UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUAFACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

EVALUACIN DE LA ADICION DE SO2 SOBRE EL CONTENIDO DE OCRATOXINA EN ELABORACION DE VINO TINTO.

PERFIL DE TESIS:Previo a la obtencin de ttulo de :INGENIERO AGROINDUSTRIAL.PRESENTADO POR:KATYA PILAR CALIZAYA MIRANDAMOQUEGUA-PERU2014

CONTENIDOI.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.6II.ANTECEDENTES.8III.JUSTIFICACIN.9IV.MARCO TEORICO.104.1.Vino.104.2.Micotoxinas.104.3.Ocratoxina A.114.3.1.Propiedades fisicoqumicas de Ocratoxina A.114.3.2.Efecto de la contaminacin por Ocratoxina A.124.3.2.1.Intoxicacin aguda.4.3.2.1.1.Intoxicacin subcrnica.124.3.2.1.2.Nefrotoxicidad.Error! Marcador no definido.4.3.2.1.3.Neurotoxicidad.124.3.2.1.4.Carcinogenicidad.134.3.2.1.5.Genotoxicidad.134.3.2.1.6.Inmunotoxicidad.134.3.3.Especies productoras de OTA en vino.144.3.3.1.Aspergillus carbonarius.144.3.4.Factores involucrados en la presencia de OTA en vinos y uvas.144.3.4.1.Rotura de la piel de la uva: los principales hongos productores de OTA,154.3.4.2.Perodo de maduracin de la uva.164.3.4.3.Proceso de elaboracin del vino.164.3.4.4.Zona geogrfica.164.3.5.Lmite mximo tolerable.17Fuente: (Reglamento de la Unin Europea N 105/2006184.3.6.Abatimiento de la ocratoxina A.184.3.6.1.Sulfitado de vinos.18a)El anhdrido sulfuroso o dixido de azufre (SO2).184.3.7.Mtodos de anlisis de ocratoxinas.19V.OBJETIVOS.225.1.Objetivo general.225.2.Objetivo especfico.22VI.HIPTESIS.236.1.Hiptesis general.236.1.1.Hiptesis especficas.23VII.MATERIALES Y METODOLOGA.247.1.1.Lugar de ejecucin.247.2.Material experimental.247.3.Materiales y equipos.257.3.1.Equipos.257.3.2.Instrumentos de laboratorio.257.3.3.Reactivos.267.3.3.1.Reactivos para la separacin de la OTA en una columna de inmunidad.267.3.3.2.Reactivos para HPLC.277.3.3.3.Reactivos para el sulfitado.277.3.3.4.Preparar soluciones.277.3.3.5.OTA solucin madre.28VIII.METODOLOGA EXPERIMENTAL.298.2.Muestreo.298.3.Preparacin de las muestras.318.4.La purificacin por columna de inmunoafinidad.318.5.El anlisis por HPLC348.6.Cuantificacin de ocratoxina A (OTA)34IX.ANLISIS ESTADSTICO.39X.RESULTADOS.39XI.CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.40XII.BIBLIOGRAFIA.41

INDICE DE TABLAS.

Tabla 1: Lmites mximos permitidos (ug/kg) de ocratoxina A en diferentes productos de vid.17Tabla 2: Lmites mximos permitidos (ug/kg) de ocratoxina A en diferentes productos de vid.30Tabla 3: Diseo experimental de anlisis de las muestras de vino tinto37Tabla 4: nivel de ocratoxina A en vino tinto.39

INDICE DE FIGURAS.Figura 1: Estructura qumica de la ocratoxina A12Figura 2: Bayas de uva con presencia de ocratoxina A.15Figura 3: extraccin con columnas de inmunoafinidad.20

EVALUACIN DE LA ADICION DE SO2 SOBRE EL CONTENIDO DE OCRATOXINA EN LA ELABORACION DEL VINO TINTO.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.El estudio de las micotoxinas en particular la ocratoxina A, debido a su alto nivel de toxicidad, efectos nocivos, cancergenos, neurotxicos, genotxicos, y teratognicos, constituye un riesgo importante para la salud humana.Siendo la ocratoxina A un metabolito secundario producido por hongos filamentosos de los gneros Aspergillus y Penicillium que estn presentes en el suelo, en materias orgnicas y de all se expanden y se desarrollan en las uvas, motivo por el cual este ndice de contenido conlleva a repercutir en daos a la salud a las personas que consumen este producto, considerando que la regin Moquegua se encuentra dentro de las principales zonas productoras de vino del sur del Per es importante realizar controles microbiolgicos en el vino y asegurar la calidad del producto. Siendo el vino una bebida que forma parte del hbito alimenticio de la poblacin por ser considerado un alimento beneficioso para la salud demostrado por su composicin fenlica, contenido de resveratrol, que le otorgan propiedades antioxidantes, antimutagenicas y antiagregantes, sin embargo la presencia de ocratoxina afectara a todas estas propiedades y el consumo del vino constituira un riesgo para la salud del consumidor, es por ello que hay disposiciones dentro del mbito vitivincola que norman el lmite mximo permisible de ocratoxina A en vinos con el fin de garantizar la salud humana, las condiciones de produccin y comercializacin.

Por lo tanto en la investigacin nos planteamos lo siguiente:Cul es el efecto de la aplicacin de dixido de azufre (SO2) en el crecimiento de hongos de los gneros aspergillus y Penicillium causantes de la Ocratoxina A en el mosto de vino tinto?Los niveles de ocratoxina A se encuentran dentro de los lmites permisibles de las normas internacionales en el vino tinto producido por las bodegas: Zapata, Mocho, Parras y Reyes, Campano de la regin Moquegua?

