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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL INFORME FINAL DE PROYECTO SIP20080111 ESTABLECIMIENTO DE LA LINEA CELULAR SF9 PARA EL DESARROLLO DE UN BACULOVIRUS RECOMBINATE CON POTENCIAL BIOINSECTICIDA ELEVADO. DIRECTOR DE PROYECTO: M. en C. Erick de Jesús de Luna Santillana Reynosa, Tamaulipas 10 de Enero del 2009
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
INFORME FINAL DE PROYECTO
SIP20080111
ESTABLECIMIENTO DE LA LINEA CELULAR SF9 PARA EL DESARROLLO DE UN BACULOVIRUS RECOMBINATE CON
POTENCIAL BIOINSECTICIDA ELEVADO.
DIRECTOR DE PROYECTO:
M. en C. Erick de Jesús de Luna Santillana
Reynosa, Tamaulipas 10 de Enero del 2009
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1. I N T R O D U C C I O N.
La utilización masiva de los entomopatógenos requiere aún de muchos esfuerzos. Si bien es
cierto, que existen productos comerciales y la investigación ha avanzado con relación al mejor
conocimiento de la bioactividad controladora de estos microorganismos, se necesita de una
mayor promoción de sus bondades para fomentar su empleo. Desde hace mucho tiempo, quienes
fomentan los programas de Manejo Integral de Plagas (MIP), han creído en la utilidad de los
entomopatógenos en una línea de control microbial. Algunos aspectos acerca de la patología
presentes en insectos se han estudiado desde tiempos inmemorables por los chinos, griegos y
egipcios 1500 años A.C. Algunas de estas son causadas por microorganismos, entre los que
sobresalen algunas especies de bacterias, hongos, riketsias y protozoarios. Tomando como
antecedente la patogénia de algunos de estos agentes entomopatógenos es que a principios de
siglo pasado, se han venido utilizando estos agentes como una estrategia biotecnológica a
utilizarse en el control de plagas. Aunque los microorganismos causantes de enfermedades en
insectos sobresalen las bacterias y hongos principalmente, el cupo se ha ampliado al incluir entre
ellos a virus y nemátodos, que también son causa de enfermedades en insectos. Las innovaciones
relacionadas a los entomopatógenos y su empleo en el MIP, debe cubrir no sólo la posibilidad de
acceder a las formulaciones comerciales y su adecuado manejo, sino también tienen que
considerarse que en forma natural los patógenos de insectos actúen y sean eficientes para llevar a
cabo el biocontrol de insectos plaga. Por otro lado los recientes avances de la ingeniería genética
podrán en el futuro, mejorar los entomopatógenos y crear cepas microbianas de mayor impacto
en las poblaciones plagas.
Los virus como patógenos de insectos presentan una serie de características benéficas como lo es
la capacidad de originar grandes epizootias en las poblaciones de plagas, además de ser altamente
específicos e infecciosos.
Los Baculovirus son la familia de mayor importancia para el control de insectos. Poseen estos
virus, una molécula de ADN circular superenrollada. Envolviendo el ácido nucleico hay proteínas
compuestas de subunidades denominadas capsómeros, los cuales forman una capa denominada
cápside. Uno ó más núcleo-cápsides están envueltos por una membrana que normalmente está
constituida de material celular del hospedero. El conjunto compuesto por la envoltura y la núcleo-
cápside se conoce como virión, los cuales son unidades infectivas del virus. Los Baculovirus
contaminan a los insectos por vía oral y cuando estos son aplicados sobre los cultivos a proteger
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los viriones son ingeridos por los insectos al alimentarse y causan una serie de patologías al
insecto plaga a controlar.
Otra de la familia de virus usados en el control biológico de insectos son los Polidnavirus. Este es
un grupo de gran interés, debido a que se encuentran en simbiosis con himenópteros parasíticos.
Cada especie de parasitóide lleva un polidnavirus diferente y característico de esa especie. La
replicación de este agente ocurre en el núcleo de las células del cáliz del oviducto, de tal forma
que cuando la hembra parasitóide deposita un huevo dentro del hospedero, también inyecta el
polidnavirus. Los viriones entran y se dispersan en los tejidos y permanecen en el hospedero
durante el desarrollo del parasitóide. Se considera que los polidnavirus son generalmente
inmunosupresivos, perturbando o desactivando las defensas inmunológicas del hospedero, lo cual
permite el desarrollo del parasitóide en el interior del insecto huésped.
Basado en estos antecedentes, el laboratorio establece una línea de investigación, la cual plantea
crear un Baculovirus recombinante o modificado con un gen heterólogo del polidnavirus
involucrado en disminuir la respuesta inmune de los insectos, con la finalidad de que esta nueva
característica en el Baculovirus receptor, origine que la patogénia del Baculovirus recombinante
sea mayor y que su tiempo letal se vea disminuido. Por lo que con el presente proyecto
planteamos establecer líneas celulares blanco a nivel de laboratorio con la finalidad de propagar
tanto el Baculovirus recombinante como nativo y de esta manera poder hacer los bioensayos
finales de toxicidad para medir el efecto de la nueva característica de este agente de
entomopatógeno.
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2. ANTECEDENTES
2.1 Baculovirus
Los baculovirus son clasificados como un grupo de virus específicos de artrópodos con
núcleocapside en forma de barra con dimensiones de 30-60 nm x 250-300 nm (Jehle et al, 2006).
Hasta la fecha más de 600 tipos de baculovirus han sido descritos que infectan especies de
insectos de las ordenes Lepidóptera, Díptera e Himenóptera. Los baculovirus son clasificados
como un grupo de virus específicos de artrópodos con núcleocapside en forma de barra con
dimensiones de 30-60 nm x 250-300 nm (Jehle et al, 2006). Hasta la fecha más de 600 tipos de
baculovirus han sido descritos que infectan especies de insectos de las ordenes Lepidóptera,
Díptera e Himenóptera, más del 90% de los baculovirus conocidos en el presente, fueron aislados
de especies de lepidópteros. (Jehle et al 2006(2)).
Existen dos fenotipos para los viriones: derivados de oclusión (ODV) y los viriones injertados
(BV). Los ODV están ocluidos en una matriz de proteína cristalina denominada “cuerpo de
oclusión” miden aproximadamente 0.15–15 µm, consisten de una sola o múltiple núcleocapside
que están presentes en una envoltura que tiene un diferente origen o composición de proteínas
virales. Los BV típicamente contienen una sola núcleocapside dentro de una envoltura que es
derivada de la membrana plasmática del hospedero que es modificada por una o mas proteínas
virales miden alrededor de 40 nm × 300 nm. (Cory y Myers, 2003; Michalsky et al, 2008).
Esas diferencias morfológicas de viriones que son genéticamente idénticos reflejan sus
respectivos roles en cuanto a transmisión de la infección por baculovirus ya sea de célula a célula
(BV) y de insecto a insecto (ODV). ((Jehle et al 2006 (1)).
Dos tipos morfológicos de cuerpos de oclusión son reportados, los cuales están correlacionados
con la actual clasificación de baculovirus. Los miembros del genero nucleopolyhedrovirus
(NPV) tienen cuerpos de oclusión de 0.15 a 15 µm de tamaño y contienen muchos viriones
derivados de oclusión, por otra parte el género granulovirus (GV) es caracterizado por ser más
pequeño, a menudo sin cuerpos de oclusión los cuales son de 0.13x0.5 µm de tamaño y
normalmente contiene un solo virión derivado de oclusión ambos grupos producen viriones que
son similares en estructura y patología de la infección, análisis en las secuencias de NPV y GVs
muestran que contienen muchos genes homólogos. (Ackermann y Smirnoff, 1983, Popham et al,
2001).
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2.2 CICLO INFECCIOSO DE LOS BACULOVIRUS
Los baculovirus solo infectan larvas en estadios en los cuales son capaces de alimentarse de
cuerpos de oclusión (OB), estos son unas estructuras de proteínas que contienen los viriones
(partículas virales). Los cuerpos de oclusión son la unidad infectante de los baculovirus y son
críticas para diseminar la infección entre los hospederos. Muchos baculovirus contienen varios
viriones en cada OB (Cory y Myers, 2003).
En el intestino los viriones son rápidamente liberados por la acción combinada del pH alcalino y
las proteasas que desintegran los OBs, los viriones entonces pasan a través de la membrana
peritrofica que cubre los intestinos (Engelhard et al, 1994).
Dentro del ambiente hostil del intestino, la infección primaria incluye una fase de fijación y
entrada a las células del intestino, una rápida replicación y producción de progenie. Es posible
que AcMNPV tenga involucrados mecanismos para optimizar la producción de virus progenie en
esas condiciones ambientales difíciles. Incluso antes de la expresión de los genes virales la
presencia de esas proteínas en virus parentales puede facilitar el inicio de la replicación del DNA
viral (Braunagel et al, 2003).
Los baculovirus codifican varias proteínas que mejoran el proceso infeccioso, los viriones
liberados de los cuerpos de oclusión se fusionan con las membranas plasmáticas de las células
intestinales y el DNA contenido en las núcleocapsides se mueve hacia el núcleo celular para
iniciar la infección (Cory y Myers, 2003).
