con los parámetros % Hipor y valo-res de las áreas 1, II y III bajo la curva de distribución de los hematíessegún concentración de hemoglobina obtenida por citometria de difracciónde luz láser. Comprobada la existencia de diferencias estad(sticarnenteslgraiflcatlvas entre casos i’ cont~oPes aplicando contrastes no pararnánrlcos(U de Mann-Whitney previo ANOVA II de Kruskal— Wallis), se estudió laeficacia diagnóstica del método definiendo su sensibilidad y especificidadrespecto de los parámetros HC, % Hipen y Ateo II de la curva (elegida enfunción de su distribución de frecuencias, que apuntó una capacidad díscrí-minativa superior al Anca 1). Se prescindió del Area III para este análisis

78

por ser prácticamente equivalente por su definición al % Hipen, parámetroéste obtenido directamente del citómerro con exactitud y precisión a

diferencia del Area III bajo la curva de distribución referida, cuya medidacon frecuencia resultó errónea por lo reducido de su superficie y por loindirecto de su estimación.

3.8.3. AnálIsis estadístico general de casos y controles

Los datos lueron procesados - por el Departamento de Bloesíadisticade la’>Cllnica Puerta de HierrolMadrid), con un ordenador MlCROVAX II<digital) mediante un paquete Informático BMOP standard 42~

Los parámetros discretos o cualitativos se presentan en forma de

distribuciones de frecuencias y las variables continuas se han tabuladoofreciendo la media aritmética> desviación típica y rango de valores delos datos de cada muestra.

A partir de estas cifras se ha realizado ur~ contraste de Koimogorov(muestuas grandes) para verificar la normalidad de las poblaciones en

cuento a la distribución de sus variables> prueba que calcula la diferenciaentre los porcentajes acumulados correspondientes a los valores de lamuestra- y los respectivos al misnio valor en el supuesto de que la pobla-ción fuera de distribución normal, La diferencia será tanto mayor cuantomás se aleje la distribución obtenida de la curva normal, Esta cormproba—

ción de normalidad tiene el objeto de disminuir el error asociado a lasprueb4s de comparación de medias y ‘arianzas, que presuponen una distri-bución normal y de varlanzas homogéneas (veríficable medIante el ANOVAF de Snedecor) del parámetro estudiado. La aceptacIón de ambas hIpótesisde normalidad y de homogeneidad de vaclanzas ha determinado la aplica—

cidra de coa,ttastes paramétricosl el - rechazo de la primera hipótesIs o de

la segunda (en caso de ser aceptada la primera) ha supuesto la realizaciónde contrastes nro paramétricos.

El estudio de los pacIentes se ha realizado en dos partesa en pri-mcl Inigea, los análIsis Intragrupo y en segundo ~osestudios lntergrupo.

Los análisis intragrupo han consistido en la aplicación a todos losparárneteos de la correlación lineal de Pearson y regresión mínimo cuadrá-

tica entre dos variables, con el cálculo de sus rectas de regresión lineal,

según la ecuación yuax*b (donde b es la pendiente de la recta y a elvalor de y para. b—o, punto en que la recta corta el eje y> y de sus co—

79

rrespondientes coeficientes de correlación r, cuya significación viene dadaen función del error p que se pretenda y de los grados de libertad corres~~

pondientes a n-M, siendo n el número de casos y M el número de varia-bies. Se habla de relación de dependencia o tendencia si r supera 0,5,relación cuya intensidad se acerca a la verdadera correlación cuanto másse aproxime el valor absoluto de r a 1, ya que r mide la Intensidad de larelación si ésta es significativa y al menos una de las distribuciones liga-das es normal, condiciones no necesarias si ¡a muestra es grande 152~

Los análisis intergrupo se han realizado preferentemente mediantetets no paramétnicos 162, practicando comparaciones de medias según laspruebas U de Mann—Whitney para muestras con datos independientes y 1’de Wllcoxon para series con datos relacionados o apareados, previo ANO—

VA H de Kruskal—Waliis; estos contrastes se han aplicado cuando las dis-tnibuciones de las variables en las poblaciones no satisfacían la hipótesisde normalidad o, en caso de cumplirla, rechazaban la hipótesis de homoge-neidad de varianzas. En los supuestos con aceptación de ambas hipótesisla comparación de medias se realizó mediante la prueba t de Student,precedida pon el AN>OVA F de Snedecor y el test de comparaciones usúlti-píes de Student-Newman-Keuls 46,152

Todos los tests se valoraron con dos colas y se consideraron esta—disticamente significativos los resultados con niveles de significación p In-feriores a 0,05.

3.8.4. Evaluación de la eficacia estadística de las pruebas diagnósticas

Se estudió la eficacia en la detección de esferocitosís de los pará-

metros derivados de la curva de distribución de los hematíes según concen-tración de hemoglobina obtenida por citometria de difracción de luz láseraplicada al grupo de EH no esplenectomizadas por su expresión sin modifi-cao de la enfermedad. Asimismo se evaluó la eficacia díagnóstLca de losdéficits parciales de espectrina y anklrina en la membrana eritrocitariapor medio de la SOS—PACEaplicada a la EH.

La eficacia estadística se define como la capacidad de la prueba

diagnóstica para indicar la presencia o ausencia de un determinado proble-ma 144, Se expresa estadisticamente en los siguientes cuatro Indices 62,68, 144, cuyo valor máximo es 1 (ó 100%):

— la sensibilidad o probabilidad de que la prueba sea positiva en un sujetoenfermo,

80

— la especificidad> probabilidad de que el test sea negativo si el individuo

no presenta tal problema,

— el valor predictivo del íest positivo, o exactitud de la predicción positi-va, que hace referencia a la probabilidad de estar afecto por la enfer-mudad si el test es positivo,

— el valor predicaivo del test negativo o exactitud de la predicción negati-

va, como probabilidad de estar libre del problema sí el test es negativo.

Los dos últimos índices no sólo dependen de los primeros sino tambien de

la prevalencía de la entidad 62,68,144

Los valores de estos indices pueden estar distorsionados por eltipo de pacientes incluidos en el estudio y por los sesgos inherentes a laevaluación del resultado del sest y de la situación de los sujetos respectode la enfermedad 144, Para descartaría es preciso que la prueba sea muy

sensible, sensibilidad que ha de explorarse en un amplio rango de enfermosafectos por la entidad. De forma análoga> su diagnóstico requiere de un

lest de elevada especificidad probada en un extenso espectro de pacientes

libres del problema 144~

Por otra parte, cuando i.a prevalencia o probabilidad de tener una

determinada enfermedad se desconoce, resulta adecuado completar el estu-dio de la sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas aplicadascon el estudio de su precisión o reproductibilidad y la descripción de los

rangos de normalidad ~ ya que la evaluación de sus valores predictivos

es imposible sin dicha prevalencia 62,68,144 Este es el caso de la EH>

cuya prevalencia descrita de 1r5000 é.í2,65,112,139,163,195 muy probable-

mente subesrima la realidad ante la frecuencia desconocida de casos leves

o asiníom~íícos no detectados por los métodos diagnósticos convenciona-

les 64,140 Por ello el estudio de la eficacia estadística de los parámetros

indicadores de esferocirosis y de los déficlís parciales de espectrina yankinina como medios diagnósticos de la EH ha incluido el análisis de lasensibilidad especificidad, precisión y rango de normalidad exploradas enun amplio espectro clínico de la enfermedad, sobre todo respecto de su

extremo lene, con un grupo control de sujetos sanos.

4. RESULTADOS

82

Las abreviaturas de los parámetros analizados, las unidades y los va-lores de referencia se describen en la tabla II. Los datos de los 43 pacien-res no esplenectomizados constan en la tabla IV (características clínicasy paramétros bioquímicos y de membrana> y tabla V <parámetros hemato-lógicoshariáloga información de los 19 pacIentes esplenectomizados seespecífica en las tablas VI y VII, y en las tablas VIII y IX se encuentranrecopilados los correspondientes datos de los 12 progenitores de enfermossin historia familiar de EH.

Los puntos básicos del análisis estadístico (media aritmética, desvia-ción standard, intervalos de confianza y rangos de valores> se muestran enforma de tablas de medias. Asf pues, la tabla X refleja tal análisis delos datos heniocitornétricos y del estudio de la membrana eritrocirarla enlos cont roles. Las tablas XII y Xl exhiben, respectivamente, los estudiosestadísticos básicos de los parámetros hematológicos y de los datos bioquí-micos y estudio de la membrana eritrocitaria de los casos, incluyendo ba-jo esta denominación genérica tanto pacientes no esplenectomízados yesplenecromízados como progenitores de EH sin afectación familiar aparen-te.

4.1. Estudio de los controles. Control de calidad

El análisis de los datos hemarológicos de los casos <a excepción dela prueba de iragilidad osmótica> se realizó versus 140 controles, mientrasque el estudio de los datos de la membrana eritrocitaria se llevó a caborespecto de 24 controles. Tales controles siempre fueron sujetos adultosde ambos sexos, sin antecedentes patológicos significativos, cuya analíticaformaba parte del estudio preoperatorlo de una cirugfa menor; 6 de los140 controles hablan sido esplenecrornizados aiios antes por rotura traumá-tica del bazo. Los datos de este colectivo control se hallan descritos enla tabla X.

Los parámetros hemocitométricos fueron objeto del control de

calidad habitual tanto Interno como externo (Programa de Control de Cali-dad Externo de Hematología, PCCEH, Comité de Estandarización en Hema-tología, Asociación Española de Hematología y Hemoterapia>, siendo aquélel tinico factible en el caso de los parámetros derivados de la curva dedistribución de los hematfes según concentración de hemoglobina, cuyaprecisión o reproductibilidad ha respondido a los valores considerados dpi—

83

cos en la serie roja descritos previamente ~ con CV por debajo de 2%para HC y CHCM. Por otra parte, la medida y cuantificación del Area IIIfue muy imprecisa debido al escaso número de hematíes con concentracio-nes de hemoglobina superiores a 40 g/dL y a la estimación indirecta delparámetro, por lo que se decidió su exclusión del análisis (véase Materia-

les y Métodos).

Desde el punto de vista de los parámetros de la membrana entro—citaría, se definieron inicialmente como objeto del análisis los cocientes

Sp/B3, Ank/B3 y B4/B3 (considerando globalmente la tanda 4, dado quenuestro sistema nunca fue capaz de resolver netamente las bandas 4.1 y4.2>. El control de calidad de la técnica de SDS-PAGE aplicada demostróque es un procedimiento preciso y reproducible respecto de los cocientesSp/B3 y Ank/B3. La variabilidad lntraensayo fue muy pequeña, con CV de7,6, 0,5 y 3,3% para Sp/B3, Ank/83 y B4/B3, respectivamente. En cuantoa la reproductibilidad lnte¡ensayo, las comparaciones emparejadas demedias mediante el contraste t de Student y análisis de la varlanza (ANOVA)

1’ de Snedecor no mostraron diferencias estadisticamente significativaspara Sp/B3 <t 0,13; 14 g.l.) y Ank/B3. Ct 1,64; 14 s.l.>, con sendos CV in-feriores a 6 y 4%; sin embargo, en el caso de B4/B3 existió diferencia es—tadisticamente significativa entre las determinaciones del parámetro (t

3,73; 14 g.L) para pcO,OOl, por lo que consideramos que 34/83 carecía deprecisión o reproductibilidad interensayo y se prescindió de este dato enel análisis de enfermos y progenitoresde EH sin afectación familiar aparen-te.

4.2, EstudIo de los enfermos

El rango de EDAD de los pacientes afectos de EH fue amplio,incluyendo desde los 4 meses a los 66 años, con una media aritmética de23,03 años globalmente. Veinte enfermos no espíenectomizados eran meno-res de 15 años y 23 superaban esta edad; respecto de las 19 EH espleneo—tomizadas, 6 casos fueron menores y 13 mayores de 15 años (gráfica 1>.

La representación de ambos SEXOS fue equilibrada en ambos gruposde pacientes, con una relación varón/mujer de 1 <gráfica 2>.

Considerando la forma de herencia del defecto <gráfica 3>, 53casos eran de herencia dominante <36 EH no esplenectomizadas y 17 EHesplenecromizadas) y procedían de 21 familIas; 7 enfermos carecían dehistoria familiar y el estudio familiar de sus ascendientes con metodología

84

convencional fue negativo, clasificándose como formas no dominantes<incluyendo 6 EH no espienectomizadas y 1 EH esplenectomízada). En 2enfermos, uno de ellos esplenectomizado, no fue posible llevar a cabo unestudio familiar.

Según el CURSO CLíNICO de la EH se clasificaron los pacientes entres categorías (gráilca 4). Se definió la categoría leve—aslnrcmátícacomo la integrada por aquellos 23 casos que nunca presenraron anemia nireticulocítosis por encima de 200 x i09/L, ninguno de ellos había sufridoesplenecromia. De curso clínico moderado se consideraron las 31 EH, 15de ellas esplenectomizadas, que padecieron anemia ocasional que no precisétransfusión y con reticulocitosís igual o superior a 200 x 109/L. Comoformas graves se Incluyeron aquellos 8 casos de EH con anemia hemolíticacrónica, 4 de los cuales habían sido esplenectomizados.

Se eligió la ESPLENECTOMIA como cualidad definitoria y divisoriade dos grandes grupos de enfermos en nuestro estudio por el radical cam-bio que determina en la evolución de la EH al minimizar la hemólísis. Asípues, se han evaluado 43 enfermos no esplenectomizados y 19 pacientesespí enec t o mizados.

El análisis realizado se expondrá desglosándolo en los siguientes

tres bloques: estudios Intragrupo de los enfermos no esplenectomizados ~esplenectomizados, y comparaciones intergrupo de ambos bloques de pacien-tes y entre ellos y el grupo control.

