BIOTECNOLOGIA EN BIOTECNOLOGIA EN INMUNOLOGIA CLÍNICAINMUNOLOGIA CLÍNICA

Dr. Martin Villarroel MareñoDr. Martin Villarroel MareñoDoctorando Inmunología Doctorando Inmunología

Experto en Docencia UniversitariaExperto en Docencia Universitaria UAH - UAH - Alcalá de Henares, EspañaAlcalá de Henares, España

Instituto Boliviano de oncohematología Paolo Belli.Instituto Boliviano de oncohematología Paolo Belli.Laboratorio de Biología CelularLaboratorio de Biología Celular

Facultad de Medicina.Facultad de Medicina.Universidad Mayor de San Andrés.Universidad Mayor de San Andrés.

La Paz - BoliviaLa Paz - Bolivia

Plan de la clasePlan de la clase• Tecnología de anticuerposTecnología de anticuerpos

1.1. Uso de los anticuerpos en el laboratorio: Uso de los anticuerpos en el laboratorio: inmunodiagnósticoinmunodiagnóstico

2.2. Uso clínico de los anticuerpos: Uso clínico de los anticuerpos: inmunoterapiainmunoterapia

3.3. ProducciónProducción de anticuerpos para uso de anticuerpos para uso clínico y diagnósticoclínico y diagnóstico

1. Usos diagnósticos y terapéuticos de los 1. Usos diagnósticos y terapéuticos de los anticuerposanticuerpos

• Técnicas analíticas/diagnósticas:Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera miden generalmente fuera del organismo por técnicas "del organismo por técnicas "in vitroin vitro" algún parámetro" algún parámetro– ELISAELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad– WESTERNWESTERN inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección– IMMUNOHISTOQUIMICAIMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, anatomía patológica , biopsias, anatomía patológica – NEFELOMETRIANEFELOMETRIA turbidometría, Ig séricas turbidometría, Ig séricas– CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemias Diagnóstico de leucemias

• Técnicas terapéuticasTécnicas terapéuticas: diseñadas para curar. : diseñadas para curar. – Tratamiento Tratamiento antineoplásicoantineoplásico destrucción células tumorales destrucción células tumorales– Tratamientos Tratamientos antiinflamatoriosantiinflamatorios. Neutralización de mediadores . Neutralización de mediadores

proinflamatoriosproinflamatorios

1. Uso de anticuerpos en el laboratorio1. Uso de anticuerpos en el laboratorio • Fundamento:Fundamento: Pueden ser utilizados como Pueden ser utilizados como

nanoherramientasnanoherramientas capaces de capaces de reconocer específicamente reconocer específicamente y a las que nosotros podemos y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o medir. sujetar, localizar o medir.

1.1. EspecificidadEspecificidad en el reconocimiento aportada por la región en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo.Fab del anticuerpo.

2.2. Posibilidad de Posibilidad de marcajemarcaje: radioactivo, enzimatico, : radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y fluorescente, con puente biotina-avidina. Detección y medida. medida.

3.3. Unión a soportes (Unión a soportes (magnéticos o de plástico) por región Fc. magnéticos o de plástico) por región Fc. Separación y purificación molecular y celular. Separación y purificación molecular y celular.

1. Ag.

2. *3.

Cuantificación de antígenoCuantificación de antígeno• Miden analitos mediante anticuerpos especificos unidos a Miden analitos mediante anticuerpos especificos unidos a

isotopos raisotopos radioactivosdioactivos (RIA) o a (RIA) o a enzimasenzimas (ELISA), comparan (ELISA), comparan

con una curva estándar con concentraciones conocidas de la con una curva estándar con concentraciones conocidas de la

sustancia problema. sustancia problema.

• ELISA o RIA ELISA o RIA competitivocompetitivo. Antígeno pegado. El antígeno de la . Antígeno pegado. El antígeno de la

muestra inhibe la unión de un anticuerpo indicador al antígeno muestra inhibe la unión de un anticuerpo indicador al antígeno

pegado al pocillo.pegado al pocillo.

•   ELISA o RIA ELISA o RIA sandwichsandwich. 1. 1erer anticuerpo pegado captura antígeno anticuerpo pegado captura antígeno

segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado segundo anticuerpo indicador unido a enzima o radiomarcado

reconoce otro determinante del antígeno.reconoce otro determinante del antígeno.

