INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA PRECLÍNICA

TÍTULO DEL PROYECTO

EFECTO DE LA α-ASARONA Y DOS ANÁLOGOS CON ACTIVIDAD HIPOCOLESTEROLÉMICA EN LA

FERTILIDAD DE RATAS MACHO.

INFORME DE ACTIVIDADES

1. INTRODUCCIÓN La espermatogénesis es un proceso celular en el que se producen las células

sexuales masculinas y tiene lugar en los túbulos seminíferos del testículo. Dentro

de los túbulos seminíferos, en el epitelio seminífero las células germinales están

asociadas con las células de Sertoli que les brindan soporte físico y forman la

barrera hemato-testicular a través de uniones estrechas.

Existen tres principales fases en la espermatogénesis: En la primera, la fase

mitótica, la espermatogonia prolifera para incrementar en número y genera

espermatocitos primarios. En la segunda, la meiosis, los espermatocitos

primarios experimentan la recombinación de la información genética y genera a

las espermátides. En la tercera fase, conocida como espermiogénesis, las

espermátides sufren procesos de diferenciación hasta que adquieren la

morfología característica de la especie (Monesi, 1982). Finalmente los

espermatozoides son liberados hacia el lumen tubular de los túbulos seminíferos y

dirigidos hacia el epidídimo. En el ratón el ciclo espermatogénico completo dura

35 días (Franca, 1998).

Después de su paso por el epidídimo, los espermatozoides sufren cambios

fisiológicos y bioquímicos que en conjunto completan su maduración para

prepararlos para el proceso de la fertilización. Asimismo, durante la maduración

epididimal se ha observado cambios en la membrana plasmática del

espermatozoide, entre los que se encuentran modificaciones en la composición

lipídica, en la distribución de proteínas intramembranales y en los niveles de

glicosilación que ocurren principalmente en la cola del epidídimo que va desde 6

días en el ratón hasta 10 días en el hombre (Parks y Hough, 1993). Aunque los

espermatozoides tienen la capacidad de fertilizar cuando se encuentran en la cola

del epidídimo, no pueden hacerlo sin antes ser capacitados en el tracto

reproductivo femenino (Hicks, 1972). La capacitación espermática consiste en el

desarrollo funcional que sufre el espermatozoide, después de una serie de

cambios estructurales y funcionales, como resultado de su interacción con las

secreciones de la mucosa del aparato reproductor femenino (Topfer, 1999). Estos

cambios incluyen la alteración y eliminación de sustancias que fueron integradas

en la membrana plasmática del espermatozoide cuando pasaron por el epidídimo

y provee al espermatozoide las condiciones adecuadas para que se efectúe la

fertilización (Pellicer,1995). Uno de estos cambios es la disminución de colesterol

en la región de la membrana plasmática que recubre al acrosoma. La

capacitación culmina con la reacción acrosomal, que es un proceso especializado

de fusión de la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa después

de que el espermatozoide se une al receptor ZP3 de la zona pelúcida del ovocito,

que le permiten entrar y fertilizar al ovocito (Patrat, 2000).

El colesterol es un componente básico de todas las membranas celulares

animales y precursor de hormonas esteroides, ácido cólico, ácidos biliares y

vitamina D. Su biosíntesis en el hombre tiene lugar predominantemente en el

citosol de las células hepáticas a partir de su precursor, el acetato (Pacheco

1996).

El colesterol, los triglicéridos y los fosfolípidos se transportan en forma de

complejos de lipoproteínas. Existen cinco clases de lipoproteínas: quilomicrones

(QM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), de baja densidad (LDL) y de

alta densidad (HDL).