4.2.1. Enfermos no espleneciomizados. Estudio intragrupo

En esta población de 43 sujetos <Nn43), el test de Kolmogorov re-

chazó la hipótesis de normalidad (p < 0,05) de las variables continuasferritina, haptoglobina, EPO y ROO incubada inIcial, aceptándola en todaslas demás. La aplicación de la correlación lineal de Pearson y regresiónrnlnlmo-cuadráííca entre dos variables cuantitativas ha demostrado tenden-cias y correlaciones enire diversos parámerros, que se comentarán breve-mente.

La edad se hallaba lógicamente relacionada con los valores hemocí—tométricos, como la cifra de hemoglobina (coeficiente de correlación0.546; p < 0,001>, hemasocríto (r 0,590; p < 0,001> y VCM (r 0,536;p< 0,001).

85

Los parámetros hemocitométricos exhibieron tendencias y correla-ciones entre si, en general esperadas dada su interrelación e Interdepen-

dencia, que se describen a continuación:

— el número de hematíes mostraba correlación con las cifras de hemoglo-bina, hematocrito y RDW (con r de 0842; 0,834 y -0,729, respectiva-mente, siempre con p < 0,001),

— la cifra de hemoglobina presentó correlación con el hematocrito y HG<con sendos r de 0,961 y 0,63C; p <0,001),

— el hematocrito con \‘CM (r 0,574; p <0,001),— la CHCM con HG y Area II (con r de 0,725 y 0,608; p C 0,001, gráfi-

cas 5 y 6),— la HG con el % Hiper y con el A rea II (sendas r de 0,829 y 0,826;

p 4 0,001 siempre, gráficas 7 y 8), tratándose de verdaderas correla-ciones significatIvas por ser parámetros definidos a partir de la curvade distribución de los hematíes según concentración de hemoglobina,

— el % Híper exhibía una relación de tendencia con la cifra de retlculoci-

tos y el Area II (r de 0508 y 0,567; p 40,001),— el RDXV con la cifra de reticulocitos (r 0,558: p <0,001, gráfica 9).

Es un detalle importante a señalas que el ~ Hiper muestra correlaciónestadísticamente significativa con el parámetro HG y no con CHCM (grá-fica 30), explicable por ser el CHCM un valor calculado a diferencia deHC, cuya medida es directa.

Los datos del estudio de ROO exhibieron las siguientes relacionesde tendencia entre si y con datos hematológicos y bioquímicos:

- la ROO inmediata inicial con RDW (gráfica u) haptoglobina y Area 1(con r de 0,537; 0,515 y —0,525, respectIvamente, con p <0,001>,

- la ROO inmediata media con la ROO incubada inicial (r 0,644;pC 0,001),

- la ROO incubada inicial con RDW, reticulocitos, y ROO inmediata me-dia <con sendos r de 0,518, 0,526 y 0,505, siempre con pC 0,001>,

— la ROO incubada media con % Hipor (gráfica 12> RDW (gráfica 13) re—ticulociros (gráfIca 14), haptoglobina, ROO inmediata inicial y mediay ROO incubada Inicial (con r correspondientes de 0,531, 0,603, 0,593,-0,529, 0,590, 0,547 y 0,797. con p 4 0,001 en todas ellas>,

- la ROO Incubada total con la ROO inmediata total (r 0,525;p 4 0,001>.

86

Estas relaciones descritas reflejan un vínculo entre la distribución de loshematíes según volumen y la prueba de fragilidad osmótica, que índica -

que las EH no espienectomizadas poseen una población de hematíes hetero-génea integrada por rericulocitos y células maduras de fragilidad osmóticavariable, según su grado de condicionamiento espiénico. A este hechopuede arribuirse que la correlación esperada entre parámetros de esieroci—tosis (que solamente traducen la presencia de esíerocitos en una muestra,sin aportar información sobre su causa) como HG y % Hiper y datos delestudio de fragilidad osmótica se limite a la relación de tendencia entre% Hiper y ROO incubada media, aunque de acuerdo con la observación deque las células hipercrómicas son susceptibles a la hemólisís osmótica 14,

La relación de la fragilidad osmótica con la haptoglobina resulta

ob’ia al trátarse de un parámetro Indirecto de hemólisis.

El análisis de los datos bioquímicos ha ofrecido relaciones de ten-dencia entre las siguientes variables~

— la cifra de bilirrubina total con RDW (r 0,513; p 4 0,001),— el valor de ferritiuia sérica con VGM y HGM (con sendos r de 0,513 y

0,536, con p < 0,001 en ambos casos),- la haptoglobina con el número de hematíes (gráfica 15>, RDW, ROO

inmediaía inicial y ROO incubada media (r de 0,688, —0,517, 0,515 y

-0,529, siempre ~onp <0,001>,— la EPO con el número de hematíes, hemoglobina hematocrito y RDW

(con r de -0,675, —0,694, —0,672 y 0,759, respectivamente, y p C 0,001,gráficas 16, 17, 18 y 19>.

Ello traduce la relación entre parámetros de hemólisis y la consecuentee¡itropcyesls compensadora.

Los datos del estudio de la membrana eritrocítarla mediante SDS—

PAGE no han mostrado asociaciones con otros valores según la correlaciónlineal de Pearson y regresión mínimo cuadrática entre variables.

Descrito el análisis de los datos cuantitativos, es esencial realizarmención especial al estudio de la variable GRA~’EDAD, que siendo un pa-rámetro discreto o cualitativo podría considerarse como una variable semí—cuantitativa. La correlación lineal de Pearson y regresión mínimo—cuadráti-ca cnt re dos variables mostró relaciones de tendencia y correlación conlos parámetros número de hematíes, hemoglobina, hematocrito, RDW, ten—

87

culocitos, bilirrubina total, EPO y ROO incubada media (con sendos r de—0.598, —0,530, 0.540, 0,161, 0,530, 0,595, 0,651 y 0,556, siempre con

p <0.00;, grálicas 20 a 27) indicando la asociación entre el estado hemo—

lítico y erirropoyesis compensadora, fragilidad osmótica 3’ gravedad delcurso clínico de la enfermedad.

Cosi el fin de estudiar el comportamiento de los parámetros asocia-

dos a esferocitosis respecto de la gravedad, se aplicó un contraste no pa—ramétrlco (U de Mann—Whitney para datos no emparejados, previo ANOVA

1-1 de Krus)~al—Wallls> comparando las EH leves—aslrncmánicas versus lasEH moderadas y graves globalmente, puesto que son solamente 4 losenfermos graves no esplenectomizados Incluidos, número insuficiente para

ser analizado de forma Independiente. De este modo s’, constataron dife-rendas esradtsnlcamente sIgnificativas respecto de las variables % Hiper,RDW, ROO inmediata inicial y EPO, con p <0,001, y .4rea II, ROO inme-diana media y Sp/BS, con p <. 0,05, demostrando que estos parámetros semodifican de acuerdo con la gravedad de la EH (tabla XIII>, cuya magní-¡ud traducen.

El motivo de pormenorizar tan exhaustivamente este análisis intra—grupo radica en el hecho de que es en los enfermos no esplenectomizadosen quien la EH se manifiesta fisiopatológlcamente con plenitud. Ante elconjunto de datos comentado, hemos elaborado una clasificación de laentidad según su expresivldad biológica (rabia XIV>, en la que relacionamoslos valores de los parámetros hemanológicos, bioquímicos y del estudio dela membrana eriltocitania por SDS—PAOE con la evolución clínica más co-mún de cada una de las categorías de enfermos no esplenectomizados de-finidas por su gravedad.

4.2.2. Enfermos esplenectomizados. Estudio intragrupo

En este colectivo de 19 pacientes (N49>, 15 de curso clínicomoderado y 4 graves, se aplicó la correlación lineal de Pearson y regre-sión minimo—cuadyática entre dos variables cuantitativas para analizar pa-rámetros asociados a esferocluosis y datos de los estudios de fragilidad os-mótica y de membrana erinrocitaria, observándose las siguientes relacionesde tendencia y correlación:

— la HG con RDW, % Hiper, Area II y ROO inmediata inicial (con0,536, 0,904, 0,598 y 0,662 respectivamente, con p 40,01 en todas ellas

88

excepto p <0,001 para la relación con % lliper, gráficas 28, 29, 30 ~31>,

- el % Hiper con RDW (r 0,710; p ~ 0,001, gráfica 32> y ROO nmediatainicial (r 0,680 y p <0,01, gráfica 33),

- el Arce II con la ROO Inmediata total (r 0,616; p <0.05).

En este gtupo de enfermos se pone de manifiesto la relación entre pará-metros indicadores de esferocitosis, hemólisis y fragilidad osmótica, reile-jando que las células más hiperorómícas son las más frágiles osmóticamen.te 14,137, De forma análoga a las EH esplenectomizadas, los contenidosde la membrana eritrocítarla en espectrina y ankirina tampoco han presen-nado asociaciones estadfstioas con otros parámetros.

Basándose en los estudios intragrupo de ambos bloques de enfermos,resulta importante señalar la naturaleza de las interacciones de la variableRDW, asociada en las EH no esplenectomizadas con la reniculocitosis y laROO inmediata inicial e incubada media <ésta a su vea relacionada con el% Hiper>, mientras que en las EH esplenectomizadas la asociación te pro-duce con el % Hiper y la ROO inmediata Inicial, Esto se debe a que enlos enfermos no esplenectomizados la amplitud de la curva de distribuciónde los hematíes según volumen obedece a una población crin rolde heterogé-nea a expensas de reticulocitosis y de células más o menos bipercromas,según su grado de condicionamiento esplénico, cuya hemólisis osmóticapuede facilinarse con un tratamiento de incubación que aproxime su “olu-men hemolftlco cr(tico. En cambio, en los enfermos esplenectomizados, laamplitud de dicha distribución corresponde a una población de hematíesmás homogénea por predominio de células hipercromas osmóticamentefrágiles, como se ha descrito previamente 4,14,136,139 Tal efecto seproduce, sin duda, en el grupo de EH no esplenectomizados, pero la real—culocítosís enmascara su repercusión en el estudio estadístico.

4.2.3. Respuesta a la esplenectomia

De los 19 enfermos integrantes del grupo EH esplenectomizados,se dispuso en it casos (8 de curso clínico moderado y 3 graves> de partede sus datos hemocinoménricos previos a la esplenectomia, principalmentenúmero de hematíes, hemoglobina, hematocrito, VCM, HCM, CHC.VI y ci—.ira de reniculocitos (tabla XV). Con el frn de evaluar la respuesta tera-péunica habida en estos 11 pacientes se aplicó un contraste no parainétrí—co T de Wilcoxon para datos emparejados <procedentes de un mismo gal—

89

po>. que demostró diferencias estadisticamente significativas con p C 0,001entre los valores pre y post esplenectomia únicamente de las variablesnúmero de hematíes, hemoglobina y hemanocrito <tabla XVI), hecho consis—-tente con la afirmación de que la esplenecnomfa produce corrección de laanemia crónica o episódica. Cabe mencionar otros efectos, como la reduc-ción de la reticulocitosis (sin diferencias estadisticamente significativascnt re sus valores previos y posteriores a la espienectomfa> y del RDW <noanalizado por disponer de sus cifras pre espienectomia solamente en 3casos).

1.3. Enfermos y controles. Estudios intergrupos

La comparación da los pacientes no esplenectomizados y esplenee—tomizados entre sí y versus el grupo control se realizó mediante pruebasno paramét ricas 162 aplicando el contraste U de Mann Whitney, datos noemparejados <precedido por el ANOVA II de Kruskal—Wailis> a los pará-metros hemocitométricos y del estudio de la membrana erinrocitaria, úni-cas variables comunes con los controles; en la tabla XVII se detallan lasdiferencias halladas y su significación estadística. Estos resultados denotanvarios hechos:

— los parámetros heniocltonlétricOs y del estudio de la membrana entro—citaría presentan diferencias estadísticamente significativas al cotejarlos enfermos no esplenecromizados versos el grupo control,

— la esplomecromía produce resolución de la anemia crónica o episódicacon reducción de la reticulocitosis y la normalización del RDW; lacomparación entre pacientes no esplenectomizados y esplenectomizadosde la misma gravedad (formas moderadas y graves> exhibe descensosdel % Hipar, RDW, ROO Incubada media y Area II (p <0,05 en todoslos casos)como efectos de la esplenectomía al desaparecer el condicio-namiento esplénico y reducirse la hemólisis,

— a pesar de la espienectomfa persisten las direrencias estadisticamentesignificativas entre las EH y el grupo control respecto de aquellas va-riables derivadas de la curva de distribución de los hematíes, segúnconcent ración de hemoglobina medida directamente: HC, % Hiper, Areay Arce II, parámetros. por tanto, realmente Indicadores de la existen-cia de esferocitosis en sangre perifériCa.

— los datos del estudio de la membrana eritrocitarla conservan sus dife-rencias estadisticamente significativas respecto del grupo control, inde-pendientemente de la esplenectorttfa, comportamiento lógico por el ca-rácter de defecto estructural y genético de la EH.

90

Los parámetros hemocinomén ricos definidos a partir de la curva dedistribución de los hematíes según concentración de hemoglobina estimadadirectamente mediante citometria de difracción de luz láser varian, depen-diendo del curso clínico de la enfermedad o gravedad, y mantienen dife-rendas estadísricamente significativas con el grupo control en el caso delos enfermos esplenectomizados, por lo que aparentemente permiten discri-minar la existencia de esferocitosis, calidad morfológica en modo algunopatognomónica o exclusiva de la EH. La evaluación de la eficacia diagnós-tica de estos parámetros y de esta tecnoiogfa en la EH se ha realizadoen el grupo de enfermos no espienectomizados, en quienes el defectoofrece al completo su genuina fisiopatología (tabla Xviii).

