1.- Introduccin XE "1.- Introduccin"

Contexto del problema y la prctica profesional

La importancia del estudio de la medicina de altura radica fundamentalmente en la prevalencia de la gran actividad laboral a gran altura existente en el norte grande de Chile, la cual se desarrolla sobre los 3000 metros de altitud, considerando principalmente la minera, la cual involucra un elevado nmero de personas, sobre los 50.000 de acuerdo al Instituto Nacional de Estadsticas (INE), los cuales se encuentran sometidos a la exposicin a gran altura de forma intermitente, lo que se conoce como el Modelo Chileno de Hipoxia Intermitente (Richalet, et al; 2002). Asimismo la medicina de altura tiene importancia porque genera ciencia bsica y aplicada en las patologas asociadas en esta rea. Uno de los pilares fundamentales para generar ciencia bsica en el rea de la medicina de altura es el desarrollo de la medicina molecular, la medicina genmica, la farmacogenmica, el diagnstico molecular y la terapia gnica, que han resultado ser de gran impacto en la biologa molecular y en todas las ciencias mdicas (Tenover et al., 1997). En la ltima dcada, las investigaciones en biologa molecular provocaron, desarrollos biotecnolgicos de fundamental importancia en el campo de la salud, el cual ha sido uno de los ms beneficiados con el desarrollo de esta tecnologa. Las investigaciones que se realizan en esta rea estn enfocadas a un diagnstico oportuno de enfermedades, as como su posible tratamiento a travs de la terapia que entrega este tipo de tcnicas moleculares. Adems, proporciona una herramienta fundamental para la solucin de futuras enfermedades mortales para el hombre (Cerezo y Madrid, 1995).El Instituto de Estudio de la Salud y Medicina de Altura, centra su investigacin en las patologas asociadas a la exposicin a la altura, principalmente en el rea cardiovascular, donde una de la lneas importantes de estudio la constituye una de las patologas ms prevalentes en altura como es la Hipertensin Pulmonar de Altura. Esta enfermedad, se caracteriza por presentar una presin arterial pulmonar promedio de > 30 mmHg o una presin pulmonar arterial sistlica > 50 mmHg medidas en la altura, hipertrofia ventricular derecha, insuficiencia cardaca, hipoxemia moderada y hematocrito elevado. La prevalencia de esta patologa a nivel mundial en poblaciones de altura es de un 10 a un 15% (Len-Velarde, 2003), y en poblaciones chilenas expuestas en forma intermitente se ha establecido una prevalencia de un 12% de sintomatologa y de hipertensin configurada de un 4% (Brito et al., 2007).Dentro de todos los estudios realizados en el IES se utilizan diversas tcnicas, con las cuales se puede dilucidar los posibles mecanismos involucrados en patologas asociadas a la altura, algunas de estas tcnicas involucran: extraccin de protena, a travs del uso del buffer de lisis RIPA, obtencin de RNA por medio del Mtodo de Chomczynski, adems de tcnicas colorimtricas correspondiente al Mtodo de Bradford y la determinacin de los Niveles de Lipoperoxidacin Lipdica. La motivacin de esta prctica profesional, en el Instituto de Estudios de la Salud y Medicina de Altura, fue no solo conocer, estandarizar y realizar tcnicas especficas, sino tambin ser parte de un proyecto conjunto, que llev a participar en otras etapas del protocolo e interactuar en un ambiente cientfico, donde se particip activamente en todas las diferentes actividades del IES: como reuniones de coordinacin, vigilancia del protocolo general, interaccin con acadmicos extranjeros, discusin de problemas, discusin de resultados, ingreso de datos, anlisis de datos y procesos administrativos.2.- Objetivos2.1.- Objetivo General Conocer y desarrollar tcnicas de laboratorio, procesos de gestin administrativa, cooperacin internacional, aprendizaje de mtodo cientfico de investigacin en el Instituto Estudios de la Salud de la Universidad Arturo Prat, el cual est enfocado en la Salud Ocupacional en la Medicina de Altura.2.2.- Objetivos Especficos - Conocer el manejo administrativo del Instituto Estudios de la Salud, con el fin de adquirir experiencia a la hora de generar la peticin de algn bien o producto necesario en una empresa.- Relacionarse con acadmicos extranjeros, hacindose participe del aporte que estos entregan al Instituto Estudios de la Salud.- Efectuar tcnicas de extraccin de muestras de tejido, adems del mtodo cientfico y el proceso de una investigacin.

- Realizar la extraccin de RNA de tejido de rin a travs del Mtodo de Chomczynski. -Efectuar la extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar, atreves del buffer de lisis RIPA.

- Medir la concentracin de protena por medio del Mtodo de Bradford.