La HDL se produce en el hígado y tiene las siguientes funciones: acepta el

colesterol libre de los tejidos periféricos y de las lipoproteínas y lo esterifica

mediante la acción de la LCAT (lecitin-colesterol-acil-transferasa) que se

encuentra asociada con las lipoproteínas de alta densidad (apoAI y apoAII). Los

ésteres de colesterol formados son transferidos a las VLDL para formar LDL o

bien son llevados de nuevo al hígado mediante el transporte inverso del colesterol

para ser catabolizado y secretado en la bilis. La HDL es un efectivo antioxidante y

tiene la capacidad de inhibir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad

(Barter et al, 2004). Por lo tanto una concentración elevada de HDL en el plasma

disminuye el riesgo de presentar enfermedades cardiacas (Ganon 1996). En

cambio acumulación de colesterol LDL en las arterias es la causa directa de la

aterosclerosis incrementando el riesgo de sufrir un infarto al miocardio (Austin et

al; 1988).

La aterosclerosis se produce por la formación de placas ateromatosas que

comienzan con el depósito de pequeños cristales de colesterol que se hacen

mayores con el tiempo y llegan a fusionarse apareciendo grandes formaciones

cristalinas. Además, hay proliferación de tejido muscular liso y fibroso que forman

capas y van creciendo hasta alcanzar un tamaño que provocan la disminución de

la luz del vaso y por consiguiente la reducción del flujo sanguíneo (Fig. 2). La

expansión de esta lesión produce el resultado clínico final: trombosis y oclusión

de una arteria coronaria principal (Rubin y Farber 1990). Debido a la importancia

de este problema se han buscado nuevos agentes que disminuyan las

concentraciones de lípidos ya que altos niveles de LDL contribuyen al progreso

de la aterosclerosis. Estudios sugieren que algunos compuestos endógenos y

exógenos con actividad antioxidante pueden tener efectos benéficos en la

prevención de la aterosclerosis. El ácido ascórbico (vitamina C) y α-tocoferol

(vitamina E) son los antioxidantes más importantes hidrofílico y lipofílico,

respectivamente. Por consiguiente estudios en animales y humanos sugieren que

estos compuestos antioxidantes contrarrestan el desarrollo de enfermedades

coronarias (Heller et al; 1998).

La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa

regula la biosíntesis de colesterol. Entre lo agentes hipocolesterolemiantes

inhibidores de ésta enzima están el grupo de las estatinas. La fluvastatina es un

inhidor competitivo reversible de la HMG-CoA (Fig. 3) por inhibición del ácido

mevalónico, y consecuentemente de la biosíntesis del colesterol (Hayashik et al;

1993). En estudios con modelos animales hipercolesterolémicos se ha observado

una disminución en los niveles séricos de colesterol total, LDL, apolipoproteìna B

y/o triglicéridos después de la administración de fluvastatina (Paterniti, 1992). Así

mismo, estudios clínicos en los que fueron medidos apolipoproteínas, la

fluvastatina redujo marcadamente los niveles de apolipoproteína B junto con los

niveles de colesterol LDL, mientras que aumentaron apolipoproteínas A-I

similarmente que los niveles de HDL (Baggio et al 1994).

Guatteria gaumeri es un árbol del sureste de la República mexicana

conocido en lengua maya con los nombres de elemuy o ek-le-muy, de donde

proviene el anagrama Yumel. Pertenece a la familia de las anonáceas y el

extracto de la corteza se emplea en medicina tradicional, entre otros propósitos,

para el tratamiento de la hipercolesterolemia y colelitiasis (Martínez 1992).

El Yumel ha sido objeto de algunos estudios en humanos y animales de

laboratorio que justifican su uso y han permitido conocer otras propiedades

farmacológicas. La α-asarona, su principio activo mayoritario, demostró poseer

propiedades interesantes, lo que motivó a realizar algunos estudios toxicológicos

para determinar su seguridad. Los efectos encontrados son los correspondientes

a su hepatotoxicidad y mutagenicidad, que se manifiestan a dosis bajas, lo que

anticipa un margen terapéutico reducido. Los resultados del estudio teratogénico

no parecen ser preocupantes. Los efectos en rata fueron del tipo embriotóxico

aunque en ratón hubieron algunas malformaciones que dejan entrever la variación

de la respuesta a un fármaco o un agente químico en función de la especie; entre

tanto debe evitarse la ingesta de extractos de la planta en mujeres durante el

primer trimestre del embarazo (Chamorro et al; 1993).

