IDENTIFICACION Y RECONOCIMIENTO DE LAS CARACTERISTICAS PRESENTES EN AMINOACIDOS Y PROTEINAS POR MEDIO PRUEBAS CON

DIFERENTES REACTIVOS

Cristina Erazo 1 Jorge Garzón 2 Lorena Matabanchoy 1

1 Estudiante de tercer semestre del programa de ingeniería Agroindustrial de la universidad de Nariño, pasto (Colombia)

2Estudiante de quinto semestre del programa de ingeniería Agroindustrial de la universidad de Nariño, pasto (Colombia)

RESUMEN: la práctica realizada en laboratorio es con el fin de reconocer y diferenciar características de proteínas y aminoácidos, para lo cual se llevaron a cabo diferentes pruebas. La primera reacción fue la de la ninhidrina prueba utilizada en el reconocimiento de aminoácidos y proteínas, da negativa en la prolina por ser un iminoacido. Una segunda reacción xantoproteica, ayuda a identificar las sustancias que presentan un anillo aromático. Se realizó la reacción de biuret llevada a cabo para identificación de la sustancias con presencia de enlaces peptídicos, positiva para las proteínas dando una coloración violeta-rosado en la solución. Otra de la reacción realizada de aminoácidos azufrados muy útil para reconocer aminoácidos y proteínas que tengan azufre en su composición, la prueba fue positiva con la presencia de un precipitado de color café. Reacción del millón, fue una reacción que dio positiva para la tirosina, ya que la prueba es útil para la identificación de la presencia del grupo fenólico en la tirosina. Se llevó acabo la reacción de Hopkins Cole con la que se puede distinguir proteínas donde se encuentre presente el triptófano, observándose luego de la reacción la formación de un anillo violeta en la interface de la solución. Una última prueba fue la desnaturalización de proteínas realizada para la proteína albumina

INTRODUCCIÓN 

“Todos los aminoácidos comparten una estructura química común. Un grupo de amino (representado químicamente como NH2) está unido a un átomo de carbono (el carbono central o alfa) que después se une a otro átomo de carbono. Éste se encuentra en la forma de ácido carboxílico (abreviatura química

COOH). El grupo de amino y el grupo de ácido carboxílico tienen una participación crucial en los enlaces que se forman entre los aminoácidos cuando se sintetizan las proteínas.” [1]

Las proteínas están constituidas por diferentes grupos de aminoácidos con la presencia de diferentes grupos R, lo que les confiere la capacidad de reacción con determinados agentes,

esto es significativo para el reconocimiento de aminoácidos presentes en las proteínas de determinadas muestras a analizar, para ello se utilizan reacciones o pruebas de caracterización (pruebas coloreadas) como la ninhidrina ,reacciona con los aminoácidos y proteínas, dando la coloración azul violeta o amarillo como es el caso de la prolina e hidroxiprolina. Otra reacción utilizada es la “Reacción Xantoproteica, emplea el  ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro.” [2]

Reacción de Biuret  reacción coloreada para identificar enlaces tripeptidos en adelante. Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta.  Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio alcalino se compleja con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las proteínas. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas.

Reacción de los aminoácidos azufrados: evidenciada en la

formación de un precipitado negro correspondiente al sulfuro de plomo. La reacción del millón concerniente a la presencia de grupos fenólicos que dan lugar a una coloración rosada. La reacción de Hopkins Cole, para las proteínas que contienen triptófano la formación de Un anillo entre violeta y rojo indica que la reacción es positiva. Por último se analiza La desnaturalización de proteínas o pérdida de las estructuras de orden superior se debe a factores que modifican la interacción la proteína con el disolvente, disminuyendo su estabilidad en disolución provocando la precipitación y perdida de su función biológica (cuando están desnaturalizadas).

METODOLOGIA:

En el laboratorio de reconocimiento de aminoácidos y proteínas, todas las reacciones trabajadas se desarrollaron en tubos de ensayo.

Reacción de la ninhidrina, para dicha tare fueron utilizadas las sustancias aminoácidos y proteínas: glicina, metionina, prolina, albumina y muestra biológica, que fue utiliza la leche, esta fue para todas las pruebas escogida por su alto contenido en proteínas (“Caseína, Beta-lactoglobulina Alfa-lactoalbúmina Lactoferrina, Lactoperoxidasa, Inmunoglobulinas, Lisozima” [5])

El proceso de la reacción con la ninhidrina con cada sustancia se llevó acabo conforme se estipulaba en la guía de laboratorio. Finalmente se procedió a observar y detallar las coloraciones presentadas y se registraron los resultados.