- Adquirir experticia en el diseo y desarrollo de investigacin.-Adquirir conocimientos de un mtodo para medir dao oxidativo, utilizando T-BARS. 3.- Descripcin de la Empresa

El Instituto de Estudios de Salud y Medicina de Altura (IES), perteneciente a la Universidad Arturo Prat, el cual depende de Vicerrectora de Investigacin, se crea el 13 de Agosto de 1996 en la ciudad de Iquique, con la misin de responder a las crecientes demandas de Educacin de pre y postgrado, investigacin en Salud y de los fenmenos fisiolgicos y patolgicos de la minera en altura de la 1ra regin. Esto con el objetivo de poder entregar y / o proponer respuestas y / o soluciones a las necesidades acadmicas y de investigacin de la regin en el mbito de la salud. Especialmente en aquellos que sean de especial preocupacin de la UNAP. Asimismo, actuar como facilitador y puente en el desarrollo de estas materias entre la Universidad y la Comunidad externa demandante. Su visin es poder lograr un centro de investigacin de primera lnea que abarque desde el rea de salud pblica en conjunto con la fisiologa molecular de acuerdo a las necesidades de salud regionales. Las lneas de investigacin estn centrada en:1) Lnea Matriz Primaria, (Hipoxia Hipobrica Intermitente): estudiados en dos mbitos.- Seres Humanos (Epidemiologa Clnica y sus variantes): esto involucra enfermedades de altura, efectos sobre la salud de las personas, calidad de vida y efectos de la adaptacin y desadaptacin en seres humanos.- Laboratorio (Adaptacin en Animales): Efectos fisiolgicos, celulares, moleculares, y efectos morfolgicos de adaptacin en animales y rganos especficos; adems de la lnea de nutracuticos posibles para mitigacin.2) Lnea Matriz Secundaria, (Epidemiologa General): involucra enfermedades y salud poblacional, estudios poblacionales focalizados y estudio factores riesgo de enfermedad.Actualmente el Instituto de Salud cuenta con un grupo consolidado en hipoxia y trabajo en altura intermitente, multidisciplinario y transversal en el enfrentamiento de la investigacin. Se orienta hacia la investigacin aplicada y para esto tiene investigadores con alto grado acadmico (doctorados) que adems realizan docencia. El Instituto de Salud tiene como soporte una amplia red de investigacin Internacional y Nacional, donde se ha convertido en un referente en el orden nacional, en relacin a los 4 grupos existentes en Chile e Internacional en Hipoxia Intermitente. Realiza consultoras pblicas y privadas, adems de realizar consultoras en el diseo de polticas pblicas sobre el tema de hipoxia de altura, lo que ha convertido a los integrantes del Instituto en miembros de la comunidad internacional en hipoxia de altura, en calidad de expertos cientficos.Algunas de las redes nacionales e internacionales que cooperan con el Instituto de Salud en las diferentes lneas de investigacin son la Universidad Cayetano Heredia de Per, La Universidad Autnoma de Madrid, Espaa y la Universidad de Hamburgo Alemania, Universidad Catlica del Norte de la Serena, Universidad de Chile, Universidad de Concepcin y Universidad de Tarapac, con destacadsimos acadmicos y doctorados en el rea, como lo es la Doctora Fabiola Len Velarde, de la Universidad Cayetano Heredia del Per, as como, el Dr. Rainer Boger de la Universidad de Hamburgo, Alemania entre otros igualmente importantes tanto en el campo internacional como el nacional.Adems dentro de sus redes de investigacin y cooperacin con instituciones o empresas del sector pblico se encuentra, la SEREMIA de Salud, Tarapac, Servicio de Salud, Iquique y el Ejrcito de Chile. Por otra parte el sector privado como el Consejo Minero, la Compaa Minera Doa Ins de Collahuasi y el Instituto de Seguridad del Trabajo que han sido un gran soporte para el desarrollo de un vstago de investigaciones realizadas por el Instituto de Salud.La organizacin por lo tanto del grupo integral, que realiza la investigacin est constituido de la siguiente forma:Figura 1: Estructura organizacional del Instituto de Estudios de Salud.La prctica profesional fue realizada en el laboratorio del IES, con dependencia administrativa del Encargado de Investigacin, que est dedicado al desarrollo de proyectos en el rea de Salud Ocupacional en la Medicina de Altura, desde estudios poblacionales hasta estudios de carcter biotecnolgicos aplicados en animales y en humanos.El trabajo realizado en el Instituto de Salud, consisti en una serie de actividades que involucraron el anlisis molecular, como extraccin y purificacin de ADN y RNA, tcnicas colorimtricas. Adems de tareas administrativas, atingentes a la investigacin, tales como cotizaciones, participacin en diseos de primer, compras de insumos, interactuar con acadmicos, participacin en cursos de post grados.4.- Desarrollo del TemaLa prctica se inici a partir de la entrega del protocolo diseado por el IES en conjunto con la Universidad de Eppedorff de Hamburgo, Alemania, asimismo se realiz la compra de los insumos y materiales necesarios, adems del tratamiento de las muestras para su posterior uso en la realizacin de todas las pruebas como: la extraccin, purificacin de ADN, RNA y tcnicas colorimtricas, en el IES. 4.1.- Variables a realizar En esta prctica se realizarn las siguientes variables: se proceder a la extraccin de los tejidos de rin, hgado y pulmn, para su posterior uso en las tcnicas utilizadas en el IES. Se efectuaran tcnicas de extraccin, purificacin y concentracin para obtener tanto protena como RNA, adems se medir el dao oxidativo provocado por la exposicin a la altura. Todas estas tcnicas sern explicadas a continuacin.4.1.1.- Extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar La metodologa empleada para la extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar consisti en lo siguiente: Previo al protocolo de extraccin de la protena en arteria pulmonar se debe preparara el buffer de lisis RIPA, el cual debe ser preparado en el momento de procesar las muestras, este buffer consiste en diversos reactivos. La cantidad de buffer a preparar depende del peso de la muestra. Tabla 1: Preparacin del buffer de lisis RIPAReactivos para el buffer de Lisis (RIPA)Concentraciones de los reactivos utilizados