ANTECEDENTES.Debido a su importancia toxicolgica la ocratoxina A, ha sido ampliamente estudiada en diferentes cultivos alimentarios, la OTA es teratgenica, genotxica y ha sido clasificada por la IARC (Agencia Internacional de Investigacin del Cncer) como posible carcingeno en humanos, perteneciente al grupo 2B (Galvis, Sanchez, Barros, & Delgadillo, 2008)El estudio realizado por Garmendia & Vero (2011) determinaron que la ocratoxina A (OTA) es una micotoxina que ha sido detectada en uvas y vinos y que es producida por Aspergillus ochraceus, Penicillium verrucosum, Aspergillus carbonarius y especies pertenecientes al agregado Aspergillus niger., Adems se optimiz la tcnica de PCR en tiempo real para la deteccin y cuantificacin de esta especie en uvas de la variedad Tannat.. Daz et al. (2009), partiendo de un 0.5 % de uvas contaminadas con Aspergillus carbonarius se obtiene un vino con niveles de OTA que superan el lmite mximo de contaminacin aceptado por la OIV. En Chile, estudios de (Alvarado, 2009) recientes han demostrado la presencia de A. carbonarius en viedos de la zona central, siendo junto con A. niger las principales especies ocratoxicognicas que contaminan la produccin de uvas del pas tal como ocurre en las dems regiones del mundo.La presencia de OTA en vino, jugos de uva y pasas se descubri a mediados de los aos 90 (Zimmerli & Dick, 1995) . Diversas metodologas analticas han sido utilizadas para la determinacin de OTA en alimentos: cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) con deteccin por fluorescencia (FLD) (Castellari et al, 2000) LC/espectrometra de masas (MS) (Reinsch et al, 2007), cromatografa en capa fina (TLC)/FLD (Dawlatana et al , 1996), electroforesis capilar (CE)/FLD (Corneli, Maragos, & Agric, 1998), CE/UV (Gonzales, Peas, Leache, & Lopez, 2001) y cromatografa de gas (GC)/MS (Soleas,& Agrid, 2001). JUSTIFICACIN.Los estudios sobre micotoxinas tienen gran transcendencia a nivel mundial, debido a los daos que stas causan a la salud de la poblacin, as como las prdidas econmicas ocasionadas por los alimentos contaminados, siendo ms de 1000 millones de toneladas al ao, la contaminacin de aquellos productos susceptibles, ocurre como resultado de las condiciones medio ambientales en el campo, as como tambin por las condiciones inadecuadas en que son realizadas las operaciones de cosecha, almacenamiento y procesamiento del producto (FAO, 2011).La produccin de vino tinto en la regin Moquegua constituye un sector relevante de la economa de la regin y el pas. Siendo adems el vino una bebida que es parte del consumo habitual de la poblacin por ende este producto debera garantizar calidad, inocuidad ya que actualmente se pretende que en los alimentos garantice un alto grado de seguridad alimentaria con la finalidad de recuperar y mantener la confianza de la ciudadana en la calidad de los alimento.Es importante evaluar los niveles de ocratoxina A en el vino tinto que se produce en la regin Moquegua debido a que la produccin vitivincola es unas de las principales actividades econmicas de la regin y es de suma importancia contar con productos de calidad, que genere competitividad en el mercado nacional, ofreciendo un producto que asegure el bienestar y la salud humana.

MARCO TEORICO.1.1. Vino.Segn (Cueva, 2001) La definicin de vino es el producto resultante de la fermentacin alcohlica total o parcial del jugo de uvas sanas y maduras, con un contenido mnimo de 8,5% (v/v) de etanol. El vino es, por tanto, una mezcla hidroalcohlica, los componentes ms abundantes son el agua, que proviene de la uva y que se encuentra entorno al 80-85%, segn el tipo de vino, y el etanol, que se encuentra normalmente en una proporcin del 9 al 20% en volumen (Fernandez , 2004).Existen factores como el proceso de vinificacin, la variedad y el mtodo de cultivo, que marcan diferencias en los atributos de un vino (Kennedy, 2008), la tipicidad de la uva (Torres et al., 2006), lo cual se expresa en el contenido de azcar, acidez, color y aroma, entre otros (Tonietto, 2007). En general, la calidad de una vendimia est determinada por la interaccin del cultivar con el suelo y el clima predominante en una regin (Ferrer et al., 2007). Por otro lado, en el vino tambin se pueden encontrar coadyuvantes tecnolgicos y aditivos de uso permitido y generalmente necesarios para su elaboracin. Entre los compuestos aadidos exgenamente a la uva o al mosto y al vino para favorecer la vinificacin, o prevenir la aparicin de microorganismos indeseables o alteraciones, se incluyen sulfitos, enzimas pectolticas y otros preparados enzimticos, y compuestos presentes en cantidades traza como metales. (Goldner, Zamora, & Calvilo, 2008)1.2. Micotoxinas.Las micotoxinas son metabolitos secundarios txicos, producidos por algunos gneros de mohos, las cuales pueden estar presentes en los alimentos, tanto si son destinados para consumo humano, o en las materias primas utilizadas para su manufactura (Adams & Moss, 2000). Las micotoxinas son sustancias que tienen estructuras qumicas muy diversas con un peso molecular relativamente bajo. Esta es la causa principal de su elevada resistencia al calor (Mossel & Moreno, 2003). 1.2.1. Ocratoxina A.La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por hongos filamentosos superiores de los gneros Aspergillus y Penicillium (principalmente A. ochraceus, P. verrucosum y A. carbonarium), que fue descubierta por Van der Merwe en 1965 (Van der Merwe, 1965).La molcula est formada por un anillo de isocumarina unido por medio de su grupo carboxilo a travs de un enlace tipo amida, con una molcula de L--fenilalanina. La OTA forma parte de una familia de compuestos con estructura similar, algunos de los cuales son producidos por las mismas especies fngicas (Xiao, 1996), el crecimiento fngico en el alimento no implica necesariamente la presencia de la micotoxina, porque su produccin est influenciada por diversos factores como la humedad, la temperatura, el pH y la composicin del alimento, entre otros, y estas condiciones influyen adems de manera diferente en cada especie productora (Moss,1996)Debido a su importancia toxicolgica, OTA ha sido ampliamente estudiada en diferentes cultivos alimentarios. La Ocratoxina A es hepatoxica, teratgenica, inmunotoxica, genotxica y ha sido clasificada por la IARC (Agencia Internacional de Investigacin del Cncer) como posible carcingeno en humanos, perteneciente al grupo 2B (Soriano, 2007).1.2.1.1. Propiedades fisicoqumicas de Ocratoxina A.Fsicamente, OTA es un slido cristalino incoloro, altamente soluble en solventes orgnicos como alcoholes, cetonas, benceno y cloroformo, levemente soluble en agua y soluble en solucin acuosa de bicarbonato de sodio. Es insoluble en teres de petrleo y en hidrocarburos saturados. Su peso molecular corresponde a 403.82 g/mol. Sus puntos de fusin son 90 y 171C) (Villarroel, 2009).Con respecto a la estabilidad, esta micotoxina es estable al calor y resistente a procesos de esterilizacin y coccin aplicados en prcticas culinarias (Sanchez., 2008). Es estable frente al tiempo. Soluciones etanlicas refrigeradas de OTA son estables por ms de un ao.