La distribución de frecuencias de la variable HG (gráfica 34)muestra que en el 95% de los controles (133 de 140> es inferior a 35g/dL, mientras que en un 72% de las EH <Si de 43> excede esta cifra,existiendo superposición de ambas distribuciones. La definición de 35 g/dLcomo el umbral de HG por encima del cual se sospecha esferocitosis,supone una especificidad de la prueba aceptable que se pierde sin mejoríasustancial de la sensibilidad si dicho punto de corte se despiaza a valoresde HG menores de 35 g/dL. La medida de este parámetro resulta precisao reproducible, con GV por debajo del 2%; su variabilidad dentro del grupocontrol fue discreta, con CV de 2,64%, algo mayor en el colectivo de EHno espienecromizados, cuyo GV fue de 4,78%, HG constituye la mediaaritmética de las concentraciones corpusculares de un número de hematíesdado y proporciona una orientación global sobre la distribución de loshematíes según concentración de hemoglobina, curva de la que derivan losparámetros comentados a continuación.

La distribución de frecuencias del parámetro % Hiper (gráfica 35>ha demostrado que aunque en las EH leves y asintomáticas puede serinferior a 2%, en los controles es excepcional que supere esta cifra y

nunca sobrepasa 3%. Gonsiderando como nivel para la detección de esfero—citosis valores de % Hiper mayores de 1,5, 2 y 3%, la sensibilidad diagnós-tica de la prueba fue de 90,7, 79 y 62,8%, respectIvamente, con sendas es-pecificidades de 94,3, 98,6 y 100%. La precisión de la medida del % Hiperresponde a un GV máximo de 30% <mayor cuanto más alta es la cantidadde hematíes con concentración de hemoglobina superior a 41 g/dL en lamuestra estudiada) y su variabilidad dentro de los grupos control y EH noesplenectomlzados ha obedecido a sendos GV de 67,4 y 100,4%.

91

Respecto de las áreas definidas en la curva de distribución de loshematíes según concentración de hemoglobina <gráfIcas 36 y 37), con el~fin de mejorar la utilidad diagnóstica del método, sobre rodo en las EH le-ves y asinnomáticas, la capacidad díscriminativa del Area II es superior ala del Aren 1, según sus distribuciones de frecuencias, aunque con mayorsolapamietto de enfermos y controles que con el parámetro % Hiper, sien-dc, por tanto. ci A res II menos eficaz que él en la detección de esferocí—tosis. Al situar los puntos de corte para ello en Areas II superioresa 9 y10%, la sensibilidad diagnóstica de la técnica fue de 88,4 y 814%, con es-pecificidad correspondiente de 91,4 y 90,7%. El estudio de la reproductibí—Udad o precisión del cálculo del Area fi ofrece un CV medio del 11%, yla modificación del parámetro dentro de los grupos coitrol y de enfermosno espienectorírisados ha tenido lugar según GV de 71,3 y 45,4%, respectiva-mente.

La combinación de % HipertArea II en la definición de la esferocí—

tosis se traduce en una discreta reducción de la sensibilidad sin mejoría,eal de la especificidad; si esta combinación diagnóstica se consideracomo % Hipes vio Area II se produce un aumento de sensibilidad con lige-rs disminución de especificidad.

III estudio de la membrana del hematíe en los enfermos medianteSUS-PACE arroja un descenso de ambas variables Sp/83 <~ 0,990,

St 0,727> y Ank/83 <R 0.195, SU 0,003> estadisílcamenie slgnificarivo res-pecto del control normal <tabla XVII) demostrativos de un déficit parcialde espectrina y ankirlna de la membrana erinrocitaria en la EH.

La eficacia diagnóstica de dichos parámetros del estudio de la

membrana erinrocitaria se describe también en la tabla Viii. Las distri-bucionos de frecuencias de los enfermos (considerados globalmente enfer-mes no esplenectomianidos y esplenectomizados, ya que no se han aprecia-de diferencias estadisticamente significativas entre ambos grupos respectode estas variables> y controles respecto de los cocientes SpfBS (gráfica

38> y Ank/133 (gráfica 39) exhibe notable superposición aunque resulta de—finitho el hecho de que ningún control presenta $/83 inferior a 1,04 6Ank/83 por debajo de 0,197. La medida de estas variables en nuestro sis—ema es precisa o reproducible, como se ha expuesto previamente (véase

estudio de los controles y control de calidad>, con una varIabIlidad en losgrupos control y EH consideradas globalmente según GV de 4,7 y 11,85%,

92

respectivamente, para Sp/B3, y de 0,5 y 11,84%, a su vez, en el caso deAnk,’B3. En cuanto a eficacia diagnóstica del método, la combinación de

ambos parámetros en el sentido de detectar al menos un cociente defecti-yo supone una mejoría de la sensibilidad sin detrimento de la especificidad.El conrenido proteico total de los estromas eritrocitarios estudiados obte-nidos tanto de casos como de controles osciló entre 1 y 2 mg/mL.

Gomo dato adicional, el inmunobiot anniespectrina fue normal enrodos los casos, descartando la fragmentación de esta prone(na comocausa de su déficit.

4.4. Estudio de los progenitores de EH sin historia familiar

Este conjunto incluye seis parejas progenitoras de sendos casos deEH sin antecedentes familiares del defecto (enfermos con número deerder~ 1, 7. 8, 31, 41 y 58). El contraste de este grupo frente a las EH

no esplenecromizadas mediante pruebas no paramétnicas (U de Mann Whit-ney precedido por el ANOVA H de Kruskal—Walils) arroja diferencias esta—dísticamente significativas en todas las variable cuantitativas (hemoglobi-na, GHGM y Area 1 con p <0.05~ número de hematíes, hematocrito, RDW,bilirrubina total, LDH, EPO, ROO Inmediata inicial y media, Sp/B3 yAnk/B3 con pC 0,01, y HG. % Hipar, reticulocitos, Area II haptoglobina y

• los tres parámetros de la ROO incubada con p C 0,001) excepto \GM,

HCM, sideremia. fernitina t ROO inmediata toral. Si esta comparación serealiza solamente versus las EH no esplenectomizadas de gravedad leve-asiratornática, con quien el grupo de progenitores ofrece mayor similitudante la escasa expresividad del defecto, continúan existiendo las diferenciasestadísticamente si~iificativas respecto de las variables número de hema-tíes. hematocrino, GHCM, LDH y Ank/B3 con p 4 0,05; HC, reticulocitos,haprogiobina, ROO incubada inicial y total y Sp/B3 con p 4 0,01 y %Hipar, Area II y ROO Incubada media con p <0,001.

El análisis no paramérrico de los progenitores frente al grupo con-trol (tabla XVII> no pone de manifiesto diferencias estadisticamenre signi-ficativas al valorar los parámetros hemocitomérricos; en cambio, si laspresenta respecro de las variables del estudio de la membrana ant rocita—ria mediante SDS-PAGE, con p 4 0,01 para ambas Sp/83 y Ank/B3 apesar de la superposición de sus distribuciones de frecuencias <gráficas 38y 39) en progenitores y controles. Este hecho demuestra que en el grupo

93

de progenitores de EH sin afectación familiar aparente existe un pequeñogrado de defecto no derectable por otros medios diferentes al SOS—PACE -

de la membrana erítrocitaria, sugiriendo que al menos uno de los miembrosde cada pareja presenta una forma de EH asinnomática e imperceptiblepor m~nodos diagnósticos convencionales e incluso por citometría de luzláser. Este hecho apunta la rareza da las verdaderas formas clínicas rece—sfvas de la El-?.

El perfil biológico de este colectivo se indica en la tabla XIVjunro con análogos datos de las EH no esplenecromizadas clasificadas se-gún la gravedad del curso clínico de la entidad.

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• Varones

20- El Mujeres

10

Grifo. 2~ ~1str1buc1ánde <recre-encIss¿ Vsrisblr se”

120

U Dominante

E ‘No Dcminante

EHE

u40

30:

20-

10-

161 _

EI-INE

GrUir. 3— Distribuc!6n de fretuencius. Varl,ble herencia.

121

• Leves - Asintomaticas

E Moderadasfl Gravas

20-

loe

o.EHNE EHE

Gr5ilc, ~.— istr1b~c16n dr irt~uenti~,. Va’tabSe írítedad.

122

hC{g/dL)

4

38

36

34

38 40

Gr6fica 5.— Enterito, no es~Ienrctoitifldbs Gráfica de <arrolacián lineal variables

y HC. Orbos ~ar5nenrosson la concentrícián de ttenaoloblna <O!pLS—

colar cedía, calculada la CMCM y nedida dirretarnente la HG.

3228 30 32 34 3S

CHCM <g/dL)

123

a (O/o)

40

30

20

10

o

011CM (g/dL)

— Eeferros rs espl<nectonizldóse Gráfl~n de corre~,ciárh línoní, tarinMes

28 30 32 34 36 38 40

y tren U.

124

%H¡per30

20

lo

o38 40

Grfiuics 7—(nder~os te etplertecton.l,aícs. Gdrit. de correloción lIneaL varIables

Iii y ~ Hiper, antas derivadas de It curva de distrIbucIón de los core—

tic, íeojr concentración de hC<OCiCbInle

32 34 36

HC(Q/dL)

125

Ares II (a/o>

40

30

20

10

0 40

Ondina 5.— (nferíros no esplonecionIísdOS¿ Gráilca de eorrtlí<Iá<t lIneal e’itriablet

y i«es líe Los dos panlínetros proceden de le curva de dIstrlbutCIOfl

de los herittfOS segórt vortctntrarlón de h.nío0ínblné¿

32 34 36 38HC(g/dL)

- RDW (%)

30

20

100 200 400 600 800 1000 1200

Reliculocitos (10 %L>

fiíifIca 9—[eternosno esrlerírclnnieados. GráfIca de ~rreIac!ón lIneal, enríatíes

01W y :eticulochtcs.

O/~Hiper

30

20

10

1228 30 32 34 36 38 40

CHCM Cg/dL)

Cráfion 10— £-ferrns rspienectórni,adon. Grífína Ce torreiaci¿n lineal, e’írIabIes

~I~1 y % 4ieer. N reíste correlacIón siGnifIcatIva, ya pee la 151W en

it CAler calculado y no nodldo dIrectatneat~

127

si

1),

it

fi

ir

1>

liii

y

1~• •

• •o.

• .0•

•.

128

-RDW (¾)

30

20-

10•0,4 0,5 0,8 0,7 0,8 0,9

AGO nmed¡ata inEcial (%CINa>

••

• •••

¡ • ¡s

Grófíca 11.— [cUres no es~lenettnrlaadns. GráfIca de correlacIón lineal, tariables

IGO iníiedlata ¡nIdal y 11W.

129

~/oHipar30

20

lo

o0,5

ROO Incubada media <%CINa)

Gdllca 12.— ErSer,,es rL es,enert~r~IíiQO5. Crítica de carrelsolón 1ln@al~ varlabl,S

~r.:~badat&oIt y % Siper.

0.6 0,8 0.9

RDW (a/a>

30

20

lo0>8 0,9

ROO incubada media (0/oCINa)

Gr5fícs 13•— Es!ern~n no esplenectnírlzados. Grófíca 51, trrrelac1órii,eaí, ta’ia~es

0,6 0,7 0,8

CGO Incubada ve~Ia y [0W.

131

Reticutocílos (lo 9M1200

1000

800

600

400

200

o0,5 0,8 0>1 0,8

RGO Incubada media (%OiNa)

0,9

Grille. 1lt,.~ tnrerí,cor e’, *srlenecieriíados, GráfIca de torrelacióte’ lIneal n-arIabIen

RIO IncLSba~a inedia y ,etícnloeltos,

132

Hapioglobina (mg/dL>

200

100-

o2 3 4 5 6

Hties (10 12A-)

Gr5fica 13.— Enfemnos so enpíenectenlzodos. Cráfíca de correlación lIneal, narielies

nónero de heretfes y haptegiobína.

• e

1

• • ee• e• ee

• e e . •—e e

133

Eri3ropOyetifla (mU/mL)

800

Hiles (¶0 12¡-)

GrEflez 16.— EnfermoS esRleneetenlzadOSe GráfIca de nrrelatIót lineal> narlablEs

erltropoyetlría (Epa) y nóensro de hematíes.

o2 3 4 5 6

1 34

Eritropoyatina (mU/mL)

800

800

400

200

o4 6 8 10 12 14 16 lB

Hb(g/dL)

Grófíce’ 17.— Enfern,, mí esplene:lonizídos. Gráfica de correlación ilmeal, variables

euitrope~etina ((Py) y tienaIlebina.

135

Eritrcpoyetina (mU/mU

800

600

400

200

o10 20 30 40 50 60

Rol (O/o>

Gr5fIca 18..— Erferres rin espier-ecir ,a~ts. flr~f~p de ter<tiici& “~en1 tarininles

eMtrn?o~r1r.a ([P~ > rer-í~onuite.

136

ENtropoyeliria (mU/mL>

800

600-

400-

200-

lO 20

RDW <%)

Grifica 19.. [cferr:n n~ esRíeuíec¶íríndos. irfilca de correIsclón li~en1, <¡arlables

e’Mro~ryeiin, Cre> ~

30

U7

HUes (113 12K)8

5

4

3

2

GRAVEDAD

Gróflca 20.— trf,rnos ro es erocte,i:ac,s Grófica de no,relnci6n i1reÑ tariabbes

yraveesd y t~r.ero ce hecat:ns.

Leve Moderada Severa

13fi

lo

8

6

4

Hb (g/dL)

18

18

14

12

GRAVEDAD

Erferrcs re CSRICe:tte’zídcn Gráfica de tnrrel ación lIneal> varísbles


GliCina 21.—

DrsQedr y ~c~c;icbrp

139

• hiel (%)

so

50

40

30

20

10

GRAVEDAD

Grófiem 22— ESfCTrnLS rí5 es~Ienr:toi~ados. Gráfica dr c,rreiación lineal, narlables


gravedad y Iíeeietr:rito.

140

RDW (e/a)

30

GRAVEDAD

GrifIca 23.— Etderí’ne ro eíplenectovínuns. GráfIca de correlación lineal. varIables

Iravedad y ROW.