Leupeptina1mg/mL

NaF0,5M

NaCl5M

DTT1M

Hepes1M

EDTA0,1M

EGTA0,5M

PMSF0,2M

Glicerol20%

La metodologa utilizada para la extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar con RIPA fue: se procedi a pesar (Balanza Analtica, BEL Ingineering, Ser N: IT1001526, Max 210g, Made In Italy) y utilizar la totalidad de la arteria, la cual se introduce en un tubo Eppendorf, posteriormente se aade nitrgeno lquido para que la muestra quede congelada, de esta forma ser ms eficaz la homogenizacin de la muestra. Seguido se pulveriza la arteria con la ayuda de un homogenizador de vstago (Glass-Col Terre Haute, in USA, 6000rpm) para Eppendorf. A continuacin se aaden 200-300L de buffer por cada arteria, agitar las muestras en vortex. Enseguida dar un choque trmico a las muestras, despus congelar las muestras con nitrgeno lquido nuevamente y descongelar en bao a 37C (se debe repetir este procedimiento por 4 veces). Terminado lo anterior, extraer el sobrenadante. Finalmente cuantificar la protena por el Mtodo de Bradford.4.1.2.- Cuantificacin de Protena: Mtodo de Bradford

La tcnicas utilizada para determinar la concentracin de protenas totales presentes en el tejido de arteria pulmonar fue: se realiz previamente una curva de calibrado, donde en tubos con concentraciones ya determinadas de BSA (1,5; 2,5; 5,0 y 10 g/mL) diluidas en agua destilada se le agreg el colorante Bradford (Comassie Blue G-250) y se dej incubar por 5 minutos a temperatura ambiente libre de luz, luego se midi la absorbancia por triplicado (Tabla 6) en un biofotometro (eppendorf AG Biophotometer) a una longitud de onda de 595 m.Tabla 2: Concentracin estndar de BSA por mtodo de Bradford (triplicado) a 595mBSA

[1,5 g/mL]BSA

[2,5g/mL]BSA

[5,0g/mL]BSA

[10g/mL]

TUBO 1ABSTUBO 2ABSTUBO 3ABSTUBO 4ABS

10,18410,26010,48410,833

1`0,183 1`0,258 1`0,481 1`0,825

1`` 0,184 1`` 0,260 1`` 0,483 1`` 0,822

BLANCO0,000

Una vez estandarizada la curva de calibrado, se extrae una alcuota de sobrenadante (1,5L) de la muestra y se almacena en tubos de 1,5mL donde se diluye con agua destilada y se agrega el colorante Bradford (Comassie Blue G-250), se deja incubar por 10 minutos a temperatura ambiente libre de luz, finalmente se mide la absorbancia y se determina la concentracin de protenas en la muestra por medio de un biofotometro (Eppendorf AG Biophotometer, Hamburgo; Alemania),a una longitud de onda de 595nm.La determinacin de la concentracin de protena se vio afectado por la inadecuada homogenizacin del tejido arterial de pulmonar, por lo cual se postergo la medicin de estas concentraciones y solo se obtuvo la curva de calibrado.

4.1.3.- Extraccin de RNA total: Mtodo de Chomczynski4.1.3.1.- Homogenizado del Tejido

Se utiliza el siguiente mtodo estandarizado previamente: se procede a pesar (Balanza Analtica, BEL Ingineering, Ser N: IT1001526, Max 210g, Made in Italy) la cantidad necesaria de tejido, en este caso se utiliz rin, se tomaron 50mg de ste, seguido se agregan 0,5mL de la solucin de Chomczynski, posteriormente se centrifuga a 12.000rpm por 10min. Finalizada la homogenizacin se realiza la separacin de fases.4.1.3.2.- Separacin de Fases

Para la separacin de faces se procede de la siguiente forma: la muestra obtenida en la homogenizacin anterior se deja incubar a temperatura ambiente durante 5min. En este paso se puede guardar la muestra a -20C. Si se utiliza la muestra el mismo da se extraer el sobrenadante y se agrega 01mL de cloroformo, a continuacin se agita vigorosamente por 15seg. incubndose la muestra durante por 2-3min. a temperatura ambiente, finalmente se centrifuga la muestra a 12.000rcf por 15min. a 28C.