Identificación, purificación y Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicoscaracterización de antígenos proteicos

• Inmunoprecipitación Inmunoprecipitación

1.1. Se solubilizan proteinas celulares con Se solubilizan proteinas celulares con detergentesdetergentes

2.2. SSe usa un anticuerpo especifico para precipitar e usa un anticuerpo especifico para precipitar una proteína, una proteína,

3.3. Se lava y así se la separa de las otras sustancias. Se lava y así se la separa de las otras sustancias.

4.4. Se libera el antígeno por cambio de pH que Se libera el antígeno por cambio de pH que reduce la afinidad de la unión Ab-Ag.reduce la afinidad de la unión Ab-Ag.

• Estudios de Estudios de coinmunoprecipitación +westerncoinmunoprecipitación +western.. Estudio de complejos moleculares.Estudio de complejos moleculares.

Identificación, purificación y Identificación, purificación y caracterización de antígenos proteicoscaracterización de antígenos proteicos

• Western e inmunoblot Western e inmunoblot

1.1. SSeparación analítica por electroforesis en gel eparación analítica por electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa proteínas por de (SDS)-poliacrilamida separa proteínas por su peso molecular su peso molecular

2.2. Son transferidas a un filtro poroso por Son transferidas a un filtro poroso por capilaridad. capilaridad.

3.3. Las proteínas son reconocidas porLas proteínas son reconocidas por anticuerpos anticuerpos radiomarcados o unidos a enzimas.radiomarcados o unidos a enzimas.

Identificación, purificación y Identificación, purificación y caracterización de célulascaracterización de células

• Citometría de flujo. Citometría de flujo. • La expresión de antígenos es medida en cada célula La expresión de antígenos es medida en cada célula

haciéndolas pasar de una en una por delante de un haz haciéndolas pasar de una en una por delante de un haz de luz, anticuerpos marcados fluorescentes son de luz, anticuerpos marcados fluorescentes son utilizados como moléculas indicadoras. utilizados como moléculas indicadoras.

• Marcaje de superficie celularMarcaje de superficie celular• Marcaje intracelularMarcaje intracelular• Marcaje de células secretorasMarcaje de células secretoras

Localización del antígeno en tejidos o célulasLocalización del antígeno en tejidos o células• InmunofluorescenciaInmunofluorescencia Anticuerpos fluoromarcados en microscopia Anticuerpos fluoromarcados en microscopia

óptica. estructuras no marcadas no se ven, dificultando la localización óptica. estructuras no marcadas no se ven, dificultando la localización

precisa del marcaje fluorescente.precisa del marcaje fluorescente.

• Citometría Láser de barridoCitometría Láser de barrido ilumina con láser, lee fluorescencia a ilumina con láser, lee fluorescencia a

varios coloresvarios colores

• Inmunohistoquímica:Inmunohistoquímica: Utilización en microscopia óptica de Utilización en microscopia óptica de

anticuerpos unidos a enzimas que producen compuestos coloreados e anticuerpos unidos a enzimas que producen compuestos coloreados e

insolubles que precipitan en la posición del ag .insolubles que precipitan en la posición del ag .

• Microscopia inmunoelectrónica: Microscopia inmunoelectrónica: Utiliza anticuerpos unidos a Utiliza anticuerpos unidos a

compuestos electrodensos, como el oro coloidal. compuestos electrodensos, como el oro coloidal.   

Localización del antígeno en pacientesLocalización del antígeno en pacientes

• InmunoresonanciaInmunoresonancia marcaje con anticuerpos unidos a marcaje con anticuerpos unidos a

sustancias con propiedades de conservación de spin sustancias con propiedades de conservación de spin

caracteristicascaracteristicas

• Inmuno scanner radiológico Inmuno scanner radiológico marcaje de anticuerpo con marcaje de anticuerpo con

compuestos radio-opacoscompuestos radio-opacos

• InmunoPETInmunoPET. Marcaje con anticuerpos sustancias emisoras de . Marcaje con anticuerpos sustancias emisoras de

positrones. positrones.   

• Inmunoliposomas permiten marcar anticuerpos con casi Inmunoliposomas permiten marcar anticuerpos con casi

cualquier cosacualquier cosa

Uso de anticuerpos para separación Uso de anticuerpos para separación celularcelular..

•   Métodos de fase sólidaMétodos de fase sólida Fijación de anticuerpos por su Fijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida. región Fc a una fase sólida. – Panning Panning – Fijación de anticuerpos a plástico. Células portadoras del Fijación de anticuerpos a plástico. Células portadoras del

antígeno se unen al soporte. lavado y separación mecánica o antígeno se unen al soporte. lavado y separación mecánica o química.química.

– MACSMACS (Magnetic Activated Cell Sorting) (Magnetic Activated Cell Sorting) – Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son

retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Células portadoras del antígeno aplica un campo magnético. Células portadoras del antígeno se unen al soporte. lavado y elución por eliminación del se unen al soporte. lavado y elución por eliminación del campo magnético.campo magnético.