20


141

RetiouIocIlCS (10 ~/L)

GRAVEDAD

Sr&fIca 24— Fr, formos no esQlmeeetocizados. órUiea de ror,elGtión lineal, terlsbles

1200

o

5)

Lave Moderada Seveta

9’aredad y retlculoclios.

142

Bilirrubina (mgdL>7

8

5

4

a2

o

GRAVEDAD

6r~fica 25.— Enferrins so esplene<tntinI:tdei. Gráfica de correlaclón lIneal, variables

aveded y bhiirrnbits total.


143

Eritropbyetina (mu/mU800

800-

400-

200 -

oLeve Moderada Severa

GRAVEDAD

fir5iIca 2L— £nferrrs nr estlenectbnl1?drs. Gráfica de correlacIón lineal. naniables

enmedad y ovItropsyetIra ([PO).

u

144

ROO Indubada media (%OlNa)0,9

GRAVEDAD


£rífIc, 27.— [mIemosno esplenetor.Ieadns. Gráfic, de <errelaelón lineal, variables

gravedad y 060 Incubada cedía.

lIS

RDWC%)16

15

‘4.

13

¶2-

¶1—

1032 34 38

HO(g/dL)

38 40

GrUje; 28,— Emfermos esrienectoniza~os. Gráfica de corre!acjám lineal, Narfables

Mt y Rbi.. Iras la tstene:tonia, al reósíti ,s~ la metItíñtcifosis. se

naniflesta la relación entre la anhiltud ¿e la distribuehór de Ion

henat~es sr,Gr¡ Leiute’em :~ esferoeitonis.

• •

146

~/oHiper

40

GráfIca 29.— Erfemnos esplenecteri,adas .~rifica te correlselón lineal, íad!atles

HE y % Hipe,.

32 34 38 38HO (g/dL)

147

Area II40

30-

20-

toe

o32 34 36

HO (g/dL)

• •

38 40

Grófica 30.— ErfHrn,s rlRlenectHr~eaco~ Gráfica de cerrelaclón html. iirIítItE

SC y [vea 1!.

148

-HO(g/dL)

40

38

36

34

320,4 0,5 0,6 0,7 0>8 0,9

ROO inmediata Inicial (0/cOlNa)

Gr5fica 31..— Erfeirias espiemecter.ieodes Cr5fica de correlacIón l1reLi. Lar:í~ieí

it y [GOieero¡ata irielal.

F4DW( %>IB

Ib

14

13

12

II

0/oHiper 30 4)

GrófIca 32.— [<ferros es~Ienectmr.i,adcs. Gráfica ÓH COr(HilC1&H lineal, ~riatlen

% 518ev y [be.

0 lO 20

150

Hiper

30

20

la.

o0,4

RGO inmediata inicial (0/cCINa)

Cr~fIca 33.-¿ [nfern<mseseiHnHctonhizadrs. cráríca de correIsciár lineal, Nariebles

% biprr It-e :nr.edlata ir:cell.

0>5 0.6 0,7 0,8 0.9

151

30 32 33 34 35 36 37 38 39 40

HO (g/dL>

Grófica 3t~-¿~~rer~c5 mm eÉRieríHctOiZídCS y centrales. DhtrliD!iól de ireturmtlas

varlablH MC. El 95% de los ~nULlH5 rentre’’cr CC inferiares a 35 o/dL

y s¡iprvleres a esta cifra el 72% de le! EH. La sittltfóm del umbral ~a-

re lo 4QtHCCtóIt de esfHrccItCSiS er 34,5 — 33 cId ninoare ír.a aceptable

e. 1<0<10 dnoqmóstlca.

152

Wc H¡per (% hematíes con HO>41 g/dL>

Grófica 35.— ~mrarrnosna esplenector1zados y centro!.,. [istríbuciGe’ de frecuencIas,

tUariabIH ~4upen. La ubización del manta de corte para el dia~r4sti:o

de .rfe,oc!tosis en Hiper 1,5 — 2% Ma denustrada una encelene. efica-

cia •stadímtíca de le orueba.

0 0>5 1 1,5 2 2>53 5 10 20 30

153

8 12 18 24

Area 1 (% hematíes con 35 c HO< 37,5 g./dL)

36— (alertas ma esrleredonlaedrs y camtroles. bístrlbacítn de frenaemcías,

LariLbie [reí 1. La sapHrposInIóm entre padecías y nantroles deternima

qa< la ta~ar~dad d1serIí~irat1a-a de ea?eranibosls de ente Parinlhtrn sea

Gcb> e.

SL30 38 42 48

Area II (¾hematFes con 37,5 < HO< 40 g/dL)

inline’ 3t— Enfe!nes no e:elrnectonizates y costr<es. Distr!baciCn, ce fe:uevlme -

4-ariatiL Lrra U La deHiNiclón dci umbral rara la fetec:::. ce

titcsie e’; 9% orepordone sria baena eficí:aa c:annosteca.

0 5 10 15 20 25 30 35 40

‘55

0-

0>85 0,90 0>95 1>00 1,05 1,10 1,15 1>20 1>25

SpIE3

Grifica 3h.— £rferrc 5r c:er¿tnrLs y cDr.¶nol&s. Rlstrlbuc!óm de frecsemcial,

aar3abie Se¡~-

156

0,185 0,190 0>195 0>197 0,200

AnIqBS

0,205

Gr~fIna 59.— tIernes, prroeri,cres y ~rtmoles. Dlstribanl¿n de frecacacías>

varIable Arik¡13,

ARBOLES GENEALOGICOS

CODIGOS

Varón, normal

Mujer, normal

varón> no estudiado

Mujer, no estudiada

Varón, EH

Mujer. EH

Varón> EH y esplenectornizado

Mujer, EH y esplenectomizada

Progenitor, déficit parcial de espectrina + anklrina

Progenitora déficit parcial de espectríria + ankirlna

EoLE

euo

tas cifras Corresponden al número de Orden de cada caso.

159

Familia A

58

Familia E

160

Fam4Iia O

u-48

183 2

49

62

61 60

Familia O

161

Familia E

3

4

66 67

65

Familia F

142

Familia O

e

6 5

7

Familia H

163

Familia 1

51

8

Familia J

164

Familia }<

26

ME

15 ¶6

Fami$ia L

165

Familia Ni

17

19

18

Familia N

166

Familia O

21

Familia P

167

Familia O

68 69

Familia R

168

Famiria S

169

Familia 1~

170

Familia U39

29

171

Familia W

Familia X

172

37

Familia Y

Familia Z

r

173

45Familia a

70

Familia b

174

ó

Familia o

Ó

44 43

Familia ci

5. nISCUSION

¡76

Hemos estructurado este capitulo desgiosóndolo en tres bloques, patadiscutir en el primero las técnicas de citometría de difracción de luz lásery de SDS-PAGE de la membrana eritrociraria que han constituido la metodo..logia base de nuestro estudio, con una breve referencia al tratamiento esta..dístico; realizar en el segundo un sucinto comentario de tos controles, y des-arrollar en el tercero el análisis de nuestra serle de EH segón los objetivosplanteados Inicialmente, para lo cual hemos agrupado los datos bajo los Indi-cadores siguientes:

— los indicadores clínicos, incluyendo la edad, sexo herencia, gravedad delcurso clínico y antecedentes de esplenectornia, que definen subgruposhomogéneos que facilitan el estudio de sus características,

- los indicadores de hemólisis y erlsropoyesls compensadora, en el caso dela hemocimetria, morfología de la serie roja y bioquímica sérica,

— los indicadores de esferocitosis, o aquellos parámetros derivados de la. cur-va de distribución de los hematíes, segón concentración de hemoglobinaobienida por cicometría de difracción de luz láser que demuestran la exís—lencia de esferocitos en una muestra de sangre,

— los indicadores de la naturaleza de la hemólisis que dirimen del estudiode fragilidad osmótica y reflejan la reducción de la relación superficie/yo.lumen celular,

- os indicadores de déficit parcial de espectrina y anklrina en la membranaerirrocitaria, o contenidos de estas proteínas estimadas mediante SDS—PA—GE de los estromas aislados.

S.l. Método

5.1.1. Citometría de difracción de luz láser

El Sistema 8-1 Tecnicon TM (fIgura 15> ha permitido obtener Indicado-res de esferocitosís citométrícos. Este método es capaz de medIr de formaexacta, directa y simultánea la Intensidad de la luz difractada por cada cé-lula (previamente esferificada isovolumétrícamente y ligeramente fijada coriglutaraldehido) en dos Intervalos angulares, generándose un par de valoresque se transforman por proceso electrónico basado en la teoría de difracciónde Míe 90 en un par de cifras respectivas de volumen y concent ración de he-moglobina para cada hematfe estudiado, elaborando sendos histogramas 5egi~nvolumen y segi5n concentración de hemoglobina, de donde se computan \‘CM,HC (concentración de hemoglobina corpuscular media estimada directamente),RDW, HDW (desviación standard de la distribución según concentración de

177

hemoglobina) y % Hiper, entre otras variables de dichos histogramas agrupa-das ordenadamente en la pantalla de Investigación ti

0 i, que es posibleseleccionar en el software de los Sistemas 8 de TechrilconTM.

Este procedimiento mide con exactitud un amplio rango de valores deVCM (30 - 120 EL) y de CHCM (27 - 45 g/dL), permitiendo obtener una in—formación-rápida y cuantitativa de a presencia do hematíes con el caracte-rístico Incremento de concentración de hemoglobIna del esferociro 12,38,53,

112,137, ventaja Importante respecto de los citómetros convencionales (fi-gura 14), que, en cambio, no son capaces de estimar correctamente CHCMpor encima de 35 mg/dL al medir de forma Inexacta el volumen de las cé-luías deshidratadas 128, y además, la rigIdez, esfericidad y elevada concentra-clón de hemoglobina del esferocito impiden la valoración adecuada de suvolumen, por interferencia de la concentración de hemoglobina (entre otrosfactores), y de su CHCM por tratarse de un valor computado a partIr delVC\1 125,128,17l,l73; tales inconvenientes suponen no descubrir formas leveso moderadas de EH 64,140 SIn embargo, el método seleccionado resulta¿primo para el estudio de la EH por su capacidad de medida directa, simul-tánea, exacta y sin Interferencias del volumen y de la concentración dehemoglobina de los hematíes, ofreciendo información cuantitativa del porcen-taje de células con concentración de hemoglobina superior a 41 g/dL en elparámetro % Hiper, que junto con NC y ¡-<0W alerra sobre la existencia deesferocitosis en una muestra dada (figura ~ 64,140

La cítometria de luz láser ha mostrado una buena precisión o reproduc-tibilidad. que ha sido contrastada mediante los oportunos controles de calidadinternos y externos (Programa de Control de Calidad Externo en Heniatolo-gia, PCCEH). En efecto, el parámetro HG ha ofrecido CV Inferiores al 2%,

al igual que CHCM, encontrándose dentro de los márgenes considerados tí-picos de los parámetros de serle roja ~. Además, el método dIsfrute de ex—celemos sensibilidad y especIficIdad en el diagnóstico de eslerocitosis, proba-blemenre superiores al resr de fragIlidad osmótica, y con la ventaja de larapidez, fácil disponibilidad y resultado cuantitativo de calidad controlableinherente a las técnicas citométricas.

Pero resulta de capital importancia InsIstir y enfatizar que el método

detecta ESFEROCITOSIS, entendida como la presencia de esferecitos en unadeterminada muestra, hecho no exclusivo nl patognomónico de la EI-1, sibien en este trabajo se ha aplicado tal tecnología y se ha evaluado su elíca—

178

cia diagnóstica en dicha enfermedad. Existe esferocitosis también en laanemia hemolijica autoinmune, bemólisis con cuerpos de Heina, hiperesple—mismo, enfermedad hemolítica del recién nacido y quemaduras extensas, que,corno la elevación de HC y % Hiper no es específica de la EH, puesto queen estas entidades aparecen hematíes con concentración de hemoglobina su-perior a 4i g/dL. Se debe saber que el parámetro % Hiper mo es monopoliode la EH, enfermedad que sólo puede diagnosricarse con seguridad si la eva-luación de esta tecnología forma parte de un conjunto de datos clínicoshematológicos y bioquímicos compatibles con EH.

5.1.2. Estudio de la membrana eritrocítarla

Los Indicadores de déficit parcial de la membrana eritrocitaria en es—pectrina y ankirina proceden de la SDS—PAGE de los estromas aislados de

casos y controles por cálculo de sus contenidos en dichas proteínas o cocien-tes Sp/83 y Ank/B3,

Para la obtención de buenos resultados es esencial evitar la proreolisisde las muestras, no sólo retirando la capa leucoplaquetaria de la sangre pe-

riférica sino tambIén inhibiendo la actividad proteolitica endógena de laspropias membranas eritrocttarlas aisladas producida por proteasas originadasea ellas y que ejercen su papel durante el proceso de hemólisis In “itro y

subsiguientes pasos, incluso cuando las células contamInantes se han elimina-do concienzudamente, siendo ha anklrina y la banda 4.9 particularmente sus-ceptibles a esta acción 160, cuyos efectos estriban desde desplazamientosmás o menos graves de las bandas hacia zonas de menor peso molecular

hasta ligeras degradaciones solamente detectables por inmunohlotting. Ademásse ha descrito un- mayor grado de proteolisis de la espectrina y menor dela banda 3 por dicho proceso de autodigestión 60, ante el cual los est romas

eritrocitarios de la EH son más estables que los procedentes de controlesél.La estrategia general es minimizar los tiempos de exposición a las proteasasendógenas y controlar su actividad mediante inhibidores tales como el PMSF

Cferiilmetilsulionlliluoride, que reacciona rápidamente con los residuos de

serma de los centros activos de los serin—ptoteasas), del que se ha demos-trado que suprime la degradación progresiva de la ankirlna si se adiciona

al buí lcr de hemólisis, al cual se afiaden también agentes quelanres para

evitar la activación de las proteasas calcio—dependientes de las membranas

aisladas 160, En este trabajo se han satisfecho todos estos requerimientos

con el fin de asegurar la integridad de las proteínas de la membrana entro—

1179

citada que permitiera su análisis posterior; en lo que respecta a la espec-trina, los inmunobíot antiespectrina normales en los controles excluyen sudegradación proteolítica en el transcurso de la técnica.

