JOSÉ CARLOS SÁNCHEZ AGUIRRE
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA QUÍMICA FARMACÉUTICO BIOLÓGICA “Optimización de un sistema farmacéutico que comprende liposomas con Interleucina 2 en gel y redacción de la patente” TESIS EXPERIMENTAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLÓGO PRESENTA: JOSÉ CARLOS SÁNCHEZ AGUIRRE DIRECTOR: DR. BENNY WEISS STEIDER ASESOR: DR. RAMÓN SOTO VÁZQUEZ Ciudad de México, 2016
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA QUÍMICA FARMACÉUTICO BIOLÓGICA
“Optimización de un sistema farmacéutico que comprende
liposomas con Interleucina 2 en gel y redacción de la patente”
TESIS EXPERIMENTAL
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLÓGO
PRESENTA:
JOSÉ CARLOS SÁNCHEZ AGUIRRE
DIRECTOR: DR. BENNY WEISS STEIDER
ASESOR: DR. RAMÓN SOTO VÁZQUEZ
Ciudad de México, 2016
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2
“El presente trabajo experimental fue realizado en el Laboratorio de
Oncología Celular de la UMIEZ FES-Zaragoza, Campus II, UNAM; bajo la
Dirección del Dr. Benny Weiss Steider y la asesoría del Dr. Ramón Soto
Vázquez y la Dra. Ma. Teresa Corona Ortega con financiamiento del
proyecto PAPIIT IN-219315, IN-228111 y IN-214113”
3
Agradecimientos
A Dios y San Judas Tadeo, por tomarme de la mano y guiarme a lo largo de este
camino, por escucharme y atender a mis peticiones, por el apoyo brindado desde que
tengo uso de razón.
A mis Padres, quienes desde niño me han inculcado valores y amor para que sea un
hombre de bien, demostrándome que mediante el trabajo, humildad y perseverancia es
posible conseguir tus sueños. A mi padre, José Martín Sánchez Urenda, que a pesar de
que fue apartado físicamente de mi vida, siempre ha estado presente en mi mente y
corazón, apoyándome, protegiéndome y guiándome en cada paso que doy, que en el
tiempo que estuvo conmigo siempre me demostró su amor y su cariño. A mi madre,
Rosalía Aguirre Carrasco, por ser la persona a la que más amo y admiro, por todos sus
sacrificios que ha hecho para tratar de darme todo en la vida, por estar conmigo en las
buenas y en las malas, por ser mi confidente y quien con un abrazo me trasmite amor,
fuerza, valor y ánimos para salir adelante en la vida, por ser quien siempre está detrás de
mí por cualquier cosa que necesite, a pesar de ya no ser un niño. Ahora sé muy bien que
la mujer de la frase “detrás de un gran hombre hay una gran mujer”…es mi MADRE.
A mis Hermanas, Vanessa y Cinthia, por estar conmigo en todo este trayecto, dándome
su amor y apoyo, siendo el mejor regalo que Dios me dio a través de mis padres.
A mi Tía Ana y mi Tío Salvador, por su cariño y apoyo incondicional, por siempre estar
para mí y mi familia en todo momento.
A Mamá Rosy, por darme siempre esa cachetada que me trasmite cariño y ánimos para
seguir adelante.
4
A mi Tía, la Dra. Nery, por demostrarme con base al ejemplo que las metas son
alcanzables.
Al Dr. Ramón Soto Vázquez, por brindarme la oportunidad y confianza de ser participe
en este proyecto, por su apoyo incondicional, por compartirme sus conocimientos y
consejos, tanto como profesionista y como persona.
A la Dra. Ma. Teresa Corona Ortega, quien a pesar de que su nombre no se mencione
en la portada, quiero constatar que ella ha sido una asesora más de este proyecto, no
solo brindándome los recursos necesarios para la realización del proyecto, sino por estar
al pendiente de mí y apoyarme en todo momento.
Al Dr. Benny Weiss Steider, por depositarme su confianza, tiempo, apoyo y
conocimiento.
A la Dra. Rosalva Rangel Corona, por compartirme sus conocimientos y apoyarme en
cada momento.
A la Mtra. Guadalupe Gómez García y a la Mtra. Reyna Lara Martínez, por brindarme
su tiempo y conocimientos durante las lecturas en el citómetro de flujo y en el
microscopio electrónico respectivamente.
Al Dr. Miguel Ángel Antonio Ibañez Hernández, de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, por la asesoría e información para la síntesis
del espermidil-colesterol.
Al Dr. Adelfo Reyes Ramírez, por su asesoría y disposición en la síntesis del espermidil-
colesterol.
Al Q.F.B Cristian Cruz Vázquez, por compartirme sus conocimientos en los procesos de
producción realizados a lo largo del proyecto.
5
Al Sr. Chavarría Mancilla José, quien es parte fundamental para el funcionamiento de
los proyectos del laboratorio.
A mis amigos, que fueron parte importante en esta maravillosa etapa de mi vida.
Y especialmente a la UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO, por
brindarme la oportunidad de estudiar una licenciatura, por forjarme como profesionista,
pero sobre todo como ser humano.
6
Índice 1. Introducción .................................................................................................................................8
2. Marco teórico ...............................................................................................................................9
2.1. Biotecnología ........................................................................................................................9
2.1.1. La Biotecnología en México ................................................................................ 10
2.2. Nanotecnología ..................................................................................................................11
2.3. Liposomas ...........................................................................................................................12
2.3.1. Clasificación ........................................................................................................ 14
2.3.2. Uso de los liposomas en la Industria farmacéutica ............................................ 15
2.4. Desarrollo farmacéutico ....................................................................................................16
2.4.1. Preformulación .................................................................................................... 16
2.4.2. Formulación......................................................................................................... 17
2.4.3. Optimización ....................................................................................................... 17
2.4.4. Estabilidad ........................................................................................................... 18
2.5. Forma farmacéutica ...........................................................................................................19
2.5.1. Geles ................................................................................................................... 20
2.6. Cáncer .................................................................................................................................27
2.6.1 Cáncer Cérvico Uterino ........................................................................................ 28
2.6.2 Tratamiento .......................................................................................................... 29
2.6.2.1 Inmunoterapia con Interleucina-2 ..................................................................... 30
2.7. Propiedad Intelectual .........................................................................................................31
2.7.1. Actualidad de la Propiedad Intelectual en México ............................................. 32
3. Planteamiento del problema ....................................................................................................34
4. Hipótesis .....................................................................................................................................36
5. Objetivo general ........................................................................................................................37
5.1. Objetivos específicos ........................................................................................................37
6. Tipo de estudio ..........................................................................................................................38
7. Material .......................................................................................................................................39
8. Metodología ...............................................................................................................................40
8.1 Síntesis del espermidil-colesterol .....................................................................................41
8.2 Fabricación de liposomas ..................................................................................................41
8.3 Fabricación del gel ..............................................................................................................41
7
8.4 Evaluación del sistema farmacéutico. ..............................................................................42
8.4 Redacción de la patente ....................................................................................................43
9. Resultados .................................................................................................................................46
9.1 Síntesis del espermidil-colesterol. ....................................................................................46
9. 2 Evaluación de geles mediante Citometría de Flujo .......................................................46
9. 3 Evaluación de geles por Microscopia Electrónica de Transmisión ............................54
9.4 Evaluación de la actividad biológica de la IL-2 mediante ELISA ..................................56
9.4.1. Curva estándar para la cuantificación de interleucina 2 .................................... 57
9.4.2. Determinación de IL-2 en el sistema farmacéutico. ........................................... 59
10. Análisis de Resultados ...........................................................................................................61
11. Conclusiones ...........................................................................................................................64
12. Referencias ..............................................................................................................................65
8
1. Introducción
La industria farmacéutica es uno de los sectores más importantes de la economía
actual y sus descubrimientos han representado grandes avances en el tratamiento
de enfermedades crónicas y de aquellas que causan la muerte a quienes la
padecen; entre ellas, el cáncer, que además de ser difícil de diagnosticar, debido a
que frecuentemente se presenta como una enfermedad asintomática al inicio, es
complicada de tratar, ya que la mayoría de los medicamentos usados no son
específicos, lo que conlleva al empeoramiento de la salud física y emocional del
paciente, reduciendo notablemente sus posibilidades de retomar una vida sana.
Hoy en día, las alternativas farmacéuticas basadas en la Biotecnología son clave
en el desarrollo industrial debido a la aplicación de sistemas biológicos y
organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o
procesos para usos específicos; uno de ellos la encapsulación de fármacos dentro
de nanopartículas, con la finalidad de direccionar el principio activo al sitio de
acción además de reducir los efectos secundarios al disminuir su contacto con
otras células sanas.
El presente trabajo tuvo como finalidad determinar el periodo de estabilidad de un
sistema farmacéutico que comprende liposomas con interleucina 2 (IL-2) en gel y
posteriormente contribuir en la redacción de una patente que contenga la
información suficiente para sustentar y proteger la invención.
9
2. Marco teórico
2.1. Biotecnología
La Biotecnología es sin duda una de las áreas tecnológicas clave en el desarrollo
industrial contemporáneo. J. Coombs expresa que por biotecnología debe
entenderse la “...Aplicación de organismos, sistemas biológicos o procesos
biológicos a las industrias de manufacturación de servicios. Esta definición puede
extenderse e incluir cualquier proceso en el que se utilicen organismos, tejidos,
células, orgánulos o enzimas aislados para convertir materias primas de tipo
biológico en productos de mayor valor, así como el diseño y uso de reactores,
fermentadores, procesos de purificación, equipos de control y análisis asociados a
procesos de producción biológica. Ciertos aspectos de la ingeniería genética y
bioingeniería también se incluyen, dentro del término de biotecnología, así como
también algunos aspectos de la agricultura, horticultura y silvicultura en los que se
utilizan técnicas de propagación o manipulación genética in vitro...” 1.
Es generada en diversas disciplinas, como la Biología Molecular, la Ingeniería
Genética, la Ingeniería Bioquímica, la Microbiología, la Inmunología y permite un
estudio integral en la manipulación de los sistemas biológicos como microbios,
plantas y animales, buscando hacer un uso inteligente y respetuoso de la
biodiversidad mediante el desarrollo de tecnología eficaz, que sea limpia y
competitiva, para facilitar la solución de problemas en sectores como el de salud,
agropecuario, industrial y de medio ambiente 2.
10
2.1.1. La Biotecnología en México
“En México, prácticamente toda la investigación en el campo de la Biotecnología
se desarrolla en centros e instituciones gubernamentales o dependientes de las
universidades. Muy poca investigación y desarrollo tecnológico se lleva a cabo en
empresas” 2.
