Investigación sobre la presencia de Coxiella burnetii en quesos elaborados con leche

cruda de oveja

A. Piñero; R. A. Juste; J. F. Barandika; A. Hurtado; A. L. García-Pérez

NEIKER-Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario Departamento de Sanidad Animal, Berreaga 1

48160 DERIO (Bizkaia)

Zoonosis de distribución mundial

Bacteria: Coxiella burnetii

El brote de fiebre Q en Holanda

-2007: 168 casos -2008: 1000 casos-2009: 2357 casos-2010: 208 casos

Roest et al., 2011, Epidemiol Infect

Ciclo silvestre

Garrapatas

Ciclo doméstico

Subproductos

Ciclo de Coxiella burnetii

Supervivencia:

Soporta el pH ácidoPolvo: 120 díasAgua: 36 meses Carne fresca:1 mes (4º C)Heces de garrapatas: 1-2 años Mantequilla, queso fresco:42 díasLana: 12-16 meses Leche: 42 meses (4-6ºC)Orina desecada: 50 días-20º C: 2 añosResistente a los U.V.

Destrucción:

Etanol 70%Hipoclorito 0.05%Formol 10%Peróxido de hidrógeno 5%

Alta resistencia de Coxiella en el ambiente

Temperaturas:

50ºC 30’72ºC 40’’85ºC 7’’

FORMA AGUDA

• Síndrome febril aislado• Neumonía• Hepatitis

PI: 1-3 semanas

La fiebre Q en humanos

FORMA AGUDA

• Síndrome febril aislado• Neumonía• Hepatitis

FORMA CRÓNICA

• Endocarditis• Hepatitis crónica• Meningitis • Encefalitis• Muerte

FORMA AGUDA: mayoría de los casos asintomáticos y esporádicos: Coxiellosis

FORMA CRÓNICA:

Fiebre Q en rumiantes domésticos

Ganado ovino/caprino: Abortos a término (hasta 50%)Partos prematurosBajo peso de corderos/cabritos

Ganado bovino:

Aborto (esporádicos)InfertilidadMastitisMetritis

Coxiella burnetii; 9%

Fetal anomalies; 1%

Not determined;38%

Border disease; 16%

Chamydophila abortus;12%

Salmonella abortus ovis;10%

Brucella mellitensis; 3%

Toxoplasma gondii; 15%

Yersinia pseudotuberculosis; 1%

Listeria ;4%

Oporto et al., 2006, Annals NY Acad Sci

Nº rebaños analizados= 148 -Estudio de fetos, placentas, y otras muestras

Abortos por fiebre Q en los rumiantes de la CAPV

Según casuística de NEIKER, y trabajos de investigación, en vacuno los casos de fallo reproductivo o aborto relacionados con fiebre Q son esporádicos en la CAPV (Atxaerandio, 2001; Aduriz, 2001)

OVINO

BOVINO

Especie Seroprevalencia explotaciones

Seroprevalencia individual

Nº Nº Pos (%) Nº Nº Pos (%)

Vacuno leche 193 93 (48.2) 2692 176 (6.5)

Vacuno carne 42 18 (42.9) 618 41 (6.6)

Ovino 46 34 (73.9) 1298 160 (12.3)

Caprino 11 5 (45.5) 109 9 (8.3)

Seroprevalencia frente a Coxiellaen los rumiantes de la CAPV

Ruiz-Fons y cols., 2010, BMC Vet Res Astobiza y cols., 2012, J Dairy Sci

OvejasVacasCabras

ELISA indirecto (ELISA Cox kit, LSI, Francia) con un antígeno aislado de rumiantes (cepa CBO1)

Casos humanos en la CAPV

Fuente: Informe Dpto. Sanidad del Gobierno vasco, 2008

¿Ganado ovino es el principal reservorio? (Cilla et al., 2008)

Tissot Dupont y cols, 2004. Emerging Infect Dis

Especies animales asociadas en los brotes humanos

Europa (1982-2010)

- Rumiantes 6- Ovino 25- Caprino 7- Vacuno 1

EFSA report, 2010

Una placenta puede contener hasta 1.97x109 bacterias

Eliminación de Coxiella en fluidos vaginales, leche y heces

El periodo de mayor riesgo es el periodo de abortos /paridera

Especie Periodo de eliminación de C. burnetii Moco vaginal Heces Leche Vacuno esporádico 14 días 13 meses Ovino 71 días 5 meses 4 meses Caprino 14 días 20 días 4 meses

Eliminación de Coxiella al medio tras el aborto / parto

Rodolakis y cols, 2007; Guatteo y cols., 2007; Astobiza y cols, 2010; EFSA, 2010

Muestreador de aire

Contaminación medioambiental en la paridera de un rebaño ovino infectado

Astobiza et al, 2010. Res Vet Sci

Coxiella/ml en aerosoles

Fecha visita

Nº PARTOS

EXTERIOR

INTERIOR

No. anim. posit. / analizadas (%)