Para la SOS—PACE de los estromas eritrocitarfos aislados de casos ycontroles se eligió el sistema de Falrbanks y cols. 50,51 por ser. ampliamenteutilizado y de fiabilidad probada, que resulta ideal para el análisis rutinariode las membranas por su rapidez y sencillez, siempre y cuando no se necesi-te la mejor resolución en pesos moleculares de 30.000 a 90.000 daltons (fi-gura 19) ~ Una ventaja de este sistema continuo es su capacidad de resol-ver la banda 2.1 o ankirlna de la banda 2 o cadena de la espectrina,componentes que tienden a superponerse en los sistemas discontinuos ~112. La estimación del contenido proteico de los geles teñidos puede realí—zarse por densitometria 29,30,50,82,106,166 o por elución del colorante enpIridina ~ ambas de uso difundido. Se ha sugerido ci óltimoprocedimiento como más adecuado, puesto que para el azul de Coomasle laIntensidad de tinclón determinada por densitometria se desvía de la ley deBeer cuando el contenido proteico de una determinada banda excede de 10

rg mientras que la elución del colorante en piridina mantiene su linearidadhasta 100p.g 51.53, En el presente estudio se ha utilizado la densírometrfa(figura 17) por su rapidez y porque la cantidad total de proteína aplicadasobre los geles para la SOS—PACE nunca fue superior a 15 ¿-g, quedando,por tanto, asegurada la fiabilidad del método.

Los cocientes Sp183 y Ank/83 expresan los contenIdos prorelcos de lamembrana erírrocitaria en ospectrína y anklrina 3,4,30,36,106 respectívamea—re, denominados densidades proteicas por algunos autores que reservan elvocablo “contenido” para la cuantificación real de la espectrina por radio-ínmunoensayo 4,179, Se ha criticado que la SOS—PACE subestima el verda-dero déficit corpuscular de espectrina comparado con el radioinmunoensa—yo por considerar que el contenido de banda 3 se encuentra discretamen-te reducido antes de la esplenectomfa, por la elimInación de porciones demembrana eritrocitarla en virtud del condicionamiento espiénico, de formaque existen contenidos mayores de banda 3 en los Individuos esplenectomi—zados; por tanto, antes de la esplenectomfa, la reducción del contenido deespectrina respecto de la banda 3 Iniraestlnia su déficit real, mientras quedespués de la esplenectomia sucedería a la inversa, dándose contenidos deespectrína menores atrlbuffiles a cierto aumento de banda 33,4, Tambiénse ha definido como densidad de espectrina la concentración de mmoles de

180

esta proteína por mmoles do fósforo lipídico «, suprimiendo la posibleinexactitud relativa a la banda 3.

En nuestras manos, el procedimiento considerado globalmente, ha de-mostrado ser rápido, sencillo, reproducible para estimar los contenidos dela membrana eritrociraria en espectrina y anklrina, eficaz y fácilmentedisponible.

5.1.3. Anáiists estadístico y eficacia de las pruebas diagnósticas

La justificación de la aplicación preferente de pruebas no paramétricasradica en que la hipótesis de normalidad y en su caso la hipótesis dehomogeneidad de varianzas no fueron aceptadas siempre para las distribu-clones de todas las variables y muestras estudiadas, Ciertamente, las pruebasno paramétricas tienen la ventaja de no hacer hipótesis sobre las distribu-clones, conservando en la mayor parte de los casos una potencia comparablea la de las pruebas clásicas’52.

Es preciso subrayar que la eficacia estadística predictiva de las técni-cas diagnósticas depende de la prevalencia de la enfermedad 62,68,144, queaunque estimada en 1:5000 12,38,65,83,137,139,163 no se conoce realmentepor la ignorada frecuencia de casos leves y asintométicos de la entidaddesapercibidos por los métodos diagnósticos tradicIonales 64,140 Esta preva—lencla real desconocida de la EH ha motivado que el análisis de la capaci-dad diagnóstica de los métodos discutidos se clrcunscriba al estudio de susensibilidad y especificidad <indices independientes de la prevalencla 68>complementado con la evaluación de la precisión y la descripción del rangode normalidad, dado que dicha prevalencla ignora impide el análisis de los‘ajores predictivos y la eficiencia matemática de las pruebas diagnósti-cas 62,68,144

Los valores de los indices de la eficacia estadística de los tests diag-nósticos puede variar segdn ci tipo de pacientes Incluidos en el estudio, la.interpretación de los resultados y el estado de los sujetos respecto de laentidad a estudiar 144• La eficacia del método para descartaría depende desu sensibilidad, que para ser real ha de explorarse en un amplio espectroclfnico del problema; de la especificidad dirime la eficacia del tesr endecidir un diagnóstico, por lo que su estudio ha de Incluir pacientes conenfermedades que formen parte del mismo diagnóstico diferencial 68,144

Creemos que nuestro estudio redne las mejores condiciones para laevaluación de la sensibilidad de las técnicas, puesto que Incluye un amplio

181

rango clfnico de la EH con un buen número de formas leves o asintomátícas.Sin embargo, el grupo control comparatIvo está constituido exclusivamentepor Individuos sanos y sin problemas afines a la EH, hecho que Incidesobre la especificidad. Pero la citomeirfa de difracción de luz láser si esespecífica de esierocitosis, aunque no sea exclusiva de la EH, cuyo diagnés—tico nece~lta de otros datos cifnicos y de laboratorio compatibles condicha entidad; de forma análoga sucede con la SOS-PACE de las membranaseritrocitarlas aisladas. Su contribución al diagnóstico de ‘a EH ha de enten—derse en un contexto clínico y biológico propio de ella, y así se ha conside-rado en nuestro estudio.

5.2. Controles

El estudio de los datos hemocitométrícos se realizó sobre 140 Indivi-dtsos de ambos sexos adultos y sanos. Los valores obtenidos, en especialpara los Indicadores de esferocitosis, resultan simIlares a los descritospretiamenre 64. cabe resaltar la escasa díspersién de la variable HG (gráfica34), de CV 2,98% (muy parecido a la CHCM, cuyo CV fue de 2,42%), quecontrasta con la amplitud de las distribuciones del Area II <gráfica 37) y91 Hiper <gráfica 35) con CV de 71,31 y 67,38%, respectivamente. 1-a mayorparte de los controles no exceden de 33,76 g/dL, 5,56 y 0,83% para lasvariables NG, Area II y ?$ Hiper, con una probabilidad de error del 0,1%.

En lo concerniente a los parámetros del estudIo de la membranaeritrocitaria mediante SOS—PACE, evaluados sobre 24 controles sanos, losvalores hallados son superponibles a los observados por otros autores 30,36,82;nuestras cifras de Sp/B3 son ligeramente más elevadas. Las distribuciones6e frecuencias, tanto de Sp/El, y sobre todo de Anlv83 exhiben dispersionesreducidas (gráficas 38 y 39), con sendos CV de 4,75 y 0,1%, de forma queel grupo control no suele presentar valores de $183 por debajo de 1,09(con probabilidad de error d~ 0,1%) y nunca Inferiores a 1,04, sIn registrarse

cifras de Ank/83 menores de 0.197.

5.3. Esferocitosis hereditaria

5.3.1. Datos clínIcos

Cabe distribuir nuestra serie de EH en subgrupos definidos por laedad, sexo, herencia, gravedad del curso clínico y antecedentes de espienec—tomia, datos clínicos respecto de los cuales exhibe una serle de caracterís-ticas que discutiremos a continuación.

182

La EDAD media global de los pacientes fue de 23,03 años, considerandosolamente los enfermos no espienectomizados, dicha edad media fue dr20,69 años, y de 28,31 para los esplenectomizados. Según la gravedad del cur-so clínico de las EH no esplenectomizadas, las edades medias han sido dife-rentes en cada categoría definida, con 20,84 años para las formas leves oasinromáticas, 24,62 para los casos moderados y 4,15 años para los enfermosgraves. De hecho, todas nuestras EH graves han llegado a la edad adulta es—plenectomizadas y la mitad de ellas lo fueron en edad pediátrica <gráfica1). Estas observaciones refrendan la conocida necesidad de la esplenectomiadurante la infancia en los casos graves y muestran que con la edad aumen-tan las Indicaciones de esplenecromía entre las formas de curso clínicomoderado por complicaciones como crisis anémicas y colelitiasís sintomáti—caC,i3h,llS,139. No se apreció afectación predominante de uno de los dosSEXOS <gráfica 2).

La HERENCIA del defecto (gráfIca 3) se ajusró a un patrón autosómí-co dominante en 21 familIas <53 casos) de las 28 <60 casos) en que fue po-sible acceder a un estudio familiar; los 7 enfermos restantes fueron clasifi-cados hipotéticamente como no dominantes al carecer de afectación familiarevidente a los métodos diagnósticos convencionales. Estas cifras suponen un74,1 y 25,9%, respectivamente, de familias de herencia dominante y “no domí—nanteV valores de acuerdo con los referidos por Lux (1987)112. Sin embargo,otros autores indican porcentajes equivaléntes de enfermos y no de familiascon uno u otro tipo de herencia 4~6783,163; si se consideran de este modonuestros pacientes, el 88% fueron casos de herencia típica autosómico domi-nanre y el 12% formas sin historia familiar. Estas cifras exhiben un netopredominio de los primeros, con representación proporcionalmente menor delos casos “no dominantes”; podría ser posible en este sentido un cierto ses-go motivado por el carácter de reclutamiento de nuestro estudio (qué pa-cientes deciden colaborar).

Es preciso matizar dos hechos: en primer lugar, el hallazgo de una fa-milia de cinco miembros (familia O) todos ellos con EH leve o asintomáticaevidente, excepto el propósirus (caso número 2), cuya forma clínica graverespondió completamente a la esplenectomia realIzada en edad escolar, datoconsistente con el comportamiento de un trastorno de herencia mendelianadominante en la mayoría de las EH y cuya penetrancia puede ser varia-ble 112,139 Así es común que el grado de expresión patobiológica de la EH

283

dominante sea relativamente uniforme ¿entro de una familia dada38137138,aunque también puede variar ampliamente 12,137,138 de manera que alguno.~pacientes de casos de EH típica solamente presentan formas leves del defec-te 137,138, y hemos constatado ambos supuestos. Oicho case número 2 pisedeser clasificado como homocigoto o bien doble heterocigoto de la alteracIóno alteraciones genéticas causales de la EH en su familia, al igual que otroscasos descritos con anterioridad 2,4,137,139,l68 cuyos padres presentaban pe-queñas anomalías reveladoras de su condición de heterccigotos mínimamenteafectos y que en la familia D fueran evidentes con explotaciones rutinarias,Seria plausible Que la penetrancia variable y las Interacciones genéticas enla transmisión vertical y dominante de la ~ 41 expliquen la existencia deenfermos homocigotos o doblemente heterocigotos en que el defecto, lejosde ser incompatible con la vIda 112, exhibe un curso clínico análogo a otroscasos de herencia dominante clásica. El segundo hecho a enfatizar se refIerea que de los 7 enfermos con EH sin afectación familiar aparente, 4 casoscursaron gravemente y 3 de forma clínica moderada, de acuerdo con observa-clones previas 3,4,6,12,112,137,139,163 en que se subraya el pyedominio ¿eEH de cursos clínicos desfavorables entre los casos teóricamente no dominan-ter del defecto.

La GRAVEDAD del curso clínico de la enfermedad fue leve o asintomá-tica en 23 pacientes y moderada en 31, con 8 enfermos graves, cifras quelepresentan porcentajes de 37, 50 y 13% para cada categoría, respectivamen~e(grálica 4). Tales valores se ajustan a estudios que reconocen un 20—40% deformas leves, un 60-65% de formas moderadas y un pequeño número, proba-blemente no superior al 5%, de pacientes graves 12,44,112, a excepción deuna mayor representación de este último grupo en nuestra casuística. Esiacircunstancia probablemente obedece a que la existencia de anemia hemolí-tica ha sido el único criterio deftnitorlo de la categoría grave; ciertamenteen algunos casos se trata de una anemia discreta no dependiente de trarxsfu-sión, que ha podido causar un ligero retraso ponderal y quid otros autoreslos hubiesen clasificado como de curso clínico moderado, aunque dentro desu rango fueran claramente los enfermos más afectos.

Se han descrito formas casi letales de EH 2,3,12, que no hemos teni-do la oportunidad de observa;, caracterizadas según la llierarura por una In-tensa anemia hemolítica de notable requerirnlento transiuslonal y respuestaIncompleta a una esplenecromía necesaria antes de la edad escolar 2,4,6,12,30

___________________ .1

184

113,137,139 siendo generalmente casos catalogados como aurosómico recesi-

vos; en ciertas ocasiones este tipo de enfermos se ha incluido en la catego—rfa grave 112,163 En este punto resulta interesante recordar el sello deafectación del curso clínico de las EH de herencia considerada autosómicorecesiva 3,4,6,12,30,112,137,138,139,163, corroborada y discutida en esteestudio, que presumiblemente traduce su condición de homocigotos o dobleheterocigotos para defectos causales de la entidad; de hecho sólo raravez44 se han comunicado casos leves o aslraomátlcos entre ellos y quetampoco hemos observado.

La gravedad del curso clínico de la EH supone una serie de variacionesde los indicadores de hemólisis y eritropoyesis compensadora, de esferocíto—sis, de la naturaleza de la hemólisis y de déficit proteico de la membranaerirrocitarla, modificaciones con trascendencia estadística entre las catego-rías clínicas definidas y que comentaremos más adelante.