Entre otras propiedades farmacológicas que la α-asarona posee se

encuentra el efecto tranquilizante (Menon y Dandiya 1967), insecticida (Ciccia et

al; 2000), actividad antiplaquetaria (Poplawski et al; 2000), antifúngica (Loset et al;

2000), larvicida (Loset et al; 2000), analgésica (Ademar et al; 2004).

Además de que hipercolesterolemia representa un factor de alto riesgo

para las enfermedades coronarias, se ha reportado que concentraciones elevadas

de colesterol y/o triglicéridos en plasma están asociados con una pobre calidad de

semen y con efectos adversos en la función testicular que pueden traducirse a

problemas de fertilidad masculina (Jones y Sherins; 1979). En un grupo de 100

individuos infértiles que presentaban hipercolesterolemia y/o trigliceridemia, se

encontró que la causa de la infertilidad en un 65% se debía al estado

hiperlipidémico que presentaban (Ramírez et al; 2000).

La administración de una dieta con un 1% de colesterol en ratas macho

incrementaron los niveles de colesterol total y de triglicéridos; los efectos de la

hipercolesterolemia se vieron reflejados en una disminución de la fertilidad, peso

de los testículos, concentración espermática, porcentajes de motilidad y viabilidad

espermática y un aumento en las anormalidades de los espermatozoides. La

administración conjunta de α-tocoferol y simvastatina indujo un efecto protector y

mejora de la infertilidad (Shalaby et al; 2004).

Los antioxidantes juegan un papel importante en la reducción o prevención

de la lipoperoxidación que es extremadamente citotóxica para los

espermatozoides humanos, pudiendo causar pérdida de su motilidad, viabilidad y

actividad (Shelley et al 1991). Los radicales libres cumplen una función

importante en los procesos homeostáticos como intermediarios en las funciones

de óxido-reducción que son esenciales para la vida. En cantidades excesivas son

tóxicos ya que oxidan moléculas biológicas, alterándolas y desencadenando

trastornos en el metabolismo celular. Los organismos poseen un sistema

antioxidante (AO) protector (enzimas y nutrimentos esenciales) contra los

radicales libres (RL). La generación de RL y la defensa AO se encuentran en

equilibrio por lo que al romperse se genera un estado de estrés oxidativo.

En el semen y epidídimo existe un conjunto enzimático protector contra

los radicales libres: superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, glutatión

reductasa y catalasa; además, existen mecanismos no enzimáticos como la

allbúmina, vitaminas A, C y E, piruvato taurina y fructosa (Tribble,1999).

Los radicales de oxígeno son capaces de iniciar la lipoperoxidación de los

lípidos de la membrana, inactivar enzimas y atacar a los ácidos nucleicos. Por

causa de su alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados, principalmente el

ácido docohexanoico, los espermatozoides humanos son especialmente sensibles

al daño causado por ROS y al parecer el peróxido de hidrógeno es el más tóxico

de estos radicales. Además los lipoperóxidos y sus productos de degradación

(malonildialdehído, hidroxial-quenales, etc.) son altamente tóxicos para las

células sexuales masculinas y provocan un daño irreversible a la motilidad y

defectos morfológicos del cuerpo de los gametos masculinos (Zayas et al;2000).

La cianobacteria Spirulina, es un alga verde-azul que en algunos países se cultiva

como suplemento alimenticio, fuente de colorantes y de aditivos para la industria

farmacéutica y alimentaria (Belay et al; 1996). Posee diversas propiedades

farmacológicas, entre las que se encuentran os efectos antialérgico (Yang; 1998),

antianémico (Kapoor et al; 1998), anticancerígeno (Mishima et al 1998),

antihepatotóxico (Torres-Durán; 1998), antiinflamatorio (Castillo; 1998), antiviral

(Ayehunie; 2001) y antioxidante (Romay et al; 1998). La característica

antioxidante de la Spirulina es debida principalmente a la ficobiliproteína,

ficocianina. Es un dímero de dos subunidades similares α y β, tiene un cromóforo

llamado ficocianobilina en la subunidad α y dos en la β; es soluble en compuestos

polares, estable a pH entre 5 y 8 y es usada en formulaciones cosméticas

(delineadores) como pigmento ( Akhilender et al; 1999). Posee diferentes

propiedades farmacológicas, como antiinflamatoria (Gonzáles et al; 1999),

antioxidante (Romay et al; 1998) e hipocolesterolemiante (Nagaoka et al; 2005).