A continuación, se resume por sectores la aplicación de la Biotecnología en
nuestro país:
Sector agrícola: Las investigaciones se encuentran orientadas a generar
plantas resistentes a cambios climáticos drásticos y herbicidas que permitan
sobreproducción de elementos nutricionales, biopesticidas y certificación de
semillas, sustituyendo el uso de fertilizantes químicos 2.
Sector alimentario: Se desarrollan tecnologías para la producción de
alimentos o productos intermedios como enzimas, colorantes,
edulcolorantes polisacáridos 2.
Sector salud: Se realizan proyectos en áreas tales como vacunas,
métodos de diagnóstico, terapia génica, evaluación de enfermedades en
humanos utilizando animales transgénicos, producción de proteínas
recombinantes para el tratamiento de enfermedades, fármacos, trasplantes
más seguros 2.
Sector medio ambiente y control de la contaminación: En este sector se
trabaja en el tratamiento de suelos contaminados, instalación de plantas de
tratamiento y con transferencias de tecnología 2.
11
2.2. Nanotecnología
Es un concepto que indica la capacidad de trabajar en escala entre 1 y 100 nm,
para comprender, crear, caracterizar y usar estructuras, materiales y sistemas con
nuevas propiedades derivadas de su pequeño tamaño. Así, las nanopartículas se
definen como aquellas partículas tridimensionales de hasta 100 nm en cada una
de las dimensiones 3.
El desarrollo y la difusión de las nanotecnologías auguran un sustantivo impacto en
las técnicas y los procesos de producción industrial y, en consecuencia, en el
desarrollo económico y social. La velocidad con la que se difunde se advierte en la
creciente diversidad de productos que las han incorporado: desde procesadores
electrónicos hasta cosméticos, pasando por medicamentos, textiles y levas para
motores de automóviles y de aviones. Su notable avance en las principales
economías de mundo va acompañado de montos sustantivos de financiamiento
público y privado para su investigación y desarrollo. En vías de un potencial
desempeño comercial e industrial, las nanotecnologías conforman un campo que
progresa rápidamente en descubrimientos e innovaciones. El dinamismo de la
innovación en esta área se constata por un sustantivo crecimiento de las patentes
nanotecnológicas. En efecto, las nanotecnologías prometen una enorme aplicación
potencial en los ámbitos de la economía, la medicina y la protección del medio
ambiente 3.
12
2.3. Liposomas
Fueron descubiertos en 1961 por el hematólogo británico Sir Alec D. Bangham
mientras estudiaba un tipo de biomoléculas, los fosfolípidos (FL) y su relación con
la coagulación sanguínea 4. Desde entonces, se han convertido en herramientas
versátiles en Biología, Bioquímica y Medicina.
Son vesículas preparadas artificialmente, de talla nanométrica (aunque algunas
pueden alcanzar tamaños mayores) y forma aproximadamente esférica con una
fase acuosa interna rodeada por una o más bicapas lipídicas. Bangham descubrió
que los FL en agua forman inmediatamente esferas cuyas paredes se encuentran
organizadas en bicapas debido a que cada molécula tiene una terminal
hidrosoluble en tanto el otro es hidrofóbico, es decir se trata de moléculas
anfifílicas5.
Los lípidos que los constituyen pueden ser de origen natural o sintético y se
caracterizan por presentar una parte polar (cabeza) y otra parte hidrófoba (cola)
que les confieren propiedades anfifílicas. Sus características son las siguientes:
Parte polar. Puede ser no iónica o estar cargada positiva o negativamente.
Suele ser un fosfo o glicogrupo esterificado con distintos grupos, que da lugar
a diferentes lípidos polares 4.
Parte apolar. Consiste normalmente en una o dos cadenas de ácidos grasos
de 14-18 carbonos de longitud, saturados o insaturados (de 1 a 4 dobles
enlaces) 4.
13
Pueden contener también un «grupo esqueleto» que sirve de puente entre la parte
polar y la apolar. Este grupo es generalmente glicerol o esfingosina, y da lugar a los
denominados glicerolípidos y esfingolípidos. Cuando la cabeza polar está unida
directamente al ácido graso nos encontramos ante lípidos de cadena simple,
mientras que si existe una molécula esqueleto se pueden obtener lípidos tanto de
cadena simple como de doble cadena. Su estructura depende de la naturaleza
química, longitud y grado de saturación de las cadenas hidrocarbonadas presentes,
el pH y la carga iónica de la fase acuosa. Este tipo de moléculas no son solubles en
agua, sino que forman dispersiones coloidales. La parte polar o cabeza se dispone
de tal forma que encierra el compartimiento acuoso, mientras que las colas se
orientan enfrentadas entre sí, dando lugar a la formación de la bicapa 6.
Los fosfolípidos son los lípidos más comúnmente utilizados en la elaboración de
liposomas. La variabilidad de éstos estriba en el grupo que se une al fosfato. Así,
se pueden unir aminoalcoholes (fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina),
aminoácidos (fosfatidilserina), alcoholes (fosfatidilglicerol) y azúcares
(fosfatidilinositol). Dentro de los fosfolípidos, la lecitina (fosfatidilcolina) es la más
utilizada, puesto que es fácilmente extraíble de la yema de huevo y de la semilla de
soya 6.
Las vesículas formadas por fosfolípidos son usadas como modelo para estudiar el
comportamiento de membranas biológicas, debido a que muestran similitudes
como pueden ser su estructura, composición, selectividad y permeabilidad
selectiva6.
14
Son excelentes vehículos de administración de fármacos, debido a su naturaleza
biodegradable y no tóxica. La ampliación de las aplicaciones en las que se utilizan
liposomas es debido a que son capaces de incorporar a su estructura moléculas
hidrofílicas, hidrofóbicas y también las de carácter anfifílico. Además algunas de
sus propiedades físicas como carga superficial, tamaño, permeabilidad y rigidez de
la pared, les permiten acceder con mayor facilidad a determinados tejidos, por
ejemplo tumores. Son fácilmente modulables debido a la amplia variedad de
fosfolípidos que existen. Por último, si se utilizan lípidos funcionalizados, se pueden
unir anticuerpos u otros ligandos a la superficie del liposoma, lo que les confiere la
capacidad de interactuar con las estructuras presentes en la superficie de las
células 7.
2.3.1. Clasificación
Para que los liposomas se formen es necesario que se alcance una concentración
mínima, conocida como concentración vesicular crítica (cvc). Además de este
parámetro, las disoluciones vesiculares se caracterizan por la lamelaridad
vesicular, la polidispersidad de tamaños y la micropolaridad de los diferentes
microentornos vesiculares. La clasificación de los liposomas se puede realizar en
base a tres criterios: atendiendo a sus características fisicoquímicas, tomando en
cuenta su tamaño y el número de bicapas o lamelas que conforman la pared del
liposoma, al proceso por el que han sido elaborados, ya que influye directamente
en su tamaño y complejidad y a las aplicaciones mismas de los liposomas como
consecuencia de las modificaciones que, con diferentes fines, se hayan podido
introducir en su estructura 8.
15
2.3.2. Uso de los liposomas en la Industria farmacéutica
En el sector farmacéutico los liposomas utilizados están formados principalmente
por fosfatidilcolina. Este lípido es el principal componente de la membrana celular,
por lo que los liposomas se difunden en los tejidos con mucha facilidad. Se utilizan
como vía de encapsulación de moléculas y principios activos ya sean hidrosolubles
o liposolubles, para el diagnóstico y tratamiento de una infinidad de enfermedades,
como el cáncer y ya en los últimos años en la terapia génica 9.
En la actualidad, los nuevos sistemas de liberación de fármacos incluyen la
optimización en la acción hacia los tejidos y de las formas de dosificación para
conseguir una respuesta adecuada con mínimo efecto no deseable. Además se
intenta que cubran otras necesidades como conseguir una liberación lenta de
fármacos hidrosolubles, mejorar la biodisponibilidad de medicamentos poco
solubles en disoluciones acuosas, desarrollar unos contenedores biodegradables y
controlar la liberación de medicamentos tóxicos 9.
Después de un lago periodo de investigación y esfuerzos de desarrollo, las
formulaciones de fármacos en liposomas han entrado en las clínicas para tratar
cáncer e infecciones fúngicas sistémicas y locales, principalmente porque son
biológicamente inertes y biocompatibles y prácticamente no causan reacciones
toxicas o antigénicas no deseadas al presentar una estructura similar a la celular
debido a que se fusionan con las membranas celulares 9.
16
2.4. Desarrollo farmacéutico
El objetivo del desarrollo farmacéutico es el diseño de un protocolo de calidad y su
proceso de fabricación para lograr una respuesta terapéutica previsible a una
sustancia activa que forma parte de una formulación y que pueda fabricarse a gran
escala con una calidad reproducible en la cual han de cumplirse múltiples
condiciones como la estabilidad química y física.
Las etapas de desarrollo farmacéutico son:
Revisión bibliográfica/Planeación.
Preformulación.
Formulación.
Optimización.
Escalamiento.
Estabilidad 10-12.
2.4.1. Preformulación
Puede describirse como el proceso de investigación y desarrollo de una sustancia
activa, a través de la determinación y/o caracterización de las propiedades físicas
y químicas fundamentales, tanto en sólido como en solución, consideradas
importantes en la formulación de una forma de dosificación estable, eficaz y
segura, además durante esta caracterización es posible conocer las interacciones
con los diversos componentes destinados a ser utilizados en el producto final. Es
decir, las pruebas de preformulación abarcan todos los estudios sobre la
17
composición de una sustancia activa con el fin de obtener información útil para la
posterior formulación de una forma de dosificación biofarmacéuticamente estable.
La preformulación está conformada por distintas etapas:
a) Caracterización de la sustancia activa.
b) Estabilidad intrínseca.
c) Compatibilidad sustancia activa-excipiente 11-14.
2.4.2. Formulación
Durante esta etapa se describe el tipo de forma de dosificación seleccionada y la
formulación propuesta.
Al formular un producto se debe tener en cuenta:
Evaluar la viabilidad del proyecto en términos comerciales y técnicos.
Evitar el desperdicio de recursos valioso en el desarrollo de un producto
que no es necesario o deseado.
Consideraciones comerciales y de marketing.
Consideraciones de propiedad intelectual.
Consideraciones ambientales y de salud.
Evaluación de la seguridad 10-12, 15.
2.4.3. Optimización
La optimización definirá e investigará los parámetros críticos del proceso, variando
éstos dentro de las limitaciones prácticas en las cuales puede ser fabricado un
18
producto, es decir, identificará todos los parámetros que podrían afectar a la
calidad y/o rendimiento del producto. Los parámetros críticos pueden incluir:
Definición de la orden de adición de la sustancia activa y excipiente.