Un 30% de los enfermos <19 de 62 casos) habían sufrido ESPLENECTOMíA por hemólisis o colelitiasis sintomáticas, siendo 15 de afectaciónmoderada y 4 graves (gráfica 4). El 60% de los pacientes restante Incluye 23casos leves o asintomáticos, 16 de curso clínico moderado y 4 graves; enestas EH no esplenectomizadas se ha estudiado la repercusión biológica dela entidad sobre los indicadores de hemólisis y su naturaleza y de esferocí—tosis, puesto que en estos enfermos la EH se manifiesta sin modificar.

5.3.2, Respuesta a la esplenectomía

En el grupo de pacientes esplenecromizados se ha valorado la respuestaa la esplenectomia en los 11 casos en que fue posible, así como el cambioque el procedimiento determina sobre los Indicadores de hemólísis. Segúncabía esperar 6,12,38,44,83,112,137,139,154,163,183, la respuesta a la espíe—nectomía consistió en la corrección de la anemia crónica o episódica <ta-bla XVI) en todos los casos, con reducción de la reticulocitosis en gentrahno hemos apreciado las respuestas parciales de la anemia observadas porotros autores2,4,óIíí,301í13,1371139 particularmente en las EH de gravedadintensa consideradas autosómico recesivas: de los 11 enfermos estudiados

en este sentido sólo 1, el caso número 41 (famIlia c) carecía de afectación

familiar aparente, fue clinicamente moderado y respondió perfectamente a

la cirugía.

Trataremos con detalle en el siguiente apartado la repercusión de la

185

esplenectomia sobre los demás Indicadores de hemólisis y su naturaleza y

de esíerocirosis, repercusión inaparente en el caso de los indicadores dedefecto proteico de la membrana eritrocitarla.

5.3.3. CaracterísticaS citométricas de la EH. Relación con otros datos

La ¿itometría de luz láser dibuja un perfil biológico típico en esta

entidad. En los enfermos no esplenectomizados, junto a las cifras de hemo-

globina y hematocrito más o menos conservadas, ofrece una curva de distri-

bución de los hematíes según volumen amplia y heterogénea de elevado

E~OW a expensas de rericulocitosis (gráfica 9) y de células de fragilidad os-mótica variable según el grado de condicionamiento esplénico (gráficas 11,12, 13 y II), y que son responsables del característico desplazamiento

hacia la h¡percromia de la distribución de los hematíes según concentración

de hemoglobina (figura 18) que se traduce en forma de los indicadores deesferocitosis HC, % Hiper y Arce II <gráficas 7, 8 y 12; tambIén RDW o

des’iac¡ón standard de la distribución, no analizada en este estudio) deacuerdo con la observación de que las células más hipercromas son osmótí-

carnente más frágiles 14,137

Esta hemólisis, ext ravascular In vivo y esencialmente esplénica, conileva

la elevación de la bilirrubina sérica y el correspondiente consumo de hapto—

giobina (gráfica 15). La eriíropoyesis compensadora queda plasmada, además

de en itt rericulocirosis y a través de ella en ci RDW, en un aumento de

los niveles de EPO <gráfIcas 16, 17, 18 y 19>. Tales cambios son esradisti—

camente signí iicat vos respecio del control (tabla XVII) y entre las diferen

tos categorías definidas según el curso clínico de la EH, subrayando que lamodificación de estos indicadores es directamente proporcional a la gravedad

de la enfermedad <gráficas 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27; tabla XIII).

La desaparición del condicionamiento esplónico y minimización de la

hemólisis se manifiesta en las EH espienectomizadas no sólo en la resolución

de la anemia crónica o episódica, sino también en la reducción de la retlcu—locitosis y correspondiente normalización de RDW <tabla XVII), con disminu-ción de la fragilidad osmótica Incubada y de los Indicadores de esierocitosis

% Híper y Area II <tabla XVII). Así pues, con la esplenectomia se hacemás homogénea la curva de distribución de los hematíes según volumen alquedar integrada principalmente por células hlpercromas de fragilidad osmó-tica inmediata sin tratamienros adicionales para sensibilizaría <gráficas 28,

186

32 y 33). Estos efectos en nuestra opinión quedan enmascarados en las EH

no espienecromizadas por la reticulocitosis.

La condición de los indicadores de esferocirosis como tales se ratifíca

en que la esplenectomía no consigue suprimirlos (tabla XVII) porque eviden—teniente no anula el defecto aunque modifique su expresividad clínica.

La conducta del ROW, aumentando con la gravedad de la enfermedad

en los sujetos no espienectomizados <tablas Xlii y XIV) y normalizándose

con la esplenecromia (tablas XVI y XVII) es congruente con observaciones

previas 140 El RDW asimismo exhibe asociaciones con la bilirrubínemia, la

haproglobina, está a su vez relacionada con las ROO inmediata Inicial e in-

cubada media como naturaleza de la hemólisis, y la EPO (gráfica 19),

cuyos niveles se conducen junto a la reticulocitosis y en cierto modo al

ROW como indicadores de la actividad eritropoyética compensadora y mues-

tran un comportamiento directamente proporcional al grado de anemia

<gráficas 16, 17 y 18), reflejando la magnitud de la hemólisis.

La reducción de la hemólisis con la esplenectomia se acompañó obvia—rtente de un descenso de la bilirrubinemia y del consumo de haptoglobina

scbre todo en las formas de curso clínico moderado, y de la normalización

de la cifra sérica de EPO.

5.3.4. Eficacia estadística de la citomerría de difracción de luz láser en el

diagnóstico de la EH

La aplicación de los indicadores de la esferocitosis obtenidos por esta

tecnología como medio diagnrisrico de la EH ha demostrado que se trata

de un método útil, preciso y enraordinariamente eficaz con las ventajas

de ser sencillo, rápido, proporcional a la gravedad del defecto (tablas XIII

y XIV) y cuantitativo.

Ha sido previamente utilizada con éxito con este sentido 64,140 aun

cuando algunos autores 140 han valorado el trazado de las curvas de distribu-

ción de los hematíes según volumen y según concentración de hemoglobina

sólo cualitativamente, reconociendo la presencia de esferocitos por sendas‘colas’ microcítica e hipercroma. En un estudio preliminar del actual 64 se

comprobó la utilidad de la verriente cuantitativa del método basándose en

los parámer ros % Híper, HC y HDW, y se sugirió un posible aumento de su

capacidad diagnóstica si pudiesen detecrarse células con concentraciones de

hemoglobina entre 36 g/dL y 41 g/dL.

-7

187

En el presente estudio hemos analizado la eficacia estadística de la

citometrfa de difracción de luz láser en el diagnóstico de la EH incluyendo

el procedimiento arbitrado para el cálculo de las áreas dentro de la curvade distribución de los hematíes según concentración de hemoglobina, y endefinitiva del Area II o tanto por ciento de hematíes con concentración dehemoglobina entre 37,5 g/dL y 40 g/dL. Demostramos que el método es ex-quisitamerite sensible y especifico en la detección de esferocitosis en esta

enfermedad si los umbrales de los parámetros para ello se sitúan en HGsuperior a 34,5 g/dL, 91 Hiper mayor de 1,5% y Paca II por encima del 9%,

que arrojan parejas respectivas de sensibilidad y especIficidad del 81,4 y87,i%,90,7 y 94,3% y 88,4 y 91,4% (tabla XVIII). Estos indices no mejoransustancialmente con la combinación diagnóstica de Area II mayor de 9%y/o 91 Híper superior a 1,5%.

El indicador de esferocitosís más discriminativo ha sido eí % Híper,

que como puede apreclarse en las distribuciones de frecuencias <gráficas 34,35, 36 y 37) es el parámetro en que el solapamiento entre enfermos y

controles es menor. El 91 HIper permite detectar incluso grados mínimos

de esferocitosis, cuya Identificación en la extensión de sangre periféricasería difícil por subjetiva y escasa, ya que todas la EH leves o asintomáticashan presentado % Hiper por encima de 0,5% y mayor de 1% en 21 de los23 casos de esta categoría. En nuestra opinión, la ausencia en una muestrade células con concentración de hemoglobina superior a 41 g/dL. descarta —

la esferocitosis, y por ende, la EH.

5.3.5. Fragilidad osmótica, esierocitosís y EH

En realidad, los estudios de fragilidad osmótica y de lisis en glicerol

no son más que verdaderos Indicadores, a veces no lo suficientemente sensi-bies, de la esfericidad de los hematíes dado que el principio en el que sebasan estos métodos en la característica reducción de la superficie respecto

del volumen de los eritrocitos 38,39,6ó,í12,137,139,14ó,163,169. En estasentido, Pan y cola. (1989)140 han manifestado que ante la especificidaddel trazado de la distribución de los hematíes según concentración dehemoglobina rara vez seria necesario evaluar la fragilidad osmótica, espe-cialmente en los estudios familiares

Los indicadores de la naturaleza de la hemólisis han mostrado unaumento de la fragilidad osmótica erirrocitaria dependiente de la intensidaddel curso clínico de la EH (tablas XIII y XIV) como sucede con los indica-

188

dores de esferocirosis, y que resulta más ostensible en su estudio post incu-bación, sobre todo en los casos leves o asintomáticos de la entidad.

En cuanto a los trazados de las curvas de fragilidad osmótica (figura56) hemos apreciado una tendencia a la formación de curvas de perfildenominado normal entre los enfermos leves o asintomáticos, de modo que

con el aumento de la gravedad del curso clínico y a su vez de la esferocito—

sis se han dado curvas caudadas y diagonales, éstas circunscritas a las EH

más graves y sobre todo a a versión Incubada de la prueba. Estos datosson sobradamente conocidos 38,39,83,137,139

Los puntos de las curvas más vulnerables a la gravedad de la enferme-

dad han sido la ROO inmediata Inicial y la ROO incubada media

<p ~,0.001~ gráfica 2’7~ tablas Xlii y XIV) seguidas de la ROO inmediatamedia y de la ROO incubada inicial <p 4. 0,05~ tablas XIII y XIV), sinexistir diferencias estadisticamente significativas respecto de los puntos de

lisis total. Tales hallazgos cont rastan con estudios previos ~ en que las

diferencias estadisticamente significativas conciernen a la ROO inmediata

inicial y ROOs totales. Nos Inclinamos a favorecer nuestro resultado, que

creernos confirmado en las correlaciones de la ROO incubada media <gráfica12) y de la ROO inmediata Inicial <en enfermos esplenectomizados, gráfica33) con 91 Hiper, genuino indicador de esferocitosis,

Como Indicadores de esferocitosis, la fragilidad osmótica y técnicas

afines quedan ampliamente superadas por la cirometria de difracción de

luz láser con los parámetros derivados de la curva de distribución de los

hematíes según concentración de hemoglobina y el protagonismo indudable

dei 91 Hiper ya que se trata de un método de gran eficacia, preciso, dire-

cto, cuantitativo de forma directamente proporcional a la gravedad delcurso clínico de la EH, sencillo y rápido a diferencia de las técnicas ante-

riores, a las que puede reemplazar largamente en el diagnóstico de laentidad <tabla XIII).

£36. Rol de la SOS—PACE de la membrana eritrocitaria en el diagnósticode la EH

El estudio de los indicadores del déficit proteico de la membrana del

heniarles mediante SOS—PACE de la misma ha demostrado ser un método

eficaz y reproducible para la estimación de sus coníenidos en espectrina y

ankirina en la EH <tabla XVIII), con las ventajas de ser un procedimiento

sencillo, rápido y fácilmente disponible.

189

Ante la ausencia de diferencias estadisticarnente significativas entre

enfermos no esplenectomizados y esplenectomlzados de la misma gravedad

(tabla XVII), los indicadores de déficit proteico de la membrana del hematíese han analizado globalmente en todas las EH.

El defecto básico encontrado accesible a la tecnología aplicada hasido el clásico déficit parcial de espectrína manifestado en forma de un

descenso del contenido de esta proteína en la membrana eritrocitarla del87791, de la normalidad como medía global (~ 0,990; SD 0,117) que havariado de acuerdo con la gravedad del curso clínico de la enfermedad

(tablas XIII y XIV), acompañado en 45 de 62 pacIentes <22,6%) de un

déliclí parcial medio de aniririna <~ 0,195; SO 0,003) dei 97% de la norma-lidad, muy discreto pero estadisticamente significativo respecto del caruto

1.

Tales datos confirman observaciones ~83112,116437,l39,163 sobre todo en cuanto al déficit de espectrina, docu-

mentado desde los estudios de Agre y cols. 2,3,4 que han descrito conteni-

dos de espectrina, determinados por radioinmunoensayo ~A, del 63—81% ydei 30—74% de la normalidad para las EH dominantes y no dominantes,

respecrivamenre <tabla XIX), siempre variando de manera inversamente

proporcional a la gravedad del curso clínico. Estos autores Indican conten!—

dos de espectrina del 3091 de la normalidad en las formas casi letales de

la entidad y marIzan que la SOS-PACE Infraestima la verdadera defIciencIacorpuscular de esta proteína en comparación con el radlolnmunoensayo ~.

Otros estudios han comunicado contenidos de espectrina del 80-90%de la normalidad en casos dominantes, en general de cursos clínicos levesy moderados 36, y del 50—70% para las lormas no dominantes 30,82, habi-rualmente de gravedad Intensa o moderada <tabla XIX>. Eber y cola, <1990) ~,que eliminan el elemento de inexactitud que puede introducir la cuantía de

banda 3 en la medida de los contenidos proteIcas de la membrana calculan-

do el contenido de espectrina como mmoles de espectrina por rnmoles de

lósioro lipidico, han obtenido valores del 80—100% de la normalidad para

las EH leves o asintomáricas, del 50—80% para los casos moderados y del40—60% para las formas graves.