FIGURA 1: Estructura qumica de la ocratoxina AFUENTE: Antn & Lizaso (2001).

1.2.1.2. Efecto toxicolgicos por Ocratoxina A. a) Intoxicacin subcrnica.Se ha reportado que OTA es nefrotxica, teratognica, inmunotxica, genotxica en animales se ha comprobado la inmunotoxicidad de OTA en varias especies de mamferos y sus propiedades teratognicas, mielotxicas y carcinognicas han sido estudiadas en ratas y ratones. (Micotoxinas y micotoxicosis de importancia en la salud humana en Colombia , 2009)

b) Neurotoxicidad.Se ha demostrado que la OTA produce lesiones en el sistema nervioso central (Belmadani et al. 1998a, Sava et al. 2006), tambin Sava et al. (2006) mencionan la posibilidad de que un gran nmero de pequeas dosis de OTA pueden inducir parkinsonismo a edades adultas.

c) Carcinogenicidad.

Ha sido establecida la carcinogenicidad de la OTA mediante estudios a largo plazo con roedores, siendo el principal rgano afectado en cuanto a formacin de tumores, el rin y el despus el hgado (Bendele et al. 1985)Segn la Agencia Internacional para la Investigacin del Cncer, la OTA se encuentra dentro del grupo 2B por ser posible carcinognica en humanos (IARC 1993).d) Genotoxicidad.Algunos estudios han demostrado que la OTA es genotxica tanto in vitro como in vivo, a pesar de que la OTA ofrece resultados negativos en muchos de los tests para mutageneidad. En algunos trabajos realizados para observar su posible capacidad de mutacin en bacterias los resultados obtenidos han sido negativos (Hennig et al. 1991), mientras que en clulas de mamferos algunos resultados han sido positivos (Groene et al. 1996) y otros negativos (Bendele et al. 1985).

e) Inmunotoxicidad.

Son limitados las referencias acerca de los posibles efectos que tiene la OTA sobre el sistema inmunolgico. A pesar de ello, algunos estudios in vitro e in vivo sugieren que la OTA puede afectar a ambas respuestas inmunes, tanto la celular como la humoral aunque estos efectos se ponen de manifiesto cuando las cantidades de OTA ensayadas son muy altas. (Adams, 2000)1.2.1.3. Especies productoras de OTA en vino.En el vino los principales productores de OTA son miembros del gnero Aspergillus seccin Nigri (A. niger, A. awamori, A. foetidus, A aculeatus, A. japonicus), especialmente A. carbonarius, aunque en pases como Francia, se ha detectado la presencia de algunas especies de Penicillium (P. expansum, P. espinulosum, P. crustosum, entre otras) en uvas, pero en menor porcentaje con respecto a Aspergillus (Araujo, 2009).a) Aspergillus carbonarius.Diversos estudios han demostrado que A. carbonarius es el principal responsable de la contaminacin de uvas y vino con OTA (Anton, 2001). Se report por primera vez la presencia de A. carbonarius en uvas podridas en la India en el ao 1956 (Villarroel, 2009) A. carbonarius presenta un alto poder de sntesis de OTA y se ha demostrado que la interaccin con otros hongos puede influenciar la produccin de micotoxina (Abarca, 2000).

b) Penicillium.

De todas las especies analizadas, el gnero "Penicillium" ha aparecido en cantidades insignificantes, menos del 3%. En las primeras etapas del ciclo de la uva, los gneros que ms abundan son "Alternaria" y "Cladosporium", y descienden su concentracin a medida que va madurando (Antn, 2001).1.2.2. Factores involucrados en la presencia de OTA en vinos y uvas.La presencia de OTA en vino, jugos de uva y pasas se descubri a mediados de los aos 90 (Zimmerli & Dick, 1995). La aparicin de OTA en el vino se debe a la presencia y difusin de los hongos productores en los viedos. Los principales factores que afectan la propagacin de los hongos son medioambientales y climticos, as como tambin las condiciones de aireacin y humectacin de la uva, el estado sanitario de las mismas y las heridas en las bayas, las cuales son los principales lugares de entrada de los hongos ocratoxignicos (Araujo, 2009).1.2.2.1. Rotura de la piel de la uva: los principales hongos productores de OTA.