Braunagel et al 2003, determinaron que cinco de las seis proteínas esenciales para la replicación
del DNA viral están presentes en los ODV: DNA polimerasa, helicasa, IE1, lef3, y lef1, la
incorporación al azar de tales proteínas no es descartada, pero también es probable que el
ensamblaje viral proceda con un alto grado de especificidad. El AcMNPV puede incorporar tales
proteínas en los ODV por razones relacionadas con la infección primaria y la replicación del
DNA.
La infección inicia cuando la envoltura de los ODV se pega y fusiona con la membrana en forma
de cepillo de las células columnares de los intestinos. Si los ODV generan una infección dentro
de las células intestinales, un segundo fenotipo viral virus injertados (BV) brotan de la membrana
plasmática basal lateral. Dentro del hemócele, el blanco secundario inmediato son las células
traqueolares. Esas células respiratorias penetran a través de la lámina basal del intestino con
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largos filamentos citoplásmicos que están en intima asociación con las células del intestino a las
cuales mantienen (Haas-Stapleton et al, 2005).
El empaquetamiento de las núcleocapsides de AcMNPV es posible por la temprana expresión de
GP64, la cual es la proteína que envuelve los BV pero que está ausente en los ODV (Washburn et
al, 2003). La GP64, es la proteína de fusión de los virus injertados (BV), los cuales diseminan la
infección mas allá del intestino, esta proteína es sintetizada durante la fase temprana y tardía de la
infección. Esos dos rasgos habilitan a las núcleocapsides de ODVs parentales para “brotar” de
las células intestinales infectadas, esencialmente como BV, para establecer la infección
secundaria antes de que se complete la replicación viral dentro de las células del intestino medio.
Esta estrategia habilita a los virus para responder a la principal defensa del hospedero: la muda de
las células intestinales infectadas, y acelera el inicio de la infección sistémica (Washburn et al,
2003(2), Jarvis y García, 1994).
En todos los grupos de no lepidópteros, la infección queda restringida a el intestino o su
equivalente, los cuerpos de oclusión son continuamente expulsados al ambiente por medio de las
heces, sin embargo, en los lepidópteros la mayoría de los baculovirus se propagan a otros tejidos
por vía de la infección del sistema traqueal de la larva, el cual provee el mayor conducto para que
los virus pasen a través de la lamina basal y se diseminen por todo el insecto.
Los baculovirus establecen infecciones sistémicas dentro de especies de hospederos, incluso a
través de tejidos que son rodeados por la lámina basal, la cual es una matriz extracelular de que
excluye particular incluso menores a esos virus (Flipsen et al, 1995). La infección de sistema
traqueal de la larva proveen la capacidad de evadir la lámina basal y diseminar la infección a
todo el cuerpo del hospedero. Las células epidérmicas traqueales, son los únicos componentes
del sistema traqueal y comparten un sistema linfático en común. Localmente esas células tienen
contacto una con otra por ciertas extensiones citoplasmáticas. Esos dos rasgos del sistema
traqueal facilitan la rápida diseminación del virus (Engelhard et al, 1994; Flipsen et al, 1995).
El sistema traqueal facilita el intercambio de gases entre todos los tejidos y el ambiente externo a
través de invaginaciones de la pared externa del cuerpo las cuales llenan de aire los tubos
llamados traqueas. La traquea esta forrada de una cutícula de quitina secretada por las capas
epidérmicas que la mantienen, por lo que es muy parecida al exterior del insecto, la traquea se
bifurca por todo el insecto, creando tubos cada vez más finos hasta que el lumen de cada tubo se
vuelve una estructura intracelular llamada traqueólo. Las células que aLuria Bertaniergan
traqueólos producen células hijas en la epidermis traqueal, llamadas traqueoblastos (Engelhard et
al, 1994). Adicionalmente los viriones libres en el hemócele no parecen entrar en otros tejidos
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directamente pero parecen depender del paso a través de los traqueoblastos. Así la infección
sistémica parece estar mediada por los traqueoblastos que le sirven como portal para el paso
bidireccional de BV a través de la barrera de la lámina basal (Haas-Stapleton et al, 2003).
La rápida transmisión de la infección dentro del sistema traqueal y el cuerpo graso entre 24 y 48
hrs es difícil de explicar por medio de un mecanismo de infección directa de célula a célula. La
infección de los traqueoblastos por AcMNPV ofrece tres ventajas al virus (i) los traqueoblastos
proveen un punto de infección permanente debido a que esas células no se mudan como las
células del epitelio intestinal, (ii) los traqueoblastos están en contacto directo con la epidermis
traqueal, la cual no solo mantiene la infección si no que también está en contacto intimo con
todos los otros tejidos, así el sistema traqueal puede funcionar como productor de tejidos blanco y
como conducto hacia otros tejidos, (iii) finalmente la infección de los traqueoblastos permite
evadir la lamina basal (Engelhard et al, 1994; Haas-Stapleton et al, 2003).
En infecciones sistémicas, las células traqueolares generan BV que diseminan la infección a lo
largo del cuerpo y entran a la hemolinfa, donde se lleva a cabo la infección de los hemocitos. Ya
dentro de la hemolinfa, se alcanzan altas densidades virales (108-1010 p.f.u. por ml) lo cual facilita
el establecimiento de focos de infección distantes entre sí dentro de las células traqueolares las
cuales ayudan al mantenimiento de otros tejidos del hospedero, los cuales subsecuentemente son
infectados. En última instancia, todas las células del hospedero son infectadas y el insecto muere,
hay licuefacción y liberación de millones de cuerpos de oclusión (Haas-Stapleton et al, 2005).
En varios hospederos permisivos (Spodoptera exigua, Trichoplusia ni y Heliothis virescens), la
infección de una sola célula traqueolar es suficiente para generar una irreversible fatal infección,
lo cual resalta la importancia de la muda en las células del intestino como una defensa contra la
fatal infección (Zhang et al, 2004).
En lepidópteros al final del ciclo infeccioso, los tejidos de las larvas infectadas se convierten
millones de OBs que son liberados al ambiente cuando el hospedero muere. Los cuerpos de
oclusión persisten en el ambiente por considerables periodos de tiempo, particularmente cuando
son protegidos de la degradación por rayos UV. Los bacuovirus permanecen sin cambios en el
interior de los OBs hasta que son ingeridos por algunos de los hospederos susceptibles o hasta
cuando es inactivado.
Entre los núcleopolihedrovirus, el ODV que inicia la infección en los insectos hospederos puede
contener solo una núcleocapside por virión (denominados SNPVs) o muchas núcleo cápsides por
virión (denominados MNPVs); la principal consecuencia del empaquetamiento de los ODV (en
SNPVs o MNPVs) es que la primera célula blanco infectadas con el fenotipo MNPVs recibe
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múltiples núcleocapsides mientras que aquellas infectadas con el fenotipo S reciben solo una
(Washburn et al, 2003).
La espontánea generación de enfermedad por baculovirus en insectos aparentemente sanos ha
sido observada por mas de 100 años, lo cual ha estimulado la discusión sobre una posible etapa
de latencia en la enfermedad así como las causas que pueden provocarla. Cory y Myers, 2003.
Los virus latentes no son infectivos y no se replica pero pueden ser transformados a un estado
infectivo por alguno de los factores desencadenantes (Fuxa et al, 1992).
Los baculovirus ofrecen una alternativa prometedora a los pesticidas químicos para el control de
tal peste agrícola, pues esos patógenos pueden matar larvas de lepidópteros y se restringen solo a
larvas de insectos. AcMNPV tiene un relativamente amplio rango de hospederos y puede infectar
y causar mortalidad a las larvas de varias especies de plagas (Granados & Williams, 1986).
El tiempo que le toma al baculovirus para matar al insecto hospedero va de días a semanas
dependiendo de la temperatura ambiental, dosis viral, edad del insecto y de la especie del virus
(Bonning y Hammock, 1996), lo cual es una desventaja pues la velocidad para matar los insectos
plaga infectados con los variantes silvestres del baculovirus es relativamente baja, en este lapso
entre la infección y la muerte, los insectos pueden continuar alimentándose y causar daño a las
cosechas por días o incluso semanas sobrepasando el umbral de daño económico (Harrison y
Bonning, 2001).
2.3 BACULOVIRUS RECOMBINANTES COMO BIOINSECTICIDAS
La introducción en el genoma de los baculovirus, de genes que codifiquen proteínas que
interfieran con el metabolismo del insecto o las metamorfosis, tales como toxinas, hormonas,
enzimas puede mejorar la patogenicidad de los baculovirus.
El gen de la proteína cristalina cry1A fue introducido en el genoma del AcMNPV en el lugar que
usualmente ocupa el gen de la polihedrina. Con este baculovirus se infectaron celulas Spodoptera
frugiperda. El inserto fue expresado en altos niveles sin interferir en la producción de viriones.
La proteína cristalina fue encontrada en el citoplasma de las células, principalmente en forma de
largos cristales con una estructura similar a la de los cristales producidos por Bacillus
thuringiensis. Los extractos obtenidos de las células infectadas propiciaron que Pieris brassicae
dejara de alimentarse. La toxicidad del cristal recombinante obtenido en este estudio fue
comparable con la toxicidad de la proteína-cristal obtenida de las correspondientes cepas
recombinantes de E. coli (Martens et al., 1990).