En nuestra serle, los contenidos medios de la membrana eritrocitariaen espectrina han sido del 84,5% (X 0,953; 50 0,003) de la normalidadpara las formas no dominantes, que incluyen 4 enfermos graves y 3 deafectación moderada, y de 89,9 y 84,9%, respectivamente, para las Bid no

190

espleneciomizadas y espienecromizadas <tabla Xl), éstas integradas por 4

casos graves y 15 moderados sin formas leves o asintomáricas. Según la.

intensidad del curso clínico, los contenidos medios de espectrina han sido

de 91,3% en los enfermos leves o asinromáticos, de 89,5% en aquellos de

u curso clínico moderado y de 83,6% en los casos graves <tablas XIII y Xl\’).

Las d[lesencias entre esras cifras siempre han tenido trascendencia estadis—rica, a pesar de la impresión de proximidad entre si que pueden causar,

Dichos valores exhiben grados de déficit más modestos respecto de

los descritos anteriormente, hecho que probablemente traduce la observación

de Agre y cols. 34 referente a que la SOS-PACE subestima el grado realde defecto respecto al radloinmunoensayo. No hay que olvidar que la SOS-

PACE es un método semicuarititativo en cuya resolución influye ci tipo degel de poilacrilamida, homogéneo 50Si,161 o de gradiente 7,4,2~,30,3á,8í,8í,106,122,191 utilIzado én el procedimiento. Es posible que en este sentido

se justifique, al menos en parre, la ausencia de correlaciones estadísticas

de los contenidos protelcos de la membrana eritrocitaria con los indicadores

1de hemólisis y su naturaleza y de esferocitosis existente en nuestro estudio.

No hemos tenido la oportunidad de observar casos de EH con conteni-

do de especíriná normal y aumento del cociente Sp/63 85,1l5,122,163 Tan

sólo en el caso número 66 fue del 110% de la normalidad, caso que forma—

ha parte de una clásica familia de herencia dominante, gravedad principal-mente moderada y con discreto déficit parcial medio de espectrina del

95,3% dc la normalidad en el resto de sus miembros <familia F). No cree-

mos que tenga valor tal hallazgo aislado que no fue posible confirmar y

aun más en el seno de una familia de estas características.

Como dato adicional, es inmunoblot antiespecírina fue normal en lo-dos los pacientes, excluyendo la posibilidad de fragmentación de dicha pro—tema como causa de su déficit, Esto había sido explorado en EH atipica—mente graves de herencia recesiva en nuestro estudio se ha evaluado en

todos los casos,

El défIcit parcial de ankirina, acompañante del anterior en el 72,6%

de los casos 5’ muy ligero, se ha mantenido alrededor del 97% tanto en las

formas dominantes como no dominantes, EH no espienecromizadas y espíe-nectomizadas y no ha mostrado una variabilidad estadisticamente ostensiblesegún la gravedad del curso clínico (tabla XIII) de la entidad. Estos hallaz-

gos corroboran la afirmación de que un 50—75% de los enfermos de herencia

191

dominante típica exhiben discretos déiicits de anicirlna.82.i1S, del que se

han descrito diversos grados, desde 15-25% 82,116 a 2—13% ~ de reduc~

ción respecto del control normal. Los pacientes afectos de formas atipí—camente grates y herencia recesiva 30,82,116 presentan niveles de ankirinadisminuidos aproximadamente al 50% de la normalidad, circunstancia que

tampoco s~ ha producido en nuestra casuística. De modo análogo al déficit

de espect rina, la SOS—PACE ha de sobreestimar el contenido real de anicí—

rina en la membrana del hemacfe al referirlo a la batida 3, supuesto que

no ha sido comprobado.

Aparentemente no se apreciaron diferencias cualitativas entre casos y

controles en las restantes bandas proteicas resultantes de la SOS—PACE de

los estromas erlírocitarlos (figura 19). El método aplicado no nos ha permi-

tído acceder a otras anomalías del esqueleto de la membrana descritas en

la EH. La detección del trastorno del dominIo ~%IV de la especí rina con

unión defectiva a la proteína 4.1 <HS fl, Sp-II; tabla 1) comunicado era

casos dominantes 69,186 y estimado como un 10% de las EH, requiere cro—marografia de afinidad de extractos de espectrina sobre protefna 4.1 Inmovi-

izada 186 o bien análisis bldimensional 13, técnica ésta necesaria para

Identificar el dominio or. lía, hallado en algunos casos no dominantes 118,119,y que probablemente también permita ci estudio de las alteraciones de la

banda 84,131 El déficit de banda 4.2, conocido en japoncies con EH

recesiva 81,121,1 38,139 es perfectamente evaluabie mediante SOS—PACE

con mejor resolución en sistemas discontinuos 81.95; con nuestro procedi-

miento, continuo y homogéneo, al no conseguir una separación neta de las

bandas 4.1 y ‘1.2, intentamos estimar el contenido de la banda 4 en lamembrana como el cociente ¡34/83, pero no fue posible evaluar sus resul-

tados por no ser reproducibles en el control de calidad de la técnica, y

por ello se excluyó el parámetro 84/133 del análtslsl en cualquier caso, eldéficit de proteína 4.2 en la EH ha de ser excepcional en Occidente.

Así pues, el defecto primordial en nuestros enfermos ha sido el défi-

cit leve—moderado de espectrina y anklrina <HS Sp+ Anltt tabla 1) de acuer-

do con el predominio de formas leves o asintomáticas y de curso clínico

moderado (solamente incluimos 8 casos considerados graves por anemia

hemolítica crónica) ofreciendo cierta similitud con la familia de 19 casos

estudiada por Costa y cols. <1990)36 en que se demostró la transmisión de

la EH dominante ligada al polimorfismo Nco 1 deI gen de la ankirina.

192

Se puede especular que nuestro 32% de EH dominantes sin déficitparcial de ankirina <17 de 53 casos) estuvieran afectas de formas con ano-

malía del dominio IV de la espectrina de unión defectuosa a la proteína

4.1 <HS Sp-4l; tabla 1), de prevalencla estimada en un 30% de las EH

dominantes en sus descripciones originales69’186, pero la tecnología apli-cada no es apta para demostrar este defecto y además muy probablemente

subestima la carencia real de ankirina. Se ha descrito en estos enfermos

la existencia de esieroequinocitos en sangre periférica de modo caracte-

rísrico 12,38,112,137,139,186 en realidad únicamente valorable en los pa-cientes no esplenectomizados, al formar parte de los cambios hemoperifé—

ricos postespíenectomía 83 Este dato morfológico sólo se observó en los

casos no esplenectomizados números 10 y 38, integrados, respectivamente,en las familias J y 8 cuyos déficirs parciales leves—moderados de espectrinay ankirina (HS Sp Anid; tabla 1) prácticamente excluyen el defecto su-

puesto. Ño obstante, la Identificación de hematíes espiculados en sangre

periférica es subjetiva y, por tanto, inexacta, por cuanto su valor como

orientación diagnóstica es más que cuestionable.

Confirmamos que el déficit leve—moderado de espectrina y anitirina

<RS Sp Ankt; tabla 1) es el defecto más prevalente enrre las formas auto—

srlmico dominantes de EH 3,’t36,82,1lóí39, en el cual el déficit de espec—

trIne es secundario a un defecto primario en el gen de la anicirína, aún

por caracterizar y que determinaría la alteración de su estructura o fun-

c¡óu, 36,8211ó,138

La situación no parece distinta en nuestras EH sin afectación familiar

evidente a los métodos diagnósticos convencionales, que han mostrado grados

de déficit de espectuiria y aril<lrina equivalentes a los registrados en laslormas dominantes del mismo curso clínico. No se han observado casos

intensamente graves con respuestas parciales a la esplenectomía y con 5091

de déficit de ambas proteínas. Este interesante hecho enlaza con los resul-tados del estudio de sus progenitores, grupo Integrado por 6 parejas.

54. Progenitores de EH sin historia familiar

La comparación de los progenitores con el grupo cont rol ofrece unimportante resultado: miestras los parámetros citométricos, incluyendo los

indicadores de hemólisis y de esferocitosis, no muestran diferencias esta—

disticamente sIgnificatIvas, éstas si existen respecto de los Indicadores dedéficit proteico de la membrana erit rocitaria, con contenidos medios de

193

espectrina de 95,991 y de ankirina de 99% en este grupo de progenitores.

Agre y cols. (í986)~ observaron en casos similares una mínima dls2minución de espectrina, a diferencia de Eber y cois. <1990>~~, y constata-

ron que los contenidos de esta proteína inferiores al 97% de la normalidad

se asocian a un aumento de la fragilidad osmótica al determinar ligeras

reducciones de la relación superficIe/volumen del hematíe, hecho que trans-

forma en acreedores del defecto a este grupo de sujetos. Apenas se conocen

datos de los contenidos de anl<irina de la membrana eritrocíraria en los

progenitores; tan sólo lolascon y cols. (1991)82 han descrito aisladamente

un ligero déficit.

Tales resultados sugieren que al menos uno de los miembros de cada

pareja está afecto por una EH de penetrancla genética Incompleta, es de-

cir, con ausencia de expresión del genotipo anómalo cuando debería mani—

festarse, efecto que obedece a que la tara genética requiere de la concu-

rrencia de otros factores que incluyen la acción de otros genes, fenómenos

ambientales o el azar, y teniendo también en cuenta la dificultad diagnós-

rica que plantean estos casos, en que la entidad escapa a la metodología

básica, incluso a la citometria de difracción dé luz láser <en nuestro grupo

siempre existió un pequeño % Hiper, aunque no significatIvamente distinto

del control), y únicamente puede demostrarse mediante SDS—PAGE de los

est romas e nt roc itaríos.

Es mu:. probable que la mayor parte de las EN sin historia familiarsean ciertamente formas de herencia autosómico dominante, como prueban

los Indicadores de déficit proteico de la membrana del hematíe en los pa-

dres de nuestros enfermos, cuyos cursos clínicos, no más desfavorables quelos de otros casos típicamente dominantes, pueden explicarse por penetran-

cia variable del defecto entre miembros de una misma familia y la posibi-

lidad de interacciones genéticas.

De acuerdo con Oelaunay y cois. (1990> 41, la variabilidad fenotipica dela EH podría ser la consecuencia de un gen mutado modulado por

la actividad de su correspondiente alelo y/o de otros genes no alélicos, yaque la interacción genética de dos o más alelos en locí distintos podría

suponer efecros aditivos o supresores sobre el fenotipo esperado por la ac-

ción de cada uno de los loci aislados. De esta afirmación consideramos

un claro ejemplo a la familia O, cuya primera generación (casos números48 y 49), con EH leve o asintomárica, que fue detectable con los mé—

194

todos diagnósticos utilizados engendró una descendencia con expresividad

clínica muy heterogénea. Estos datos ponen de manifiesto la rareza de las

EH de terdadera herencia autosómico recesiva, y reafirman la conclusiónde Agre <1989)6, que considera la EH dominante y recesiva enfermedades

distintas, nés alía de la mera expresión homocigota o hererocigota delproblema.

La solución definitiva del dilema de la transmisión genética de la

EH en estos casos requeriría demostrar su asociación a un determinado

polimorfismo del gen de la ankirlna 36, o bien la caracterización bioquími-

ca de defectos ya conocidos y ligados a la EH dominante (como las formas1-15 (3 Sp—4.I; tabla 1) o recesiva (anomalía n¿.lla de la. espectrina 41,118,119o el déficit combinado grave de espectrina y ankirina por síntesis reducidade ésta 29,77) Esto sobrepasa las posibilidades de nuestra tecnología.

5.5. Clasificación de la EH según su expresión biológica

El análisis de la gravedad o curso clínico de la EH entre los enfer-

mos no esplenectomizados ha puesto de manifiesto una modificación de

los indicadores de hemólisis (y erirropoyesis compensadora), de la natura—

esa de la misma, de esferocitosis y de déficit parcial de espectrina y

ankirina de la membrana del hematíe según las categorías definidas respec-

to de dicha variable, Los criterios aplicados para ello han sido tan senci-

líos como la existencia o no de anemia, si ésta es crónica o episódica y

la magnitud de la retículocitosis, datos que orientan de forma rápida y

fácil sobre la Intensidad del curso clínico de la enfermedad en cada pa-

ciente y que es prudente determinar en situación basal.

Dichas variaciones resultan estadísticamenre sIgnIficativas, delimitan-

do una clasificación de la EH según su expresividad biológica y con impor-

rancia pronóstica, que se describe en la tabla XIV. Eber y cois, (l990)~’1

han elaborado una clasificación parecida que relaclona el déíiolt de espec—

trina <calculado como nimoles de espectrina por mmoles de fósforo lipídico

de la membrana eritrociraria), pero no conrempla los Indicadores de esie—

rocitosis derivados de la ciromet rfa de difracción de luz láser. No se han

considerado aquí los enfermos esplenectomizados porque la exéresis del ba-zo modifica la expresión de la entidad al minimizar la hemólisis.

Así pues, distinguimos un grupo de cuatro pacientes de categoríagrave, de edad pediátrica y sin antecedentes familiares del problema conanemia hemolítica crónica que en algunos casos requirió transfusión. En

ellos eí defecto repercute en los indicadores definidos con intensidad, que

195

denotan ser portadores de una población eritrocitaria muy heterogénea envolumen, a expensas de reticulocitos y células más o menos hlpercromas

1

según su grado de condicionamiento esplénico, de gran fragilidad osmótica

in vit ro, espontánea e incubada, cuyas curvas suelen trazar un perfil diago-

nal (fIgura ló). Esto se proyecta como anemia con reticulocítosis frecuen-

temense superior a 600 x 109/L, intensa esferocitosis en forma de HC y

91 Hiper muy elevados, con notable aumento de la bllirrubínemia, LOH y

EPO y caída de la haptoglobina sérica. Sus contenidos ce la membrana del

hematíe en espectrina y ankirina están disminuidos, :on cifras que en

nuestras manos estriban entre 82—84% y 9791 de la normalidad respectiva-

mente y que resultan superiores a las descritas en este tipo de enfermospor otros autores: se han descrito contenidos de espectrína del 50% 3,29 al

70% 4,44,82,143, y de ankirina del 50% 29,82,143 La discordancia puedeobedecer a la superior gravedad de la EH en sus pacientes o bien a la ex-

presión biológica de genotipos distintos, puesto que nuestros casos muy

probablemente corresponden a formas autosómico dominantes de penetrancia

genética mayor o con interacciones genéticas desfavorables, o acaso aformas homocigotas o doblemente heterocigotas de defectos presentes en

sus ascendientes. En tales enfermos suele estar Indicada la esplenectomfa

en edad pediátrica.