Métodos fluorescentes inteligentes Métodos fluorescentes inteligentes

• FACSFACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) (Fluorescence Activated Cell Sorting) • anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son

reconocidos en la superficie de cada célula. reconocidos en la superficie de cada célula. • Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una

a una y separadas en función de las combinaciones de a una y separadas en función de las combinaciones de parámetros seleccionados. parámetros seleccionados.

• Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el contenedor de fracción deseado.de la célula hacia el contenedor de fracción deseado.

• Se pueden Se pueden clonar célulasclonar células de características específicas. de características específicas.

2. Terapia con anticuerpos monoclonales2. Terapia con anticuerpos monoclonales“from magical bullets to smart bombs”“from magical bullets to smart bombs”

• La idea era de principios del siglo XXLa idea era de principios del siglo XX• Tecnología anticuerpos monoclonales 1975. Nobel a un Tecnología anticuerpos monoclonales 1975. Nobel a un

Posdoc KohlerPosdoc Kohler• Limitaciones de anticuerpos murinos Limitaciones de anticuerpos murinos

– Vida media corta en humanos Vida media corta en humanos – No interaccionan óptimamente con sistemas efectores humanosNo interaccionan óptimamente con sistemas efectores humanos– Estimulan formación de anti-anticuerpos (reacciones anafilácticas)Estimulan formación de anti-anticuerpos (reacciones anafilácticas)

• Anticuerpos humanizadosAnticuerpos humanizados• 200 anticuerpos distintos en pruebas clínicas y a diferencia 200 anticuerpos distintos en pruebas clínicas y a diferencia

de antiangiogénicos están funcionando en terapia de antiangiogénicos están funcionando en terapia antitumoral. antitumoral.

• Estimulan activación complemento, ADCC, fagocitosis.Estimulan activación complemento, ADCC, fagocitosis.

2. Uso terapéutico de los anticuerpos2. Uso terapéutico de los anticuerpos• Radioconjugados Radioconjugados

– Fósforo, Estroncio, Yodo, YtrioFósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio – I-antiCD45 leucemias mieloides agudasI-antiCD45 leucemias mieloides agudas– Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90 Itrio 90 emisiónemisión– Bexxar antiCD20 de ratón Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131Iodo131

• Quimioconjugados Quimioconjugados – AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676)

produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis.apoptosis.

– Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antígeno CD33 se Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.

– AntiCD22 Conjugados con AntiCD22 Conjugados con RNAsasRNAsas se experimentan en linfomas. se experimentan en linfomas.• Anticuerpos puros Anticuerpos puros

– AntiCD40 induce AICD en linfomas.AntiCD40 induce AICD en linfomas.– AntiCD20 mata células de linfomas y leucemias (depende de AntiCD20 mata células de linfomas y leucemias (depende de

polimorfismo Receptores Fc).polimorfismo Receptores Fc).

Anticuerpos sin conjugarAnticuerpos sin conjugar• Terapia antitumoral selectivaTerapia antitumoral selectiva

– 1999 AntiCD20 Rituximab para linfomas y Leucemias de 1999 AntiCD20 Rituximab para linfomas y Leucemias de células Bcélulas B

– 2001 Anti CD52 Campath 1H tumores de células B, 2001 Anti CD52 Campath 1H tumores de células B, enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto enfermedad mínima residual, rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunescontra huésped, enfermedades autoinmunes

• Eliminación de células indeseables de inóculos Eliminación de células indeseables de inóculos para trasplante de médula ósea.para trasplante de médula ósea.– AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inóculos AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inóculos

alogénicos anti-CD3alogénicos anti-CD3

– Purgado de células tumorales de inóculos autólogos.Purgado de células tumorales de inóculos autólogos.

Conjugados con partículas magnéticasConjugados con partículas magnéticas

• AntiCD34 para purificación de células madre AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética.inmunomagnética.

• Permite purificar células madre a partir de sangre Permite purificar células madre a partir de sangre periférica.periférica.

Antagonistas de citocinasAntagonistas de citocinas

• Anticuerpos anticitocina Anticuerpos anticitocina Anti-TNFAnti-TNFInfliximab Infliximab – Neutralizan mediadores proinflamatorios Neutralizan mediadores proinflamatorios – Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorioTienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio– Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

• Receptores solubles de TNF EtanercepReceptores solubles de TNF Etanercep– También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.