2. ACTIVIDADES REALIZADAS

1. Búsqueda bibliográfica

2. Estandarización de nuevas técnicas.

Técnica para la obtención de espermatozoides del epidídimo

Técnica para realizar cuenta espermática

Técnica para determinar viabilidad espermática

Técnica para determinar reacción acrosomal

Técnica para peroxidación lipídica

3. Manejo de algunos equipos: TOX-IVOS, SELECTRA 2

4. Preparación de dietas hipercolesterolémicas para la inducción de la

hiperlipidemia

5. Inducción de la hiperlipidemia durante 6 y 35 días

6. Obtención y análisis de esperma en animales tratados con la dieta

hipercolesterolémica

7. Determinación del perfil lipídico en animales tratados durante 6 y 35 días

con la dieta

8. Determinación de la concentración óptima de GABA para la inducción

acrosomal

9. Extracción de C-ficocianina a partir del alga Spirulina

10. Identificación espectroscópica de UV de la C-ficocianina

11. Asistencia a cursos y congresos.

1er. foro institucional de Formación de investigadores. IPN

con una duración de 6 horas. Mayo 18, 2006.

Curso teórico – Práctico ”Diagnóstico de Semen y Técnicas

de Reproducción asistida” 40 horas, Instituto Valenciano de

Infertiidad México. UNAM, Facultad de Estudios Superiores de

Zaragoza. México D.F. del 12 al 16 de junio de 2006.

4th Internacional Symposium on Probiotics. México D.F., del

11 al 13 de mayo de 2006.

VI Congreso Mexicano de Toxicología Ciudad Universitaria,

México, D.F. del 5 al 7 de julio de 2006.

Curso de Toxicología Alimentaria, VI Congreso Mexicano de

Toxicología Ciudad Universitaria, México, D.F. del 5 al 7 de julio de

2006.

Poster: Efecto de la hiperlipidemia sobre parámetros

espermáticos en ratón.

Poster: Estudio preliminar de excencefalia por la

administración de CdCl2.

Poster: Estudio del efecto hipolipemiante de análogos de α-

asarona.

Asistencia a las actividades del XX Congreso Nacional de

Posgrado, celebrado en la ciudad de México D.F. los días 16 y 17

de octubre de 2006.

Poster: Evaluación de la calidad de la proteína de las semias

de chía.

Ponencia: Análisis de la situación de la nutrición en México.

Posgrado en Alimentos, ENCB, IPN.

Asistencia al 1er. Foro Latinoamericano sobre el factor de

Transferencia. IPN.

3. METODOLOGÍA

Se realizó un estudio preliminar para determinar el tiempo de tratamiento con la

dieta hipercolesterolémica a 6 días (duración de la maduración epididimal) y a 35

días (duración del ciclo de espermatogénesis). Se analizaron las concentraciones

de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL y se evaluó la calidad

espermática (movilidad y cuenta).

TÉCNICA PARA LA OBTENCIÓN DE ESPERMATOZOIDES DEL EPIDÍDIMO

Ratones macho ICR de 8 semanas de edad (22-25g), fueron alimentados con

una dieta hiperlipidémica (dieta estándar con caseína, colesterol, margarina,

colato de sodio y azúcar glass) durante 6 y 35 días; al término de este tiempo se

sacrificaron los animales mediante dislocación cervical y se obtuvo la cola y el

conducto deferente (lugar de almacenamiento de los espermatozoides maduros).