4.1.3.3.- Precipitacin del RNA El precipitado de RNA se obtiene de la siguiente manera: Finalizada la separacin de fases se procede a la precipitacin del RNA, se debe transferir la fase acuosa superior a un tubo Eppendorf nuevo, se precipita el RNA aadiendo 0.25mL de alcohol isoproplico. Mezclar e incubar por 10min. a -20C. Seguido se centrifuga la muestra a 12.000rcf por 15min. a 2-8C, pasado el tiempo se elimina el sobrenadante y se lava el precipitado de RNA con 0,5mL de alcohol etlico al 75%, en esta etapa se retira el sobrenadante quedando solo el precipitado. A continuacin la muestra se centrifuga a 7.500rcf por 5min. a 2-8C. Terminada la centrifugacin se elimina el sobrenadante y secar el precipitado al aire por 5-10min. Disolver el RNA en 50L de agua libre de nucleasa (no se debe resuspender y se debe guardar inmediatamente a -20C). Finalmente cuantificar por espectrofotmetro (Thermo Electron Corporation GENESYS 6, USA) a una concentracin de 260 m para RNA. Con el propsito de verificar la integridad del RNA extrado y descartar aquellas preparaciones que presentaran degradacin y contaminacin con protenas y alcoholes, se procedi a medir a travs del biofotmetro (Eppendorf AG, Biophotometer, Hamburgo, Alemania) con un rango de absorbancia de 260-280m y de 260-230m, respectivamente, al da siguiente.El RNA obtenido se utilizara con posterioridad para el anlisis de Real Time-PCR.4.1.4.- Mtodos para medir el dao oxidativo: Nivel de Lipoperoxidacin de Lpidos por medio de TBARSPara medir el dao oxidativo se procede con el siguiente protocolo: previamente al protocolo de extraccin, se debe preparar el buffer de RIPA el cual consiste en los siguientes reactivos, con sus respectivas concentraciones. Tabla 3: Preparacin del buffer de RIPA para medir Nivel de Oxidacin de Lpidos

Reactivos para el buffer de lisis (RIPA)Concentraciones de los reactivos utilizados

EDTA1M

PMSF2M

NaCl150L

Tris-HCl50M

SDS0,1%

Tritn X-1001%

Se deben pesar (Balanza Analtica, BEL Ingineering, Ser N: IT1001526, Max 210g, Made In Italy) 0,05mg de tejido (se utilizo hgado y rin) a las muestras se le agrega el buffer de lisis RIPA (la descripcin de los reactivos para realizar el RIPA se encuentran en la tabla 3), posteriormente se procede a homogenizar la muestra por medio del homogenizador de vstago (Glass-Col Terre Haute, in USA, 6000rpm). En esta etapa la muestra homogenizada se puede guardar a -20C, si as se lo requiere. Siguiendo el protocolo se extraen 100L del homogenizado y se incorporan 200L de TCA (Tricloroacetico). Se debe esperar 30min. Luego se centrifuga la muestra a 2.200rfc por 15min. a 4C. Seguido se elimina el sobrenadante y se aade el TBA al 0,67% (200L). Despus se lleva a 100C por 30min. Pasado los 30min. se debe dejar en completa oscuridad la muestra por 15min. hasta enfriar y en ltimo lugar se toman 400L de la muestra para medir la concentracin a travs del espectrofotmetro (Thermo Electron Corporation GENESYS 6, USA) a una longitud de 532m. Los datos obtenidos fueron normalizados con respecto a la concentracin de protena obtenida mediante el ensayo micro Bradford.4.1.5.- Ensayo de micro Bradford

La metodologa para la cuantificacin de protenas extradas fue: el mtodo de micro Bradford (Bradford, 1976), para el cual se requiri realizar una curva estndar utilizando albmina de suero bovino (BSA) preparada como indica la tabla 3, punto 4.1.2. Posteriormente se procedi a cuantificar las muestras en estudio con un factor de dilucin 1:999. Se adicion 960L del reactivo Bradford (bioRad) a los estndares y muestras en estudio. A continuacin estas fueron incubadas en obscuridad durante 15 minutos y ledas en un biofotomtro (Eppendorf AG, Hamburg, Germany). Obteniendo la concentracin de protenas en g/mL. Cada muestra se midi por duplicado.4.1.6.- Otras actividades: Curso de Estadstica en Ciencias de la Salud y su Aplicacin InformatizadaDentro de las actividades realizadas en el IES se describe el siguiente curso: Como parte de las actividades realizadas en la prctica profesional se particip en el curso de - Estadstica en Ciencias de la Salud y su aplicacin informatizada -, enmarcado dentro del proyecto Gore - Tarapac, denominado, "Medicina y Biologa de Altura para la Regin de Tarapac", FNDR - BIP 30125349-0. El curso, se efectu desde el 8 de abril y culmino el 10 de abril, donde se trataron los conceptos y herramientas estadsticas utilizadas en Estadstica en Ciencias de la Salud, adems de su aplicacin informatizada para profesionales con inters en investigacin de origen regional en salud de altura o en temas relacionados, curso que equivale a un crdito correspondiente a diplomado o mster (Anexos 1, 2, 3, 4).