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Las neurotoxinas insecto-selectivas también han sido usadas para el desarrollo de insecticidas a
base de baculovirus recombinantes; la neurotoxina AaHIT, la cual fue expresada en AcMNPV
presentando efectos sobre los insectos plaga sin embargo la producción de toxina fue muy bajo
(Taniai et al., 2002).
La ruta de secreción de la toxina presenta los siguientes pasos: modificaciones post-
trasduccionales, separación del péptido-señal, transporte al retículo endoplásmico (RE), doblado
en el RE, transporte a través del aparato de golgi y glicosilación.. la secuencia del cDNA de
AaHIT indica que todos los pasos, menos la separación del péptido-señal, no son indispensables
(Bougis et al., 1989). El gen fue insertado bajo el promotor p10. Los niveles de mRNA y
proteína AaHIT fueron comparables con otras proteínas como la hormona juvenil esterasa (JHE)
(Bonning et al., 1992, Hammock et al., 1990) la cual es expresada en el mismo sistema de
expresión por medio de baculovirus. Sin embargo la eficacia de la secreción de AaHIT fue
significativamente mas baja que la de JHE. (Bonning et al., 1992)
El análisis Western blot sugiere que AaHIT es conglomerado y acumulado en las células. Lo cual
se intento contrarrestar con la expresión de la proteína chaperona BiP para incrementar la
cantidad de AaHIT soluble secretado, lo cual trajo resultados positivos al incrementarse la
cantidad de AaHIT dentro de las células sin embargo no se detecto incremento en la cantidad de
AaHIT en el medio. Estos resultados sugieren que la secreción y el doblado de AaHIT son
inadecuados en las células de insectos utilizadas (Taniai et al., 2002).
La mayoría de las toxinas utilizadas para crear baculovirus recombinantes, atacan los canales de
sodio por lo que tienen un efecto similar a los pesticidas químicos que pertenecen al grupo de los
piretroides, sin embargo el sitio de acción especifico dentro de los canales de sodio es diferente,
por lo que incluso puede haber sinergia cuando son usandos juntos. Bloomquist, 1996.
Otra promisoria aproximación para la mejora de los baculovirus ha sido el efecto cooperativo de
insecticidas, esto ha sido observado cuando un acmnpv expresa un par de toxinas foráneas
LqhIT1 y LqhIT2 (una combinación de una toxina depresiva con una toxina excretora), este tipo
de construcción ha provisto una mejora del 40% en el tiempo necesario para lograr la paralisis
cuando se compara con el el AcMNPV y una mejora del 20% cuando es comparado con los
recombinantes que solo contienen alguna de las dos toxinas foráneas. Regev, et al, 2003. Los
baculovirus recombinantes pueden ser usados para infectar larvas por medio de ingestion o por
inyeccion de particulas virales en el hemocele. Szewczyk et al, 2006.
Han sido construidos baculovirus recombinantes a los cuales se les sustituye el gen de
polihedrina por el gen foráneo., por lo cual no forman cuerpos de oclusión. La cantidad de esos
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viriones es difícil de cuantificar en base a partículas virales, y son 5 veces menos infecciosos que
los virus ocluidos cuando son suministrados de manera oral a los insectos. Volkman y Summers,
1977.
Por lo tanto el efecto de un baculovirus recombinante sin gen de polihedrina como bioinsecticida
no puede ser fácilmente determinado. De hecho la aplicación en campo de tal virus es impráctica
pues serian rápidamente inactivados. Bishop, 1989. Los baculovirus recombiantes que mantienen
el gen de polihedrina son mas idóneos para evaluar dosis y tiempo de mortalidad. Sin embargo
alternativamente los baculovirus recombinantes que son negativos a polihedrina pueden ser co-
ocluidos con baculovirus de tipo Silvestre y poder asi determiner su actividad biologica. Martens
et al, 1990.
Los baculovirus en cuerpos de oclusion persisten en el ambiente por años sin ser afectados, la
viabilidad de los baculovirus puede ser influenciada por la temperatura, pH, humedad ambiental.
El factor com mayores efectos sobre los baculovirus es atribuido a la luz UV, en condiciones de
campo existe muy poca actividad de baculovirus si la superficie esta expuesta al sol o no esta
protegida por las sombra de las plantas, se han desarrollado muchos protectores de UV para
baculovirus, entre ellas los abrillantadores, lignosulfatos, gelatina y dióxido de titanio. Szewczyk
et al, 2006.
La bioseguridad de los baculovirus genéticamente modificados es un importante problema el cual
requiere consideración especial. Un numero de estudios indica que los baculovirus no han
representado peligro a animales que no sean sus hospederos, por ejemplo el baculovirus que
expresa la toxina de escorpión AaIT no fue patogénica a abejas, pajaros, peces o algún otro
vertebrado. Los baculovirus genéticamente modificados no han afectado la comunidad
microbiana acuatica en ningún sentido. Los enemigos naturales de las larvas tales como los
parasitoides y depredadores no fueron adversamente afectados por hacer presas de larvas
infectadas con baculovirus recombinantes. (Boughton, et al 2003; Kreutzweiser, et al 2001;
Smith, et al 2000).
Otro asunto concerniente a la bioseguridad es el potencial que el gen clonado en el virus “salte”
hacia el organismo receptor del virus. Esto en teoría es posible, sin embargo esto no ha sido
probado hasta ahora, en resumen hasta ahora no existe evidencia que los baculovirus
recombinantes representen un riesgo, para el mundo animal y el ambiente, mayor al que los
baculovirus parentales. Szewczyk et al 2006.
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2.4 LINEAS CELULARES DE INSECTOS
Las células de los insectos han sido exitosamente cultivadas in Vitro por alrededor de 54 años.
Los primeros esfuerzos para cultivar células de insectos, virus y otros patógenos fueron un factor
de esfuerzo para que los investigadores desarrollaran diversas líneas celulares de insectos. El
mayor impacto de en el cultivo de líneas celulares fue descubierto gracias a que se demostró la
posibilidad de modificar por medio de ingeniería genética el AcMNPV para producir proteínas
heterólogas. El éxito de los esfuerzos hechos para establecer líneas celulares ha dependido
siempre de tener en primer lugar un detallado conocimiento de la bioquímica del insecto,
debieron estudiarse a fondo primero características tales como el pH, la presión osmótica, el
contenido de sales y azucares de los fluidos corporales. Lynn, 1999.
Vaughn y colaboradores en 1977 desarrollaron dos lineas celulares, la IPBL-SF-21 fue
desarrollada con medio suplementado con hemolinfa y fue mantenida continuamente en el medio.
La segunda linea celular IPLURIA BERTANI-SF-1254 fue desarrollada con un medio
conteniendo una combinacion de suero vertebrado y hemolinfa , posteriormente este medio fue
adaptado a un medio libre de hemolinfa despues de el sexto paso. la duplicacion celular ocurre a
las 30 y 36 horas respectivamente, la morfologia y distribucion cromosomal es tipica a la de otras
celulas de lepidopteros. Asi tambien se observo la existencia de por lo menos un antigeno en
ambas lineas celulares.
El sistema de expresión baculovirus-célula de insecto es ampliamente usado para la expresión de
proteínas recombinantes en un ambiente eucariótico. Las células de insectos tienen capacidades
eucarióticas en el procesamiento de las proteínas, esto es debido a que estas células pueden
doblar, modificar, transportar y ensamblar polipéptidos sintetizados para producir proteínas muy
similares a las autenticas (Luckow y Summer, 1988).
Sin embargo es igualmente verdadero que las rutas de procesamiento de proteínas en células de
insectos no son necesariamente equivalentes a aquellas presentes en los eucariontes superiores.
Konst et al, 2005).
Sharon et al, en 1998, investigaron el efecto de la infección por baculovirus en el ciclo de vida de
las células Sf9. Demostrando que la infección detiene el crecimiento del 84% de las células en las
fase G2/M de 18 a 24 hrs. La prolongada detención de se debe a las proteínas codificadas por el
AcMNPV; análisis de hibridación demostraron que el máximo índice de replicación viral ocurre
antes de la detención de desarrollo. La replicación del DNA celular no ocurre durante esas fases
de arresto, sin embargo experimentos adicionales demostraron que la replicación del DNA celular
no es necesaria para la replicación del DNA viral.
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3. JUSTIFICACIÓN
El surgimiento de resistencia de los insectos plaga a los insecticidas químicos y los efectos
adversos que tienen éstos sobre el medio ambiente, han propiciado la búsqueda de métodos que
complementen o sustituyan, parcial o totalmente, a los insecticidas químicos. Uno de esos
métodos es el empleo de baculovirus, del cual no se tienen reportes de la construcción de
baculovirus recombinantes con el gen CrV1 del PDV de C. rubecula para su uso como
bioinsecticida, esta construcción podría potenciar el efecto infeccioso de los baculovirus.
4. OBJETIVOS
4.1 General
Desarrollar y determinar si los baculovirus recombinantes con el gen crv1 tienen algún
efecto pesticida superior al mostrado por mostrado por el baculovirus nativo.
