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ARTIGO ORIGINALACTA MDICA PORTUGUESA 2003; 16: 65-69

R E S U M O / S U M M A R Y

ESFEROCITOSE HEREDITRIA -PREVALNCIA DOS DFICES PROTEICOS

DA MEMBRANA DO ERITRCITO

ELISA GRANJO, PEDRO MANATA, NOMIA TORRES, LURDES RODRIGUES, FTIMA FERREIRA,ROSWITHA BAUERLE, ALEXANDRE QUINTANILHA

Servio de Hematologia Clnica. Hospital de S. Joo. Porto. Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar. Porto.Servio de Hematologia. Centro Hospitalar de Coimbra. Coimbra. Servio de Hematologia. Hospital de Matosinhos. Matosinhos.

Servio de Medicina Interna. Hospital de Viana do Castelo. Viana do Castelo

A Esferocitose Hereditria (EH) uma anemiahemoltica congnita que resulta de alteraesquantitativas e/ou qualitativas das protenas damembrana do eritrcito. A fim de identificar asalteraes proteicas e procurar relacion-las com ofentipo clnico estudaram-se 25 famlias comEsferocitose Hereditria (EH), da regio Norte dePortugal, pela tcnica de electroforese em gel depoliacrilamida (SDS-PAGE). Nas 25 famliasestudadas detectaram-se 18 com uma reduoprimria de anquirina, sendo que 16 apresentavamum modo de transmisso dominante, uma erarecessiva e numa no foi possvel demonstrar omodo de transmisso. Em cinco famlias foiencontrada uma reduo primria de banda 3, todascom um padro dominante. Encontrou-se aindauma famlia com reduo de protena 4.2(esferocitose leve) com transmisso recessiva euma outra com reduo primria de espectrinas(esferocitose leve) em que no foi possveldemonstrar o modo transmisso. De 15 doentescom dfice de anquirina, estudados numa situaode pr-esplenectomia, dez tinham uma esferocitoseleve (um dos quais com hemlise compensada) ecinco tinham um fentipo de esferocitosemoderada. Nas famlias com dfice de banda 3, dezindivduos foram tambm estudados numa situaopr-esplenectomia, sendo que sete apresentavamuma esferocitose leve (dois dos quais tinham umahemlise compensada) e trs uma esferocitose

HEREDITARY SPHEROCYTOSIS PREVALENCE OF ERYTHROIDCYTOSKELETAL PROTEIN DEFECTSThe authors studied the relative prevalence oferythroid cytoskeletal protein defects and theirrelationship with the clinical course of HereditarySpherocytosis (HS) in 39 Portuguese patients ofNorth of Portugal (25 families). This study showedthat, in the North of Portugal, HS is primarily due toanquirin deficiency (72%), followed by band 3(20%). These findings are similar to the publisheddata in other Caucasian populations. Anquirinprimary defects have been difficult to diagnosebefore splenectomy, due to high reticulocytescounts.

Key Words: Hereditary Spherocytosis, haemolytic anaemia, red-cellmembrane protein, SDS-PAGE, protein deficiency.

Recebido para publicao: 07 de Janeiro de 2002

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ELISA GRANJO et al

moderada. Nas 25 famlias estudadas verificou-seuma predominncia do dfice de anquirina (72%)seguido pelo dfice de banda 3 (20%), protena 4.2(4%) e de espectrinas (4%). Estes resultados estoassim de acordo com estudos previamenterealizados.

Palavras-chave: Esferocitose Hereditria, anemia hemoltica, protenas damembrana do eritrcito, SDS-PAGE, dfice proteico.

INTRODUOA Esferocitose Hereditria (EH) a anemia hemoltica

congnita mais comum dos Caucasianos. Resulta dealteraes quantitativas e/ou qualitativas das protenas damembrana do eritrcito. Caracteriza-se por uma anemia degravidade varivel, com ictercia intermitente, presena deesfercitos no esfregao de sangue perifrico, fragilidadeosmtica aumentada, esplenomegalia e com uma respostafavorvel esplenectomia-SPL1.