El curso fue dictado por el Profesor, Dr. Juan Jos de la Cruz Trocca, Profesor asociado del Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pblica, de la Facultad de Medicina, de la Universidad Autnoma de Madrid., posee una gran experiencia en estadstica aplicada, a participado en mltiples proyectos de Investigacin Europeos y cuenta con una extensa cantidad de publicaciones. Adems, posee una colaboracin de ms de 8 aos con la Universidad Arturo Prat a travs del convenio existente y con el Instituto de Estudios de la Salud, habiendo participado en mltiples proyectos colaborativos y publicaciones en conjunto especialmente en el tema de Medicina de Altura. Al finalizar el curso se realiz una evaluacin la cual consisti en preguntas estadsticas aplicadas a un modelo de estudio poblacional, dicha evaluacin fue realizada en conjunto con otros dos alumnos del IES, con lo cual la suscrita aprob con nota 6.9.

4.1.7.- Estudio de CohorteDentro de las actividades realizadas en el IES se dio apoyo al estudio de cohorte realizado en el mes de abril en la ciudad de Arica, con el fin de medir diversas condiciones de resistencia en conscriptos del fuerte militar de Arica, tanto a nivel del mar como en altura. Adems se tomaron muestras de sangre para determinar la Actividad Arginasa especfica en el IES. 4.1.7.1.-Estudio en humanos

Finalizadas las pruebas y exmenes basales a los conscriptos militares se precedi a extraer una muestra de sangre las cuales en parte fueron analizadas por el laboratorio clnico BIONET de Arica y el plasma fue alcuotado para efectuar la determinacin de Actividad Arginasa en el IES.5.- Resultados5.1.- De la prctica general

1.- Se logr la integracin a un equipo de trabajo cientfico, en una institucin como el IES, que lleva varios aos en investigacin y que posee un reconocimiento nacional e internacional en el tema de hipoxia.2.- Durante la prctica se gener un contacto directo, entre alumno y distinguidos acadmicos en el rea de investigacin tanto nacional (Dr. Patricia Siques; Dr. Julio Brito, IES), como internacional (Dr. Fabiola Len-Velarde, Universidad Peruana Cayetano Heredia; Lima, Per; Dr. Juan Jos de la Cruz Universidad Autnoma de Madrid, Espaa). El Dr. Juan Jos de la Cruz, dicto el curso de Estadstica en Ciencias de la Salud y su aplicacin informatizada, el cual aporto al conocimiento y manejo de estudios estadsticos para la salud aplicable al rea de medicina de altura.3.- La prctica permiti adquirir una mayor experiencia, con nuevos grupos de trabajo multidisciplinarios en el laboratorio (IES) durante el transcurso de una investigacin en la prctica.4.- Se adquiri un aprendizaje y el logro de experticia en tcnicas de estudio biomolecular, importante para el desempeo profesional a futuro, cmo tcnicas de extraccin y purificacin de protena a travs del lisado de la muestra con RIPA y RNA por medio del mtodo de Chomczynski, adems de tcnicas colorimtricas como es el mtodo de Bradford y la medicin de nivel oxidativo en lpidos.5.- Esta prctica fue tutelada en las diferentes etapas de una investigacin cientfica.5.1.1.- De la investigacinA continuacin se presentan un resumen de las tcnicas realizadas correspondiente a la extraccin de protena en tejido de arteria pulmonar de rata y RNA de rin e hgado de rata, en conjunto con tcnicas colorimtricas como el mtodo de Bradford y Nivel de Oxidacin de Lpidos, realizadas durante la prctica profesional efectuada en el IES.5.1.2.- Variables Realizadas 1.- En este caso se quiso obtener de manera ntegra la mayor cantidad de protena posible de arteria pulmonar, esta cantidad ser utilizada para su posterior anlisis con la tcnica de Western Blot, con el fin de medir los niveles de protena especficas. Para poder extraer la protena en el tejido se utiliz el buffer de lisis RIPA el cual consiste en un stock de reactivos a diferentes concentraciones (Tabla 2), esta buffer se prepara dependiendo de la cantidad que se quiera utilizar. Una de las funciones que cumple el buffer RIPA es inhibir proteasas y fosfatasas presente en la muestra, ya que estas pueden interferir en la obtencin de la protena de inters.2.- El mtodo utilizado para cuantificar la cantidad de protena presente en el tejido de arteria pulmonar fue el mtodo de Bradford. El principio se basa en emplea un colorante hidrofbico cuya disoluciones acuosas en presencia de Ac. Fosfrico tiene un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una protena, origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Para determinar la concentracin de protena total presente en una muestra se requiere la preparacin de una curva de calibrado empleando una protena patrn, que generalmente suele ser la seroalbmina bovina. Con esta tcnica se pudo cuantificar de manera eficiente la protena en el tejido de estudio.

3.- Para la extraccin de RNA se utiliz el mtodo de Chomczynski, el cual se basa en el uso de una solucin monofsica de fenol e isotiocianato de guanidina para la lisis de las clulas y la separacin de las muestras en dos fases (acuosa y orgnica). Seguida de la extraccin y precipitacin del RNA total con cloroformo e isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa. A travs de este mtodo se pudo obtener RNA, comprobando tanto su concentracin como su pureza, por medio de espectrofotometra y biofotometro respectivamente.