A. Carbonarius y A. Niger, son saprfitos de las frutas y por lo tanto no pueden penetrar en uvas sanas. Sin embargo, ante cualquier dao en las bayas, ya sea de tipo mecnico, qumico o bien una accin por parte de microorganismos, estos hongos pueden entrar en la uva y en el interior, el pH, el alto contenido de azcar y en ocasiones, las altas temperaturas, crean un ambiente ideal para estas especies (Sez et al. 2004). Algunos factores asociados al dao en la piel de la uva son: la presencia del gusano de la uva, Lobesia botrana y las prcticas de produccin vitivincola, entre otros (Jornet et al. 2000).

Figura 2: Bayas de uva con presencia de ocratoxina A.1.2.2.2. Perodo de maduracin de la uva. La cantidad de A. Carbonarius en las bayas aumenta con el perodo de maduracin (perodo en que la uva comienza a colorearse) hasta la cosecha de la uva. La produccin de OTA aumenta con la madurez de los racimos de uva y alcanza su mximo al final de la cosecha. (Rotter et al. 1996).1.2.2.3. Proceso de elaboracin del vino. El contenido de OTA vara naturalmente durante la produccin de vino. Las concentraciones aumentan durante la maceracin por extraccin de la micotoxina desde las bayas infectadas. Debido a ello, los vinos tintos son ms susceptibles a este tipo de contaminacin que los blancos o ros. En el caso del vino blanco, la uva es prensada inmediatamente despus de ser recogida y luego se separa la piel del jugo, en cambio en vinos tintos y ros, una vez que la uva es prensada, la mezcla de zumo y piel es macerada por un periodo determinado de tiempo de acuerdo al tipo de vino a producir (vinos tintos mayor perodo de maceracin). Durante esta fase se dan condiciones aerbicas, no fermentativas, que probablemente favorecen el crecimiento fngico. (Lopez, 2003)1.2.2.4. Zona geogrfica.La OTA se presenta en todos los tipos de vino, en cada regin del mundo, en los vinos tintos es ms frecuente encontrar grandes cantidades de OTA que en los ros o blancos (Murillo, 2001). Por otro lado, algunos estudios sugieren que en regiones como Europa y frica del Norte, los vinos del sur contienen mayor cantidad de OTA que los provenientes del norte de esas zonas Las principales diferencias han sido atribuidas a factores climticos, diferencias en los cultivos, tcnicas de produccin del vino y condiciones de almacenamiento. (Ravelo, Rubio, Gutierrez, & Torre, 2011)1.2.3. Lmite mximo tolerable.Con el objetivo de garantizar la seguridad del consumidor y conseguir que no se superen los valores de ingesta diaria tolerable fijados, el reglamento de la Comisin Europea N 1881/2006 relativo al contenido mximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios y el reglamento N 105/2010 que modifica el anterior (Reglamento N 105/2006), establecen los siguientes lmites mximos (gkg-1) para la ocratoxina A en algunos alimentos.

Tabla 1: Lmites mximos permitidos (g/kg) de ocratoxina A en diferentes productos de vid.Alimento(ug/Kg)

Vino (incluidos los vinos espumosos y excluidos los vinos de licor y los vinos con un grado alcohlico mnimo de 15% vol. Y vino de frutas.2

vino aromatizado, bebidas aromatizadas a base de vino y cocteles aromatizadas de productos vitivincolas2

Zumo de uva, zumo de uva concentrado reconstituido, nctar de uva, mosto de uva y mosto de uva reconstituido, destinados al consumo humano directo.

2

Fuente: (Reglamento de la Unin Europea N 105/20061.2.4. Abatimiento de la ocratoxina A.1.2.4.1. Sulfitado de vinos.a) El anhdrido sulfuroso o dixido de azufre (SO2). Es el principal conservante utilizado durante la vinificacin para proteger a los vinos de posibles alteraciones. Su uso como conservante enolgico se conoce desde la antigedad, siendo ya utilizado en tiempos de egipcios y romanos para la desinfeccin y limpieza de bodegas (Frazier et al., 1978). Pero ha sido en las ltimas dcadas cuando se han adquirido la mayor parte de los conocimientos cientficos sobre su empleo en enologa, extendindose su uso en operaciones de pre-fermentacin durante la vinificacin.En los vinos, este compuesto tiene mltiples propiedades, entre las que se pueden destacar su capacidad antimicrobiana y antioxidante. El SO2 es un agente antisptico frente a levaduras y bacterias, presentando un mayor poder antimicrobiano frente a BAL, que frente a levaduras. El SO2 impide la oxidacin no enzimtica y enzimtica del vino mediante un consumo lento del oxgeno e inhibicin de enzimas oxidativas tales como las tirosinasas y lacasas. Adems, la unin del SO2 con el etanol y otros compuestos similares protege los aromas del vino. Por otra parte, tambin previene el pardeamiento de los vinos mediante la inactivacin de enzimas como la polifenoloxidasa, peroxidasa y proteasas, e inhibe la reaccin de Maillard (Ribrau et al., 2006).Generalmente, a las concentraciones en las que estn presentes los sulfitos en el vino no existe riesgo para el consumidor. Sin embargo, en los ltimos aos, existe una tendencia a reducir progresivamente los niveles mximos de SO2 autorizados en los mostos y vinos, debido al aumento de problemas para la salud humana, preferencias de los consumidores, posibles alteraciones organolpticas en el producto final (olores defectuosos producidos por el propio gas sulfuroso, o por su reduccin a sulfhdrico y otros mercaptanos) y a una legislacin cada vez ms estricta sobre los conservantes (Santos et al., 2012). Aunque en la actualidad, ningn compuesto conocido puede desplazar al SO2 en todas sus propiedades enolgicas, existe un gran inters por la bsqueda de otros conservantes inocuos para la salud que puedan sustituir o al menos complementar la accin del SO2, permitiendo la reduccin de su nivel en los vinos ( Ruiz et al.,2008)1.2.5. Mtodos de anlisis de ocratoxinas.1.2.5.1. Tcnicas de extraccin y purificacin.a) Extraccin con columnas de inmunoafinidadEl procedimiento de purificacin consiste en acondicionar previamente la columna, para luego aadir el extracto objeto de anlisis. La micotoxina problema se unir a los anticuerpos monoclonales fijados en la columna de inmunoafinidad y mediante un lquido de lavado podrn eliminarse los restos de la matriz. Por ltimo, la elucin de la micotoxina por desnaturalizacin de los anticuerpos permitir continuar el anlisis. Las columnas de inmunoafinidad presentan el inconveniente de tener un alto coste, fecha de caducidad y en ocasiones la variabilidad de la reproducibilidad interlotes.Actualmente dos empresas (R-Biopharm y Vicam) comercializan columnas de inmunoafinidad ocratoxina A, tambin se ha desarrollado columnas de inmunoafinidad que permitan la extraccin y purificacin simultnea de varias micotoxinas al mismo tiempo como puede ser la OchraAflaprep para aflatoxinas y ocratoxina A.