Definición de la configuración óptima de los equipos.
Optimización del tiempo según los parámetros del proceso.
Definir el rango de temperatura óptimo.
Desarrollo de procedimientos de limpieza para el proceso 11.
2.4.4. Estabilidad
Hoy en día, el estudio y la determinación de la estabilidad de los medicamentos se
han convertido en una necesidad de la industria farmacéutica moderna, a fin de
poder asegurar la identidad, efectividad, potencia, inocuidad y pureza de los
productos hasta el momento de su uso.
El objetivo de los estudios de estabilidad es proporcionar evidencia de cómo la
calidad de un fármaco o medicamento varía con el tiempo bajo la influencia de
factores ambientales como: temperatura, humedad o luz. Los estudios de
estabilidad permiten establecer las condiciones de almacenamiento, periodos de
reanálisis y vida útil 16.
2.4.4.1. Criopreservación
Es una serie de técnicas que tienen como objetivo el mantenimiento de la
viabilidad y funcionabilidad celular a temperaturas bajas. Algunas sustancias con
capacidad de actuar como criopreservadores son: azúcares (sacarosa, trehalosa),
19
polioles (manitol, sorbitol, inositol), algunas sales, aminoácidos (glutamato) y
sustancias proteicas (peptona, leche descremada).
La refrigeración y congelación son las principales técnicas de conservación,
consiste en la aplicación de bajas temperaturas, lo cual inhibe el crecimiento de
microorganismos y reduce la velocidad de las reacciones químicas. Ambos
métodos hacen posible alargar la vida de anaquel, con la diferencia de que la
refrigeración permite una preservación a mediano plazo, mientras que la
congelación conserva los productos a largo plazo. La desventaja que presenta la
congelación es la expansión de agua que genera la formación de cristales de hielo
y la estructura celular tiende a destruirse; al igual que en los acarreadores de
fármacos como los liposomas, debido a que presentan una bicapa lipídica en su
estructura, asemejando su comportamiento al celular en el proceso de
congelación, provocando su ruptura y la liberación del fármaco de forma no
deseada, por lo que se recomienda un sistema de congelación rápido, que a
diferencia del lento donde se generan cristales de hielo grandes, genera cristales
pequeños y el daño en la estructura celular es menor 17.
2.5. Forma farmacéutica
Es la mezcla de uno o más fármacos con o sin aditivos, que permita su
administración 16. Éstas se pueden clasificar atendiendo a diferentes criterios, las
más comunes son: vía de administración (enteral y parenteral) y estado físico
(líquido, sólido, semisólido).
20
2.5.1. Geles
Preparación semisólida, que contiene el o los fármacos y aditivos, constituido por
lo general por macromoléculas dispersas en un líquido que puede ser agua,
alcohol o aceite, forman una red que atrapa al líquido y Ie restringe su movimiento,
por lo tanto son preparaciones viscosas.
Vía de administración: bucal, oral, tópica, cutánea 18.
2.5.1.1. Usos de los geles
Son utilizados con más frecuencia en tratamientos farmacéuticos y cosméticos por
varias propiedades importantes, como su estado semisólido, su grado de claridad,
facilidad de aplicación, remoción y uso. Pueden ser usados debido a que:
Sirven como vehículos para fármacos de aplicación tópica, como
emolientes, vendajes oclusivos o como protección y para la aplicación
sobre las membranas mucosas.
Se utilizan como matrices para preparaciones de liberación prolongada.
Son lubricantes para catéteres, bases para pruebas con parches
cutáneos o geles de cloruro de sodio para electrocardiografía.
Su uso como cosmético incluyen geles para baño, para después de
afeitar y pantallas solares 13, 19.
2.5.1.2. Clasificación
A. De acuerdo a su comportamiento frente al agua Geles hidrófilos o hidrogeles
21
Las bases generalmente consisten en agua, glicerol o propilenglicol,
gelificados con agentes como tragacanto, almidón, derivados de la
celulosa, polímeros de carboxivinilo y silicatos de magnesio y
aluminio 19.
Geles hidrófobos, lipogeles u oleogeles
Las bases generalmente consisten en parafina líquida con
polietileno, aceites grasos gelificados con sílice coloidal, jabones de
aluminio o zinc 19.
B. En función del origen y/o naturaleza de los polímeros.
Tabla 1. Origen de los polímeros 20, 21.
Polímeros Ejemplos
Polímeros naturales Alginatos, carragenina, tragacanto,
goma xantana
Polímeros naturales modificados Metil, etil y carboximetilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa
Polímeros o copolímeros vinílicos Alcoholes polivinílicos,
polivinilpirrolidona (PVP),
polivinilmetil éter
Polímeros carboxivinílicos Carbómero
Polímeros acrílicos- acrilamidas Ácido carboxipoliacrílico, acrilato de
metilo, acrilato de etilo, metacrilato de
metilo
22
C. Número de fases.
Geles monofásicos.
Consisten en macromoléculas orgánicas distribuidas de modo
uniforme a través de un líquido de manera que no existan límites
aparentes entre las macromoléculas dispersas y el líquido. Pueden
obtenerse de macromoléculas sintéticas o de gomas naturales, estas
últimas se llaman también mucílagos. Si bien los geles generalmente
son acuosos, pueden utilizarse alcoholes o aceites como fase
continua 19.
Geles bifásicos.
Cuando la masa del gel consiste en una red de partículas pequeñas
separadas, se clasifica como sistema bifásico. Su comportamiento es
tixotrópico porque forman semisólidos en reposo y se tornan líquidos
después de agitar la preparación. Estas preparaciones deben
agitarse antes de usarse para garantizar su homogeneidad 19.
D. Geles de emulsión.
Pueden ser producidos por la combinación de aceite, agua y ciertos
emulsificantes. Estas combinaciones dan como resultado la formación de
microemulsiones, estas sirven para formar geles de emulsión.
En un gel de emulsión, la fase continua tiene una fracción volumétrica
pequeña, y consiste en una red de películas líquidas finas que separan la
fase dispersa, cuyas gotas están deformadas y desarrollan una descripción
geométrica de células poliédricas 21, 22.
23
Geles hidrófobos con emulsionantes.
La capacidad de absorción de los geles hidrófobos puede elevarse
apreciablemente por la adición de los emulsionantes adecuados. Los
geles hidrófobos secos que contienen emulsionantes con los cuales
forman con agua sistemas de emulsión W/O, son indicados también
como bases de absorción.
Como emulsionantes se utilizan en la mayor parte de los casos los
alcoholes de lanolina 22.
Geles hidrófilos con emulsionantes.
Las bases de emulsión hidrófilicas permiten mediante la adición de
agua la preparación de geles de emulsión O/W. Como emulsionantes
se utilizan principalmente los estearatos 23.
E. Xerogeles.
Los geles con baja concentración de disolvente, son conocidos como
xerogeles. Estos son a menudo producidos por la evaporación del
disolvente, dejando atrás la estructura de gel. Pueden volver al estado de
gel por la introducción de un agente que hinche la matriz de gel 21, 24.
2.5.1.3. Componentes
Los principales componentes de un gel son:
Vehículo. Medio en cual se disolverá el principio activo. El agua purificada
es el disolvente más común. Sin embargo, los cosolventes pueden ser
utilizados, para mejorar la solubilidad. Ej.: agua, etanol, propilenglicol.
24
Agente gelificante. Forma la red tridimensional. Ej.:
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, carbopol, noveon.
Agente modificador de pH. Ayuda a la formación de la red tridimensional
del gel al modificar el pH. Ej.: hidróxido de sodio, trietanolamina, hidróxido
de potasio.
Amortiguador. Se pueden incluir en geles acuosos e hidroalcohólicos
para controlar el pH de la formulación. Ej.: solución amortiguadora de
fosfatos, citratos.
Conservadores. Previene la aparición de agentes microbianos. Ej.:
metilparabeno, propilparabeno, ácido benzoico.
Antioxidantes. Aumentan la estabilidad química de los agentes
terapéuticos que son propensos a la degradación oxidativa. La elección
del antioxidante se basa en la naturaleza del vehículo. Ej.: metabisulfito de
sodio, ácido ascórbico, ácido cítrico.
Edulcorantes / saborizantes. Los sabores y edulcorantes sólo se
incluyen en geles diseñados para la administración en la cavidad oral. Ej.:
sacarina sódica (edulcorante), cítricos (saborizante).
Colorantes. Cuando apliquen (sólo podrán usarse colorantes autorizados
por las distintas farmacopeas). Ej.: ultramarino, violeta de manganeso,
óxido de zinc 24, 25.
2.5.1.4. Ventajas y desventajas
En la Tabla 2 se describen las ventajas y desventajas de los geles.
25
Tabla 2. Ventajas y desventajas de los geles 11, 13, 19, 24.
VENTAJAS DESVENTAJAS
Aplicación externa y fácil Al ser la piel una barrera de protección,
algunas mezclas no penetran
completamente.
Fácil liberación del fármaco Los lípidos generalmente presentan
resistencia al paso de los fármacos.
Poseen la habilidad de permanecer en
la superficie de aplicación por un
tiempo determinado
Las moléculas pequeñas penetran con
mayor rapidez que las de gran tamaño
Si la base es agua, son preparaciones
lavables además de permitir la
respiración percutánea.
Materiales de alto peso molecular
presentan penetración variable
Pueden tener efecto local y/o sistémico Pueden causar irritación en el área de
aplicación
Pueden ser aplicados directo a las
mucosas, lo cual permite una mayor
rapidez de penetración a la circulación
sistémica.
A temperaturas elevadas pueden
volverse líquidos.
Los geles a menudo proveen una
liberación más rápida del activo, en
comparación con las cremas y
pomadas.
Los agentes terapéuticos que son
propensos a hidrólisis no deben ser
formulados en geles acuosos.
Pueden ser formulados para
proporcionar excelentes propiedades
de propagación y proporcionará un
efecto de enfriamiento debido a la
evaporación del disolvente.
Son susceptibles a contaminación
microbiana, sobre todo cuando están
fabricados en base hidrófila.
Dependiendo de sus constituyentes el
gel puede ser claro u opaco.
Pueden presentar sinéresis, es decir,
expulsar el disolvente.
26
2.5.1.5. Mecanismos de formación
Polímeros que dan lugar a un gel dependiendo del pH del medio.