4.2 Específicos
Establecer las condiciones operacionales y ambientales óptimas para la propagación de la
línea celular Sf9.
Generar baculovirus recombinantes mediante co-transfección en líneas celulares Sf9.
Determinar el efecto de los baculovirus recombinantes en larvas de S. exigua del segundo
y cuarto instar.
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5. HIPÓTESIS
Es posible generar un baculovirus recombinante con el gen crv1 mediante un sistema de co-
transfección en líneas celulares Sf9, el cual podría tener un efectos insecticida incrementado
sobre larvas de Spodoptera exigua.
6. MATERIALES Y MÉTODOS
66..11.. BBAACCTTEERRIIAASS,, LLIINNEEAASS CCEELLUULLAARREESS,, VVIIRRUUSS EE IINNSSEECCTTOOSS..
Escherichia coli cepa HB101 fue usada para llevar a cabo las transformaciones necesarias
en este trabajo.
Células de la línea Sf9 de Novagen derivadas de Spodoptera frugiperda.
Larvas del segundo y cuarto instar de Spodoptera exigua.
El baculovirus tipo silvestre AcNPV C6 Wild-type de BD Biosciences Pharmingen™
EL genoma de baculovirus linearizado BD BaculoGold™ Linearized Baculovirus DNA
de Pharmingen.
66..22.. IINNIICCIIAADDOORREESS DDEE RREEAACCCCIIOONN DDEE PPCCRR
UUnniivveerrssaalleess MM1133 5´-GTT TTC CCA GTC ACG TTG TA-3´
5´-TTG TGA GCG GAT AAC AAT TTC-3´
EEssppeeccííffiiccooss ppaarraa eell ggeenn CCrrVV11
5'-ATGTCACTCGTCAAAAGTGCGT-3´
5'-AGTGTGTTCTCTAGGGGTCGAT3´
iinniicciiaaddoorreess BBggllIIII--CCrrVV11--SSpphhII
´5-GCGCAGATCTATGTCACTCGTCAAAAGTGCG-3´
´5-AATAGCATGCGGTACCGGGCCCCCCCTCGAG-3´
14
IInniicciiaaddoorreess ppPPoollhh--CCrrVV11
5´-TATATAGTTGCTGATATCATGG-3´
5'-AGTGTGTTCTCTAGGGGTCGAT-3´
IInniicciiaaddoorreess ppPP1100--CCrrVV11 5´-TGTAAATTACATTTTATTTA-3´
5'-AGTGTGTTCTCTAGGGGTCGAT-3´
66..33.. VVEECCTTOORREESS
ppBBlluueessccrriippttKKSS--CCrrvv..
Vector de transferencia para baculovirus pVl1392 de Pharmingen.
Vector de tranferencia para baculovirus pAcUW21de Pharmingen.
Plasmido pGEM®-T Easy Vector Systems de Promega.
66..44.. CCOONNSSTTRRUUCCCCIIOONN DDEE VVEECCTTOORREESS DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS CCOONN
EELL GGEENN CCRRVV11..
Los vectores de transferencia Pvl1392 y pAcUW21 fueron utilizado para transformar células E.
coli calcio competentes (ver apéndice E), las cuales después de la transformación fueron
cultivadas en medio Luria Bertani selectivo para resistencia a Ampicilina, con las bacterias se
llevo a cabo de ADN plasmídico, se realizó una caracterización de cada uno de los vectores
digiriéndolos con las enzimas de restricción HindIII y KpnI por separado y se realizó
electroforesis en un gel de agarosa, posteriormente se visualizó este gel con una lámpara de luz
ultravioleta para analizar la presencia de bandas de ADN así como su tamaño.
66..55.. EESSTTRRAATTEEGGIIAA PPAARRAA LLAA CCOONNSSTTRRUUCCCCIIÓÓNN DDEE VVEECCTTOORR DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA
RREECCOOMMBBIINNAANNTTEE ((11)) ppVVLL11339922--VV11..
El plásmido pBluescriptKS-Crv1 y el vector de transferencia pVL1392 fueron digeridos con las
enzimas de restricción PstI y KpnI con los productos de esta reacción se realizó electroforesis en
un gel de agarosa durante 30 minutos y, posteriormente se visualizó este gel con una lámpara de
luz ultravioleta, las bandas de 1400 y 9100 pares de bases fueron separadas del gel con ayuda de
una navaja. Cada porción de gel fue colocada en una columna de purificación de DNA (Spin
15
Columns and Elution Tubes de la marca AMBION catalogo AM10065), y cada columna fue
colocada en el tubo de elución provisto, se centrifugo a 12000 rpm durante 5 minutos. El
resultado de la purificación fue verificado por medio de electroforesis en un gel de agarosa,
posteriormente se visualizó este gel con una lámpara de luz ultravioleta para analizar la presencia
de bandas de ADN así como su tamaño y concentración utilizando concentraciones conocidas de
DNA de fago lambda (λ). Con los fragmentos purificados se llevó a cabo una reacción de
ligación. El resultado de la ligación fue utilizado para transformar células E. coli las cuales
después de la transformación fueron cultivadas en placas de agar Luria Bertani selectivo para
resistencia a Ampicilina, las colonias resultantes fueron cultivadas en medio Luria Bertani
liquido.
Figura 1. Esquema de la estrategia para la construcción del vector de transferencia
(1)pVl1392.V1
9136 pb.
CrV1
1427 pb.
CrV1
pPolh
pPolh
16
66..66.. EESSTTRRAATTEEGGIIAA PPAARRAA LLAA CCOONNTTRRUUCCCCIIOONN DDEELL VVEECCTTOORR DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA
RREECCOOMMBBIINNAANNTTEE PPAACCUUWW2211--VV11
Los iniciadores BglII-crv1-SphI fueron usados para hacer PCR (92 ºC por 2 min, y 30 ciclos de:
92 ºC por 30 sec, 60 ºC por 30 sec y 70 ºC por 1 min.), usando como templado el plásmido
pBluescriptKS-Crv1. Los productos de PCR fueron ligados en el pGEM®-T Easy Vector dando
origen al vector pGEM®-T Easy + crv1. Con el cual se transformaron células E. coli las cuales
después de la transformación fueron cultivadas en medio Luria Bertani sólido, selectivo para
resistencia a Ampicilina, las colonias resultantes fueron cultivadas en medio Luria Bertani liquido
con las que se llevo a cabo extracción de DNA plasmídico, los plásmidos fueron digeridos con
las enzimas de restricción BglII y SphI, al igual que el vector pAcUW21. Con los productos de
esta reacción de digestión se realizó electroforesis en un gel de agarosa durante 30 minutos y,
posteriormente se visualizó este gel con una lámpara de luz ultravioleta, las bandas de 1300 y
9600 pares de bases fueron separadas del gel con ayuda de una navaja de bisturí. Cada porción de
gel fue colocada en una columna de purificación de DNA Spin Columns and Elution Tubes de la
marca AMBION, y cada columna fue colocada el tubo de elución provisto, se centrifugo a 12000
rpm durante 5 minutos. El resultado de la purificación fue verificado por medio de electroforesis
en un gel de agarosa al 1.0%, durante 1hora y, posteriormente se visualizó este gel con una
lámpara de luz ultravioleta para analizar la presencia de bandas de ADN así como su tamaño y
concentración. La reacción de ligación de estos fragmentos se llevo a cabo con la siguiente
mezcla: DNA de vector 120 ng, DNA de inserto 40 ng, buffer 10X de ligasa 1 µl, ligasa T4
(Promega®) 1 µl (unidades Weiss), el volumen de reacción fue aforado a 10 µl con agua miliQ
libre de nucleasas esta mezcla se colocó a 4oC toda la noche. El resultado de la ligación fue
utilizado para transformar células E. coli las cuales después de la transformación fueron
cultivadas en medio Luria Bertani sólido, selectivo para resistencia a Ampicilina, las colonias
resultantes fueron cultivadas en medio Luria Bertani liquido.
17
Figura 2. Representación esquemática de la construcción del vector de transferencia
recombinante pAcuw21-V1.
CrV1
Productos de PCR,
primers BglII-CrV1-
SphI, 1362 pb.
1362 pb. 6947 pb.