As protenas do esqueleto proteico interagem com abicamada lipdica e com as protenas transmembranaresfornecendo assim membrana do eritrcito rigidez eintegridade (Figura 1). Alteraes de determinadasprotenas da membrana como a anquirina, espectrinas,banda 3 e protena 4.2 esto na origem da diminuio daresistncia osmtica dos esfercitos. A microvesiculaodestas clulas resulta na perda de rea de superfcie semqualquer reduo substancial de volume celular. Osesfercitos perdem resistncia, elasticidade e capacidadede deformao, reduzindo a sua capacidade de atravessaros orifcios entre as clulas endoteliais, assim como asclulas que formam a parede dos cordes esplnicos e da

polpa vermelha dos seios esplnicos, verificando-se umacongesto acentuada desta ltima. A descida do pH,glicose e ATP, bem como a elevada concentrao deradicais livres produzidas pelos macrfagos adjacentesagravam a leso da membrana dos eritrcitos.

As alteraes moleculares subjacentes doena somuito heterogneas.

A anquirina a protena que promove a ligao doesqueleto proteico bicamada lipdica atravs deinteraces com a protena transmembranar banda 3. Odefeito mais comum nos indivduos com EH deve-se aalteraes nesta protena. Nos dfices de anquirina podemexistir redues secundrias de espectrinas e protena 4.2,sendo o padro de hereditariedade autossmico dominanteo mais frequente2.

A banda 3 medeia interaces dentro do esqueletomembranar via ligao com as protenas 4.2 e 4.1 e com aanquirina pelo terminal amino do domnio citoplasmtico.Indivduos com dfice de banda 3 tm redues proteicasna ordem de 20 a 40%, com dfices secundrios de protena4.2. O padro de transmisso dominante e o quadro clnico de uma anemia ligeira ou moderada. Nos portadores dedeficincia de banda 3, observam-se no esfregao desangue perifrico, alguns eritrcitos com a forma decogumelo. Estes eritrcitos so muito especficos nestesubgrupo da esferocitose hereditria e desaparecem ps-esplenectomia.

Deficincias de protena 4.2 e espectrinas so mais raras,sendo o padro de hereditariedade autossmico recessivoe dominante, respectivamente2,4.

Do ponto de vista fenotpico, a expresso da EH tambm muito heterognea, podendo variar de formasassintomticas at situaes clnicas de anemia grave,Fig. 1 - Protenas da membrana do eritrcito.

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ESFEROCITOSE HEREDITRIA - PREVALNCIA DOS DFICES PROTEICOS DA MEMBRANA DO ERITRCITO

dependentes de transfuses. Na forma tpica, os doentesapresentam uma anemia moderada desde o perodo neo-natal, esplenomegalia e referem uma histria familiar de EH.A anemia muito bem tolerada, sendo contudo perceptvelnos propsitos a ictercia conjuntival e a esplenomegalia.Na EH de expresso ligeira, o grau de anemia leve, podendoa hemlise ser totalmente compensada. Do ponto de vistalaboratorial, de referir que a bilirrubina srica e percentagemde reticulcitos normal ou ligeiramente aumentada.Geralmente, os portadores deste tipo de EH detectam-sedurante os perodos de infeco por mononucleoseinfecciosa, geralmente com aumento marcado daesplenomegalia e em situaes de infeco por parvovrus19, que leva a uma supresso da eritropoiese medular5.

Os portadores assintomticos so diagnosticados nodecorrer de estudos familiares de doentes com a forma tpicade esferocitose. Do ponto de vista laboratorial, aconcentrao de hemoglobina, bilirrubina total, epercentagem de reticulcitos, normal. Apenas afragilidade osmtica eritrocitria est aumentada, por vezesapenas aps incubao a 37C.

Os pacientes com a forma grave de EH so dependentesde transfuses e a esplenectomia s corrige a anemiaparcialmente. Est associada a dfices muito acentuadosde espectrinas, com padro de hereditariedade recessiva, enas deficincias combinadas de anquirina e espectrinas.

No presente estudo os autores analisaram a prevalnciado dfice proteico em 39 indivduos, estabelecendo umacorrelao com o fentipo clnico e determinao do padrode hereditariedade.

MATERIAL E MTODOSForam estudados 39 doentes (de idade compreendida 6

meses 77 anos; 24 pacientes do sexo masculino e 15 dosexo feminino) com E.H., pertencentes a 25 famlias do Nortede Portugal.

Na rotina hematolgica, os hemogramas foramrealizados num contador automtico para determinao dosdiversos parmetros hematolgicos e os esfregaos desangue perifrico, corados pelo mtodo de May-GrunwaldGiemsa.