La siguiente reacción a realizar fue la de la Xantoproteica, utilizando solución albumina, leche, glicina, triptófano, fenilalanina y tirosina; como reactivo se utilizó HNO3 concentrado, se desarrolló la práctica conforme a lo dicho en la guía. Por último se procedió a observar los resultados.

Para la Reacción de Biuret se utilizaron albúmina de huevo, glicina, alanina y leche como reactivo se añadió solución de hidróxido sódico al 20%, posteriormente se añadió gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%. Esperando obtener una coloración violeta-rosácea característica.

Reacción de los aminoácidos azufrados los aminoácidos y proteínas utilizadas fueron: albúmina de huevo, glicina, cisteína, metionina y leche. El reactivo utilizado fue solución de hidróxido sódico al 20%, gotas de solución de acetato de plomo al 5%. Luego se calentó el tubo hasta la ebullición. Se esperó a que se forme un precipitado de color negruzco lo que indico que se formó sulfuro de plomo, utilizando el azufre de los

aminoácidos, lo que es útil para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.

En la Reacción de Millón se trabajó con las soluciones albúmina de huevo, glicina, tirosina y leche. Y se realizó los pasos descritos en la guía de laboratorio. Por último se debe observar una coloración roja lo cual indica la presencia de tirosina.

En cuanto a la Reacción de Hopkins Cole, las sustancias utilizadas fueron: albúmina, huevo, triptófano, glicina y leche. A las soluciones se adiciono el reactivo de Hopkins Cole, después se adiciono a cada tubo por las paredes cuidadosamente, sin mezclar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. Al formarse un anillo violeta en la interfase da como resultado que es prueba positiva con presencia del triptófano en las proteínas o aminoacidos.

Y finalmente el último procedimiento a realizar fue la Desnaturalización de Proteínas, para el cual se utilizó la proteína albumina presente en la clara de huevo. Se desarrolló lo estipulado en la guía.

ANALISIS Y RESULTADOS:

1. Reacción ninhidrina.

Esta práctica realizada es usualmente utilizada para la determinación de la

presencia de aminoácidos y proteínas.

Se obtuvieron como resultados al adicionar ninhidrina a cinco diferentes sustancias (aminoácidos y proteínas) la presencia de una coloración en las sustancias, siendo los siguientes:

Albumina: color azul oscuro.

Glicina: azul oscuro.

Metionina: azul oscuro.

Muestra orgánica (leche): azul oscuro coagulado.

Prolina: amarillo.

La ninhidrina reacciona con los aminoácidos y proteínas, dando la coloración azul violeta; con la prolina fue diferente dando una coloración amarilla, ya que la prolina no es un aminoácido como tal sino un iminoacido.

“la ninhidrina es un agente oxidante poderoso y lleva acabo la deaminacion oxidativa de los grupos alfa-mino, liberando amoniaco, bióxido de carbono, y el correspondiente aldehído, así como la forma reducida de ninihdrina. El amoniaco entonces reacciona con un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de ninihidrina reducida para dar una coloración azul violeta.”[3]

La reacción general de la ninhidrina con aminoácidos es la siguiente:

2. Reacción xantoproteica.

Esta prueba es utilizada para la identificación de la presencia de grupos bencénicos, en aminoácidos como en las proteínas. Su presencia es identificada por que luego de llevarse a cabo la reacción de xantoproteica se observa la solución de color anaranjado.

Los resultados obtenidos en las soluciones luego de la reacción:

Albumina: color anaranjado.

Glicina: no hay coloración es una solución trasparente.

Triptófano: color anaranjado oscuro.

Fenilalanina: en el momento de realizarse la reacción xantoproteica no hay coloración en la solución, se adiciono ácido sulfúrico con el cual si se observa un cambio de coloración a un color amarillento-anaranjado.

Tirosina: coloración verde amarillenta

Leche: color anaranjado amarillento.

La prueba es positiva en la albumina, triptófano, tirosina y leche se debe a

que esos aminoácidos y proteínas llevan en su estructura grupos bencénicos. En la fenilalanina también hay una prueba positiva pero en condiciones más fuertes, con la adición de un ácido más fuerte como el ácido sulfúrico.

Fenilalanina

Tirosina

Triptófano

La reacción con glicina no se observa el precipitado de color naranja, ya que no presenta en su estructura grupos bencénicos.