4.- La tcnica de TBARS, determina la reaccin de sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS) de las cuales el MDA (malondialdehdo) es el producto ms importante de la oxidacin de los cidos grasos poliinsaturados. El MDA es el aldehdo ms significativo obtenido en dicha degradacin y tambin el ms cuantificado. El MDA, en condiciones de bajo pH y alta temperatura, reacciona con el cido tiobarbitrico (TBA) dando lugar a un aducto MDA-TBA cromgeno o pigmento rojo que es detectable por espectrofotometra. El objetivo de este estudio ha sido determinar las condiciones experimentales ptimas para la determinacin de los lipoperxidos, mediante la reaccin con TBA, con el fin de establecer una pauta de trabajo que permita el anlisis rutinario y la obtencin de resultados reproducibles. Bajo este protocolo se logr medir el dao oxidativo en tejido de hgado y rin. 5.- En cuanto al curso de estadsticas se logr el aprendizaje del programa estadsticos SPSS para ser aplicados en el rea de la salud, especficamente en el rea de altura, guiado por el profesor experto en estadstica Dr. Juan Jos de la Cruz, quien explico de manera didctica con un caso de estudio estadstico real, pudiendo comprender cada una de las funciones estadsticas del SPSS6.- Por ltimo la participacin en el estudio de cohorte, como en el caso del proyecto de investigacin con los conscriptos militares de la regin de Arica y Parinacota, a cargo de la Dra. Patricia Siqus, fue de mucho agrado y de gran importancia para el rea de la biotecnologa mdica, ya que permite tener conocimiento sobre las etapas, los protocolos a utilizar y las etapas administrativas y burocrticas necesarias para realizar estudios de este tipo, con seres humanos, como parte del desarrollo en el rea profesional, para futuros ensayos clnicos.6.- Discusin1.- Un paso importante al momento de tratar un tejido y obtener protena, es extraer de manera eficiente la mayor cantidad de protenas en la muestra. En este caso fue uno de los puntos ms complicados ya que el tejido de arteria pulmonar a utilizar era demasiado fibroso, lo cual hace que el tejido vuelva a su estado original dificultando su homogenizacin. No tan solo la constitucin del tejido fue una dificultad, tambin lo fue el homogenizador, puesto que no se tena el vstago adecuado para poder homogenizar de manera eficiente la muestra de tejido. Tambin un probable problema es la falta de detergente que se deben adicionar para tratar la muestra de forma ms eficaz y as conseguir la mayor cantidad de protena posible. A pesar de que el RIPA es uno de los buffer de extraccin altamente eficiente para la lisis celular rpida y posee una buena solubilizacin sobre una amplia gama de protenas, aumentada an ms su compatibilidad con la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa, la capacidad para minimizar la unin de protenas no especficas conducen a un menor error en la inmunoprecipitacin y su idoneidad para la cuantificacin de protena (Ngoca, 2008), no pudo lograr una adecuada extraccin de protena, por lo que puede modificarse el protocolo para que sea mucho ms eficiente en este tipo de tejido. 2.- Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos (Suelter, 1985). El mtodo de Bradford es simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas (Bradford, 1976).

Considerando lo anteriormente mencionado se debe tener mucho cuidado al momento de realizar esta tcnica, ya que si el reactivo de Bradford llega ser expuesto a la luz este reacciona dando resultados invlidos al momento de la lectura de la concentracin de protenas, por lo tanto, puede llegar a ser una tcnica fcil y adecuada para medir protenas, pero verse obstaculizada por no controlar de manera exhaustiva el procedimiento del protocolo en su totalidad.3.- La purificacin de RNA es otro paso clave en la experimentacin en Biologa Molecular. Cuando se trabaja con clulas de mamfero existen dos posibilidades: purificar RNA total o mRNA (en base a la cola de poliA) (Prieto et al 2006). La purificacin de RNA es la base de la cuantificacin de transcritos en estudios de expresin gnica. La clave de la purificacin de RNA radica en evitar su degradacin por accin de las ribonucleasas (Falcn et al 2004). De manera que todos los protocolos existentes se basan en la rpida inactivacin de dichas enzimas. El mtodo de "Un solo Paso" originalmente descrito por Chomczynski y Sacchi permite aislar ARN de manera ms simple y rpida, aunque se le atribuyen dificultades en la recuperacin (Sambuccetti y Snchez, 1996). Es por esta razn que se debe tener gran precaucin al momento de seguir el protocolo de manera adecuada, para no provocar algn tipo de contaminacin sobre la muestra, ya sea con agentes externos, como polvo en suspensin, amilasa salival entre otros, tambin otro punto a considerar es tener los reactivos adecuados, ya que si se realiza este protocolo con un reactivo con aos de uso, puede que la muestra no sea extrada apropiadamente, provocando lecturas errneas. No tan solo estos puntos son importantes, si no que el trasvasije de la muestra a los tubos Eppendorf y la homogenizacin se deben considerar para poder obtener de manera eficiente y eficaz la mayor cantidad de RNA de la muestra. 4.- Entre la variedad de mtodos analticos desarrollados para determinar el dao oxidativo de los lpidos, el ms comnmente utilizado se basa en la reaccin del malondialdehdo con el cido 2-tiobarbitrico (TBA) para formar aductos cromgenos y fluorescentes de MDA-TBA muy estables y que se pueden cuantificar por espectrofotometra de absorcin visible o por fluorimetra (Estepa et al, 2001). En este caso la se pudo ver la formacin de cromgenos en la muestra la cual dio una lectura indicando la presencia del nivel oxidativo en las muestras utilizadas, no obstante uno de los pasos que dificulto la formacin de este cromgeno fueron los tubos Eppendorf utilizados para realizar el ensayo, ya que al momento de colocarlos a una temperatura de 100C estos tubos se abran de manera abrupta haciendo que se volatilizara en su totalidad la muestra, lo cual provocaba un retraso en el protocolo, al repetir las muestras perdidas por esta proceso del protocolo, esto se pudo solucionar sellando de forma hermtica los tubos con parafilm, lo cual mejoro bastante el procedimiento. 5.- El curso de estadstica fue de gran ayuda ya que se podr usar todo lo aprendido en las tesis a realizar en el IES, aplicando el conocimiento a cabalidad, al momento de generar los modelos estadsticos con los resultados obtenidos en una tesis.