28/11/2008 92 1.69 3.47 11/12/2008 32 Neg 1.72 22/12/2008 60 Neg 2.51 29/01/2009 29 Neg 2.56 02/03/2009 3 Neg Neg 02/04/2009 2 Neg Neg

Ovejas: 61/91 (67%) Primalas: 0/8 (0%)

100 l./ min durante 10’

-La fuente más importante de contagio es la aerógena

-Entre 1 y 10 bacterias pueden provocar la infección en humanos

Vías de infección

- Ruta oral, en discusión

Vías de infección

Transmisión por vía oral

NO CONFIRMADA

Seroconversión tras la ingestión de leche cruda o

productos lácteos contaminadosBerri et al., 2005

Ausencia de síntomas

clínicos (Benson et al., 1992;

Fishbein y Raoult, 1992).

154 leches de tanque ovinas

ELISA (Cox kit LSI, Francia)Suero lácteo

Pos/ NegEstudio de anticuerpos

PCR/ qPCRLeche entera

Pos/ NegCuantificación: Log Cox/ ml

Estudio de la distribución de Coxiella en 154 rebaños

ovinos de leche

García-Pérez y cols., 2009, J Dairy Sci

Nº rebaños

Nº posit

% ELISA pos

% PCR pos

154

62

40.3

22.1

Determinar la presencia de C. burnetii en quesos elaborados con

leche cruda de oveja con el fin de valorar el riesgo potencial

que supondría el consumo de este producto.

Objetivo del estudio

Materiales y métodos

Tipo de muestra N Procedencia Adquisición

Quesos elaborados a partir de leche cruda de oveja

79 Tres comunidades autónomas

Compra directa

en tiendas,

mercados y

supermercados

Objetivo Técnica

Extracción de ADN

Pretratamiento de la muestra y Kit

comercial (Qiagen)

Homogenización (stomacher) 10 g de queso en 20 ml de buffer. Centrifugaciones y lavados. Extracción ADN según las instrucciones del fabricante.

Detección y cuantificación de

ADN de C. burnetii

qPCR

Diana: Gen IS1111. Cuantificación: Diluciones 1/10 de la diana desde

1x106 hasta 1x102. Control interno de inhibición:

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents (Applied Biosystems®).

Caracterización molecular de las

muestras positivas

MLVAAnálisis del número de repeticiones en tandem

presentes en seis posiciones del genoma de C.burnetii.

Materiales y métodos

Detección de C. burnetii por qPCR

Autor Año Procedencia Especie de origen N NºPosit (%)

Este estudio 2013 local Ovino 79 37 (47)

Hirai A. 2011Francia Vacuno 26 4 (15,4)

Italia Vacuno 5 3 (60)

Capuano F. 2012Italia Vacuno 41 16 (39)

Italia Ovino/Caprino 56 15 (27)

Eldin C. 2013

Italia, Grecia y Francia Vacuno 101 83 (82)

Italia, Grecia y Francia Ovino 25 8 (32)

Italia, Grecia y Francia Caprino 39 20 (51)

Carga bacteriana: 0,1-3,6 (Log bact/gr)

Genotipos MLVA

Muestra Especie Origen Año Ms23 Ms24 Ms27 Ms28 Ms33 Ms34 Genotipo

Leche Ovino Gipuzkoa 2007 3 9 5 5 2 2 AA

Aerosol Ovino Gipuzkoa 2008 1 11 2 3 2 2 Z

Hisopo vaginal Ovino Gipuzkoa 2008 1 11 2 3 2 3 S

Placenta Ovino Álava 2004 3 9 4 5 2 2 T

Astobiza et al., 2012, BMC Vet Res

- 23 genotipos diferentes a los descritos en ovino previamente en casos de abortos- 1 genotipo común en PV y CyL- Mucha variabilidad en las cepas ovinas

Genotipado de DNA de C. burnetii en quesos

Conclusiones

Se ha puesto a punto un procedimiento para la extracción de ADN y amplificación por

qPCR de C. burnetii a partir de muestras de quesos.

Se ha detectado una prevalencia alta de C. burnetii en quesos elaborados con leche cruda

de oveja, similar a las descritas por otros autores. Sin embargo, los estudios de viabilidad

de C. burnetii llevados a cabo por dichos autores descartan que las bacterias detectadas

sean viables (Hirai et al., 2012; Eldin et al., 2013).

El genotipado muestra una gran variedad de genotipos de C. burnetii, que no permite

establecer relaciones con brotes previos de abortos ovinos. El genotipado de C. burnetii

podrá ser de utilidad en las investigaciones epidemiológicas de los brotes humanos de

fiebre Q, para identificar el posible origen de la cepa y la especie animal implicada.

Agradecimientos

Estudio financiado por INIA y FEDER (RTA2009-00017-00) y Dpto. De Agricultura del Gobierno Vasco.

Al grupo de Fiebre Q de NEIKER.

ESKERRIK ASKO