18
66..77.. EESSTTRRAATTEEGGIIAA PPAARRAA LLAA CCOONNTTRRUUCCCCIIOONN DDEELL VVEECCTTOORR DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA
RREECCOOMMBBIINNAANNTTEE ((22))PPVVLL11339922--VV11
Las bacterias E. coli que contienen el vector pGEM®-T Easy+CrV1 fueron cultivadas en medio
Luria Bertani sólido, selectivo para resistencia a Ampicilina, las colonias resultantes fueron
cultivadas en medio Luria Bertani liquido con las que se se llevo a cabo extracción de DNA
plasmídico, los plásmidos fueron digeridos con las enzimas de restricción BglII y KpnI, al igual
que el vector pVL1392. Con los productos de esta reacción se realizó electroforesis en un gel
(TAE1X y agarosa al 0.8%, teñido con Syber Gold) durante 30 minutos y, posteriormente se
visualizó este gel con una lámpara de luz ultravioleta, las bandas de 1374 y 9118 pares de bases
fueron separadas del gel con ayuda de una navaja. Cada porción de gel fue colocada en una
columna de purificación de DNA (Spin Columns and Elution Tubes de la marca AMBION
catalogo AM10065), y cada columna fue colocada el tubo de elución provisto, se centrifugo a
12000 rpm durante 5 minutos. El resultado de la purificación fue verificado por medio de
electroforesis en un gel de agarosa al 1.0%, durante 1hora y, posteriormente se visualizó este gel
con una lámpara de luz ultravioleta para analizar la presencia de bandas de ADN así como su
tamaño y concentración. La reacción de ligación de estos fragmentos se llevo a cabo con la
siguiente mezcla: DNA de vector 120 ng, DNA de inserto 40 ng, buffer 10X de ligasa 1 µl, ligasa
T4 (promega) 1 µl (unidades Weiss), el volumen de reacción fue aforado a 10 µl con agua miliQ
libre de nucleasas esta mezcla se colocó a 4oC toda la noche. El resultado de la ligación fue
utilizado para transformar células de E. coli las cuales después de la transformación fueron
cultivadas en medio Luria Bertani sólido, selectivo para resistencia a Ampicilina, las colonias
resultantes fueron cultivadas en medio Luria Bertani liquido.
19
Figura 3. Representación esquemática de la construcción del vector de transferencia
(2)pVl1392-V1
9118 pb. 1374 pb.
20
66..88.. CCOOMMPPRROOBBAACCIIOONN DDEE LLAA CCOORRRREECCTTAA CCOONNSSTTRRUUCCCCIIOONN DDEE LLOOSS VVEECCTTOORREESS DDEE
TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS..
En cada construcción fue verificada la correcta inserción por medio de restricción con enzimas
Kpn1 y BglII y estableciendo el contraste con los vectores no recombinantes digeridos con las
mismas enzimas. Se determinó cual es el patrón de bandas esperado en cada vector con la
digestión por medio de esas enzimas.
A) B)
C) D)
21
E)
Figura 4. Sitios de corte esperados en el patrón de restricción de los vectores: A) pVl1392,
B)(1)pVl1392-V1,C) (2)pVl1392-V1, D)pAcuw21, E)pAcuw21-V1.
66..99.. PPUURRIIFFIICCAACCIIÓÓNN DDEE LLOOSS VVEECCTTOORREESS DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS..
Las bacterias que contienen los vectores de transferencia recombinantes fueron cultivados en
medio liquido Luria Bertani selectivo para resistencia a ampicilina, los vectores fueron extraídos
por medio de minipreparación de DNA plasmídico, se realizó electroforesis en un gel (TAE1X y
agarosa al 0.8%, teñido con Syber Gold) durante 30 minutos, se visualizó este gel con una
lámpara de luz ultravioleta, las bandas de mas de 10800 pares de bases fueron separadas del gel
con ayuda de una navaja. Cada porción de gel fue colocada en una columna de purificación de
DNA (Spin Columns and Elution Tubes de la marca AMBION catalogo AM10065), y cada
columna fue colocada el tubo de elución provisto, se centrifugo a 12000 rpm durante 5 minutos.
El DNA resultante de esta purificación fue posteriormente usado para llevar a cabo las co-
transfecciones.
66..1100.. CCUULLTTIIVVOO DDEE LLAA LLÍÍNNEEAA CCEELLUULLAARR SSFF99
El medio Bacvector Insect cell médium fue colocado en un baño maría a 28 grados. El criovial
de células sf9 fue recuperado del Nitrógeno liquido y rápidamente sumergido hasta la mitad en un
22
baño María a 28 grados. El criovial fue girado suavemente hasta que las células quedaron
totalmente descongeladas. El exterior del criovial fue esterilizado con etanol al 70% y fue llevado
a una campana de flujo laminar y fue abierto cuidadosamente. Las celulas fueron tomadas
suavemente con una pipeta y se colocaron en un tubo estéril de 50 ml, se agregaron 5 ml del
medio precalentado a 28 grados, gota a gota a las células. La solución fue pipeteada suavemente
de 5 veces. La suspensión fue colocada en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm. de diámetro
(Falcón Cat. No. 3802). Las celulas fueron incubadas a 28oC por 60 minutos y posteriormente el
medio fue removido con una pipeta y 5 ml de medio (con 5% de suero bovino fetal, 50 µg/ml de
sulfato de gentamicina y 2.5 µg/ml Anfotericina B) fueron agregados. La incubación continuo
hasta que la monocapa de células alcanzó el 85-95% de la confluencia la viabilidad y la
confluencia fue verificada cada día en un microscopio invertido.
Se llevaron a cabo traspasos y sub-cultivos para diluir las células, los cultivos celulares fueron
traspasados antes de alcanzar la densidad de 2 x 106 células/ml diluyéndolas a una densidad de
1.0 x 106 células/ml.
66..1111.. CCOONNGGEELLAAMMIIEENNTTOO DDEE CCEELLUULLAASS SSFF99..
Un cultivo saludable en fase logarítmica fue centrifugado a 1000xg por 10 min, el pellet se
mantuvo en hielo y resuspendido en una solución de 90% medio Bacvector Insect cell y 10%
DMSO, ajustando la densidad celular a 4 x 106 células/ml. La solución de celulas fue dispensada
en alícuotas de 1 ml en crioviales manteniéndolas en hielo en todo momento. Las celulas fueron
congeladas colocándolas a -20oC por una hora y posteriormente a -80oC toda la noche, después
fueron transferidas a Nitrógeno líquido para ser conservadas por tiempo prolongado.
66..1122.. TTRRAANNSSPPAASSOO DDEE CCUULLTTIIVVOOSS CCEELLUULLAARR EENN MMOONNOOCCAAPPAA
Bajo una campana de flujo laminar se examinó que los cultivos en monocapa fueran saludables y
a 85-95% de la confluentes, se aspiro suavemente el medio de esos cultivos, cinco ml de medio
nuevo y precalentado a 28 oC fueron agregados a la placa. Las celulas fueron separadas del
fondo de la placa pipeteando suavemente, las celulas desalojadas fueron transferidas a un tubo
estéril de 50 ml. La solución de medio y celulas fue dividida proporcionalmente en 2 placas
donde se complementó cada una con 2.5 ml de medio con antibióticos. Los traspasos se hicieron
cada 4 días debido al crecimiento celular.
23
66..1133.. CCOO--TTRRAANNSSFFEECCCCIIOONN MMEEDDIIAADDAA PPOORR CCAALLCCIIOO
Dos millones de celulas fueron sembradas en cada placa de cultivo de 60 mm (50% de la
confluencia), las celulas se fijaron firmemente al fondo de la placa.
Mientras las células se fijaban en la placa, se mezclaron 0.5 microgramos de DNA de baculogold
con 4 microgramos de el vector recombinante de Baculovirus, en un tubo de microcentrifuga,
fueron bien mezclados bien por medio vortex, se dejó asentar la mezcla por 5 minutos y se
agregó 1 ml de búfer de transfección B.
el medio fue aspirado de la placa y reemplazado con 1 ml del buffer de transfección A.
Asegurándose que el total de la superficie de la placa estuviera cubierto, para prevenir la
resequedad en las células.
Un mililitro de la solución Buffer B/DNA vector recombinante/baculogold fue agregado gota a
gota a la placa de transfección, meneando suavemente cada 3 a 5 gotas para mezclar bien las
gotas con el medio, durante este procedimiento se formó un fino precipitado color leche de calcio
fosfato /DNA. Las placas fueron incubadas por 4 horas a 28oC.
El medio de las placas fue sustituido con 3 ml de medio TNMFH se meneó varias veces y se
volvió a reemplazar el medio con 3 ml de medio fresco. Se incubó a 28oC por 5 días. Después de
ese tiempo se colecto el sobrenadante de cada co-transfección el cual sirvió para infectar placas
de cultivo de celulas Sf9 sanas, cuyos sobrenadantes a su vez sirvieron para infectar otra placa de
celulas sanas.
El testigo positivo de este experimento se llevo a cabo usando un vector de transferencia
suplementado por el kit (Pvl1392-xyle)
El testigo negativo consistió en no usar ningún vector de transferencia en el experimento.
El virus generado de la co-transfección usando el vector (1)pVl1392-V1 se denominó (1)Ac-
pPol-V1; el virus generado de la co-transfección usando el vector (2)pVl1392-V1 se denominó
(2)Ac-pPol-V1; el virus generado de la co-transfección usando el vector pAcuw21-V1 se
denominó Ac-pP10-V1.
24
66..1133.. PPCCRR YY SSEECCUUEENNCCIIAACCIIÓÓNN DDEELL GGEENN CCRRVV11 SSOOBBRREENNAADDAANNTTEESS DDEE CCEELLUULLAASS
IINNFFEECCTTAADDAASS..
A una mezcla de sobrenadante y celulas infectadas con cada uno de los virus nuevos se les realizó
una extracción de DNA genómico con el estuche Wizard® Genomic DNA Purification Kit de
Promega® con el protocolo de extracción para cultivo celular
Las células fueron cosechadas y transferidas a un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml donde fue
centrifugado a 13000xg por 10 segundos, el sobrenadante fue removido dejando solo 10 µl de
liquido residual.