6.- Al participar en el estudio de cohorte se pudo apreciar los diversos procedimientos y recursos que se requieren para elaborar en este tipo de estudios.

7.- Aportes de la Prctica profesional

7.1.- Aporte de la prctica hacia la institucin patrocinante

Esta prctica permiti desarrollar tcnicas utilizadas en el laboratorio de altura, para ser usado por los investigadores y futuros alumnos en prctica, tesistas u otros interesados en el aprendizaje de estas tcnicas, como fueron extraccin de protena por RIPA, extraccin de RNA por Chomczynski y tcnicas colorimtricas como Bradford y TBARS. Tambin la colaboracin en otras investigaciones del IES.7.2.- Aporte de la prctica hacia la profesin

Fortalecer y ampliar los conocimientos de la suscrita en un aspecto novedoso y muy til en su futura profesin. As, se ve fortalecido desde el rea molecular, las diversas tcnicas conocidas y empleadas en el laboratorio del IES las cuales tienen una variedad de funciones y aplicaciones. Este conocimiento tiene aplicabilidad profesional tanto en aspectos laborales como de investigacin. Integrarse al mundo cientfico y a redes internacionales de investigacin, que sern de extraordinaria utilidad en el futuro para el desarrollo profesional de la suscrita. Familiarizarse con diferentes aspectos de los procesos administrativos de una organizacin y los requisitos en toda investigacin.7.3.- Aporte de la prctica como cientfico Colaborar y aprender las metodologas del desarrollo y de un diseo de protocolo, desde la extraccin de protena y RNA, junto con tcnicas colorimtricas como RIPA y TBARS conociendo cada etapa de estos protocolos para su futura reproduccin ya sea en tesis o colaborando en dichos protocolos realizados en la IES. Creacin de vnculos profesionales con otras instituciones interesados en realizar anlisis con la tcnica implementada.Familiarizarse con la metodologa en una investigacin.

Conseguir el financiamiento para la tesis profesional.

7.4.- Limitaciones

Conocer las tcnicas lleva tiempo y gasto de insumos ya que en el proceso de aprendizaje, se suelen demorar los tiempos, para llegar a obtener los resultados adecuados y estos sean reproducibles a futuro.Se presentaron problemas administrativos que dificultaron la adquisicin de recursos, pero fueron subsanado rpidamente por el equipo a cargo del proyecto.7.5.- Fortalezas

El apoyo cientfico del personal de del instituto fue de gran ayuda en esta prctica profesional para poder familiarizarse, conocer y aprender a cabalidad las tcnicas aprendidas, ya que estas tcnicas sern aplicadas en diversas tesis profesionales que se realizaran durante el ao 2013. La implementacin del laboratorio del IES que permiti la realizacin de todas las tcnicas necesarias.Cursos de capacitacin, integracin a equipo de trabajo y participacin en proyectos como Proyecto de Medicina y Biologa de Altura para la Regin de Tarapac GORE Tarapac (FNDR - BIP - 30125349-0), 2012-2014. Conseguir apoyo para la tesis profesional con la ayuda del Proyecto de Medicina y Biologa de Altura para la Regin de Tarapac GORE Tarapac (FNDR - BIP - 30125349-0), 2012-2014.8.- ConclusinEsta prctica permiti conocer: Las diversas tcnicas utilizadas en el IES para obtener de manera apropiada protena y RNA, bajo un protocolo adecuado y si es necesario ser adaptado dependiendo del tipo de tejido a utilizar en el estudio.