Se limpiaron perfectamente para evitar que la grasa interfiera con la lectura y la

obtención de la suspensión de espermatozoides. Se colocaron en un vidrio de

reloj conteniendo 0.5 ml de NaCl 0.9% (Solución Salina Isotónica) a 37°C, se

introdujo cuidadosamente sin perforar el conducto, una jeringa conteniendo 0.5 ml

de NaCl 0.9% a 37°C; con la presión ejercida por la solución al pasar lentamente

a través del conducto se obtuvo una suspensión de espermatozoides. Se agitó

vigorozamente para homogeneizar la muestra y se colocó una gota sobre un

portaobjetos a 37°C, se cubrió y se observó en el microscopio a 40X para obtener

el porcentaje de espermatozoides móviles, inmóviles y deficientes.

TÉCNICA PARA DETERMINAR REACCIÓN ACROSOMAL

Con 100 μl de Medio Whittigman o M-16 sin albúmina pregaseado con 5% de

CO2 durante 30 minutos, se tuvo una suspensión de espermatozoides; que se

resuspendió en 320 μl con el mismo medio. Se distribuyeron 50 μl de la

suspensión en tubos Eppendorf para los diferentes tiempos: 0 min., 60 min., 75

min., 60+15 min. (0.5 μM de GABA), 60+15min. (1.0 μM de GABA), 60+15 min.

(1.5 μM de GABA). Se adicionó 450 μl de medio con albúmina para obtener un

volumen final de 500 μl. Tubo 0 se agregaron inmediatamente 500 μl de

formaldehído, pero los tubos 60 y 75 se incubaron sin formaldehído durante 60 y

75 minutos respectivamente; al terminar estos tiempos se les adicionó 500 μl de

formaldehído. Para los tubos restantes 60+15 min. (0.5 μM de GABA), 60+15min.

(1.0 μM de GABA), 60+15 min. (1.5 μM de GABA), se incuban durante 60 min.

Posteriormente se les adicionó GABA a las diferentes concentraciones 0.5 μM,

1.0 μM y 1.5 μM respectivamente. Se centrifugaron cada uno de los tubos a 7000

RPM 5 minutos tres veces y se lavaron con 500 μl de cloruro de amonio 50 mM

en PBS dos veces, retirarando el exceso de cloruro de amonio y realizando un

frotis con 7 μl de la muestra. Finalmente se tiñó con azul de coomassie 12

minutos, se lavó con agua destilada y se fijó con resina; se evaluaron por

microscopía óptica a 100X con aceite de inmersión 200 células espermáticas.

TÉCNICA PARA REALIZAR CUENTA ESPERMÁTICA

A partir de una concentración de 200 μl de espermatozoides, se obtuvo una

dilución 1:20. Se tomaron 10 μl de suspensión de espermatozoides mas 190 μl

de solución Ringer-formol, 10 μl de esta suspensión se colocan en la cámara de

Neubauer; se dejaron reposar de 6-7 minutos y finalmente se contó a 40X los 25

cuadros y se aplicó el factor de corrección

TÉCNICA PARA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA

Se obtuvo una suspensión de espermatozoides de la cola del epidídimo y se

tomaron alícuotas para la técnica de movilidad y viabilidad. El resto de la

suspensión se virtió en un tubo Eppendorf y se centrifugó a 4500 RPM 6 minutos;

se retiró el sobrenadante y se ajustó a un volumen de 500 μl con SSI; se tomó

una alícuota de 10 μl para obtener la cuenta espermática. Del resto de la

suspensión se tomaron alícuotas de 5x106 células espermáticas (realizarlo por

duplicado o triplicado); las alícuotas se filtraron a través de tela crepón en los

tubos Eppendorf y nuevamente se centrifugaron a 4500 RPM 6 minutos; se retiró

el sobrenadante y se resuspendió en 20 μl de TRIS-HCl 50 mM pH 7.4.

Se congeló con nitrógeno líquido y se descongeló en baño maría a 45ºC por 5

minutos (6 ciclos); posteriormente se adicionó 65 μl de reactivo R1 del Kit de

peroxidación lipídica y se agitó en vortex de 3 a 4 segundos (3 veces); después se

agregaron 15 μl de HCl 12 N nuevamente se agitó en vortex de 3 a 4 segundos

(3 veces) y se incubaron a 45 ºC por 60 minutos en baño maría. Se enfriaron los

tubos en cama de hielo y se centrifugaron a 14000 RPM 15 minutos a 6ºC o a

temperatura ambiente, se colocaron nuevamente en cama de hielo tomándose el

sobrenadante que se deposita en la microplaca hasta la aparición de un color azul

claro; la absorbancia se mide a 586 nm, en un lector de microplacas.