200 µl de PBS fueron agregados para lavar las celulas, se centrifugó a 13000xg por 10 segundos
y se removió el PBS. Con un vortex se resuspendieron las celulas.
Se agregaron 600 µl de Nuclei Lysis Solution y se pipeteó para lisar las celulas hasta que no
hubiera celulas agrupadas visibles.
Se agregaron 3 µl de la solución RNase y se mezclo la muestra invirtiendo los tubos 3 veces. Se
incubo la mezcla 16 minutos a 37°C. posteriormente la mezcla fue enfriada a temperatura
ambiente por 5 minutos.
Se agregaron 200µl de Protein Precipitation Solution y fue resuspendido fuertemente con un
vortex por 20 segundos.
La mezcla fue enfriada en hielo durante 5 minutos y se centrifugo a 13,000 por 4 minutos. El
sobrenadante fue transferido a un tubo de 1.5 ml estéril con 600µl de isopropanol a temperatura
ambiente. La solución fue suavemente mezclada por inversión hasta que fue visible un hilo color
lechoso.
La muestra fue centrifugada por 1 minuto a 13,000 × g el sobrenadante fue decantado
cuidadosamente. Se agregaron 600µl de etanol al 70% a temperatura ambiente, suavemente fue
invertido el tubo varias veces para lavar la pastilla de DNA. Posteriormente se centrifugo a por 1
minuto a 13,000 × g. El etanol fue aspirado cuidadosamente con una pipeta. El tubo se dejó secar
al aire por 15 minutos. Se agregaron 100µl de DNA Rehydration Solution y se incubo a 65°C por
1 h. el DNA fue posteriormente almacenado a 2 °C.
Después de 6 días, los sobrenadantes de las placas donde se llevaron a cabo las co-transfecciones,
se utilizaron para infecta placas con cultivos celulares sanos, los cuales después de 6 días
sirvieron para infectar a su vez otra placa de cultivo celular sano.
Con el DNA purificado se llevo a cabo PCR ((92 ºC por 2 min, y 30 ciclos de: 92 ºC por 30 sec,
50 ºC por 30 sec y 70 ºC por 1 min.) y secuenciación usando los iniciadores pPolh-CrV1 y pP10-
25
CrV1. Por último, las secuencias obtenidas se compararon por medio del programa BLAST,
(NCBI) con las bases de datos de secuencias genómicas existentes.
6.14. INFECCIÓN DE LARVAS DE SPODOPTERA EXIGUA DEL SEGUNDO INSTAR
Los sobrenadantes de la quinta generación de placas de celulas infectadas fueron usados para
infectar la dieta de larvas de Spodoptera exigua del segundo instar, se usaron 60 vasos cada uno
con 3 ml de medio, el cual se inoculó con 100 µl de sobrenadante (a una concentración viral
desconocida). En el caso del testigo positivo el medio fue inoculado una solución de 59 cuerpos
de oclusión/ml del virus SeMNPV. Se realizaron conteos de las larvas vivas a 0, 3 y 10 días
después de la infección (dpi). En el testigo negativo se utilizo agua destilada en lugar de
soluciones virales.
6. 15. INFECCIÓN DE LARVAS DE SPODOPTERA EXIGUA DEL CUARTO INSTAR
Los sobrenadantes de la quinta generación de placas de celulas infectadas fueron usados para
infectar la dieta de larvas de Spodoptera exigua del cuarto instar, se usaron 1500 µl de
sobrenadante (a una concentración viral desconocida) por cada 50 ml de medio. En el caso del
testigo positivo el medio fue inoculado una solución de 59 cuerpos de oclusión/ml del virus
SeMNPV. Se realizaron conteos de las larvas vivas a 0, 3, 6 y 13 días después de la infección
(dpi). En el testigo negativo se utilizo agua destilada en lugar de soluciones virales. El número de
larvas fue de 50 en cada tratamiento.
7. RESULTADOS. 77..11.. CCOONNSSTTRRUUCCCCIIÓÓNN DDEELL VVEECCTTOORR DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA PPVVLL11339922--VV11
La banda de 1427 pb escindida de la digestión del pBluescriptKS-CrV1, digerido con las enzimas
Pst1 y Kpn1corresponde al gen CrV1 y la 9127 corresponde al vector pVl1392 linarizado.
Misma que por medio de ligación de extremos cohesivos fue insertada en el pVl1392.
26
Figura 5. A) Patrón de restricción, después de digerir el pBluescriptKS-CrV1(carril 2) y el pVl1392 (carril 4) con las
enzimas Pst1 y Kpn1. B) electroforesis en gel de los fragmentos de 1400 (carril 2) y 9100 pb (carril 3) purificados de
un gel de agarosa previamente por medio de columnas de elución.
77..22.. CCOONNSSTTRRUUCCCCIIÓÓNN DDEELL VVEECCTTOORR DDEE TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA PPAACCUUWW2211--VV11
Los productos de PCR fueron clonados en el vector pGEM®-T Easy Vector para originar el
vector pGEM®-T Easy Vector+CrV1 del cual se tomó el gen CrV1 por medio de digestión con
las enzimas BglII y SphI y se ligó en el vector pAcuw21 previamente linearizado con las mismas
enzimas
|
Figura 6. A) carril 4 y 5 son testigos negativos, carriles 6,7y 8 son productos de PCR, en esta reacción se utilizaron
los iniciadores pPolh-CrV y pP10-CrV1. B) carril 2 el pGEM®-T Easy Vector+CrV1 digerido con las enzimas BglII
y SphI. C) El carril 2 corresponde a la digestión del vector pAcuw21 con las enzimas BglII y SphI. D) En el carril 2
y 3 fragmentos de 7000 pb provenientes de la digestión del pAcuw21; en el carril 4, fragmento de 1300 pares de
bases correspondiente a la digestión del pGEM®-T Easy Vector+CrV1.
A) B)
A) B) C) D)
27
77..33..CCOONNSSTTRRUUCCCCIIÓÓNN DDEELL VVEECCTTOORR ((22))ppVVLL11339922--VV11
Del pGEM®-T Easy Vector+CrV1 del cual se tomó el gen CrV1 esta digiriendo con las enzimas
BglII y Kpn1. Este fragmento fue ligado en el vector pVl1392 previamente linearizado con las
mismas enzimas.
Figura 7. Carril 3 y 4 es el fragmento de 1300 pb proveniente de la restricción del vector pGEM®-T Easy
Vector+CrV1 con las enzimas BglII y Kpn1. Carril 5 y 6 corresponden a el fragmento de 9100 pb proveniente de la
restricción del vector pVl1392 con BglII y Kpn1. Ambos fragmentos fueron purificados con columnas de elución.
77..44.. CCOOMMPPRROOBBAACCIIOONN DDEE LLAA CCOORRRREECCTTAA CCOONNSSTTRRUUCCCCIIOONN DDEE LLOOSS VVEECCTTOORREESS DDEE
TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS..
Figura 8. El carril 1 y 13 son marcadores de peso moleucular de 1Kb. Todas las muestras fueron digeridas con las
enzimas BglII KpnI; el carril 2 es el vector pVl1392, los carriles 3, 4 y 5 son el vector (1)pVl1392-V1 digerido; el
carril 6, 7 y 8 son el vector (2)pVl1392-V1 digerido; el carril 9 es el vector pAcUW21 digerido; los carriles 10, 11 y
12 son el vector pAcUW21-V1 digerido.
28
77..55.. CCUULLTTIIVVOO DDEE LLAA LLÍÍNNEEAA CCEELLUULLAARR SSFF99
Los cultivos celulares alcanzaron la confluencia en un periodo promedio de 8 días, antes de eso
(cada 6 días) tenían que ser subcultivadas, el contenido de cada placa de cultivo era dividido en 2
cada 6 días. También se realizaron congelamientos de celulas para preservarlas.
Figura 9. A) Muestra el aspecto de una placa de cultivo de 0 días y B) de de 7 días de crecimiento, en esta etapa eran
subcultivadas ( 70-80% de la confluencia).
77..66.. CCOOTTRRAANNSSFFEECCCCIIOONN EE IINNFFEECCCCIIOONN DDEE LLAA LLIINNEEAA CCEELLUULLAARR SSFF99 CCOONN LLOOSS
BBAACCUULLOOVVIIRRUUSS RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS GGEENNEERRAADDOOSS..
Después de llevar a cabo la co-transfección en celulas sf9. Se llevo a cabo la infección de celulas
Sf9 sanas con cada uno de los baculovirus recombinantes.
A) B)
A) B) C) D)
29
Figura 10. A) Aspecto de cultivo celular sano, antes de llevar a cabo las co-transfecciones; B) celulas Sf9 infectadas
con el baculovirus recombinante (2)Ac-pPol-V1, a nueve días después de la co-transfección. C) Celulas Sf9
infectadas con el baculovirus recombinante (1)Ac-pPol-V1, a nueve días después de la infección. D) celulas Sf9
infectadas con el baculovirus recombinante Ac-pP10-V1. E) Celulas Sf9 infectadas con el AcMNPV tipo silvestre.