No tan solo conocer tcnicas de obtencin si no tambin tcnicas de cuantificacin, las cuales a travs de la colorimetra se puede obtener la concentracin de protenas de inters o bien el nivel de Lipoperoxidacin Lipdica presente en una muestra.

El conocimiento en el rea estadstica gracias al curso de Estadstica en Ciencias de la Salud y su aplicacin informatizada, fue de gran ayuda ya que reafirmo los conceptos ya adquiridos en mis aos de estudios y a la ves podr ser aplicados en mi tesis profesional.

Igualmente acrecent mi formacin profesional, el aprendizaje amplio y completo, del manejo administrativo desde cotizaciones hasta compra de insumos y materiales, de interrelacionar y mantener comunicaciones con personas expertas en el rea local, nacional e internacional. Asimismo, la administracin de conceptos claves para desarrollar y aprender la lnea de investigacin en hipoxia hipobrica crnica e intermitente y por ltimo lograr mediante todo el conocimiento adquirido en la prctica. Se logr la participacin en un grupo de trabajo y el aprendizaje de medos de investigacin aplicados, adems de la participacin de estudio de cohorte en la regin de Arica y Parinacota. 9.- Bibliografa 1.- Cerezo J., Madrid V. (1995). Tcnicas, estrategias y usos de biologa molecular en medicina. Rev Invest Clin, 126, 603-11.2.- Richalet, J., Donoso, M., Jimenez, D., Antezana, A., Hundson, C., Cortes, G., Osorio, J. and Len, A. 2002. Chilean miners commuting from sea level to 4500 m: a prospect study. High Alt. Med. Biol. 3(2):159166.3.- Leon-Velarde, F., Maggiorini, M., Reeves, J., Aldashev, A., Asmus, I., Bernardi, R., Hackett, P., Kobayashi, T., Moore, L., Penaloza, D., Richalet, J., Roach, R., Wu, T., Vargas, E. y Zubieta-Calleja, G.2005. Consensus Statement on Chronic and Subacute High Altitude Diseases. High Altitude Medicine and Biology. 6(2):147-57.

4.- Brito, J., Siqus, P., Len Velarde, F., De la Cruz, JJ., Lopez, V. y Herruzo, R. 2007. Chronic intermittent hypoxia at high altitude exposure foro ver 12 years: assessment of hematological, cardiovascular, and reanl effects. High Alt Med Biol 8(3):236-244.5.- Tenover, F., Robert, D. and Goering, R. 1997. How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists. Infection Control and Hospital Epidemiology. 18 (6): 426-439.6.- Falcn, L. I., E. J. Carpenter, F. Cipriano, B. Bergman y D. G. Capone. 2004. N2-fixation by unicellular bacterioplankton in the Atlantic and Pacific Oceans: phylogeny and in situ rates. Applied Environmental Microbiology 70: 765-770.7.- Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.8.- Suelter CH. 1985. A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & Sons, New York.

9.- Prieto, J., Lpez, J., Pueyo, C. 2006. Purificacin de cidos nucleicos. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba.10.- Ngoka, L.C. 2008. Sample prep for proteomics of breast cancer: proteomics and gene ontology reveal dramatic differences in protein solubilization preferences of radioimmunoprecipitation assay and urea lysis buffers. Proteome Sci. Oct 24;6:30.11.- Sambuccetti, N. y Snchez, M. 1996. Modificaciones al Mtodo de "Un Solo Paso" para la Obtencin de ARN de Clulas y Tejidos Animales. Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, A.A. 14490, Santaf de Bogot, Colombia. Revista Colombiana de Qumica. Bogot (Colombia). Volumen 25. Nos. I - 2 de 1996.12.- Estepa, V., Rdenas, S., Martn M.C. 2001. Optimizacin de un Mtodo para la Determinacin de la Peroxidacin Lipdica en Suero Humano. Seccin Departamental de Qumica Analtica. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense. 28040. Madrid (Espaa). Anal. Real Acad. Farm. 67.10.- AnexosCurso de Estadstica en Ciencias de la Salud y su Aplicacin Informatizada

1.-

2.-3.-

4.-IdNombre de la tareaDuracinComienzoFin

1PRACTICA LABORAL2 meses y 12 das1 Marzo12 Mayo

2Etapa 1

3Adquisicin de Insumos y Materiales13 das2 marzo15 Marzo

4Preparacin de Material de Investigacin13 das2 Marzo15 Marzo

5Etapa 2 Toma de Muestras3 das17 Marzo20 Marzo

7Etapa 3

8Extraccin de Protena de Arteria pulmonar25 das15 Marzo10Abril

9Cuantificacin Proteica y Enzimtica8 das10 Abril18 Abril

10Extraccin de ARN de Rin30 das12 Abril12 Mayo

11Participacin Estudio de Cohorte10 das16 Abril26 Abril

12Etapa 4

13Anlisis de Datos4 das13 Mayo17 Mayo

14Etapa 5

15InformesAbrilMayo

16Informe Final20 Mayo

Total de Horas576 horas

5.- Organizacin del tiempo, durante la prctica laboral.

*no se incluyen las horas por fines de semana.

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