Algunos polímeros dan lugar a soluciones ácidas de aspecto lechoso, que al
neutralizar con las bases adecuadas aumentan la viscosidad y disminuyen la
turbidez del medio. El mecanismo de formación del gel a distintos valores de
pH, se lleva a cabo cuando se disocia una pequeña proporción de grupos
carboxílicos del polímero, formando una espiral flexible, la adición de una
base provoca la disociación de grupos carboxílicos ionizándose, creando
repulsión electrostática entre las regiones cargadas, expandiéndose las
moléculas a un punto de equilibrio entre las mismas, haciendo más rígido el
sistema y por lo tanto gelificándolo. Un exceso de base puede producir una
pérdida de viscosidad al neutralizarse los grupos carboxílicos, con la
consiguiente desaparición de las cargas electrostáticas 24.
Polímeros que dan lugar a un gel por sí mismos (independiente del pH del
medio).
Aquellos que no precisan de neutralización para la formación del gel,
establecen puentes de hidrógeno entre el disolvente y los grupos carboxílicos
del polímero. De este modo, las moléculas del disolvente se orientan a lo
largo del polímero aumentado la rigidez del sistema 24.
27
2.5.1.6. Métodos de fabricación
En la fabricación de geles, generalmente, los componentes y/o excipientes
solubles en agua son inicialmente disueltos en el vehículo, en un recipiente de
mezcla con agitación mecánica. El polímero debe agregarse a la mezcla y agitar
lentamente para evitar la agregación, y se continúa la agitación hasta la disolución
del polímero. En caso de que el agente gelificante necesite ser neutralizado, se
debe permitir la desaireación antes de agregar el agente neutralizante y agitar de
manera lenta. Finalmente se agregan los conservadores y en caso de requerirlos
los colorantes y saborizantes.
Los geles obtenidos varían su viscosidad según el polímero presente, la técnica y
el tiempo empleado en su agitación13, 24.
2.6. Cáncer
Es un término que se usa para enfermedades en las que células anormales se
dividen sin control y pueden invadir otros tejidos. Las células cancerosas pueden
diseminarse a otras partes del cuerpo por el sistema sanguíneo y por el sistema
linfático 25.
Se clasifican en varios grupos dependiendo del tipo de células desde las que se
desarrollan 26.
Carcinomas. Son los más comunes (80%). Se originan a partir de las
células epiteliales que recubren las superficies del organismo. Dentro de
ellos se distinguen:
28
Adenocarcinomas. Surgen en el tejido glandular (mama y próstata).
Carcinoma de células escamosas o epidermoide. Se producen en
células no glandulares (esófago, cuello de útero, etc.)
Carcinoma de células basales. Se origina en la capa más profunda
de la epidermis.
Melanoma. Procede de los melanocitos (células que producen la
coloración de la piel).
Leucemias. Surgen a partir de los leucocitos, encargados de la defensa
ante infecciones. Según las células afectadas se clasifican en mieloides o
linfoides.
Sarcomas. Se originan en el tejido conectivo: cartílago, grasa, músculo,
hueso y vasos sanguíneos (condrosarcoma, liposarcoma, miosarcoma,
osteosarcoma y angiosarcoma, respectivamente).
2.6.1 Cáncer Cérvico Uterino
Entre los principales tipos de cáncer en mujeres se encuentran el de seno, colon
y recto, pulmones y bronquios, cuello uterino, estómago e hígado 27.
El cáncer cérvico uterino consiste en una enfermedad en la cual se encuentran
células cancerosas (malignas) en los tejidos del cuello uterino. Se caracteriza
porque crece lentamente y puede no tener síntomas; sin embargo, puede
diagnosticarse con un frotis llamado Papanicolaou. La aparición del este cáncer
se asocia en más del 90% de los casos con una infección causada por el virus
del papiloma humano (VPH) 28, 29, 30.
29
Es la primera causa de muerte por cáncer maligno en mujeres de 25 a 64 años de
edad y el tercero en mortalidad relacionada con los tumores malignos en la
población en general 31.
2.6.2 Tratamiento
La selección del tratamiento, depende de la etapa en que se encuentra el cáncer,
es decir, sí está sólo en el cuello uterino o si se ha diseminado a otras partes del
organismo y del estado de salud en general de la paciente.32
Puede ser farmacológico (con medicamentos), conservador (es aquel en el que se
extrae o destruye solo el tejido lesionado manteniendo el resto del órgano, de tal
forma que después cicatriza y recupera su forma y función normal, por ejemplo la
cirugía) o bien oncológico: Radioterapia (radiaciones de alta energía para eliminar
las células cancerosas) y Quimioterapia (medicamentos especiales para eliminar
las células cancerosas).32
Debido a la destrucción indiscriminada de células normales, la toxicidad de los
agentes quimioterapéuticos, así como al desarrollo de células tumorales
resistentes a múltiples drogas, se han desarrollado investigaciones para encontrar
tratamientos novedosos que se dirijan a las células tumorales basados en el
conocimiento de su biología molecular, que sean dirigidos específicamente a las
células tumorales para bloquear las vías de transducción de proteínas específicas
y producir su muerte por apoptosis, minimizando los efectos adversos indeseables
en las células sanas.32
30
2.6.2.1 Inmunoterapia con Interleucina-2
En el tratamiento del cáncer en estadios avanzados, se ha empleado la IL-2 sola o
en combinación para inducir la respuesta citotóxica anti-tumoral con resultados
alentadores 33-35. Sin embargo, su administración en altas dosis, vía sistémica,
perturba vías de regulación hematopoyética y puede generar una serie de efectos
secundarios adversos, como son: síndrome de goteo-capilar, fiebre, dolor de
cabeza, hipotensión, disfunciones respiratorias, renales y hepáticas 36, 37, 38, por lo
que se ha limitado su uso en la clínica y se buscan otras formas de administración
sin disminuir su actividad. Con el propósito de administrar altas dosis de IL-2 vía
sistémica, se ha utilizado a los liposomas como una alternativa. Actualmente
sirven como medio de transporte de diferentes medicamentos y citocinas, ya que
además de proteger el contenido permite dirigirlos a un tipo celular en particular
dependiendo de la composición lipídica y de su carga eléctrica 39-43.
La IL-2 es una glucoproteína de 133 aminoácidos, contiene 3 residuos cisteínicos
en las posiciones 58, 105 y 125, que forman enlaces disulfuro que son esenciales
para la actividad de la molécula. Las células que principalmente secretan IL-2 son
linfocitos T, CD4+, CD8+, y los macrófagos. La IL-2 activa la proliferación de
linfocitos T, células asesinas naturales (NK) y de los linfocitos B, promoviendo la
progresión desde la fase G1 del ciclo celular, lo que permite un incremento en el
número de estas células.31 Además que IL-2 también influye en la síntesis de
otras moléculas como el interferón ɣ y el factor de necrosis tumoral (TNF).32
31
2.7. Propiedad Intelectual
A lo largo del tiempo, la inteligencia del hombre ha dado lugar a varios tipos de
creaciones, los cuales se protegen de diversas formas con diferentes fines que el
titular tenga libertad de usar su creación como desee, para que tenga
reconocimiento y remuneración, entre otros 44.
Los derechos que posee el creador pueden ser objeto de cesión o bien de una
licencia a terceros, todo esto siempre y cuando no infrinja la ley.
La propiedad Intelectual deriva en dos ramas principales, la propiedad industrial y
el derecho de autor. Dentro de la propiedad Industrial se encuentra la protección a
través de patentes, la cual es una de las formas más antiguas de protección de la
propiedad intelectual, es aquella que protege tanto a las nuevas creaciones como
a las ya existentes, puede definirse como una nueva solución a un problema
técnico 44.
Las características que debe presentar una invención para que se le pueda
otorgar protección mediante patente son:
Ser nueva o novedosa.
Implicar un elemento inventivo.
Tener una aplicación industrial 44.
En las patentes no es necesario que la invención se encarne físicamente, no
obstante, existen cosas que no pueden ser patentadas.
32
Dado que los documentos de patente pueden ser títulos legales de propiedad,
aportan una valiosa información sobre las empresas que tienen la tecnología,
sobre los inventores, sobre la duración de la titularidad y la libre disponibilidad de
una tecnología cuando la patente haya caducado, entre otros 44.
El tiempo de protección por medio del sistema de patentes es de 20 años a partir
de la fecha de solicitud de patente, esta protección no es mundial, el inventor debe
pagar las tasas de presentación y de mantenimiento a todos los países en los que
desee que se proteja su invención.45
Cuando alguien quiere invertir en el desarrollo de una invención es necesario que
haga una investigación previa para corroborar que nadie más lo haya pensado
antes y tenga los derechos. Para esto es necesario realizar el estudio del estado
de la técnica o estado del arte, el cual comprende todo lo que se ha puesto a
disposición del público en cualquier lugar del mundo, mediante una publicación en
forma tangible, la venta o comercialización, el uso o cualquier otro medio, antes de
la fecha de presentación de una solicitud de patente o de la reivindicación de la
prioridad de un derecho 46.
2.7.1. Actualidad de la Propiedad Intelectual en México
El número de patentes solicitadas por los residentes de un país a la institución
oficial, en nuestro caso el Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial (IMPI), que
controla los derechos de propiedad industrial, constituye un reflejo de la
producción tecnológica, ya que mediante las patentes se evidencia gran parte de
33
los avances tecnológicos sujetos de explotación comercial, obtenidos por los
países a través del tiempo 47.
Las cifras que para México existen en materia de patentes, presentan indicadores
que demuestran que no han sido suficientes los niveles del gasto en IDE y los
recursos dedicados al desarrollo experimental, específicamente aquellos del
sector productivo, ya que la tendencia del número de solicitudes de patentes de
residentes ha disminuido considerablemente durante los últimos años 47.
En 2007 se registraron en nuestro país 16,599 solicitudes de residentes, de las
cuales se otorgó registro a 9,957. En ese mismo año las solicitudes y concesiones
de patentes de mexicanos fueron de 641 y 199 respectivamente (IMPI, 2008).
Las cantidades absolutas de patentes solicitadas son una buena referencia para
conocer la estructura de concreción del conocimiento científico y tecnológico, pero
también pueden usarse otros indicadores que contextualicen más la información;
lo anterior se logra al interrelacionar la información sobre patentes, como por
ejemplo, el número de habitantes, con lo cual generamos el indicador de Ciencia y
Tecnología (CyT) denominado coeficiente de inventiva (número de solicitudes de
patentes por residentes por cada 10,000 habitantes), o bien cuando se vincula el
número de patentes solicitadas en un país por extranjeros o no residentes, con la
cantidad de patentes solicitadas por residentes, con lo que se calcula la tasa de
dependencia tecnológica (CONACyT, 2007) 47.
34
3. Planteamiento del problema
La Biotecnología es el alcance más importante de las ciencias biológicas de este
siglo, ya que hace posible el estudio y la manipulación de los organismos vivos a
nivel celular y molecular, mediante toda aplicación tecnológica que utilice sistemas
biológicos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o
procesos para usos específicos. Entre algunas de sus aplicaciones en el campo
de la industria farmacéutica se encuentra la de aumentar la especificidad y la
eficacia de un principio activo y a su vez disminuir los efectos adversos que pueda
propiciar en el organismo.