O estudo da resistncia osmtica foi realizado por doismtodos: teste da fragilidade osmtica dos eritrcitos emgradiente de solues salinas (FO) e o teste de lise peloglicerol acidificado (AGLT).

As protenas da membrana do eritrcito foram extradaspor lise hipotnica segundo o mtodo de Dodge et al.6,posteriormente quantificadas pelo mtodo de Lowry et al.7.Depois de solubilizadas as protenas da membrana foramestudadas pela tcnica de electroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE), em gradiente linear 5-15%,Laemmli8, e em gradiente exponencial 3.517%, Fairbankset al.9. O perfil electrofortico das membranas coradocom Coomassie Blue, procedendo-se de seguida anliseproteica por densitometria (Image Master Elite 1D, version2.01 da Pharmacia Biotech). A anlise quantitativa dasprotenas da membrana expressa pela razo de cadaprotena relativamente banda 3.

RESULTADOSO diagnstico de EH realizado com base nos dados

clnicos e nos parmetros laboratoriais: parmetroshematolgicos, percentagem de reticulcitos, esfregao desangue perifrico, fragilidade osmtica, doseamento debilirrubinas (Quadro I) .

Quadro I - Classificao da Esferocitose Hereditria

Porm muitas vezes o diagnstico tem-se reveladobastante difcil, mesmo com a ajuda dos parmetroslaboratoriais, sendo necessrio recorrer tcnica deelectroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) paradeterminar as alteraes moleculares subjacentes doena.

Nas 25 famlias estudadas 18 possuam uma reduoprimria de anquirina, sendo que 16 tinham um padro detransmisso autossmico dominante, uma um padroautossmico recessivo e ainda uma outra em que no foipossvel identificar o tipo de transmisso. Em 5 famlias foiencontrada uma reduo primria de banda 3, todas comum padro dominante. Encontrou-se ainda uma famlia comreduo de protena 4.2, com transmisso recessiva, e umafamlia com reduo primria de espectrinas em que no foipossvel demonstrar o modo transmisso (Quadro II).

O fentipo clnico da EH muito heterogneo, podendovariar de formas assintomticas at situaes clnicas de

Fonte: Adaptado de Patrick G. Gallagher, Bernard G. Forget (15).

Portadores Esferocitose Leve Esferocitose moderada

Esferocitose moderadamente

severa

Esferocitose severa

Hemoglubina (g/dL) Normal 11 - 15 08 - 12 06 - 08 10 >10

Bilirrubina (mg/L) 0 - 10 10 - 20 20 20 - 30 30

Esfregao de sangue

Perifrico Normal

Esfercitos em nmero reduzido

Esfercitos Esfercitos Esfercitos

abundantes e poiquilocitose

Pr incubao Normal

Normal ou ligeiramente aumentada

Distintamente aumentada

Distintamente aumentada

Distintamente aumentada Pa

rm

etro

s Lab

orat

oria

is

Frag

ilida

de o

smt

ica

Ps incubao

a 37C

Ligeiramente aumentada

Distintamente aumentada

Distintamente aumentada

Distintamente aumentada

Marcadamente aumentada

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anemia grave. As alteraes moleculares subjacentes doena so tambm muito heterogneas. A correlao dasalteraes proteicas, que ocorrem na membrana doeritrcito, com o fentipo clnico em pacientes estudadospr-esplenectomia referenciado no Quadro III. Nos

Dfice proteico

Esferocitose leve (hemlise no compensada)

Esferocitose leve (hemlise

compensada) Esferocitose moderada

Anquirina 9 1 5

Banda 3 5 2 3

Protena 4.2 1 - -

Quadro III - Correlao do dfice da protena da mem-brana do eritrcito e o fentipo clnico.

Fig. 2 - Dfice de banda 3. Gel linear - Laemmli (A), Gel-exponencial -Fairbanks (B). Ctr - Controlo; 1 - Propsito (dfice de 22% de banda 3); 2,3 -filhas do propsito (dfice de 22 a 19% respectivamente); 4 - esposa dopropsito (sem alteraes das protenas da membrana).

Fig. 3 - Dfice de protena4.2 (12%). Gel linear -Laemmli (A). Prop.-Propsito; Ctr - Controlo.

Quadro IV - Prevalncia do dfice da protena da mem-brana do eritrcito nos doentes estudados ps-esplenectomia.