• Quimeras con región Fc. IgG. Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida alargan vida media del receptor solublemedia del receptor soluble

3. Producción de anticuerpos3. Producción de anticuerpos

1.1. Obtención de Obtención de antisuerosantisueros (anticuerpos policlonales) (anticuerpos policlonales)

2.2. Síntesis de Síntesis de anticuerpos monoclonalesanticuerpos monoclonales

3.3. Reducción de su inmunogenicidad. Síntesis de Reducción de su inmunogenicidad. Síntesis de

anticuerpos quiméricosanticuerpos quiméricos

Obtención de antisuerosObtención de antisueros (anticuerpos policlonales) (anticuerpos policlonales)

• Uso diagnósticoUso diagnóstico

• En terapia antisueros antitetánicosEn terapia antisueros antitetánicos

• VENTAJAS: rápido y de bajo coste

• INCONVENIENTES: Reproducibilidad limitada, cantidad limitada de Ab.

Síntesis de anticuerpos monoclonalesSíntesis de anticuerpos monoclonalesKohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).

- PROTEÍNA- PLÁSMIDO- CÉLULAS

-VÍA: parenteral, intramuscular...-DOSIS: 3/4 inóculos-ADYUVANTES Y CARRIERS. CEPA: BALB/c, Y3

PROTEÍNAS VIRALESMÉTODOS ELECTRICOS

CEPAS: P3/x63.Ag8.653, NSI/0, NSI/1

ELISA, IFI, RIA, WESTERN,INMUNOCITOQUÍMICAS, FACS.......

- DILUCIÓN- AGAR

Problemas para el uso terapéuticoProblemas para el uso terapéuticoinmunogenicidad de los anticuerpos xenogénicosinmunogenicidad de los anticuerpos xenogénicos

Disminución de la Inmunogenicidad Disminución de la Inmunogenicidad de los anticuerposde los anticuerpos

1.1. Anticuerpos xenogénicos Anticuerpos xenogénicos – Estimulan la formación de antianticuerposEstimulan la formación de antianticuerpos

2.2. Anticuerpos quiméricos Anticuerpos quiméricos – Regiones variables murinas Regiones variables murinas – Regiones constantes humanas funciones efectorasRegiones constantes humanas funciones efectoras

3.3. Anticuerpos humanizados Anticuerpos humanizados – Reemplazo de regiones armazón originales del Reemplazo de regiones armazón originales del

domino variable por otras humanas para disminuir domino variable por otras humanas para disminuir todavía más la inmunogenicidad.todavía más la inmunogenicidad.

Síntesis de anticuerpos quiméricosSíntesis de anticuerpos quiméricosMorrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne (Nature, 1984).Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne (Nature, 1984).

Variantes biotecnológicasVariantes biotecnológicas•Quimeras con región Fc. Quimeras con región Fc. alargan vida media de la molécula alargan vida media de la molécula asociadaasociadaAnticuerpos biespecíficos.Anticuerpos biespecíficos.Inmunopartículas biespecíficasInmunopartículas biespecíficasInmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos monoclonalesmonoclonalesletales como transportadores de sustancias toxicas letales como transportadores de sustancias toxicas intracelulares ej. RNAasasintracelulares ej. RNAasas

El “toque humano” ha permitido el uso El “toque humano” ha permitido el uso clínicoclínico

• Anticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humanaAnticuerpos quiméricos (1995-) V murina C humana– Simulect rechazoSimulect rechazo– Remicade Infliximab Crohn, ARRemicade Infliximab Crohn, AR

• Humanizados HVR murina FR humana C humanaHumanizados HVR murina FR humana C humana– Zenapax (1997) (CD25)Zenapax (1997) (CD25)– Herceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptorHerceptin (1998) cáncer de mama metastático que expresa EGF receptor– Campath (2001) antiCD52Campath (2001) antiCD52– Xolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgicaXolair Omalizumab(2003) anti IgE asma alérgica– Efalizumab (2004) psoriasisEfalizumab (2004) psoriasis– 200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.200 tipos más están actualmente utilizándose en ensayos clínicos en humanos.

Citometria de flujoCitometria de flujo

Ejemplo de aplicación de la citometria de flujo.Ejemplo de aplicación de la citometria de flujo.Inmunofenotipo en mieloma múltiple y evaluación de la EMRInmunofenotipo en mieloma múltiple y evaluación de la EMR

VALORACION DE RESPUESTA CELULARVALORACION DE RESPUESTA CELULAR

Hemos aprendidoHemos aprendido

1.1. Métodos de uso de los anticuerpos en el Métodos de uso de los anticuerpos en el laboratoriolaboratorio

2.2. Posibilidades de uso clínico de los Posibilidades de uso clínico de los anticuerpos en anticuerpos en inmunoterapiainmunoterapia

3.3. Tecnologías deTecnologías de producción producción de anticuerpos de anticuerpos para uso clínico y diagnósticopara uso clínico y diagnóstico