Un claro ejemplo del resultado de esta área tecnológica es la IL-2 recombinante,
que activa la proliferación de linfocitos T, células asesinas naturales (NK) y de los
linfocitos B, promoviendo la progresión desde la fase G1 del ciclo celular, lo que
permite un incremento en el número de estas células. De igual forma, influye en la
síntesis de otras moléculas como el interferón ɣ y el factor de necrosis tumoral
(TNF). Estas propiedades inmunoreguladoras han hecho que su uso clínico sea
alternativa terapéutica en los pacientes con cánceres diseminados resistentes a
otros tratamientos, entre los que se encuentran principalmente el melanoma
maligno, carcinomas renales, sin embargo, su administración en altas dosis, vía
sistémica, perturba vías de regulación hematopoyética y puede generar una serie
de efectos secundarios adversos, como son: síndrome de goteo-capilar, fiebre,
dolor de cabeza, hipotensión, disfunciones respiratorias, renales y hepáticas. Por
lo anterior se ha limitado su uso en la clínica y se buscan otras formas de
administración sin disminuir su actividad, entre ellas el uso de liposomas, que
35
sirven como medio de transporte de diferentes medicamentos y citocinas, ya que
además de proteger el contenido, permite dirigirlos a un tipo celular en particular
dependiendo de la composición lipídica y de su carga eléctrica.
El encapsulamiento de fármacos en liposomas pueden provocar que los fármacos
actúen en el órgano blanco, reduciendo la toxicidad y/o aumentando la eficacia del
fármaco, haciendo posible una mayor absorción local del mismo alterando
fuertemente su distribución y su tasa de liberación en el cuerpo, protegiéndolos
contra una posible degradación o inactivación.
Con base a lo anterior; en el presente trabajo, se realizó la optimización de un
sistema farmacéutico que comprende liposomas con interleucina 2 en diferentes
geles a base de agua miliQ y soluciones amortiguadoras, formulados con distintas
concentraciones del agente gelificante y con agentes criopreservadores,
almacenados a diferentes temperaturas de congelación, a fin de determinar los
componentes de la formulación y la, o en su caso, las temperaturas en las cuales
se mantiene estable. Estos resultados aportarán evidencias para la futura
presentación de un medicamento efectivo, potente, inocuo y puro y además
apoyarán con ejemplos la redacción de la solicitud de patente respectiva.
Por otro lado, si la patente de este proceso de optimización es concedida, además
de evidenciar el avance tecnológico logrado puede ayudar a extender el período
de protección para el sistema acarreador de IL-2 que ya tiene una patente
otorgada.
36
4. Hipótesis
Sabiendo que las soluciones amortiguadoras o buffer, son sustancias capaces de
mantener la acidez o basicidad de un sistema dentro de un intervalo de pH, se
espera que alguna solución amortiguadora en comparación con el agua miliQ,
mantenga el pH óptimo de los liposomas en el gel, conservando así, su integridad
ante los cambios de pH que pueden ser ocasionados por los productos de
degradación de alguno de los componentes en la formulación. Además,
conociendo que la viscosidad de un gel es mediada principalmente por la cantidad
de agente gelificante contenida en su formulación, se espera que al preparar geles
a diferentes concentraciones de agente gelificante, se presente una mayor
estabilidad de la forma farmacéutica en el gel con mayor contenido del mismo,
dado que se espera que al presentar el gel una alta viscosidad y que los
liposomas son de un tamaño de partícula pequeño, su movimiento sea restringido,
evitando su sedimentación.
37
5. Objetivo general
Optimizar la formulación de un sistema farmacéutico que comprende liposomas
con IL-2 en gel, empleando un agente gelificante a diferentes concentraciones
formados con distintos vehículos, mediante un estudio de estabilidad a bajas
temperaturas, a fin de determinar el vehículo, la concentración de agente
gelificante y la, o las temperaturas, a la cual se mantiene estable; así como utilizar
estas evidencias para sustentar la respectiva patente.
5.1. Objetivos específicos
Sintetizar el espermidil colesterol para la formación de los liposomas.
Fabricar los sistemas farmacéuticos que comprenden liposomas con IL-2 en
gel que se someterán al estudio de estabilidad a bajas temperaturas.
Evaluar el sistema farmacéutico mediante citometría de flujo, microscopia
electrónica y ELISA para determinar la estabilidad del sistema en el
transcurso del estudio.
Realizar el estudio del estado de la técnica que sustente la patente.
Colaborar en la redacción de la patente.
38
6. Tipo de estudio Forma de recolección de información: Retrospectivo. Secuencia temporal del estudio: Longitudinal. Cantidad de poblaciones: Comparativo. Actitud del investigador: Experimental. Población de Estudio. Geles de liposomas con IL-2
Criterios de inclusión: Liposomas unilamelares que contienen IL-2 activa.
Criterios de exclusión: Muestra contaminada.
Criterios de eliminación: Fallas en el equipo.
Variables:
Independiente: Tipo de vehículo y cantidad de agente gelificante utilizado en la fabricación de los geles.
Dependiente: Cantidad, tamaño y complejidad de los liposomas, Contenido de IL-2.
39
7. Material
Material de vidrio Vasos de precipitados de 50 mL y 100 mL. Varillas de agitación. Pipeta graduada 1 mL Tubos de 13 x 100 marca Pyrex Pipetas Pasteur
Material General
Tubo cónico de 50 mL marca Eppendorff Jeringas de plástico de 10 mL. Barra magnética Puntas para micropipetas diferentes capacidades Frascos viales diferentes capacidades Placas para ELISA Sarsted Catalogo 82.1581 Gradilla
Equipo
Campana de flujo laminar. Placa de agitación y calentamiento. Bomba para vacío Ultracentrífuga Modelo Beckman INV 1272811 Rotor SW40-1, Camisas Número de Serie L92L831 Microscopio electrónico. Sonicador
Instrumentos
Balanza Analítica Denver Instruments Potenciómetro Denver Instruments UV-10, Ultra Basic. Citómetro de flujo FACSARIA 2 Becton Dickinson. Lector de ELISA ELX800
Reactivos
Espermidil Colesterol Colesteril Cloroformato Espermidina base Cloroformo Nitrógeno Noveon AA1 Trietanolamina IL-2 humana recombinante Soluciones amortiguadoras Agua miliQ
40
8. Metodología En el siguiente diagrama de flujo se sintetiza el desarrollo experimental del
presente trabajo.
Control de calidad para evaluar la estabilidad de los sistemas
farmacéuticos
Microscopía Electrónica Citometría de Flujo ELISA
Sintesis del Espermidil-colesterol
Fabricación de liposomas con Interleucina 2
Fabricación de los geles y
acondicionamiento de los liposomas
con Interleucina 2
Soluciones amortiguadoras como vehículo y de 0.125 % a 4 %
p/v de agente gelificante
- 4 °C
- 13 °C
- 19 °C
Agua MiliQ como vehiculo y de
0.125 % a 4% p/v de agente gelificante
- 4 °C
- 13 °C
- 19 °C
41
8.1 Síntesis del espermidil-colesterol
Se preparó una solución de espermidina base en exceso a 0 °C y se le adicionó
gota a gota una solución de colesteril cloroformato, se evaporó el disolvente a
sequedad a vacío y se purificó el espermidil colesterol por cristalización.
8.2 Fabricación de liposomas
Se pesó espermidil-colesterol y fosfatidilcolina y se colocaron en un tubo de
ensayo, se agregó cloroformo a la mezcla de lípidos y se agitó hasta que se
observó una solución, posteriormente el disolvente fue evaporado mediante una
corriente de nitrógeno y se agregó IL-2 en cantidad suficiente, se sonicó y
ultracentrifugó para eliminar la IL-2 no encapsulada y el sobrenadante fue retirado,
por último se resuspendió en el diluyente elegido, el cual contiene agentes
criopreservadores según la solicitud de patente mexicana con número de
expediente MX/a/2015/013539.
8.3 Fabricación del gel
Se hirvió agua miliQ y se prepararon las soluciones amortiguadoras de citrato,
acetato y fosfato. Se surtieron las materias primas (Noveón AA1 y Trietanolamina).
Se colocó la cantidad suficiente de Noveón AA-1 para obtener once
concentraciones de 0.125% a 4% p/v y se dejaron hidratar ya sea con agua miliQ
o con las soluciones amortiguadoras. Después de 24 horas se mezcló y se ajustó
el pH con trietanolamina, se adicionó la solución de liposomas y se mezcló.
Finalmente se acondicionó el gel en frascos viales de 2 mL y se etiquetaron.
42
Se almacenó cada vial a la temperatura correspondiente para llevar a cabo el
estudio de estabilidad.
8.4 Evaluación del sistema farmacéutico.
Estudio inicial, se realizó terminando la fabricación del sistema farmacéutico, es
decir, tiempo cero o prueba basal, la cual sirvió como parámetro para comparar las
propiedades de los sistemas con forme a las evaluaciones obtenidas a lo largo del
estudio.
Consistió de: microscopía electrónica, citometría de Flujo, ELISA.
Microscopía electrónica: Evaluó la morfología de los liposomas por
tinción negativa. Se colocaron 5 microlitros de una disolución del sistema
en rejillas recubiertas de Formvar. Después de cinco minutos se retiró el
sobrante con papel absorbente y se le agregó acetato de uranilo por cinco
minutos, se dejó secar y se observó al microscopio electrónico.
Citometría de flujo: Se usó para evaluar tamaño y complejidad
relativos de los liposomas que conforman el sistema. Se colocaron
disoluciones de éste en el citómetro y se determinó FSC (Tamaño), SSC
(Complejidad) y un mapa de puntos que indicó la relación entre los dos
parámetros para establecer el área donde se encontró la población inicial.
ELISA: Para determinar la cantidad de IL-2 que aún presenta actividad
biológica, se llevó a cabo un ensayo de ELISA conforme al PNO:
LOCE121012 “Procedimiento maestro para la cuantificación de IL-2
contenida en un sistema nanoacarreador”. Brevemente, se colocó en cada
pozo el anticuerpo de captura MAB-602, luego se bloqueó con una
43
solución de polivinilpirrolidona (PVP), se colocaron ya sea estándares para
la curva correspondiente o muestras del sistema íntegro o lisado con tritón
y se añadió el anticuerpo biotinilado BAF-202, estreptavidina y una
solución stock de 3,3-5,5-tetrametilbenzida. Una vez llevada a cabo la
reacción las placas se evaluaron en un lector a 450 nm.