PREPARACIÓN DEL CONTROL POSITIVO

Las muestras se centrifugaron a 4500 RPM 6 minutos, se les adicionó 30 μl de

H2O2 100 μM y se incubaron a 36ºC bajo atmósfera de CO2 durante 30 minutos.

Se colocaron en cama de hielo adicionándoles 100 μl de NaCl al 0.9%, se agitó n

vortex de 3-4 segundos (3 veces) y se centrifugaron a 4500 RPM 6 minutos. Se

retiró el sobrenadante y se agregaron 20 μl de TRIS-HCl, se homogeneizó bien

para leer absorbancia a 586 nm.

PREPARACIÓN DE LA CURVA DE LOS ESTÁNDARES

ESTÁNDAR MDA (μl)

AMORTIGUADOR TRIS- HCl (μl)

R1 (μl) HCl 12N (μl)

0 20 65 15 1 19 65 15

2.5 17.5 65 15 5 15 65 15

10 10 65 15 15 5 65 15 20 ---- 65 15

53.5 μl 86.5 μl 455 μl 105 μl

Curva Tipo para MDA (111206)

MDA (μMol)

0 5

Abs

orba

ncia

a 5

86nm

100.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE LA C-FICOCIANINA A PARTIR DEL ALGA SPIRULINA

A partir de 1 g del alga Spirulina en 10 ml de amortiguador de fosfatos a pH 7.2,

puesto 16 horas a 4ºC en oscuridad, se obtuvo un extracto crudo que se

centrifugó a 13000 RPM 20 minutos (dos veces); el precipitado se desechó pero

el sobrenadante se ultra-centrifugó nuevamente a 45000 RPM 30 minutos (dos

veces). El sobrenadante que se obtuvo es ahora el extracto clarificado que se

dializó a través de una membrana de tamaño de poro de 12000 D, el extracto

clarificado dializado obtenido se liofilizó durante 5 días para finalmente

identificarse mediante espectroscopia UV y electroforesis con indicadores de peso

molecular.

3. RESULTADOS

En la Fig. 1, se observa que la concentración de colesterol total aumentó después

de la dieta hipercolesterolémica en los grupos de animales tratados durante 6

días y 35 días, en un 75% y 57º% respectivamente. En la Fig. 2 se muestra que la

concentración de colesterol LDL se incrementó en el grupo tratado durante 6 días

con la dieta en un 32%, lo que fue superior a la concentración lograda en el grupo

al que se le suministró la dieta por 35 días en el que solo hubo un aumento del

25% aproximadamente. La Fig. 3 muestra las concentraciones de colesterol HDL

que aumento 35% a los 35 días de tratamiento.

El efecto de la hipercolesterolemia repercutió en los parámetros espermáticos

(cuenta y movilidad), ya que hubo una disminución en el porcentaje de

espermatozoides móviles, aumento de inmóviles y deficientes a los 6 días de

tratamiento (Fig. 4), la cuenta espermática no resultó alterada en ningún grupo

(Fig. 5).

Además de lo anterior se estandarizó la técnica para la evaluación de la reacción

acrosomal en donde se determinó la concentración óptima de GABA en la que se

induce la reacción acrosomal. La utilización de GABA como inductor de la

reacción acrosomal se justifica porque en la membrana de espermatozoide

existen receptores a este neurotransmisor y se ha visto que desencadena la

misma cascada de señalizaciones que suceden cuando el espermatozoide se une

al receptor ZP3 en la zona pelúcida del ovocito. La concentración óptima

encontrada para inducir la reacción acrosomal fue de 1.5 μm (Fig. 6).

Por otra parte se obtuvo la ficocianina partir del alga Spirulina y se determinó el

espectro de UV del estándar de C-ficocianina y del extracto, respectivamente.