Tempo ps-esplenectomia Dfice proteico

> 1 ano e < 10 anos >10 anos

Anquirina 5 6

- Espectrina 1 -

pacientes com dfice de banda 3, verificou-se queapresentavam redues primrias de 11 a 25% (Figura 2).Apenas foi analisado um nico paciente com dfice deprotena 4.2 com uma reduo primria de 12% (Fig.3). Umpaciente com dfice de anquirina foi estudado numasituao de pr-esplenectomia e ps-esplenectomia (comuma reduo primria de anquirina-28% e com reduessecundrias de espectrinas-24% e protena 4.2- 5%).

Doze doentes foram analisados na situao ps-esplenectomia (Quadro IV). Nos que apresentavam dficede anquirina, a reduo desta protena variou de 16 a 50 %,com redues secundria de espectrina de 11-19% eprotena 4.2 de 4-31% (Fig.4) .

No nico paciente analisado ps esplenectomia comdfice de -espectrina o dfice encontrado foi de 11%.

DISCUSSODe forma a aprofundar mais o conhecimento sobre as

doenas de membrana do eritrcito e a sua prevalncia naregio Norte de Portugal, estudaram-se 39 indivduospertencentes a 25 famlias, com EH. Foi utilizada a tcnicade electroforese em gel de poliacrilamida para identificar asalteraes quantitativas e/ou qualitativas das protenas damembrana do eritrcito. A amostragem estudada

Fig. 4 - Dfice de anquirina. Gel linear - Laemmli (A), Gel exponencial -Fairbanks (B). Prop. - Propsito; Ctr - Controlo. Deficincia primria deanquirina (21%), secundrias de espectrinas (18%) e protena 4.2 (11%).

ELISA GRANJO et al

Dfice

proteico Banda 3 Anquirina -espectrina Protena 4.2

Modo de

transmisso Dominante Dominante Recessivo No provado No provado Recessivo

Famlias 5 16 1 1 1 1

Indivduos 10 25 1 1 1 1

Quadro II - Padro de hereditariedade na EsferocitoseHereditria

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essencialmente de adultos com fentipo clnico deEsferocitose leve que foram observados na consulta porcomplicaes da doena: crises hemolticas associadas ainfeces, clculos vesiculares e/ou renais, ou por estudofamiliar do propsito.

Neste grupo de indivduos estudados verificou-se queo dfice proteico mais comum foi de anquirina. O dfice deanquirina no entanto difcil de identificar, pela tcnica deSDS-PAGE, nos indivduos que no foramesplenectomizados, j que nesta situao normalencontrar-se uma ligeira reticulocitose que o bastantepara mascarar o dfice primrio. Nestes casos, em que odfice primrio est mascarado existem porm reduessecundrias das protenas de ligao: protena 4.2 eespectrinas, que so indcios de uma reduo primria deanquirina. A confirmao do dfice de anquirina possvel,pela mesma tcnica, nos indivduos que foramesplenectomizados. Nos doentes com dfice de anquirinae redues secundrias de protenas 4.2 e espectrinas, estasrevelaram-se mais acentuadas nos pacientes com quadroclnico de esferocitose moderada.

Foram ainda encontradas, para alm de redues deanquirina, redues de banda 3, protena 4.2 e espectrinas.A prevalncia dos dfices, assim como o modo detransmisso hereditria encontrado, esto de acordo comestudos previamente publicados.

Devido amostragem ser muito pequena em cada grupode dfice proteico, no foi possvel estabelecer umacorrelao entre a percentagem do dfice proteico e ofentipo clnico. Porm a tcnica utilizada neste estudomostrou-se muito til, como ferramenta de auxlio, em algunscasos de difcil diagnstico10.

CONCLUSOOs autores salientam que este estudo evidenciou que a

deficincia proteica mais comum nos doentes com EH noNorte de Portugal de anquirina, seguida de banda 3,protena 4.2 e -espectrina., o que est de acordo com abibliografia11-14.

AGRADECIMENTOSOs autores agradecem a Letcia Ribeiro e a Jos Barbot

a valiosa contribuio clnica e cientfica, a Helena Almeida,Sra. D. Umbelina Rebelo, Sr. Lus Relvas e Sr. Elsio Costa a

excelente colaborao tcnica, e s Sras. D. Susana Catoue D. Ana David a preparao do manuscrito.

O estudo das protenas da membrana do eritrcito fo-ram realizados no laboratrio da Unidade de HematologiaMolecular do Centro Hospitalar de Coimbra.

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