El muestreo se realizó mensualmente y se realizaron las pruebas antes
mencionadas para evaluar su estabilidad, el muestreo finalizó cuando la cantidad
de IL-2 en cada uno de los sistemas en estudio fue menor a 60 UI/mL y menor a
75% de nanopartículas o liposomas (cantidades mínimas requeridas para logar el
efecto terapéutico deseado, especificadas en patente concedida No. 330174).
Por motivos de confidencialidad, en esta tesis solo se mostrarán los
resultados obtenidos de la evaluación inicial y del mes en que los liposomas
contenidos tanto en el gel formulado a base de agua miliQ como en el buffer
en el cual se mantuvieron más estables, aún cumplían con las
especificaciones mencionadas en la patente concedida No. 330174.
8.4 Redacción de la patente
Se realizó la búsqueda del estado de la técnica, el cual incluyó principalmente:
información técnica, investigación exhaustiva de no invasión en bases de datos
de patentes mundiales y estudio de mercado. Se redactó la patente, la cual
contiene de manera detallada la invención, destacando los puntos a
proteger, resumen de no invasión, título, autores y apoderados. Una vez más,
44
por motivos de confidencialidad no se presenta la redacción final de la solicitud de
patente que se encuentra en trámite de presentación en México y España.
45
46
9. Resultados
9.1 Síntesis del espermidil-colesterol.
Al término de la síntesis del espermidil-colestrol se evaluó su apariencia, olor y se
realizó una cromatografía en capa fina para calcular el factor de retención (Rf) de
la muestra sintetizada en comparación con un estándar de espermidil-colesterol.
𝑅𝑓 =Distancia reccorida desde el punto de aplicacíon al centro del compuesto
Distancia recorrida desde el punto de aplicación al frente del eleyente
Obteniendo así:
Rf estándar = 0.49 Rf muestra = 0.49
Los resultados obtenidos indican que se obtuvo el lípido deseado debido a que su
apariencia, olor y Rf fueron iguales al del estándar.
9. 2 Evaluación de geles mediante Citometría de Flujo
Para evaluar la cantidad, tamaño y complejidad de los liposomas presentes en los
sistemas farmacéuticos antes mencionados, se determinaron dichos parámetros
mediante Citometría de flujo. Primero se realizaron los gráficos de puntos que
relacionan el tamaño (FSC) y la complejidad (SSC) de las vesículas dentro del gel
y posteriormente los histogramas de tamaño y complejidad correspondientes a los
geles con agua a diferentes concentraciones de agente gelificante y a las distintas
temperaturas de congelación.
De los gráficos que relacionan la complejidad y tamaño relativos para las
poblaciones iniciales, se determinó el área que ocupa esa población (Figura 1A),
47
en donde la zona coloreada de color rojo (P1) representó la población en estudio y
la zona de color verde (P2) la desviación típica debida al proceso de fabricación,
para después determinar estadísticamente el porcentaje de la población que ha
cambiado en cada condición. Adicionalmente, se obtuvieron los histogramas
iniciales de tamaño y rugosidad relativa (Figura 1B y C) para después sobreponer
los de cada condición y asociar el cambio de las poblaciones de estudio en alguno
o los dos parámetros.
Los resultados indicaron que para la formación de gel, diez de las once
concentraciones usadas gelificaron en agua; sin embargo solo un tipo de solución
amortiguadora fue capaz de gelificar estas mismas concentraciones de gel; por lo
que el estudio continúo solo con agentes gelificantes disueltos en agua y la
solución amortiguadora idónea.
Posteriormente, al integrar a los geles fabricados con agua milliQ la suspensión
de liposomas, los resultados mostraron que sólo en cuatro de las concentraciones
el sistema de liposomas se mantenía íntegro y finalmente solo en una se mantuvo
hasta por tres meses conservando el 96.2% de la población inicial (Figura 2A). Los
histogramas de tamaño y rugosidad relativa (Figura 2B y C) mostraron que el
tamaño de las vesículas se mantenía constante, más no así en la complejidad,
debido a que se observó un incremento a causa de una posible aglutinación,
aunque cabe señalar que dicho aumento se mantuvo dentro del rango delimitado
en la evaluación inicial, por lo que no hubo diferencia significativa (Figura 3A y B).
En cuanto a las temperaturas utilizadas no hubo diferencias.
48
Figura 1A
Figura 1B Figura 1C
Figura 1. Figura control o tiempo cero de gel en agua (concentración ideal de agente gelificante). Se utilizo gel en agua miliQ en la mejor concentración y se muestra una de las temperaturas de congelación. A) Gráfica de puntos que relaciona tamaño y complejidad de las vesículas dentro del gel, B) Histograma del tamaño relativo de los liposomas y C) Complejidad relativa de los liposomas.
49
Figura 2A
Figura 2B Figura 2C
Figura 2. Figura evaluada al tercer mes de gel en agua (concentración ideal de agente gelificnte). Se utilizo gel en agua miliQ en la mejor concentración y se muestra una de las temperaturas de congelación. A) Gráfica de puntos que relaciona tamaño y complejidad de las vesículas dentro del gel, B) Histograma del tamaño relativo de los liposomas y C) Complejidad relativa de los liposomas.
50
Figura 3A Figura 3B
Figura 3. Figura de sobreposición de histogramas (concentración ideal de agente gelificante). Se realizó la sobreposición de histogramas de gel en agua miliQ al inicio y al tercer mes de evaluación en la mejor concentración, mostrando una de las temperaturas de congelación. A) Histograma de sobreposición del tamaño relativo de los liposomas y B) Histograma de sobreposición de la complejidad relativa de los liposomas.
De la misma forma, se realizaron los gráficos de puntos que relacionan el tamaño
(FSC) y la complejidad (SSC) de las vesículas dentro del gel y los histogramas de
tamaño y complejidad correspondientes a los geles con el buffer idóneo a
diferentes concentraciones de agente gelificante y a las distintas temperaturas de
congelación.
De los gráficos que relacionan la complejidad y tamaño relativos para las
poblaciones iniciales, se determinó el área que ocupa esa población (Figura 4A),
en donde la zona color de rosa representó la población en estudio y la zona no
delimitada la desviación típica debida al proceso de fabricación, que en este caso
reveló ser una elevada cantidad de vesículas no homogéneas, después se
determinó estadísticamente el porcentaje de la población que ha cambiado en
cada condición. De igual forma se obtuvieron los histogramas iniciales de tamaño
y rugosidad relativa (Figura 4B y C) para después sobreponer los de cada
51
condición y asociar el cambio de las poblaciones de estudio en alguno o los dos
parámetros.
Los resultados indicaron que al igual que cuando se usó agua, solo cuatro
concentraciones de gel mantuvieron a los liposomas íntegros y que sólo una de
ellas los mantuvo hasta por seis meses, conservando el 90% de la población
inicial (Figura 5A). Los histogramas de tamaño y rugosidad relativa (Figura 5B y C)
mostraron que el tamaño de las vesículas se mantenía constante, más no así en la
complejidad, debido a que se observó un incremento a causa de una posible
aglutinación que al igual que en el gel a base de agua miliQ, se mantuvo dentro
del rango delimitado en la evaluación inicial, por lo que no hubo diferencia
significativa (Figura 6A y B). En cuanto a las temperaturas utilizadas no hubo
diferencias.
Figura 4A
52
Figura 4B Figura 4C
Figura 4. Figura control o tiempo cero de gel en el buffer idóneo (concentración ideal de agente gelificante). Se utilizo gel con el buffer idóneo en la mejor concentración y se muestra una de las temperaturas de congelación. A) Gráfica de puntos que relaciona tamaño y complejidad de las vesículas dentro del gel, B) Histograma del tamaño relativo de los liposomas y C) Complejidad relativa de los liposomas.
Figura 5A
53
Figura 5B Figura 5C
Figura 5. Figura evaluada al sexto mes de gel en el buffer idóneo (concentración ideal de agente gelificante). Se utilizo el gel en el buffer idóneo en la mejor concentración y se muestra una de las temperaturas de congelación. A) Gráfica de puntos que relaciona tamaño y complejidad de las vesículas dentro del gel, B) Histograma del tamaño relativo de los liposomas y C) Complejidad relativa de los liposomas.
Figura 6A Figura 6B
Figura 6. Figura de sobreposición de histogramas (concentración ideal de agente gelificante). Se realizó la sobreposición de histogramas de gel en el buffer idóneo al inicio y al sexto mes de evaluación en la mejor concentración y mostrando una de las temperaturas de congelación. A) Histograma de sobreposición del tamaño relativo de los liposomas y B) Histograma de sobreposición de la complejidad relativa de los liposomas.
54
9. 3 Evaluación de geles por Microscopia Electrónica de Transmisión
Para evaluar la morfología e integridad de los liposomas presentes en los sistemas
farmacéuticos antes mencionados, se hizo uso de la microscopia electrónica de
transmisión.
La evaluación inicial de las vesículas que conforman el sistema mostró una forma
semicircular con circunferencia delimitada en los geles con los distintos vehículos
y a las diferentes concentraciones de agente gelificante (Figura 7 y 8) y
posteriormente durante el estudio de estabilidad las micrografías indicaron que
solo en una de las concentraciones de agente gelificante en agua miliQ y en el
buffer idóneo fueron estables, es decir, presentaron las misas características
morfológicas hasta por tres y seis meses respectivamente (Figura 9 y 10). En
cuanto a las temperaturas utilizadas no hubo diferencias.
Figura 7. Población inicial de liposomas con IL-2 en gel de agua miliQ (concentración ideal de agente gelificante). Técnica de tinción negativa, lectura por microscopía electrónica de transmisión, 80K.
55
Figura 8. Población inicial de liposomas con IL-2 en el gel con el buffer idóneo (concentración ideal de agente gelificante). Técnica de tinción negativa, lectura por microscopía electrónica de transmisión, 80K.
Figura 9. Población final de liposomas con IL-2 en gel de agua miliQ (concentración ideal de agente gelificante). Evaluación del sistema una vez transcurridos tres meses. Técnica de tinción negativa, lectura por microscopía electrónica de transmisión, 80K.
56
Figura 10. Población final de liposomas con IL-2 en gel con el buffer idóneo (concentración ideal de agente gelificante). Evaluación del sistema una vez transcurridos seis meses. Técnica de tinción negativa, lectura por microscopía electrónica de transmisión, 80K.