Figura 3: extraccin con columnas de inmunoafinidad.1.2.5.2. Separacin, deteccin y cuantificacin.a) Cromatografa liquida.La primera publicacin sobre la aplicacin de la cromatografa liquida en el anlisis de micotoxinas data de 1973 (Rao Anders, 1973), desde entonces se ha aplicado cada vez ms a este cometido. Entre las ventajas ms importantes que presenta la cromatografa liquida se encuentra la posibilidad de separar sustancias termolbiles, no voltiles, polares y apolares con aceptable resolucin entre sustancias qumicamente similares, de manera rpida y reproducible. La cromatografa liquida en fase normal fue utilizada en un principio para el anlisis aflatoxinas, pero ha sido relegada por los sistemas en fase reversa (Sforza et al., 2006). La cromatografa lquida en fase reversa usa fases estacionarias hidrocarbonadas y fases mviles acuo-orgnicas; la interaccin entre las molculas del soluto y la fase estacionaria depende en principio de las fuerzas de dispersin (interacciones hidrfobas no especficas) separndose los compuestos segn su hidrofobicidad, los componentes ms polares eluyen primero. Las fases estacionarias apolares se preparan uniendo grupos octilo (C8), octadecil (C18) o cadenas cortas de grupos fenilo, cianopropilo y n-alquilo a la superficie del slice a travs de los grupos silanoles (SiOH).La retencin de las sustancias est controlada principalmente por la fase mvil, jugando en segundo plano la fase estacionaria; el ptimo en la selectividad se alcanza combinando correctamente los componentes de la fase mvil (Egmond et al., 1986). Los solventes orgnicos ms empleados son el metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano en diferentes combinaciones con agua destilada. La elucin isocrtica es til cuando se estudian compuestos de estructura qumica y polaridad similar, mientras que la elucin en gradientes es preferible en la separacin de muestras que contienen micotoxinas de diferente polaridad. Las muestras con compuestos ionizables se pueden analizar aadiendo aditivos a la fase mvil de forma que podamos servirnos de dos tcnicas: la supresin inica y el par inico, empleando el contrain adecuado. Aadiendo a la fase mvil cido actico, cido fosfrico, cido trifluoroactico (TFA, trifluoroacetic acid), trietilamina (TEA, triethylamine), o soluciones tampn (fosfato, acetato, borato, etc.), se puede controlar el pH de forma que se suprima la posible ionizacin de las molculas de la muestra e incluso la de los grupos del relleno de la columna. O bien se puede formar un par inico empleando el contrain adecuado de signo opuesto a la sustancia problema, el complejo resultante al no poseer carga elctrica y ser voluminoso interaccionar ms fcilmente con la fase estacionaria apolar. Se suelen utilizar alquilsulfonatos (heptanosulfonatosdico) para la separacin de basesprotonadas y bases de amonio cuaternario (hidrxido de tetrabutilamonio) para grupos carboxilo u otros aniones. Por ejemplo la moniliformina (Shepherd et al., 1986) y el cido tenuazico (Lebrun et al., 1989) han sido analizados usando la cromatografa de par inico.El acoplamiento cromatografa lquida-espectrometra de masas no es tan sencillo como en el caso de la cromatografa de gases-espectrometra de masas debido a que la transferencia de analitos debe realizarse desde una fase lquida en lugar de una fase gaseosa. En la prctica, las interfases ms difundidas son la termonebulizacin (TSP, Thermospray) que nebuliza utilizando calor, la electronebulizacin (ES, Electrospray) aplica un campo elctrico en el extremo de un capilar, y la APCI, donde la nebulizacin se consigue con ayuda de una corriente de nitrgeno a alta velocidad. Otra tcnica menos extendida es el haz de partculas (PB, Particle Beam), en la cual se hacen llegar las molculas neutras de la micotoxina hasta la fuente de ionizacin mediante una difusin selectiva. (Goryacheva et al., 2007; Zollner et al., 2006).