El grupo de curso clínico moderado, definido por anemia hemolítIca

sólo ocasional y reticulocitosis por encin~a de 200 x 109/L, exhibe una

considerable afectación de los indicadores referidos, por cuanto sus pobla-

clones erúroides son aún heterogéneas en volumen por retículocitosis, habi-

tualmente entre 200 x 109/L y 600 x 109/L, y una cantidad variable de

células de cierta hlpercromía, cuya hemólisis hipotónica puede no ser evi-

dente sino tras incubación, con tendencia a describir curvas caudadas 38,39.83.137,139 <fIgura 16). A la ausencia de anemia en situación basal se

une una notable esferocitosis (HC 36—37,5 g/dL y 91 Hlper 5—15,591), hiper—

bilirrubinenlia y caída de la haptoglobina ~‘ariables pero discretas en general,

al igual que el aumento de la EPO. La reducción registrada de los conteni-

dos de espectrina y ankirlna de la membrana eritrocitaria es análoga a la

obtenida por Costa y cols. <1990)36 (tablas XIV y XIX). Los enfermos deesms características no suelen necesitar la esplenectomia en edad pediatrh.

ca: en nuestra serie sólo fue así en 4 de 31 casos (12,9%) y hasta un só91de ellos la había sufrido en edad adulta. Sin embargo, Eber y coIs. <1990)~~

indican la esplenectomia en estos pacientes en la edad escolar, observación

196

probablemente debida a que clasifican como de curso moderado casos de

mayor gravedad clínica, incluso con anemia crónica.

En los enfermos de la categoría leve-asintomática, sin anemia ni re..ticulocitosis intensa, el diagnóstico suele Ser causal o a consecuencia del

estudio familiar de otros casos más expresivos clinicobiológicamente Su

población de células rojas puede ser más uniforme, aunque claramente des-

plazada hacia la hipercroma como reflejan los indicadores de esferocitosís,con HC 34,5—36,5 g/dL y % Hiper 1,5—9,591, y una fragilidad osmóticaapreciable tras incubación con tendencia a dibujar curvas de tipo normal 38,39,83,137,139 (fIgura 16). Su ligera hemólisis puede no repercutir en los

Indicadores de henólisis séricos. También es leve el déficit de espectrina

que presentan, y aún más sutil el de anl<irina, en su caso. Puesto que enla clasificación de maestros casos en esta categoría se ha observado riguro-samenre sólo el criterio clínico, hemos podido constatar que puede sercompatible con cifras de reticulocitos entre 80 x 10

9/L y 300 x 109/L en

la mayoría de los enfermos. Esta observación demuestra la heterogeneidad

del grupo dentro de la escasa repercusión que puede causar la entidad yque hace innecesaria la esplenecromia en los pacientes leves o asintonáticos.

Los progenitores de las EH sin historia familiar forman un grupo di-

verso en cuanto al estado patológico de cada individuo respecto del proble-

ma, ya que está constituido por sujetos normales y con un pequeño gradode delecro: a menudo se trata de verdaderas EH leves—asintomáticas. En

general, los indicadores de hemólisis y su naturaleza y de esferocitosis no

ofrecen datos significativos, si bien exhiben una cierta cifra de hematíes

con concentración de hemoglobina superior a 41 g/dL, por escasa que sea

y una fragilidad osmótica que puede estar sólo sutilmente aumentada. El

contenido de espectrina de la membrana eritrocitaria se halla discreta-

mente descendido en un rango aproximado a las EH leves—asintomáticas, eldéficit de ankirina es más difícil de apreciar, aunque en ocasiones es

notorio. Como ya se ha comentado, al menos un miembro de cada parejaprogenitora muestra estos ligeros defectos, que en su descendencia cursan

clinicamente de nodo no más desfavorable que otras formas de clara he-

rencia dominante. Cabe especular que corresponden a EH dominantes de

penet rancia genética Incompleta y variable en su transmisión vertical.

Es evidente que el espectro clinicobiológico de la EH es muy amplio

e incluye casos con pequeña expresión de su defecto, que no son detecta—

197

dos con los medios diagnósticos tradicionales. Esto sugiere que la prevalen—

cia real de la EH es muy probablemente superior a lo supuesto, puesto.

que se ignora la verdadera frecuencia de las formas leves y asintomáticas

de la entidad.

6. CONCLUSIONES

199

1.— La EH es una entidad de expresión biológica extraordinariamente

amplia, que incluye desde raras formas con hemólisis crónica grave

que precisan una espienectomfa precoz hasta posiblemente más de un

40% de casos muy leves o asintomáticos, de gran dificultad diagnósticacon Ja metodología convencional.

2.— La citometria de difracción de luz láser es una tecnología extraordina-

riamente eficaz y precisa en el diagnóstico de la esferocitosis de laEH, merced a sus parámetros indicadores HC, Area II y sobre todo

91 Hlper con las ventajas de tratarse de un método sencillo, rápido y

objetivo por ser cuantitativo de forma dIrectamente proporcional a la

gravedad de la entidad.

3.— Citométricamente, junto a la posible anemia, la EH exhibe una pobla-

clón eritroide heterogénea integrada por reticulocitos y células roja~

de hipercromia variable según su grado de condicionamiento esplénico

osrnóticamente frágiles. Estas características son directamente propor-

cionales a la gravedad del curso clínico,

4.- La espienectomía en la EH corrige ía anemia crónica o episódica y

da lugar a una población eritrocitaria más uniforme al suprimir ci

condicionamiento esplénico y aminorar la hemólisis, con reducción con-

siguiente de la reticulocitosis. Este efecto se traduce en la normaliza-

ción de la distribución de los hematíes por volumen <cuyo CV es el

RDW), con disminución de la cifra de reticulocitos y de los Indicado-res citométricOs de esferocitosis.

5.— La fragilidad osmótica y métodos afines son técnicas laboriosas y a

menudo no lo suficientemente sensibles en el diagnóstico de la EH,

que al reflejar la reducción de la relación superficie/volumen de los

hematíes se comportan como indicadores de la esfericidad erltrocita

ría. En este sentido, son netamente superados. por los Indicadores de

esferocltosis obtenidos por cirometria de difracción de luz láser, que

representan la alternativa que puede sustituir a dichas técnicas en el

diagnóstico de la EH.

6.— Dado que la esferocitosis no es monopolio exclusivo de la EH, el diag-

nóstico definitivo de esta enfermedad puede establecerse sólo si la de-

mostración de la esferocitosis forma parte de un contexto de datos

clfnicos y biológicos compatibles con la EH.

t=.e.

0o

200

t- En el estudio del defecto molecular de la EH, la SOS—PACE de los es-

¡¡ornas eritrocitarios aislados es sin duda el primer eslabón, ya que esun método reproducible, eficaz y sencillo que permite estimar los con-tenidos de la membrana del hematíe en espectrina y anitirina.

8.- La SOS-PACE de la membrana eritrocitaria demuestra en la EH un

déficit parcial de espectrina proporcional a la gravedad del curso clí-

nico de la entidad, que se acompaña hasta en un 75% de los casos deun discreto déficit parcial de ankirina, Así pues, confirmamos que eldéficit combinado leve—moderado de espectrina y anklrina

(lIS 59 AnlO) es el más prevalente en la EH.

9— Al menos u~t miembro de cada pareja progenitora de casos de EH sin

historia familiar aparente presenta un pequeño defecto únicamente evi-dente mediante SOS—PACE de sus membranas eritrocitarias. Esta ob-

servación sugiere su afectación por una EH de penetrancla genética

incompleta en ellos y variable en su transmisión vertical autosómico

dominante, á la vez que alude a la rareza de las verdaderas formas

recesivas de la enfermedad.

l0— Ante la enorme diversidad de la expresión biológica de la EH, cabe

reflexionar que la prevalencia real de la entidad ha de ser superior a

la supuesta, ya que no se conoce la frecuencia verdadera de las EH

leves y asinrométicas entre la población general.

7. RESUMEN

202

La EH es la enfermedad hemolítica hereditaria de mayor prevalenclaen la población. Su transmisión es principalmente autosómico dominante conpenetrancia genética variable, y presenta gran diversidad en su expresión

bioló~Ica y favorable respuesta a la esplenectomía en general.

No se han Identificado aún defectos primarios de la misma, pero lamembrana eritrocitaria de la mayoría de los enfermos exhibe un déficit

parcial de espectrína proporcional al curso clínico de la entidad y probable-

mente secundario a un déficit parcial de aniririna acompañante hasta en el

75% de los casos. Patogénicamente, el déficit parcial de espectrina determina

que la superficie de membrana fijada a su esqueleto sea menor, producién-dore tana liberación de las zonas de la bicapa lipidica no estabilizadas quecausa la pérdida de la relación superficie/volumen celular característica de

los esferocitos. Esta alteración se Intensifica con cada paso de los hematíesa través de los cordones esplénicos.

La demostración de esta deformidad esférica es la base de la fragili-dad osmótica y técnicas relacionadas, laboriosas y con frecuencia no lo sufi-

cientemente sensibles ni especificas en el diagnóstico de la EH. Además, la

rigidez, la esfericidad nativa y la elevada concentración de hemoglobina del

esíerocito impiden la medida correcta de su volumen y de su CHCM, paráme—ro calculado a partir del VCM en citómetros convencionales. Estos inconve-

rientes dificultan particularmente el diagnóstico de las fnrmas leves y asín—

tomáticas de EH, forma de manifestación de la entidad probablemente en

más de un 40% de los casos y que hacen incierta la prevalencia real de laEH,

Nuestro estudio de 62 enfermos de EH (19 de ellos esplenecromizados)

y de 6 parejas progenitoras de casos sin historia familiar ha confirmado lascaracterísticas clásicas del problema, como su habitual transmisión genéticadominante y su amplio espectro clínico, con un 37% de formas leves o asín—

tomáticas y un 13% de pacientes con anemia hemolítica crónica de respuesta

siempre completa a la esplenecromia. Asimismo, hemos evaluado en nuestros

enfermos el rol en el diagnóstico de la EH de los Indicadores de esferocito—

sis de la citometria de difracción de luz láser y de la SOS-PACE de los es—

romas e rlt rocitarios aislados.

Hemos demostrado que la citometria de difracción de luz láser es un

203

método útil, preciso y extraordinariamente eficaz para la detección objetiva

de la esferocitosis de la EH, que además de ser sencillo y rápido, es cuanti-

tativo de forma directamente proporcional a la gravedad de la entidad. Ello

es posible por su capacidad de medida directa y simultánea del volumen yla concentración de hemoglobina en hematíes previamente esferificados y

ligeramente fijados con glutaraldehido. De su distribución de las células ro-

jas según concentración de hemoglobina derivan parámetros que informan de

la presencia de esferocitos en una muestra, como HC, Area II y sobre todo91 Hiper. Como indicadores de esferocitosis, creemos que tales parámetros

citométricos superan notablemente a la fragilidad osmótica y técnicas afines,

a las que pueden reemplazar en el diagnóstico de la enfermedad con obviasventajas. Resulta inexcusable puntualizar que para el diagnóstico certero de

EH es imprescindible que la demostración de la esferocitosis, en modo algu-

no exclusiva de ella, forme parte del conjunto de datos clínicos y de labo-

ratono propios de la EH.

La SDS—PAGE de los estromas eritrocitarlos aislados se ha comportadocomo un método sencillo, eficaz y reproducible para la estimación de sus

contenidos en espectrina y anl<Irlna, por lo que en nuestra opinión constituye

el primer eslabón del estudio de la base molecular de la EH. Esta técnica

nos ha permitido constatar el déficit parcial de espectrina característico de

la enfermedad y proporcional a su gravedad clínica, que ha resultado acompa-

ñado en un 72,6% de los enfermos de un ligero déficit parcial de anisirina.

Dichos datos confirman que el defecto más prevalente en la EH es el déficit

leve—moderado de espect rina y anitirina (HS Sp Ank’), que en otros estudios

ha mostrado su herencia ligada al gen de la anklrina y cuya anomalía prima-

ria aún no ha sido caracterizada.

La situación no ha sido distinta en las EH sin historia Familiar eviden-

te, que han mostrado grados de déficit de espectrina y ankirlna en la mem-

brana eritrocitarla análogos a los observados en los casos típicamente domi-

nantes de su mismo curso clínico. En efecto, mientras que el estudio de sus

progenitores con metodología convencional y citometría de difracción de luz

láser no ha ofrecido diferencias estadísticanlerlte significatIvas con el grupocontrol, éstas sí existen respecto de los contenIdos de la membrana entro—citarla en espectrina y anklnlna.

204

Tales resultados sugieren que aí menos un miembro de cada pareja

progenitora presenta una forma de EH de penetrancia genética incompí¿aen ellos y variable en su transmisión vertical dominante. Este fenómenomuy probablemente podría darse en la mayor parte de la EH sin aparentes

antecedentes familiares, subrayando la rareza de las EH de verdadera heren-

cia autosómíco recesiva. Pero estas reflexiones son especulativas, ya que la

solución definitva del dilema de la transmisión genética de la EH en estos

casos sobrepasa nuestra modesta tecnología.

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