Glicina

La reacción xantoproteica cosiste en la reacción de aminoácidos o proteínas, con ácido nítrico concentrado  para  identificar  que estén presenten en su estructura

grupos bencénicos. El   anillo  es  el que reacciona  con el ácido nítrico  y produce  un sedimento de color amarillo intenso, a esta reacción se le conoce  como prueba xantocromica. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. La reacción llevada a cabo es la siguiente:

“La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofilia aromática de los residuos de aminoácidos de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH acido.” [4]

3. Reacción de Biuret.

En esta prueba se realizó con cuatro sustancias, entre ellas aminoácidos y proteínas. En ella se pretendía determinar la presencia del enlace peptídico (-CO-NH-) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Da positiva esta reacción en todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas, que al momento de reacción presentan una coloración violeta, esto se da para las proteínas.

En los aminoácidos la prueba es negativa debido a la no presencia de enlaces peptídicos, y en ellos se observa precipitado de color amarillo.

Las sustancias trabajadas en laboratorio fueron:

Glicina y alanina: dan prueba negativa presentando un precipitado amarillo, por lo que son aminoácidos.

Albumina y leche: dan la coloración violeta indicando una prueba positiva, ya que la albumina es una proteína (presente en los huevos), y la leche está compuesta de diferentes proteínas (“Caseina, Beta-lactoglobulina Alfa-lactoalbúmina Lactoferrina, Lactoperoxidasa, Inmunoglobulinas, Lisozima” [5])

En los aminoácidos la prueba es negativa como en el caso de la glicina y la alanina, debido a que ellos no presentan enlaces peptídicos, mientras que las proteínas son conformaciones de aminoácidos o restos de ellos; que están unidos por medio de enlaces peptídicos(albumina y leche).

“En soluciones alcalinas Cu+2 se compleja con las uniones de péptidos de proteínas resultando en la formación de un color morado. La intensidad del color es proporción a la concentración de proteínas. Este método es generalmente aplicable porque el número de enlaces peptídicos por unidad de peso para todas las proteínas es casi el mismo.

Las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos -CONH2 unidos directamente o por un carbono o nitrógeno. Los compuestos que contienen -CH2NH2, -C(NH)NH2 Y -CSNH2 en lugar de los grupos -CONHH2. Las estructuras peptídicas se encuentran en proteínas y sus derivados contienen enlaces peptídicos también dan positivo para la prueba de Buiret.” [6]

la reaccion general es:

4. Reacción de los aminoácidos azufrados

En la reacción se obtuvieron los siguientes resultados:

Sustancia Precipitado de sulfato de plomo

Albúmina de huevo

Si

Cisteína Si Metionina Si Muestra biológica Si

(leche)Glicina No

La reacción de los aminoácidos azufrados se evidencia en la formación de un precipitado negro, sulfuro de plomo, correspondiente a la reaccionó entre azufre de la proteína (separado mediante un álcali) y la solución de acetato de plomo.

Los resultados obtenidos para cada uno de los tubos de ensayo fue la presencia de un precipitado de sulfato de plomo lo que evidencia la presencia de proteínas que contienen aminoácidos con azufre en su estructura, la albumina de huevo es rica en cisteína, contienen azufre en los aminoácidos. Para la cisteína al ser un aminoácido con el grupo tiol, contiene azufre el que puede reaccionar y formar el precipitado negro de sulfuro de plomo. En la muestra biológica se utilizó la leche la cual presenta  lacto albúmina. Es una proteína soluble, rica en aminoácidos azufrados. La metionina es un aminoácido que contiene azufre en medio de la cadena carbonada Glicina no presenta una prueba positiva por lo que no tiene presencia de azufre en su estructura

5. Reactivo del millón:

En la prueba realizada se obtuvieron los siguientes resultados:

Sustancia Color Prueba del millón

Tirosina Rojo Positivo Albumina de huevo

Tono blanco con Coágulos amarillos

Negativo

Glicina Transparente NegativoMuestra biológica

Tono café claro y presencia de costras

Negativo

“El reactivo de Millón se prepara disolviendo una parte de mercurio (Hg) en una parte de ácido nítrico (HNO3). De esta forma, la presencia de cantidades relativamente altas de mercurio conduce a la formación de Nitrato de mercurio (I) Hg2(NO3)2 el cual en un medio fuertemente ácido reacciona con el grupo -OH de la tirosina produciendo una coloración roja característica.[7]

La reacción del millón se debe a la presencia de grupos fenólicos, la tirosina presente en algunas proteínas tiene el grupo fenólico, de esta manera solo las proteínas que tienen este aminoácido entregan resultados positivos (un color rosado).