OBJETIVOS.1.3. Objetivo general. Evaluar el contenido de ocratoxina A en tres tipos de vino tinto (seco, semi seco, dulce) y el poder de abatimiento de tres antispticos sobre la Ocratoxina A.1.4. Objetivo especfico. Evaluar el contenido de ocratoxina A en tres tipos de vino tinto (seco, semi seco, dulce) a travs de los lmites permisibles de las normas de la Unin Europea, Codex Alimentarius producido por las bodegas Zapata, Parras y Reyes, El Mocho y Campano de la regin Moquegua.

Evaluar el poder de abatimiento de tres antispticos en el crecimiento de hongos del gnero Aspergillus y Penicillium causantes de la ocratoxina A en el proceso de sulfitado.

HIPTESIS.1.5. Hiptesis general. El contenido de Ocratoxina A en tres tipos de vino tinto es mayor a los estndares internacionales de calidad, la aplicacin de tres antispticos en el proceso de sulfitado disminuyen su contenido en diferente proporcin.1.5.1. Hiptesis especficas. La concentracin de Ocratoxina A presente en los diferentes tipos de vino tinto (seco, semi seco, dulce) producido por las bodegas Zapata, El Mocho, Parras, Reyes y Campano es mayor a los lmites permisibles de las normas de la Unin Europea y el Codex Alimentarius. La aplicacin de tres antispticos en el proceso de sulfitado disminuyen el crecimiento de hongos del genero Aspergillus y Penicillium causantes de la Ocratoxina A.

MATERIALES Y METODOLOGA.1.5.2. Lugar de ejecucin.La investigacin se llevara a cabo en el laboratorio de qumica de la Universidad Nacional de Moquegua, El departamento de Moquegua est situado en el sur del Per, ubicada a 1410 m.s.n.m. sus coordenadas geogrficas se sitan entre 1517 y 1723 de latitud sur. Limita por el norte con los departamentos de Arequipa y Puno; por el este con Puno y Tacna; por el sur con Tacna y por el oeste con el Ocano Pacfico y Arequipa.1.6. Material experimental.Se realizar la determinacin de la ocratoxina A en vino tinto de la regin Moquegua, se empleara 36 L de vino para la determinacin de Ocratoxina A, esta se obtiene de las Bodegas Zapata, El Mocho, Parras y Reyes, Campano Ubicadas en la Ciudad de Moquegua.Para el tratamiento de elaboracin de vino tinto a diferentes concentraciones de anhdrido sulfuroso, metabisulfito de sodio y bisulfito de potasio se requerirn 100kg de uva de la variedad negra criolla que se obtendr del fundo de Parras y Reyes.1.7. Materiales y equipos.Los equipos que se utilizaran para el estudio sern los siguientes.1.7.1. Equipos.1.7.1.1. Equipos para determinacin de ocratoxina A. Balanza analtica de capacidad de 220 g y precisin de 0.1 mg (Shimadzu AUX220). Evaporador de muestras. Balanza de dos dgitos de capacidad para 4200 g y precisin 0.01 g (Shimadzu UW4200H). Bao Mara (Memmert). Equipo de Extraccin en fase slida al vaco (Waters). Agitador de Tubos (Maxi Mix II). Bao Ultrasonido (Cole Parmer). Equipo HPLC (Agilent 1200 series). Licuadoras (Osterizer). Bomba de vaco (GE-MOT-012). Plancha Agitadora / calentadora (Cole Parmer). Cronmetro digital (Thomas Scientific). Espectrofotmetro UV-Visible (Shimadzu 2201).1.7.2. Instrumentos de laboratorio. Probetas de borosilicato de 10 mL a 1000 mL. Balones volumtricos de 5 mL a 2000 mL. Vasos de precipitacin de borosilicato de 10 mL a 1000 mL. Embudos de filtracin de vidrio. Pipetas volumtricas de 4 mL. Vasos de vidrio para licuadora de 500 mL. Tubos de ensayo de vidrio con punta cnica de 15 mL. Sistema de extraccin al vaco. Gradillas porta tubos de ensayo. Esptula de metal. Micropipeta automtica de 100 a 1000 L y de 10 a 100 L. Puntas para micropipeta automtica. Papel filtro de 12.5cm de dimetro Whatman 4 o equivalente. Membrana HV (Durapore) EM PVDF, 0.45 m de poro, 47 mm de dimetro, blanca lisa. Membrana HV (Durapore) EM PVDF, 0.22 m de poro, 25 mm de dimetro, blanca lisa. Membrana de fibra de vidrio tipo APFB. Jeringuillas de polipropileno de 10 mL y 60 mL desechables. Columnas de inmunoafinidad para purificacin de OTA (recuperacin 90%).1.7.3. Reactivos.1.7.3.1. Reactivos para la separacin de la OTA en una columna de inmunidad. Hidrogenofosfato de disodio dihidratado (Na2HPO42H2O) Dihidrogenofosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4H2O). Cloruro de sodio (NaCl). Agua purificada para laboratorio. Metanol (CH3OH).1.7.3.2. Reactivos para HPLC. Acetonitrilo de calidad HPLC (CH3CN). cido actico glacial (CH3COOH). Tolueno (C6H5CH3).1.7.3.3. Reactivos para el sulfitado. Anhdrido sulfuroso (SO2) Metabisulfito de sodio (Na2S2O5) Bisulfito de potasio (KHSO3)1.7.3.4. Preparar soluciones.a) Tampn PB (solucin de dilucin).Para la preparacin del tampn PB se disolver 60 g de Na2HPO42H2O y 8,8 g de NaH2PO4H2O en 950 ml de agua y enrasar a 1 litro con agua.