9.4 Evaluación de la actividad biológica de la IL-2 mediante ELISA
Una vez que se evaluó la estabilidad de los liposomas con diferentes
concentraciones de gel en agua o en el buffer idóneo, se procedió a evaluar la
presencia de IL-2 contenida y/o en la superficie de los liposomas mediante un
ensayo de ELISA validado en nuestro laboratorio. Primero se procedió a
cuantificar la concentración de IL-2 expuesta en la superficie de los liposomas,
para lo cual se usó una suspensión del sistema liposomal; después se procedió a
lisar los liposomas para evaluar la IL-2 total, es decir, la expresada en la
membrana liposomal y la encapsulada en la vesícula. Finalmente por resta de la
superficial a la total, se obtuvo la cantidad encapsulada. Para la evaluación de la
cantidad acarreada por las partículas solo se utilizó el valor de la Interleucina dos
total por lo que las diferenciales de la expuesta y la encapsulada no se muestran.
Para poder calcular la concentración de IL-2 de todas las muestras procesadas,
fue necesario construir una curva estándar, la cual se realizó con un patrón de
rhIL-2 por triplicado de acuerdo a la Guidance for Industry Bioanalytical Methods
Validation for Human Studies.
.
57
9.4.1. Curva estándar para la cuantificación de interleucina 2
Al término de la realización de la curva estándar para la cuantificación de IL-2
contenida en los sistemas farmacéuticos, se elaboró una tabla (Tabla 3) donde se
muestran las absorbancias obtenidas a 450 nm y 570 nm de las diluciones. A
continuación se restaron las absorbancias obtenidas a 570nm de las obtenidas a
450 nm, para eliminar posibles errores provocados por imperfecciones ópticas
presentes en la placa (Tabla 4) y por último se hizo la corrección del blanco (Tabla
5 ) y se graficó y calculó la ecuación de la recta (Figura 11).
Tabla 3. Lecturas de Absorbancias.
Concentración ng/mL ABS a 450 nm ABS a 570 nm 0.125 0.059 0.057 0.057 0.045 0.042 0.043 0.25 0.066 0.066 0.065 0.046 0.046 0.044 0.5 0.072 0.071 0.072 0.045 0.044 0.044 1 0.089 0.091 0.091 0.043 0.044 0.042 2 0.133 0.134 0.127 0.047 0.045 0.045 4 0.19 0.184 0.195 0.046 0.044 0.047
Tabla 4. Resta de Absorbancias (450 nm – 570 nm).
Concentración ng/mL
Corrección (ABS a 450 nm – ABS a 570 nm) Promedio S CV
0.125 0.014 0.015 0.014 0.01433 0.0005 4.02802 0.25 0.02 0.02 0.021 0.02033 0.0005 2.8394 0.5 0.027 0.027 0.028 0.02733 0.0005 2.1122 1 0.046 0.047 0.049 0.04733 0.0015 3.2271 2 0.086 0.089 0.082 0.08566 0.0035 4.0994 4 0.144 0.14 0.148 0.144 0.004 2.7777
58
Tabla 5. Corrección de Absorbancia – Blanco.
Concentración ng/mL
Corrección ABS – Blanco (0.008) Ecuación de la recta
0.125 0.006 0.007 0.006 Y=0.0337x + 0.0043 0.25 0.012 0.012 0.013 r2 =0.9939 0.5 0.019 0.019 0.02 1 0.038 0.039 0.041 2 0.078 0.081 0.074 4 0.136 0.132 0.14
Figura 11. Curva éstandar de IL-2 para la cuantificación de IL-2 contenida en los distintos sistemas
farmacéuticos en estudio. Para su realización, se prepararon diluciones de 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 y 4
ng/mL con un patrón de rhIL-2 por triplicado de acuerdo a la Guidance for Industry Bioanalytical
Methods Validation for Human Studies.
De acuerdo con la Guidance for Industry Bioanalytical Methods Validation for
Human Studies, que establece que el coeficiente de determinación para métodos
biológicos es de r2≥ 0.95, la curva estándar obtenida puede ser usada para la
determinación de la IL-2 presente en los sistemas en estudio.
y = 0,0337x + 0,0043 R² = 0,9939
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0 1 2 3 4 5
Ab
sorb
anci
a
[ng/mL]
Curva Estándar para la cuantificación de IL-2
59
9.4.2. Determinación de IL-2 en el sistema farmacéutico.
Una vez obtenida la curva estándar se procedió a cuantificar la cantidad de IL-2
contenida en los liposomas correspondientes a los geles con agua miliQ y al buffer
idóneo a la concentración ideal de agente gelificante y a las distintas temperaturas
de congelación, la cual involucra la expresada en la membrana y la encapsulada
en la vesícula. Este determinación se llevó a cabo mediante ELISA, conforme al
PNO: LOCE121012 “Procedimiento maestro para la cuantificación de IL-2
contenida en un sistema nanoacarreador”, mencionado en la sección de
metodología.
Los resultados indicaron que todas las concentraciones del gel en agua miliQ
fueron estables, sin embargo solo en una el sistema conservó la cantidad mínima
requerida de IL-2 para lograr el efecto terapéutico deseado, especificada en la
patente concedida con número de registro 330174 (60 UI/mL) hasta los 3 meses,
ya que al 4to mes realizada la evaluación, se obtuvo una concentración de IL-2
total de 52.3127 UI/mL, 48.9877 UI/mL y 46.1377 UI/mL para cada una de las
temperaturas seleccionadas en este estudio respectivamente con respecto a la
inicial, la cual fue de 79.3871 UI/mL, 76.5371 UI/mL y 78.4371 UI/mL
respectivamente, habiendo una disminución de 34.1043 %, 35.9949 % y 41.1788
% para cada temperatura.
En cuanto a los resultados obtenidos en todas las concentraciones del gel en el
buffer idóneo mostraron que fueron estables, sin embargo solo en una el sistema
conservó la cantidad mínima requerida de IL-2 para lograr el efecto terapéutico
deseado, hasta los 6 meses, ya que al 7mo mes realizada la evaluación, se
60
obtuvo una concentración de IL-2 Total de 53.2608 UI/mL, 51.3600 UI/mL y
53.2608 UI/mL para cada una de las temperaturas seleccionadas en este estudio
respectivamente con respecto a la inicial, la cual fue de 73.2096 UI/mL, 71.7840
UI/mL y 69.8832 UI/mL respectivamente, habiendo una disminución de 25.8041
%, 26.506 % y 27.2489 % para cada temperatura.
61
10. Análisis de Resultados
La síntesis del espermidil-colesterol se realizó en el laboratorio de Oncología
Celular de la UMIEZ en la FES- Zaragoza, sin embargo fue una modificación del
proceso de síntesis que lleva a cabo el Dr. Miguel Ángel Antonio Ibáñez
Hernández en la ENCB del IPN, quien orientó en la realización de la misma. El
lípido obtenido se comparó con un estándar de referencia de espermidil-
colesterol, revelándose por cromatografía, que el lípido sintetizado fue el
espermidil-colesterol, debido a que el Rf tanto del estándar como de la muestra
presentaron el mismo valor, y de igual forma, el lípido que se obtuvo exhibió
físicamente las mismas propiedades de apariencia y olor que el estándar, otra
prueba que indicó que el lípido sintetizado fue el esperado, fue la formación de
liposomas haciendo uso de éste.
La fabricación de los liposomas es llevada a cabo conforme a la patente
mexicana 330174 “Composición liposómica de IL-2 y su uso en el tratamiento
de cáncer cérvico uterino”, los autores son Rosalva Rangel Corona, María Teresa
Corona Ortega, Benny Weiss Steider, Miguel Ángel Antonio Ibáñez Hernández, e
Isabel Baeza Ramírez.
Una vez fabricados los liposomas para los distintos sistemas farmacéuticos en
estudio, se suspendieron en los geles formulados con agua miliQ y el buffer
idóneo; las evaluaciones iniciales, es decir, antes de someter las muestras a las
diferentes temperaturas para el estudio de estabilidad, en las formulaciones,
indican que se tienen liposomas semicirculares con circunferencia delimitada, de
complejidad y tamaño homogéneo. Los liposomas contenidos en los geles
62
preparados con agua miliQ presentaron mayor complejidad al ser evaluados por
citometría de flujo, lo que pudiera implicar la posibilidad de que posean mayor
cantidad de IL-2 expuesta (en la membrana liposomal), lo que se confirma en la
cuantificación inicial mediante el inmunoensayo ELISA donde se detecta
aproximadamente 15% más IL-2 en la superficie de los liposomas (datos no
mostrados).
Conforme se llevó a cabo la evaluación mensual para los sistemas en estudio, se
podía observar que cierta cantidad de los liposomas con el paso del tiempo se
aglutinaba, denotado en la sobreposición de los histogramas (del inicial con el
correspondiente a cada evaluación mensual), las micrografías apoyaban esta
detección de la aglutinación, mostrando zonas de vesículas íntegras y conformes
a la morfología inicial y zonas de aglutinación de partículas ovaladas y deformes.
Por su parte, la evaluación de la cantidad de IL-2 detectada por ELISA iba
disminuyendo probablemente por problemas de homogeneidad causadas por la
migración de los liposomas a zonas de aglutinación.
Al término de la evaluación del 4to y 7mo mes para los sistemas en estudio,
siendo Agua miliQ y el buffer idóneo respectivamente; se observó descenso en la
población en cada una de las muestras, no mayor al 15 % con respecto a la
cantidad inicial de eventos, debido probablemente a su desintegración y de igual
forma se observó aglutinación de las vesículas que no supero en algún momento a
la evaluación inicial. En cuanto a la cuantificación de IL-2, en las muestras en gel a
base de agua miliQ, se notó disminución en la cantidad de IL-2 inicial con respecto
al cantidad cuantificada al término del 4to mes, la cual fue de 34.1043 %, 35.9949
63
% y 41.1788 % para las temperaturas de -4°C, -13°C, -19°C respectivamente y
para las muestras en gel en el buffer idóneo, al 7mo mes, una disminución de IL-2
del 25.8041 %, 26.506 % y 27.2489 % para las temperaturas de -4°C, -13°C, -
19°C respectivamente. El hecho de que el buffer idóneo los mantenga estables por
más tiempo hace pensar que la regulación del pH es necesaria para mantener
tanto la integridad de las partículas como la actividad biológica de la Interleucina;
aunado a lo anterior, el gel preparado en el buffer es menos viscoso lo que puede
permitir una mejor distribución de las partículas contenidas.
Nuestros resultados indican que los sistemas farmacéuticos tienen la capacidad
de permanecer dentro de las especificaciones establecidas en la patente
concedida con número 330174 (60 Ul de IL-2/mL), durante 3 meses en el caso del
gel a base de agua miliQ y 6 meses en el gel con el buffer idóneo, ambos a la
concentración ideal de agente gelificante.