El resultados obtenido para la albumina fue un color amarillo, el reactivo del millón no actuó sobre la

albumina por lo cual el resultado fue negativo. El resultado para la glicina también fue negativo debido a que no tiene grupos fenoles en su estructura para reaccionar. En la muestra biológica se utilizó leche, aunque esta presenta una pequeña cantidad del aminoácido tirosina “(143mg de tirosina por 100g de leche entera)”[8], el color obtenido en la reacción fue café muy claro por lo que la prueba fue negativa. De la tirosina se obtiene una prueba positiva, lo cual indica que contiene aminoácidos con grupos fenoles es su estructura.

Imagen (http://www.scuolaitaliana.edu.uy/imgscuola/reaccion

es.pdf)

6. Reacción de Hopkins Cole:

La reacción de Hopkins Cole, es una prueba estándar para el triptófano y para las proteínas que contienen triptófano. La solución que se va a examinar se mezcla con ácido glioxílico y se agrega ácido sulfúrico concentrado. Un anillo entre violeta y rojo en la unión de los dos líquidos indica que la reacción es positiva.[9]

Sustancia Reacción de Hopkins cole

Triptófano Prueba positiva.

Sustancia orgánica (leche )

Prueba positiva.

Albumina Prueba positiva.

Glicina Prueba negativa.

La reacción para el triptófano exhibe la forma de un anillo violeta al fondo del tubo representando una prueba positiva, para la sustancia orgánica (leche) se observa la formación de un anillo violeta en la parte intermedia lo que representa una prueba positiva, ocasionado por las proteínas con triptófano de la leche. La prueba para la albumina también resulto positiva a diferencia de la glicina que arroja resultados negativos al ser un aminoácido deferente al triptófano.

Reacción de la prueba de Hopkins-Cole http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf

7. Desnaturalización de Proteínas

Luego de realizar el procedimiento de desnaturalización se observa la formación de coágulos blancos

El ácido acético es capaz de producir la desnaturalización de las proteínas

Las cadenas de proteínas que hay en la clara de huevo se encuentran enrolladas adoptando forma esférica, se denominan proteínas globulares al agregar el ácido acético las cadenas de las proteínas se desenrollan y formen enlaces que unen unas cadenas con otras. El ácido acético es capaz de producir la desnaturalización de las proteínas.

Desnaturalización. Es la pérdida o destrucción de la estructura terciaria de una proteína, en la que la proteína pasa de una forma plegada o enroscada a una forma desenroscada o desplegada. La hélice alfa se estira o despliega, por rompimiento de enlaces de hidrógeno. “En la proteína desnaturalizada ocurren cambios estructurales que afectan sus propiedades biológicas, como la hormonal, enzimáticas y la actividad inmunológica. Se produce una pérdida de solubilidad, ya que se exponen grupos hidrofóbicos que hacen insoluble la proteína. La desnaturalización es generalmente un proceso irreversible, fuertemente endotérmico, que produce un aumento de la entropía o desorden del sistema.Los principales agentes desnaturalizantes son: Altas temperaturas, provocan la coagulación, y Cambios bruscos de pH.[10]

CONCLUCIONES

- Las pruebas realizadas en el laboratorio de reconocimiento de proteínas y aminoácidos, permiten reconocer a los anteriores en laboratorio por pruebas que los caracterizan específicamente a ellos. Por lo cual estas pruebas ayudan en la identificación de aminoácidos o proteínas con ciertas características, en muestras biológicas.

- Las proteínas son conformaciones de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, lo que hace que entre aminoácidos y proteínas hallan semejanzas como diferencias, estas se pueden observar en las reacciones realizadas en laboratorio. Como en la prueba de observar la presencia de enlaces peptídicos solo es

positiva en las proteínas; mientras que en la prueba de detectar los grupos bencénicos se pueden encontrar pruebas positivas y negativas en proteínas como en aminoácidos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

[1]http://proteinas.org.es/proteinas-aminoacidos

[2]http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_xantoproteica

[3]Prácticas de Bioquímica Descriptiva Escrito por Eva Irma Véjar Rivera pg 166-167

[4]http://quimicadesexto2012.blogspot.com/2012/06/informe-de-la-experiencia.html

[5]http://www.pulevasalud.com/ps/contenido.jsp?ID=12706&TIPO_CONTENIDO=Articulo&ID_CATEGORIA=59&ABRIR_SECCION=2&RUTA=1-2-45-59

[6]http://es.scribd.com/doc/62055042/Reaccion-de-Biuret

[7]http://es.wikipedia.org/wiki/Reactivo_de_Millon

[8]http://alimentos.org.es/aminoacidos-leche-entera-vaca

[9]https://www.google.com.co/search?q=prueba+de+hopkins-cole&oq=prueba+de++hop&aqs=chrome.1.69i57j0l5.11705j

0j7&sourceid=chrome&espv=210&es_sm=122&ie=UTF-8[10]http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/proteinas/