Ingeniería de vías metabólicas en bacterias para producción de compuestos aromáticos de...

Ingeniería de vías metabólicas en bacterias para producción de compuestos aromáticos de interés

industrial

Dr. Adelfo Escalante. Investigador Titular

Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM.

[email protected]

• Biotecnología: una serie de procesos por los cuales un organismo es manipulado, particularmente a nivel genético para la obtención de productos de interés.

Definiciones

Producto de interés

Producción

Cepa (sobre) productora (modificada genéticamente)

Selección del microorganismo

productor

Análisis in silico Ingeniería de vías metabólicas

Datos -ómicos

Fermentación y downstream porcesses

Ingeniería de Vías Metabólicas

Modificación directa de las propiedades celulares a través de la modificación de reacciones bioquímicas específicas o la introducción de otras nuevas, por medio del uso de la tecnología del ADN recombinante

Corismato sintasa aroC

3-Fosfoshikimato-1-carboxiviniltransferasa

aroA

Glu

cosa

Glucosa-6-P

2 Fosfoenolpiruvato

Piruvato

SHK

Corismato

PTS

DAHP SintasaaroF, aroG, aroH

DAHPShikimato

cinasaI y II

aroK, aroL

DHQ DHS3-Dehidroquinato

Sintasa aroB

Shikimatodeshidrogenasa

aroE

Transcetolasa I tktA

Vía de laspentosas fosfato

Eritrosa-4-P

SHK-3-P

EPSHK-3-P

FenilalaninaTirosina

Triptofano

Vía de síntesisde aminoácidos

aromáticos

Piruvato cinasaI y II

pykF, pykA

FosfoenolpiruvatosintasappsA

Piruvato

3-Dehidroquinato deshidratasa

aroD

TCA

Glucólisis

Metabolismocentral de carbono y vía de síntesis

aromáticos en E. coli JM101

CHA ANT

PRE

HPP

L-TYR

Salvianic acid

4-Hydroxyphenylacetate

3,4-Dihydroxyphenylpyruvate

L-PHE

Cinnamic acid

Cinnamoyl-CoA

Pinocembrin chalcone

2S-Pinocembrin

Malonate

Malonyl-CoA

4-Coumaric acid Coumaroyl-CoA

Caffeic acid

Ferulic acid

Caffeoyl-CoA

L-TRP Indole-3-pyruvic acid imine

Protodeoxyviolacein acid

ViolaceinDeoxyviolacein

Malonate

Malonyl-CoA

Resveratrol

vioAvioB

vioCvioD

vioC

TALCoum3H Sam5

COM

4CLCoum3H

Thioesterase

matB

Malonate

matC

STS

ldh

hpaBC

hpaBC

ldh

Malonate

matC

matB

PAL

4CL

CHSCHS

CHI

vioE

NH2

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OHO

H

O

O

CH3

CH3

H

CH3

OH

CH3

CH3

OH

OH

CH3

OH

OH

OHO

OH

OO

O

CH3

H3C

H3C

NH O

NH2

O

O

OH

OH

OBz

Bz

OH

OH

OH

O

O

NH

Pt

NH

OH

OH

OH

O

O

SA(-)- Valiolamina

Inhibidor de glicosidasa

(retrasa la digestión de azúcares, tratamiento de hiperglucemia)

3,4-oxo-isopropilideno- SA

Actividad antitrombótica, posible efecto

anticancérigeno y anti-inflamatorio

OSF

Inhibidor de NA de virus de influenza

[Pt(dach)(SA)2]

Compuesto activo vs leucemia L1210

(-)- Zeylenone

Actividad antiviral, anticancerígena y

antibiótico

1, dihidroxi-19- Nor previtamina D3

Favorece la fijación de calcio en huesos, tratamiento vs osteroporosis

POHO

HO OH

Proceso de síntesisquímica

SHKOseltamivir fosfato:

Inhibidor de la neuraminidasa tipo I (NI)de virus de influenza estacional A y B,

Virus de influenza aviar (H5N1) y de virus de influenza humana A(H1N1) y A(H3N2)

Shikimato, precursor para la síntesis de oseltamivir fosfato

HA

NA

Célula blanco

AS

Endosoma

Núcleo

Inhibidoresde NA

Gemación

Corte de receptores de AS por NA

RNA viral

Mecanismo de infección de virus de influenza e inhibición de neuraminidasas por OSF

Cortés-Tolalpa et al. 2011. Biotecnología. 15(1)

Anís estrella chino(Illicium sp)

Shikimato(2-7% en frutos de anís estrella chino)

OSF

Producción de OSF a partir de shikimato

Ingeniería de vías metabólicas en E. coli para la producción de shikimato por sistemas de

fermentación.

Ante la necesidad de contar con estrategias propias de producción de compuestos antivirales (OSF):

• Construcción de cepas de E. coli sobreproductoras de SHK y evaluación en fermentador (FBZ-AE)

• Extracción de SHK a partir de caldos de fermentación (ALM)

• Escalamiento del proceso (OTR)• Desarrollo de un proceso alternativo de síntesis de OSF

(MO, UAEM)



aroA

Glu

cosa

Glucosa-6-P

2 Fosfoenolpiruvato

Piruvato

SHK

Corismato

PTS


DAHPShikimato

cinasaI y II

aroK, aroL


Sintasa aroB


aroE



Eritrosa-4-P

SHK-3-P

EPSHK-3-P


Triptofano

Vía de síntesisde aminoácidos

aromáticos

Metabolismocentral de carbono


pykF, pykA


Piruvato


aroD

TCA

Glucólisis

JM101(silvestre) = 0.71

PB11PTS- Glc-

= 0.11


PB11PTS- Glc-

= 0.11

PB12PTS- Glc+

= 0.4

OmpC

LamBGalP

Glucosa Glucosa

PERIPLASMACITOPLASMA

OmpF

H+

Glucosa + H+Gluc-6-PGlucocinasa

ATPADP


PB11PTS- Glc-

= 0.11

PB12PTS- Glc+

= 0.4



aroA

Glu

cosa

Glucosa-6-P

2 Fosfoenolpiruvato

Piruvato

SHK

Corismato

GalP


DAHPShikimato

cinasaI y II

aroK, aroL


Sintasa aroB


aroE



Eritrosa-4-P

SHK-3-P

EPSHK-3-P


Triptofano


pykF, pykA



aroD

TCA

Glucocinasa glk

Metabolismocentral de carbono y vía de síntesis

aromáticos en E. coli PB12

Glu

cosa

Glucosa-6-P

[FosfoenolPiruvato]

Piruvato

GalP


[DAHP] [DHQ] DHS3-Dehidroquinato

Sintasa aroB


aroE



[Eritrosa-4-P]

Inactivación sencilla dePiruvato cinasa

I o IIpykF, pykA



aroD

TCA

Glucocinasa glk

[SHK]

Transformación c/pJLBaroGfbr tktA

Transformación c/pTOPOaroB aroE

Cultivos de 500mL:Medio mineral + 25 g/L glucosa+ 15 g/L extracto de levadura37°C500 rpm20% de OD10 mM IPTGCultivos 50 h

Cuantificación:BiomasaConsumo de glucosaProducción de DAHP, DHS, SA, GA

Ingeniería de vías metabólicas en bacterias para producción de compuestos aromáticos de...

Documents

Transcript of Ingeniería de vías metabólicas en bacterias para producción de compuestos aromáticos de...