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2 0

4 0

6 0

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Con

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*

*

Fig. 1 Concentración de colesterol después de la dieta hipercolesterolémica. * p< 0.05 con respecto al grupo testigo de acuerdo a un ANOVA y una prueba posterior Bonferroni Cada barra representa la media ± DE. n=6

Col

este

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DL

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0

10

20

30

40

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*

Fig. 2 concentración de colesterol LDL después de la dieta hipercolesterolémica. * p< 0.05 con respecto al grupo testigo y **p<0.05 con respecto al tratamiento hipercolesterolémico durante 6 días, de acuerdo a un ANOVA y una prueba posterior Bonferroni. Cada barra representa la media ± DE. n=6.

*

*

Fig. 3 Concentración de colesterol HDL después de la dieta hipercolesterolémica. * p <0.05con respecto al grupo testigo deacuerdo a un ANOVA y una prueba posterior Bonferroni. Cada barra representa la media ± DE. n=6

0

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*

Fig. 4 Efecto de la hipercolesterolemia sobre la movilidad espermática * p < 0.05 con respecto al grupo testigo de acuerdo a un ANOVA y una prueba posterior Bonferroni. Cada barra representa la media ± DE. n=6

Fig. 5 Efecto de la hipercolesterolemia sobre la cuenta espermática. Cada barra representa la media ± DE. n=6. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas.

*

Fig. 6 Reacción acrosomal inducida con GABA en espermatozoides de ratón * p < 0.05 con respecto a la reacción acrosomal espontánea (60 min) de acuerdo a un ANOVA y una prueba posterior Bonferroni. Cada barra representa la media ± DE. n=3

En la Fig. 7 se muestra el espectro de ultravioleta correspondiente al estándar de

la C-ficocianina, se observó un pico de absorbancia entre 500n y 650nm, siendo

el pico más alto a 619nm correspondiente a la C-ficocianina. La literatura señala

que la C-ficocianina absorbe a una longitud de onda de 620 nm (Glazer, 1973).

También se obtuvo el espectro de UV para el extracto de la C-ficocianina en

donde igualmente se observó el pico de mayor absorbancia a 619.88 nm (Fig. 8)

Fig. 7 Espectro de UV del estándar de C-ficocianina

Fig. 8 Espectro de UV del extracto de C-ficocianina

4. CONCLUSIONES

La dieta hiperlipidémica proporcionada durante 6 días dio como resultado un

incremento mayor de las concentraciones de colesterol total y de baja densidad,

causando un efecto adverso sobre la movilidad espermática. Lo que indica que la

hiperlipidemia afectó a la maduración de los espermatozoides en el epidídimo

pero no al ciclo completo de la espermatogénesis. La cuenta espermática no se

vio afectada por la dieta hipercolesterolémica proporcionada tanto a los 6 días

como a los 35 días. Por otro lado la concentración determinada de 1.5 µm de

GABA fue la óptima para inducir la reacción acrosomal.

La técnica desarrollada en el laboratorio para la extracción de la C-ficocianina es

la metodología más eficiente comparada con las reportadas en la literatura, ya

que no se utilizan agentes precipitantes.

Debido a que se utilizan modelos biológicos, los resultados pueden tardar más de

lo que se esperaba en obtenerlos, de tal manera que los resultados faltantes se

reportarán para el mes de junio de 2007.

Impacto: La hipercolesterolemia, es la principal causa de muerte en el hombre ya

que representa un factor de riesgo para el desarrollo de las enfermedades

coronarias además de que afecta considerablemente la fertilidad masculina.

Por esta razón, es necesario buscar nuevos tratamientos que disminuyan o

eliminen la hipercolesterolemia en sujetos que la padecen para contrarrestar la

consecuente infertilidad.

5. BIBLIOGRAFÍA

1. Monesi V. Espermatogénesis y espermatozoides. En: Austin CR, Short RV, editores. Células Germinales y Fertilización. Primera Edición. México: Ediciones Copilco. p. 49-88, 1982.

2. Franca L. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat. Biol Reprod., 59:1371-1377, 1998.

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