F) Testigo negativo (sano) de la co-transfección 4 días después.
77..77.. PPCCRR PPAARRAA VVEERRIIFFIICCAARR LLAA EEXXIISSTTEENNCCIIAA DDEELL GGEENN CCRRVV11 EENN DDNNAA GGEENNOOMMIICCOO DDEE
CCEELLUULLAASS SSFF99 IINNFFEECCTTAADDAASS CCOONN LLOOSS VVIIRRUUSS RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS
Los iniciadores pPolh-CrV1 y pP10-CrV1 fueron utilizados para realizar PCR, usando como
sustrato DNA extraído de los sobrenadantes de placas de cultivos de tejidos sanas e infectadas
con los baculovirus recombinantes.
Figura 11. Carril 1 es marcador de peso molecular de 1 kb, Carril 2 iniciadores pPolh-CrV1 en DNA genómico de celulas infectadas con (1)Ac-
pPol-V1 , Carril 3 es iniciadores pP10-CrV1 en DNA genómico de celulas infectadas con (1)Ac-pPol-V1, Carril 4 es DNA genómico de celulas
infectadas con (2)Ac-pPol-V1 con iniciadores pPolh-CrV1, Carril 5 es el (2)pVl1392-V1 con iniciadores pP10-CrV1, Carril 6 es DNA genómico
de celulas infectadas con (2)Ac-pPol-V1 con iniciadores pP10-CrV1, Carril 7 es DNA genómico de celulas infectadas con (2)Ac-pPol-V1 usando
iniciadores pPolh-CrV1, Carril 8 es repetición del carril 4, Carril 9 es DNA genómico de celulas sf9 sanas con oligonuceotidos específicos de
Crv1, Carril 10 es DNA genómico de celulas sf9 sanas con iniciadores pPolh-CrV1. Carril 11 es DNA genómico de celulas sf9 sanas con
iniciadores pP10-CrV1.
E) F)
30
El virus generado de la co-transfección usando el vector (1)pVl1392-V1 se denominó (1)Ac-
pPol-V1; el virus generado de la co-transfección usando el vector (2)pVl1392-V1 se denominó
(2)Ac-pPol-V1; el virus generado de la co-transfección usando el vector pAcuw21-V1 se
denominó Ac-pP10-V1.
77..88.. SSEECCUUEENNCCIIAACCIIOONN UUSSAANNDDOO LLOOSS IINNIICCIIAADDOORREESS ppPPoollhh--CCrrVV11 YY ppPP1100--CCrrVV11 eenn DDNNAA
GGEENNOOMMIICCOO DDEE CCEELLUULLAASS SSFF99 IINNFFEECCTTAADDAASS CCOONN LLOO BBAACCUULLOOVVIIRRUUSS
RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS
Tabla 2. Comparación por nucleótidos y porcentaje de identidad del producto de PCR amplificado con los iniciadores pPolh-CrV1 usando como sustrato DNA genómico extraido de placas de cultivo celular infectadas con (1)Ac-pPol-V1.
Tabla 3. Comparación por nucleótidos y porcentaje de identidad del producto de PCR amplificado con los iniciadores pPolh-CrV1 usando como sustrato DNA genómico extraido de los de placas de cultivo celular infectadas con (2)Ac-pPol-V1.
Número de
acceso
Descripción Valor E Identidad
AF359344.1
Gen completo de proteína CrV1
de virus de Cotesia rubecula 0.0 95%
U55279.1
mRNA de proteina CrV1 de
Cotesia rubecula virus 0.0 95%
EF211980.1
Gen CrV1 del Bracovirus
endógeno de Cotesia rubecula 0.0 96%
Número de
acceso
Descripción Valor E Identidad
AF359344.1
Gen completo de proteína CrV1
de virus de Cotesia rubecula 0.0 95%
U55279.1
mRNA de proteina CrV1 de
Cotesia rubecula virus 0.0 95%
EF211980.1
Gen CrV1 del Bracovirus
endógeno de Cotesia rubecula 0.0 96%
31
Tabla 4. Comparación por nucleótidos y porcentaje de identidad del producto de PCR amplificado con los iniciadores pP10-CrV1 usando como sustrato DNA genómico extraido de placas de cultivo celular infectadas con Ac-pP10-V1.
77..99.. EEFFEECCTTOO PPLLAAGGUUIICCIIDDAA EENN LLAARRVVAASS DDEELL SSEEGGUUNNDDOO IINNSSTTAARR
Larvas en el segundo instar fueron alimentadas con medio inoculado con tres virus
recombinantes, con el SeMNPV como testigo positivo y con ningún virus como testigo negativo.
Se realizaron conteos a los tres días después de la infección y diez días después de la inoculación.
Figura 12. Larvas vivas a los 0,3 y 10 días después de inocular la dieta con cada uno de los virus
recombinantes, con SeMNPV como testigo positivo y sin tratamiento como testigo negativo.
Número de
acceso
Descripción Valor E Identidad
U55279.1 mRNA de proteina CrV1 de Cotesia rubecula virus
0.0 97%
AF359344.1 Gen completo de proteína CrV1 de virus de Cotesia rubecula
0.0 100%
EF211980.1 Gen CrV1 del Bracovirus endógeno de Cotesia rubecula
0.0 97%
32
RESULTADOS DE LA COMPARACION DE MEDIAS DE LARVAS MUERTAS POR
UNIDAD EXPERIMENTAL A 0.01 DE NIVEL DE SIGNIFICANCIA
TRATAMIENTO MEDIA
(1)Ac-pPol-V1 1.8462 a
Ac-pP10-V1 1.8462 a
(2)Ac-pPol-V1 1.8333 a
SeMNPV 1.7500 a
Testigo negativo 0.3000 b
77..1100.. EEFFEECCTTOO PPLLAAGGUUIICCDDAA EENN LLAARRVVAASS DDEELL CCUUAARRTTOO IINNSSTTAARR
Larvas del cuarto instar fueron inoculadas oralmente con cada uno de los virus recombinantes,
como testigo positivo se utilizo el SeMNPV, los conteos de sobrevivientes se realizaron a los 3, 6
y 13 dias después de la inoculación.
Figura 13. Larvas vivas a los 0,3, 6 y 10 dias después de inocular la dieta con cada uno de los virus recombinantes,
con SeMNPV como testigo positivo y sin tratamiento como testigo negativo.
33
EFECTOS DE LA INFECCION SOBRE LA MORFOLOGIA DE LOS INSECTOS
Figura 14. Efectos de la infección sobre la morfología de larvas
. D I S C U S I O N.
88..11.. VVEERRIIFFIICCAACCIIOONN DDEE LLAA IIDDEENNTTIIDDAADD DDEELL IINNSSEERRTTOO
La importancia de verificar la identidad del inserto en el vector pBluescriptKS-Crv1, tuvo como
fundamento básico el determinar si tal inserto consistía en el DNA del CrV1 o bien en el cDNA
de ese gen. El gen CrV1 completo ha sido previamente caracterizado (Asgari et al, 1996; Asgari
y Schmidt, 2001) y se ha determinado la presencia de un intron a 54 pare de bases del ATG, se ha
demostrado que los baculovirus no identifican los intrones contenidos en los y en su genoma que
no tienen genes que contengan intrones un gen con intrones solo puede ser expresado de manera
exitosa en algunos casos (Kuan-Teh et al, 1987). Los resultados obtenidos indicaron que la
identidad del inserto corresponde a cDNA del gen CrV1 del polidnavirus de Cotesia rubecula
(Tabla 1).
88..22.. CCOOMMPPRROOBBAACCIIOONN DDEE LLAA CCOORRRREECCTTAA CCOONNSSTTRRUUCCCCIIOONN DDEE LLOOSS VVEECCTTOORREESS DDEE
TTRRAANNSSFFEERREENNCCIIAA RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS..
La Figura 8, muestra el patrón de restricción resultante del digerir con las enzimas BglII KpnI
tanto lo vectores de baculovirus recombinantes y no recombientes como una manera de llevar a
A) B) C)
34
cabo la comprobación de la correcta construcción de estos vectores. El patrón diferencial permite
inferir sobre la correcta construcción de los vectores de transferencia recombiantes. Esos sitios de
restricción flanquean el gen insertado en el caso de los vectores (1)pVl1392-CrV1 y (2)pVl1392-
V1 (carriles del 3 al 8), sin embargo en el vector pVl1392 tales sitios se encuentran a solo 500
pares de bases aproximadamente (carril 2) ; la diferencia entre los patrones de bandas
correspondientes a los vectores (1)pVl1392-V1 y (2)pVl1392-V1 se debe a la longitud del
inserto, debido a que en el primer caso es de 1433 pb y en el (2)pVl1392-V1 el inserto tiene
1360 pb.
El vector de transferencia pAcuw21 tiene un sitio BglII y un sitio KpnI separados por 1000 pb.
La inserción del gen CrV1 río abajo del promotor p10, tiene como consecuencia también la
inserción además de un nuevo sitio KpnI. Esas características de los patrones de restricción nos
permite inferir la correcta construcción de los vectores de transferencia recombinantes. Estos es
de suma importancia debido a que tales vectores son una herramienta indispensable para el
posterior desarrollo de los baculovirus recombinantes (Kitts y Possee 1993).