b) Tampn PBS (solucin de lavado).Para la preparacin del tampn PBS se disolver 2.85 g de Na2HPO42H2O, 0.55 g de NaH2PO4H2O y 8.7 g de NaCl en 950 ml de agua y enrasar a 1 litro con agua.c) Fase mvil de la HPLC.( agua: acetonitrilo: cido actico glacial, 99:99:2, v/v/v).Para preparar la fase mvil de la HPLC, se mezclar 990 ml de agua con 990 ml de acetonitrilo y 20 ml de cido actico glacial. Si aparecieran compuestos sin disolver, se realizara un filtrado con un filtro de 0.45 m.d) preparacin de la solucin madre OTA.Para preparar la solucin madre de OTA, se deber mezclar los disolventes (tolueno: cido actico glacial, 99:1, v/v): la proporcin de esta solucin ser de 99 partes en volumen de tolueno con una parte en volumen de cido actico glacial.1.7.3.5. OTA solucin madre.Disolver 1 mg de OTA o el mismo contenido en un bulbo, si se obtuvo la OTA en la forma de la pelcula despus de la evaporacin, en la mezcla de disolventes para obtener una solucin que contiene aproximadamente 20 a 30 g/ml de la OTA.Para determinar la concentracin exacta, registrar el espectro de absorcin entre 300 y 370 nm en un espacio de cuarzo con 1 cm de trayecto ptico, mientras que usando el disolvente mezcla de como un espacio en blanco. Identificar una mxima absorcin y calcular la concentracin de OTA (c) en g/ml mediante el uso de la siguiente ecuacin:Ecuacin 1

Dnde: = Absorcin determinada por la ola mxima ms larga (aproximadamente 333 nm). M = masa molecular OTA = 403.8 g/mol. = coeficiente de extincin de molaridad de la OTA de la mezcla de de solvante (3,12) ( =544/moles) = camino ptico (cm)

La solucin OTA estndar (2 mg / ml en tolueno: cido actico, 99:1, v / v)Diluir la solucin madre con la mezcla de disolventes para obtener una estndar.

METODOLOGA EXPERIMENTAL.1.8. Anlisis de ocratoxina A.Los anlisis de laboratorio se realizar tomando como referencia el mtodo OIV-MA-AS315-10 que corresponde a la determinacin de Ocratoxina A en vinos utilizando columnas de inmunoafinidad y Cromatografa Lquida de Alto Rendimiento (HPLC).El mtodo seleccionado est basado en la utilizacin de columnas de inmunoafinidad tecnologa que es altamente especfica, sensible, rpida en relacin a las tecnologas tradicionales de purificacin. En este mtodo la OTA es extrada de la muestra con soluciones de metanol con bicarbonato de sodio, la misma que es aplicada sobre la columna de inmunoafinidad que atrapa a la toxina, la columna es lavada para eliminar todas las interferencias, y la OTA es recuperada de la columna con una solucin metanol, la toxina recuperada es cuantificada por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), en estado adverso con deteccin fluorimtrica.1.9. Muestreo.Para lograr un muestreo representativo es importante considerar los factores que se establecen en el Reglamento C.E. N 401/2006 (E.C.D.2006): donde establece la forma adecuada del tratamiento de las muestras, el nmero de muestras que se va a tomar de las bodegas es segn la tabla N 2, donde especifica el nmero mnimo de muestras y el volumen de la muestra.

Tabla 2: Muestreo de bebidas segn la C.E. 401/2006forma de comercializacinvolumen del lote (expresado en Litros)nmero mnimo de muestras volumen de la muestra (L)

a granel (zumos de fruta, bebidas espirituosas, sidra,vino)31

botellas/envases (zumo de fruta, bebidas espirituosas) 5031

botellas/envases (zumo de fruta, bebidas espirituosas, sidra)50 a 50051

botellas/envases (zumo de fruta, bebidas espirituosas, sidra) 500101

botellas/envases de vino 5011

botellas/envases de vino50 a 50021

botellas/envases de vino 50031

Fuente: Reglamento (CE) No 401/2006 de la comisin Europea

Figura 1. Diagrama de Muestreo de vinos de diferentes bodegas

1.10. Preparacin de las muestras.Para la preparacin de las muestras se deber verter 10 ml de vino en un matraz cnico de 100 ml., Aadir 10 ml de la solucin de dilucin (tampn B), Se deber mezclar vigorosamente, y filtrar a travs de filtro de fibra de vidrio. La filtracin es necesaria para soluciones turbias o cuando hay precipitacin despus de disolver.1.11. La purificacin por columna de inmunoafinidad.Para la purificacin en la columna de inmunoafinidad se deber configurar la columna de inmunoafinidad a la bomba de vaco, y adjuntar el depsito de columnas de imnunoafinidad. Se debe de Aadir 10 ml (equivalente a 5 ml de vino) de la solucin diluida en el depsito. Poner esta solucin a travs de la columna de inmunoafinidad a un flujo de 1 gota por segundo.La columna de inmunoafinidad no debe secarse. La columna de inmunoafinidad deber lavarse con 5 ml de solucin de limpieza (Tampn PBS) y luego con 5 ml de agua a un flujo de 1 a 2 gotas por segundo.La solucin madre de OTA se deber diluir en un matraz de vidrio con 2 ml de metanol a razn de 1 gota por segundo. Se evapora el eluato a sequedad a 50 C con nitrgeno. Se disolver de nuevo inmediatamente en 250ul de la fase mvil de la HPLC y mantener a 4 C hasta que se realice el anlisis por HPLC.