Así mismo, los resultados obtenidos mostraron que la concentración ideal de
agente gelificante en ambas formulaciones es menor al 2% y mayor a 0.25 % p/v,
dado que a concentraciones menores a 0.25% de agente gelificante se necesita
adicionar una cantidad excesiva de trietanolamina para la formación del gel, lo que
ocasiona una considerable modificación del pH, alejándolo por mucho del pH
óptimo en el cual los liposomas se mantienen viables. Por otro lado, a una
concentración mayor al 2% y al ser los liposomas nanoparticulas, pueden alojarse
dentro de la red tridimensional que conforma al gel favoreciendo su aplastamiento
y subsecuente colapso o desintegración por la alta viscosidad y el efecto de la red
tridimensional. .
64
11. Conclusiones
Se optimizó un sistema farmacéutico que comprende liposomas con IL-2 en gel
mostrando que en el buffer adecuado y en la concentración ideal de agente
gelificante mantienen una estabilidad de seis meses.
Se sintetizó con éxito espermidil-colesterol necesario para la fabricación de los
liposomas.
La presencia del buffer adecuado es necesaria para proporcionarle una mayor
estabilidad al sistema.
La concentración de agente gelificante es determinante para la estabilidad de los
liposomas y la ideal es menor al 2% p/v.
65
12. Referencias 1. Coombs J. Diccionario de Biotecnología. España: Editorial Labor, Ministerio de
Educación y Ciencia; 1989. 2. Secretaría de Educación Pública. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología,
Biotecnología Moderna para el desarrollo de México en el siglo XIX: Retos y Oportunidades, S.N.E. México: Editorial CONACYT-SEP; 2001.
3. Toledo P, Guzmán C. Las Nanotecnologías: Un paradigma tecnológico emergente. Dinámica y Especialización de la Innovación en las Nanotecnologías. Razón y Palabra. ISSN; 2008.
4. Bangham. “A correlation between surface charge and coagulant action of phospholipids. Nature. Vol. 23; 1961.
5. Bangham, “Membrane models with phospholipids”.ProgBiophysMol Biol. 1968. 6. Torello M. Viscasillas A. Del Pozo A. Unidad de tecnología Farmacéutica. Facultad
de Farmacia. Universidad de Barcelona. Vol. 21; 2002. 7. Webster T. Safety of nanoparticles from manufacturing to medical applications
[libro electrónico]. New York: Springer Science + Business Media, LLC; 2009 [Consultado: 8 de septiembre de 2014]. Available from: http://books.google.com.mx/books?id=CfGbTm6pouUC&pg=PA223&dq=liposomes+applications&hl=en&sa=X&ei=iDsJVKecIoShyASHkoKACg&ved=0CCEQ6AEwATgK#v=onepage&q=liposomes%20applications&f=false
8. Ruano A. M. Fabricación de liposomas y cápsulas poliméricas [Tesis doctoral]. Madrid: Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Químicas; 2013.
9. Pan D. Nanomedicine: A Soft Matter Perspective. Florida: Taylor & Francis Group; 2014.
10. Aulton M. Farmacia la ciencia del diseño de las formas farmacéuticas. 2ª ed. Reino Unido: Elsevier; 2004.
11. Gibson M. Pharmaceutical preformulation and formulation a practical guide form candidate drug selection to comercial dosage form.USA.:CRC Press; 2001.
12. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH harmonized tripartite guideline. Pharmaceutical development Q8 (R2). 2009.
13. Lachman L, Lieberman H. The theory and practice of the industrial pharmacy. 3a ed. U.S.A.: Lea and Febinger; 1989.
14. Banker G, Rhodes C. Modern pharmaceutics. 2a ed. U.S.A:Mercel Dekker; 1990. 15. Ahuja S, Scypinki S. Handbook of modern pharmaceutical analysis. U.S.A.:
Academic Press. 2001. 16. Diario Oficial de la Federación. NOM-073-SSA1-2005, Estabilidad de fármacos y
medicamentos. 17. Avila P, Madero I, López C, León F. Fundamentos de Criopreservación. Colombia:
Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4; 2006. 18. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 11ª ed. México: Secretaría de
Salud, Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos; 2014.
19. Remingnton G. Farmacia. 20ª ed. U.S.A.: Médica Panamericana Tomo I y II; 2000. 20. Guarango J. Geles. [en línea].2011. [Fecha de consulta 3 de Septiembre 2015].
Disponible en: http://es.escribd.com/doc/52940200/geles1. 21. Lieberman H, Rieger M, Bankel G. Pharmaceutical dosage forms: disperse
systems. 2a ed. New York: Dekker Vol. II; 1996.
66
22. Paruta E. Emulsiones geles, Influencia de la formulación y fracción de fase dispersada sobre sus propiedades reológicas y estabilidad. [en línea]. Venezuela; 2008. [Fecha de consulta 3 de Septiembre 2015]. Disponible en: http://www.firp.ula.ve/archivos/cuadernos/08_MS_paruta_E.pdf.
23. Backlund S, Eriksson F, Rantala M, Varho K. Composiciones farmacéuticas derivadas de geles basados en microemulsiones, método para su preparación y nuevos geles basados en microemulsiones. España; 2001.
24. Jones D. Pharmaceutics-dosage form and design. London: Pharmaceutical Press; 2008.
25. Instituto Nacional del Cáncer. ¿Qué es el cáncer? [en línea]. [Actualizada7 de marzo de 2014]. [Fecha de consulta: 24 enero 2015]. Disponible en: http://www.cancer.gov/espanol/cancer/que-es.
26. Chicharro L, Mojares L. Fisiología Clínica del Ejercício. Buenos Aires: Editorial Panamericana. 2008
27. American Cáncer Society. Datos y Estadísticas sobre el cáncer entre los hispanos/latinos, 2012-2014. Atlanta, Georgia; 2012 [consultado 2015 agosto 15]. Disponible en: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/d ocument/acspc-036792.pdf
28. Instituto Nacional del Cáncer. Cáncer de cuello uterino. [en línea]. [Actualizada 24-diciembre-2014]. [Fecha de consulta: 25 enero 2015]. Disponible en: http://www.cancer.gov/espanol/tipos/cuello-uterino
29. Cámara de diputados. H. Consejo de la unión LXII legislatura. Boletín 4872. Cáncer, tercera causa de muerte en México; más de 128 mil casos cada año. [en línea]. [Actualizada 24 de diciembre 2014. [Fecha de consulta: 25 de enero 2014]. Disponible en: http://www5.diputados.gob.mx/index.php/esl/Comunicacion/Boletines/2014/Diciembre/24/4872-Cancer-tercera-causa-de-muerte-en-Mexico-mas-de-128-mil-casos-cada-ano
30. Gobierno del Estado de México. Instituto de Salud del Estado de México [sede web]. México: Secretaría de Salud; c2012 [actualizado 2015 agosto 20; citado 2015 agosto 21]. Disponible en: http://salud.edomexico.gob.mx/html/article.php?sid=1011.
31. Ferlay J, Shin H, Bray F, Forman D, Parkin. Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010.
32. Fuente J, Ferrandiz C. La piel en el contexto de la medicina y sus especialidades efectos adversos cutáneos secundarios al tratamiento con interleucina 2. Barcelona: Badalona; 2003.
33. Lorusso, M.P., aukerman, L.S., Polin, L., Redman, G.B., Valdivieso, M., Biernat, L. y Corbett, H.T.1990. Antitumor Efficacy of Interleukin-2 Alone and in Combination with Adriamycin and Dacarbazine in Murine Solid Tumor Systems.Cancer Research 50:5876-5882.
34. Szoka Fisher, Kefer C, Fisher R, Ellis T. A phase I trial of continuous infusion interleukin-4 (IL-4) alone and following interleukin-2 (IL-2) in cancer patients. Annals Oncol; 1994.
35. Szoka F, Papahadjopoulus D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Ann Rev Biophys Bioeng; 1980.
36. Smith. Interleukin-2: Inception, Impact, and Implications. Science; 1988. 37. Ardizzoni A, Bonavia M, Viale M, Baldini E, Mereu C, Verna A, Ferrini S,
Cinquegrana A., Molinari S, Roest J, Sharenberg, J. Biologic and Clinical Effects of
67
Continuous Infusion Interleukin-2 in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer; 1994.
38. Becker,C.J., Pancook, D.J., Gillies, D.S., Furukawa, K. y Reisfeld, A.R.1996a.T Cell-mediated Eradication of Murine Metastatic melanoma Induced by Targeted Interleukin 2 Therapy.J.Exp.Med; 1996.
39. Ciacci C, Mahida R, Dignass A, Koizumi, M, Podolsky K. Functional Interleukin-2 Receptors on Intestinal Epithelial Cells. J. Clin. Invest; 1993.
40. Vagge, J., Barberá-Gillem, E., Abra, R., Huang, A., Working, P.1994. Tissue distribution and therapeutic effect of intravenous free or encapsulated liposomal doxorrubicin on human prostate carcinoma xenografts. Cancer; 1994.
41. Meager. The Molecular Biology of Cytokines. John Wiley & Sons. England; 1998. 42. Mire A. Thorpe R. Cytokines. Academic Press Great Britain; 1998. 43. Craiu A, Barouch H, Zheng X, Kuroda J, Schmitz E, Lifton A, Steenbeke T,
Nickerson E. An IL-2/Ig Fusion Protein Influences CD4+ T Lymphocytes in Naïve and Simian Immuno deficiency Virus-Infected Rhesus Monkeys. AIDS Research and Human Retroviruses; 2001.
44. United States National Library of Medicine. ChemlDplu. ToxNet. [Fecha de consulta: 12 de Septiembre 2015] Disponible en: http//www.chem.sis.nlm.gov/chemisplus/proxyservit.
45. Paul Schwander, Oficina Europea de Patentes, La Haya. Las búsquedas sobre el estado de la técnica: una obligación para las PYMES innovadoras.[en línea]. [Fecha de consulta: 25 de enero 2015]. Disponible en:: http://www.wipo.int/sme/es/documents/prior_art.htm
46. Instituto Nacional de Propiedad Industrial. Búsqueda del Estado de la Técnica, patentes de invención y modelos de utilidad. [en línea] Gobierno de Chile. [Actualizado en septiembre del 2014]. [Fecha de consulta: 26 de enero 2015]. Disponible en: http://www.inapi.cl/portal/institucional/600/articles-979_recurso_1.pdf
47. Trejo S. La Biotecnología en México: Situacion de la Biotecnología en el Mundo y Situacion de la Biotecnología en el México y su Factibilidad de Desarrollo. Centro de Investigacion en Biotecnología Aplicada del IPN. 2010 [Fecha de consulta: 9 de septiembre de 2014]. Disponible en: http://www.gbcbiotech.com/en/imagenes/biotecnologia/33BioTecnologia_mexico.pdf