Existen diferencias marcadas entre los vectores de transferencia construidos. Por un lado los
construidos en base al vector pVl1392 permitieron la inserción del gen bajo el promotor de
polihedrina. La diferencia entre estos dos vectores se encuentre en la distancia río abajo del
promotor de polihedrina a la cual fue insertado el gen CrV1. En el caso del vector (1)pVl1392-
V1, el ATG del gen CrV1 se ubica a 189 pares de bases de la caja TATA, en el baculovirus
AcMNPV el ATG del gen de polihedrina se ubica a 146 pares de bases, pero también se ha
demostrado que la inserción de mas pares de bases entre estos elementos no actúa en detrimento
de los niveles de expresión (Possee y Howard, 1987). En el caso de el (1)pVl1392-V1 el ATG
del gen CrV1 se ubica a 189 pares de bases de la caja TATA 27 pares de bases menos que en el
virus tipo silvestre.
En el vector pAcuw2-V1 el gen CrV1 fue insertado 273 pb rio abajo del promotor de la proteína
p10.
88..33.. PPCCRR PPAARRAA VVEERRIIFFIICCAARR LLAA EEXXIISSTTEENNCCIIAA DDEELL GGEENN CCRRVV11 EENN DDNNAA GGEENNOOMMIICCOO DDEE
CCEELLUULLAASS SSFF99 IINNFFEECCTTAADDAASS CCOONN LLOOSS VVIIRRUUSS RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS
Para verificar por medio de PCR la existencia de los baculovirus recombinantes en celulas
infectadas, se diseñaron los iniciadores denominados Iniciadores pPolh-CrV1 y pP10-CrV1, los
35
cuales hibridan en el promotor de polihedrina y el extremo 3´ de gen crv1 para el caso de pPolh-
CrV1; y en el promotor p10 y el extremo 3´ del gen crv1.
Tales iniciadores fueron empleados para hacer PCR en diferentes extracciones de DNA genómico
de celulas infectadas con los diferentes virus generados después de 5 ciclos de infecciones.
La presencia de fragmentos de aproximadamente 1300 pares de bases, es señal no solo de la
presencia del gen CrV1 si no también del promotor de polihedrina o p10 según sea el caso.
En DNA genómico de celulas infectadas con el (1)pAc-pPol-V1, no hay amplificación usando los
iniciadores pP10-CrV1 (figura 11, carril 3). Los cual sugiere no solo la presencia de los virus
recombinantes si no también su correcta construcción.
De manera adicional se llevo a cabo una secuenciación de los productos de PCR originados de
DNA genómico de celulas infectadas de cada uno de los baculovirus recombinantes. La
comparación de las secuencias obtenidas con las secuencias de la base de datos del NCBI sugiere
que se trata del gen CrV1, lo cual corrobora la presencia de los virus recombinantes en las celulas
infectadas.
88..44.. IINNFFEECCCCIIOONN DDEE CCEELLUULLAASS SSFF99 CCOONN LLOOSS BBAACCUULLOOVVIIRRUUSS RREECCOOMMBBIINNAANNTTEESS
A los cuatro días después de la co-transfección, fueron visibles diferencias en la morfología de
las celulas sf9. La evolución de tales diferencias permitió incluso establecer que cada virus
utilizado presenta diferencias bien marcadas en cuanto a la morfología del cultivo celular que esta
infectando.
Las celulas infectadas con el virus (2)pAc-pPol-V1 figura 10. B), a los 11 días de infección es
notoria la aglomeración de restos celulares flotando en el medio, se observa hinchamiento de las
celulas que aun están fijadas al fondo de la placa de cultivo de tejido.
En las celulas infectadas con el virus (1)pAc-pPol-V1, figura 10. C) se observó mayor arresto del
desarrollo celular que en las otras muestras. Poca presencia de flotadores y de celulas hinchadas.
En el caso de las celulas infectadas con el virus Ac-pP10-V1, figura 10. D) la morfología a 11
días después de la infección es mas bien similar a la presente en las celulas infectadas con el
AcMNPV tipo silvestre figura 10. E). Se observan celulas muy hinchadas y presencia de restos
celulares flotando en el medio.
36
En caso contrario esta el testigo negativo del experimento figura 10. E)., que son celulas sanas
donde la presencia de flotadores es casi nula, el crecimiento se da en monocapa y no hay celulas
hinchadas.
Sharon et al, en 1998, demostrando que la infección detiene el crecimiento del 84% de las celulas
en las fase G2/M de 18 a 24 hpi. La infección por baculovirus resulta en muerte y lisis celular en
5-6 días después de la infección (Hu, 2005; Kost, et al, 2005).
Por otra parte se ha documentado que la proteína CrV1 tiene efectos sobre el esparcimiento
celular debido a la desestabilización del citoesqueleto celular principalmente en los hemocitos.
Asgari y Schmidt 2001. La hemolinfa se vuelve menos viscosa y los hemocitos comienzan a
cambiar en cuanto a su composición de superficie celular y en sus propiedades adhesivas. Asgari
et al, 1997.
88..55.. EEFFEECCTTOO PPLLAAGGUUIICCIIDDAA EENN LLAARRVVAASS DDEELL SSEEGGUUNNDDOO IINNSSTTAARR
El comportamiento similar de las diagonales correspondientes a cada uno de los baculovirus
recombinantes con el correspondiente al testigo positivo, es clara evidencia del efecto plaguicida
por parte de los baculovirus recombinantes.
Si bien las partículas virales presentes en los sobrenadantes con los que fue inoculado el medio,
no fueron cuantificas, los resultados si muestran una clara tendencia diferente a la del testigo
negativo (larvas no infectadas con baculovirus) y muy similar a la del testigo positivo cuya carga
viral, la comparación de medias indica que no hay diferencias significativas entre los tratamientos
de baculovirus recombinantes y el tipo silvestre utilizado (SeMNPV).
En baculovirus recombinantes que no forman cuerpos de oclusión, la cantidad viriones es difícil
de cuantificar en base a partículas virales individuales, y son hasta 5 veces menos infecciosos
que los virus ocluidos cuando son suministrados de manera oral a los insectos. Volkman y
Summers, 1977. De hecho la aplicación en campo de tal virus es impráctica pues serian
rápidamente inactivados. Bishop, 1989. Los baculovirus recombinantes que mantienen el gen de
polihedrina son más idóneos para evaluar dosis y tiempo de mortalidad. Sin embargo
alternativamente los baculovirus recombinantes que son negativos a polihedrina pueden ser co-
ocluidos con baculovirus de tipo Silvestre y poder así determinar su actividad biológica. Martens
et al, 1990, también se han desarrollado muchos protectores de UV para baculovirus, entre ellas
37
los abrillantadores, lignosulfatos, gelatina y dióxido de titanio. Szewczyk et al, 2006, con la
finalidad de evitar que sean inactivados por los rayos UV.
88..66.. EEFFEECCTTOO PPLLAAGGUUIICCIIDDAA EENN LLAARRVVAASS DDEELL CCUUAARRTTOO IINNSSTTAARR
Los tratamientos a base de sobrenadantes de cultivos celulares infectados con los nuevos
baculovirus recombinantes presentaron un comportamiento similar al testigo positivo en cuanto a
su capacidad para evitar que larvas del cuarto instar de S. exigua lleguen al estadio de adulto. La
infección por baculovirus tiene la característica de detener el desarrollo larvario (Duan y Otvo,
2001). Esto resulta de bastante utilidad ya que se puede evitar que las larvas de estadios
adelantados de hoy lleguen a tener progenie mañana.
88..77.. EEFFEECCTTOOSS DDEE LLAA IINNFFEECCCCIIOONN SSOOBBRREE LLAA MMOORRFFOOLLOOGGIIAA DDEE LLOOSS IINNSSEECCTTOOSS
Algunos efectos que se observaron en larvas infectadas (figura 14) , son por ejemplo que : a)
dejaron de alimentarse, en esta foto el medio esta casi intacto, lo cual sugiere una temprana
interrupción de la alimentación; b) oscurecimiento y manchas de color negro en la piel de larvas
muertas por la infección y c) licuefacción de órganos internos.
En distintos baculovirus ha sido documentada la suspensión de la alimentación a causa de la
enfermedad, aun cuando la muerte no sobrevenga aun (Inceoglu et al, 2001). En última instancia,
todas las células del hospedero son infectadas y el insecto muere, hay licuefacción y liberación de
millones de cuerpos de oclusión (Haas-Stapleton et al, 2005).
38
9. C O N C L U S I O N E S
1. Se construyeron tres diferentes baculovirus recombinantes con el gen CrV1, insertando
este gen el genoma de AcMNPV.
2. Se observaron cambios en la morfología de cultivos de celulas Sf9 debido a la infección
con los baculovirus construidos.
3. Se observó efecto insecticida de los baculovirus recombinantes en larvas de S. exigua del
segundo y cuarto instar, comparable al presente en la infección con el SeMNPV.
10. BIBLIOGRAFIA
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