Figura 4: extraccin, purificacin, y cuantificacin de la ocratoxina A

1.12. El anlisis por HPLCUsando el circuito de inyeccin, se inyectar 100l de extracto reconstituido (equivalente a 2 ml de vino) en la cromatografa.Condiciones de funcionamiento Flujo: 1 ml / min. Fase mvil: acetonitrilo: agua: cido actico glacial (99:99:2, v / v / v) Detector de fluorescencia: longitud de onda de excitacin = 333 nm Longitud de onda que emite = 460 nm Volumen de inyeccin: 100l1.13. Cuantificacin de ocratoxina A (OTA)La cuantificacin de la OTA deber calcularse midiendo el rea o la altura de los picos en el tiempo de retencin OTA y en comparacin con la calibracin curva.1.13.1. Curva de calibracin.Se preparar una curva de calibracin diaria (si el anlisis se realiza en varios das) y cada vez que las condiciones cromatogrficas lo requiera. Para ello se tendr que medir 0,5 ml de la solucin estndar de OTA a 2 mg/ ml en un matraz de vidrio y se evapora el disolvente usando nitrgeno. Se disolver de nuevo en 10 ml en la fase mvil de HPLC, que fue previamente filtrada utilizando un filtro de 0,45 m .Esto producir una OTA de 100 ng/ml de solucin .luego se preparar 5 soluciones de calibracin de HPLC en cinco matraces aforados de 5 ml. Inyectar 100 l de cada solucin en la HPLC.1.13.2. Clculos.Calcular la concentracin de OTA (COTA).En ng/ml (equivalente a g/l) mediante el uso la siguiente frmula: Ecuacin 2Dnde:Es el volumen de la ocratoxina A (en ng) en la parte alcuota de la plantilla inyectada en la columna y evaluado a partir de la curva de calibracin.F: es el factor de dilucin.V1: es el volumen de la muestra a ser analizada (10 ml)V2: el volumen de la solucin de prueba y se inyecta en la columna (100 l) V3: es el volumen de la solucin para disolver el efluente seco (250 l).

1.14. Metodologa de abatimiento de la Ocratoxina A.1.14.1. Sulfitado.Tratamiento de la materia prima.La materia prima para elaborar vino tinto ser obtenida de la produccin regional del fundo de propiedad Parras y Reyes de uva variedad negra criolla la cantidad de 100kg.Para poder evaluar el efecto del sulfitado se deber de realizar el proceso de elaboracin de vino tinto a diferentes concentraciones de anhdrido sulfuroso, metabisulfito de sodio y bisulfito de potasio las cuales se realizar el sulfitado inmediantamente despus del proceso de estrujado, tambin se evaluar en una muestra testigo sin tratamiento, de tal manera que se va a evaluar el poder de abatimiento o reduccin de la concentracin de ocratoxina A en vino tinto.

Diagrama N 2 .Proceso de sulfitado del mosto.

1.15. Diseo experimental.El diseo estadstico que se va a emplear es el de diseo de bloques completo al azar para la determinacin de ocratoxina A segn la variedad de vino y las cuatro bodegas de donde se obtendr las muestras a analizar, siendo 36 las unidades experimentales.Modelo aditivo lineal.

Ecuacin 3

Tabla 3: Diseo experimental de anlisis de las muestras de vino tintoBODEGASTIPOS DE VINO

secosemi secodulce

ZapataR1R1R1

R2R2R2

R3R3R3

El MochoR1R1R1

R2R2R2

R3R3R3

Parras y ReyesR1R1R1

R2R2R2

R3R3R3

CampanoR1R1R1

R2R2R2

R3R3R3

1.16. Diseo experimental para muestras con tratamiento de sulfitado.El diseo estadstico que se va a emplear un Diseo de Bloques al Azar para la determinacin de ocratoxina A en el mosto segn los tres tratamientos se sulfitado y se analizar una muestra testigo.

Tabla 4: Diseo experimental para evaluar el poder de abatimiento de la ocratoxina A.FUENTEADITIVOTRATAMIENTOREPETICIN

MOSTO

M1STR1R2R3

SO2T1R1R2R3

T2R1R2R3

T3R1R2R3

Na2S2O5T1R1R2R3

T2R1R2R3

T3R1R2R3

S2O5K2T1R1R2R3

T2R1R2R3

T3R1R2R3

ANLISIS ESTADSTICO.Se realizara un anlisis de varianza ANVA, si se encuentra significancia en los datos obtenidos, se proceder a realizar una prueba de comportamiento mltiple de Tukey con = 0.05.RESULTADOS.

Tabla 4: nivel de ocratoxina A en vino tinto.

FUENTES DE VARIACIONGRADOS DE LIBERTADSUMA DE CUADRADOSCUADRADOS MEDIOSVALOR F

TRAT

BLOQ

ERROR

TOTAL

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.ActividadesMeses

12345678

Revisin bibliogrficaxx

Formulacin de marco tericox

Adquisicin de materiales e insumosXx

Implementacin de laboratorioXx

Revisin de estrategia experimentalXx

Ejecucin de experimentacinXXx

Ordenamiento de resultadosXxX

Anlisis de resultadosXXx

Redaccin de informe finalXXx

BIBLIOGRAFIA.

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44

Bodega Zapata

Bodega Parras y Reyes

Vino

Bodega Campano

Bodega El Mocho

Vino seco

Vino semi seco

Vino dulce

Vino seco

Vino semi seco

Vino dulce

Vino seco

Vino semi seco

Vino dulce

Vino seco

Vino semi seco

Vino dulce

Uva

Recepcin de la uva

Despalillado- Estrujado

sulfitado

SO2:0.05,0.08,0.1g/L

S2O5K2:0.05,0.08,0.1g/L

muestreo

Raspon

Na2S2O5:0.05,0.08,0.1g/L